ES2268704T3 - Nuevos peptidos y composiciones que modulan las apoptosis. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE DIRIGE A NUEVOS PEPTIDOS Y COMPOSICIONES CAPACES DE MODULAR LA APOPTOSIS EN CELULAS, Y A METODOS PARA MODULAR LA APOPTOSIS QUE EMPLEAN LOS NUEVOS PEPTIDOS Y COMPOSICIONES DE LA INVENCION. EN UN ASPECTO, LA INVENCION SE DIRIGE A UN NUEVO PEPTIDO DENOMINADO EL "DOMINIO GD", QUE ES ESENCIAL PARA LA INTERACCION DE BAK CON BCL - X SUB,L}, Y A LA FUNCION ASESINA DE CELULAS BAK. SE PROPORCIONAN METODOS PARA IDENTIFICAR AGONISTAS O ANTAGONISTAS DE LA FUNCION DEL DOMINIO GD. EL DOMINIO GD ES RESPONSABLE EN LA MEDIACION DE INTERACCIONES CLAVE PROTEINA / PROTEINA SIGNIFICATIVAS PARA LAS ACCIONES DE MULTIPLES MOLECULAS REGULADORAS DE LA MUERTE CELULAR.

Description

Nuevos péptidos y composiciones que modulan la apoptosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo de la fisiología celular, y más particularmente, a la muerte celular programada, o apoptosis. Los nuevos péptidos y composiciones de la invención son útiles para modular la apoptosis en las células.

Antecedentes de la invención

Se sabe que el fenómeno de la muerte celular programada, o "apoptosis", está implicado y es importante para el curso normal de una amplia variedad de procesos de desarrollo, que incluyen la maduración inmunológica y la del sistema nervioso. La apoptosis juega asimismo una función en los tejidos adultos que tienen altas tasas de renovación celular (Ellis, R.E. et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 7: 663-698 (1991); Oppenheim, R.W., Annu. Rev. Neurosci. 14: 53-501 (1991); Cohen, J.J., et al., Annu. Rev. Immunol. 10: 267-293 (1992); Raff. M. C., Nature 356: 397-400 (1992)). Distintas señales fisiológicas activan normalmente la muerte celular programada en estos contextos, pero las agresiones no fisiológicas, tales como la irradiación y la exposición a medicamentos que dañen al ADN, pueden provocar asimismo la apoptosis (Eastman, A., Cancer Cells 2: 275-280 (1990); Dive, C., et al., Br. J. Cancer 64: 192-196 (1991); Lennon, S.V., et al, Cell Prolif. 24: 203-214 (1991)).

Además de su función en el desarrollo, la apoptosis se ha visto implicada como una importante salvaguarda celular contra la génesis tumoral (Williams, G.T., Cell 65: 1097-1098 (1991); Lane, D.P., Nature 362: 786-787 (1993)). Bajo ciertas condiciones, las células mueren por apoptosis en respuesta a un alto nivel o a la desregulación de la expresión de los oncogenes (Askew, L., et al., Oncogene 6:1915-1922 (1991); Evan, G.I. e et al., Cell 69: 119-128 (1992); Rao, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7742-7746 (1992); Smeyne, R.J. et al, Nature 363: 166-169 (1993); Tanaka, S., et al, Cell 77:829-839 (1994); Wu, X., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3602-3606 (1994)). La supresión del programa apoptósico, mediante diversas lesiones genéticas, puede contribuir al desarrollo y a la progresión de las neoplasias malignas. Esto está bien ilustrado por la mutación frecuente del gen supresor tumoral p53 en los tumores humanos (Levine, A.J. et al, Nature 351:453-456 (1991)). El p53 de tipo salvaje es necesario para una inducción eficiente de la apoptosis después de la lesión del ADN (Clarke, A.R. et al, Nature: 362:849-852 (1993); Lowe, S.W. et al., Cell 74:957-967 (1993); Lowe, S.W. et al., Nature 362:847-849 (1993)) y la muerte celular inducida por la expresión constitutiva de ciertos oncogenes (Debbas, M., et al, Genes & Dev. 7:546-554 (1993); Hermeking, H., et al, Science 265: 2091-2093 (1944); Tanaka, S., et al, Cell 77: 829-839 (1994); Wu, X, et al, Natl. Acad. Sci. USA 91: 3602-3606 (1944)). La citotoxicidad de muchos agentes quimioterapéuticos utilizados habitualmente es mediada por el p53 de tipo salvaje (Lowe, S.W., et al, Cell 74: 957-967 (1993); Fisher, D.E., Cell 78:539-542 (1944)). De este modo, la pérdida de la función de p53 puede contribuir al problema clínicamente significativo de las células tumorales resistentes a los medicamentos que surgen después de regímenes quimioterapéuticos.

El producto de expresión del oncogen bcl-2 funciona como un potente supresor de la muerte celular apoptósica (McDonell, T.J., et al, Cell 57: 79-88 (1989); Hockenbery, D., et al, Nature 348: 334-336 (1990). La expresión constitutiva de Bcl-2 puede suprimir la apoptosis desencadenada por diversos estímulos, que incluyen la retirada del factor de crecimiento, la expresión oncogénica, la agresión del ADN, y el estrés oxidativo (Vaux, D.L. et al Nature 335:440-442 (1988); Sentman, C.L. et al, Cell 67:879-888 (1991); Strasser, A., et al, Cell 67: 889-899 (1991); Fanidi, A., et al, Nature 359:554-556 (1992); Hockenbery, D.M., et al, Cell 75:241-251 (1993)). Asimismo, existe conservación de la función de Bcl-2 a través de las especies. Por ejemplo, el gen ced-9 del nematodo C. elegans parece ser un homólogo estructural y funcional de bcl-2 (Hengartner, M.O, et al, Cell 76:665-676 (1994)) y bcl-2 puede complementar las mutaciones de ced-9 en animales transgénicos (Vaux, D.L., et al, Science 258: 1955-1957 (1991). Estas observaciones sugieren que Bcl-2 está íntimamente conectado con un programa de muerte celular que se conserva de forma evolucionada.

Se sabe que bcl-2 es un miembro de una familia de genes relacionados, algunos de los cuales, por lo menos, modulan asimismo la apoptosis. De éstos, bcl-x presenta el grado más alto de homología con bcl-2, y es cortado y empalmado de manera diferencial para producir una forma larga, denominada bcl-x_{L}, y una forma más corta, bcl-x_{s}, que alberga una deleción interna (Boise, L.H. et al, Cell 74:597-608 (1993)). Bcl-x_{L} funciona para suprimir la apoptosis, mientras que la forma que ha sufrido la deleción, Bcl-xs, inhibe la protección contra la muerte celular proporcionada por la expresión de Bcl-2. Un segundo homólogo de Bcl-2, Bax, forma heterodímeros con Bcl-2 (Oltvai, Z. N., et al, Cell 74:609-619 (1993)) y se ha mostrado que contrarresta a Bcl-2 y acelera la apoptosis. El análisis mutacional de Bcl-2 ha sugerido que es necesaria la interacción con Bax para que Bcl-2 funcione como un inhibidor de la muerte celular (Yin, X. -M., et al, Nature 369:321-323 (1994)).

Chiltender T. et al., (1985) Nature 374: 733-736 describe la expresión de un gen relacionado, denominado bak. La expresión ectópica de Bak acelera la muerte de una progenie celular dependiente de IL-3 después de la retirada de las citoquinas, y se opone a la protección contra la apoptosis permitida por Bcl-2. Además, la expresión forzosa de Bak es suficiente para inducir la apoptosis de los fibroblastos desprovistos de suero, alcanzando la posibilidad de que Bak active directamente, o sea él mismo un componente de la maquinaria de muerte celular.

Los genes celulares conocidos relacionados con Bcl-2, si se analizan, tienen patrones distintos de expresión, y por lo tanto, pueden ejercer su función en tejidos diferentes. Mientras que la expresión de Bcl-2 parece que es necesaria para el mantenimiento del sistema inmune maduro, es deseable identificar otros genes que pueden gobernar la muerte celular apoptósica en otros linajes. Además, la identificación de regiones o dominios particulares de las proteínas codificadas por dichos genes, puede proporcionar una base para entender sus características estructurales y funcionales y permitir el desarrollo de diagnósticos y terapéuticas válidos. Por ejemplo, la identificación de agentes capaces de restaurar o inducir la apoptosis en las células tumorales (en las que la pérdida de la función del gen supresor tumoral p53 puede estar implicada en la génesis tumoral y en la resistencia clínicamente significativa a los medicamentos), sería de un significativo valor terapéutico, particularmente si tal restauración o inducción fuera independiente de la función de p53. De modo similar, el desarrollo de agentes capaces de contrarrestar la función antiapoptósica de oncogenes tales como bcl-2, cuya activación está implicada en la génesis tumoral (por ejemplo, linfoma) y en la resistencia a los medicamentos quimioterapéuticos, tendría un gran valor potencial.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo dominio proteico que tiene un significado general respecto a las acciones de moléculas reguladoras múltiples de la muerte celular, que se ha identificado y del que se ha elaborado un mapa hasta la obtención de una corta subsecuencia en la parte central de la molécula de Bak. Este dominio proteico no reconocido hasta la fecha, que el inventor ha denominado "dominio GD", es esencial tanto para la interacción de Bak con Bcl-_{xL}, como para la función de eliminación celular de Bak. Las especies con un Bak truncado que comprende el dominio GD son capaces ellas mismas de unirse a Bcl-x_{L} y eliminar células en ensayos de transfección.

El dominio GD se ha identificado en otras dos proteínas Bcl-2 de unión que ejercen su función para inducir la apoptosis: Bax y Bip1a. Como con Bak, la mutación de los elementos homólogos del dominio GD en Bax y Bip1a, disminuye la muerte celular y la función de unión proteica. Así, el dominio GD es responsable para mediar las interacciones clave proteína/proteína que tienen significado para las acciones de múltiples moléculas reguladoras de la muerte celular. En un aspecto, entonces, la invención se refiere a un péptido aislado formado por una proteína truncada seleccionada de entre el grupo constituido por Bak, Bax y Bip1a o sus mutantes, caracterizado porque el péptido comprende el dominio GD y muestra actividad de eliminación (muerte) celular y unión a Bcl-x_{L}; siendo el dominio GD de Bak QLAIIGDDIN, el dominio GD de Bax CLKRIGDELD, y el dominio GD de Bip1a, RLACIGDEMD. Dichos péptidos son útiles para inducir o modular el estado apoptósico de una célula. Los compuestos químicos que interrumpen la función del dominio GD son útiles como agentes que modulan la apoptosis. De acuerdo con esto, en otro aspecto, la invención se refiere a agentes capaces de modular (es decir, inhibir o aumentar) la función del dominio GD para utilizar en la terapia de trastornos degenerativos. Dichos agentes incluyen los seleccionados a partir de los péptidos del dominio GD, y sus imitadores, fragmentos, equivalentes funcionales y/o híbridos o mutantes, así como vectores que contengan cADN que codifique cualquiera de los mencionados. La invención proporciona procedimientos para
identificar agentes capaces de modular la función del dominio GD (por ejemplo, moléculas que modulan la apoptosis).

En otros aspectos, la presente invención se refiere a productos y procedimientos que están implicados en la clonación, la preparación y la expresión de los péptidos citados anteriormente de la invención, que comprenden el dominio GD; anticuerpos con especificidad para dicho péptido y secuencias nucleótidas que codifican dichos péptidos. Los péptidos de la invención que comprenden el dominio GD son útiles para producir anticuerpos. Dichos anticuerpos son útiles para detectar y aislar proteínas que comprenden el dominio GD en muestras biológicas que incluyen, por ejemplo, células de todos los tejidos humanos incluyendo tejido cardíaco, tejido pulmonar, células tumorales, tejido cerebral, placenta, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas, así como para modular la actividad apoptósica de las proteínas que comprenden el dominio GD en y de dichas muestras biológicas, y constituyen aspectos adicionales de la invención.

En otro aspecto todavía, la invención proporciona vectores de expresión que contienen secuencias genéticas, huéspedes transformados con dichos vectores de expresión, y procedimientos para producir los péptidos recombinantes del dominio GD de la invención.

Los agentes de la presente invención pueden utilizarse en procedimientos para inducir o suprimir la apoptosis en las células y/o tejidos de individuos que padecen trastornos degenerativos caracterizados por una proliferación celular inapropiada o una muerte celular inapropiada, respectivamente. Los trastornos degenerativos caracterizados por una proliferación celular inapropiada incluyen, por ejemplo, situaciones inflamatorias como hiperplasia prostática, cáncer, incluyendo linfomas, tumores genotípicos, etc. Los trastornos degenerativos caracterizados por una muerte celular inapropiada incluyen, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, inmunodeficiencia adquirida (SIDA), muerte celular debida a terapia con radiaciones o quimioterapia, enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer y la de Parkinson, etc.

La presente invención se refiere asimismo a la utilización de un anticuerpo contra un péptido con dominio GD seleccionado de entre una de las SEC ID nº: 1 a 10, para cribar una biblioteca de expresión de cADN o clones que comprenden inserciones de ADN que codifican inmunoproteínas de reacción cruzada, para detectar la presencia del péptido con dominio GD. El polinucleótido y los anticuerpos de la invención pueden emplearse para el diagnóstico de trastornos degenerativos, los cuales se asocian con el aumento o disminución del nivel de expresión de proteínas que incluyen el dominio GD, cuando se comparan con el nivel esperado de expresión de dichas proteínas en la población celular normal.

La presente invención se refiere a la utilización de péptidos de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos degenerativos caracterizados por una inapropiada división celular o una inapropiada muerte celular.

Los péptidos de la presente invención pueden utilizarse en procedimientos para modular el estado apoptósico de una célula, administrando dichos péptidos o sus mutantes, a un individuo que padezca un trastorno degenerativo caracterizado por una inapropiada proliferación celular o una inapropiada muerte celular, para estabilizar la proliferación celular inapropiada (es decir, inducir la apoptosis) o estabilizar la muerte celular inapropiada (es decir, suprimir la apoptosis), respectivamente, y/o en cada caso restaurar el normal comportamiento celular.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al sorprendente descubrimiento de que el dominio GD de Bak está implicado en y es suficiente para la homodimerización y heterodimerización de Bak. Ejemplos no limitativos de la dimerización del dominio GD de Bak incluyen Bak (homodimerización), Bax (heterodimerización con una proteína asesina distinta) y Bcl-x_{L} (heterodimerización con una proteína de supervivencia). Además, se ha descubierto inesperadamente que las regiones no esenciales de la proteína Bak en este aspecto incluyen los dos dominios en la mitad terminal carboxilo de la proteína que muestran el grado de homología más alto respecto a otros miembros de la familia Bcl-2 (dominios I y II de homología de Bcl-2). De este modo, los péptidos que comprenden el dominio GD pueden mediar interacciones no sólo con Bcl-x_{L} sino con Bak y Bax.

Estos y otros objetivos y aspectos de la invención, resultarán evidentes para los expertos en la materia, a partir de la descripción siguiente.

Descripción de las figuras Figura 1 Función eliminadora (asesina) de Bak en las distintas progenies celulares

Las progenies celulares que se indican se cotransfectaron con un plásmido marcador de la \beta-galactosidasa en combinación con un plásmido de control (vector) o con un plásmido que expresa al epítopo HA marcado Bak (HA-Bak). Las células se fijaron y tiñeron con X-gal en las 24 horas después de la transfección, llevándose a cabo el recuento, mediante examen microscópico, del número de células azules (\beta-galactosidasa positivas).

Figura 2 Sumario de la actividad de eliminación celular de los mutantes de deleción Bak y de las especies truncadas

Las estructuras de los diversos mutantes Bak se muestran esquemáticamente. La región o regiones exacta(s) de aminoácidos que se eliminan mediante deleción se indican por los números a la izquierda. Los extremos de los residuos de aminoácidos de Bak conservados en las especies truncadas (fondo, QVG y PEM) se indican con números que bordean los esquemas de sus estructuras respectivas. La actividad de eliminación de las células "Rat-1" (rata-1) se sumariza de la siguiente forma: +, capacidad de eliminación celular equivalente a Bak de tipo salvaje; -, no hay actividad de eliminación celular, +/- actividad de eliminación celular disminuida respecto a Bak de tipo salvaje. nd indica que el experimento no se llevó a cabo.

Figura 3 Interacción de Bak con Bcl-x_{L} A) Interacciones Bak/ Bcl-x_{L} medidas in vitro

Bak traducido in vitro marcado con ^{35}S (carril 1) se mezcló con GST- Bcl-x_{L} (carril 2) o GST (carril 3). Los complejos se capturaron en perlas de glutation-agarosa, y la proteína Bak marcada con ^{35}S unida se detectó mediante electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida, seguido por autoradiografía.

B) Interacciones Bak/ Bcl-x_{L} detectadas en células transfectadas

Plásmidos que expresan formas epitópicas marcadas de Bak y Bcl-x_{L} (HA-Bak y Bcl-x_{L} marcado Flag), se cotransfectaron en células COS. HA-Bak se inmunoprecipitó (anti-HA IP) a partir de lisados de células transfectadas y el Bcl-x_{L} asociado se detectó mediante análisis de transferencia Western con un anticuerpo marcado anti-Flag.

Figura 4 Sumario de la función de unión de Bcl-x_{L} de las deleciones Bak y de las especies truncadas

Las estructuras de los diversos mutantes Bak se muestran esquemáticamente, tal como se describe en la Figura 2. La capacidad de los mutantes Bak y de las especies truncadas para interaccionar con Bcl-x_{L} se sumariza (a la derecha) de la siguiente manera: +. equivalente a Bak de tipo salvaje en la capacidad para interaccionar con Bcl-x_{L}, tanto in vitro como en las células COS transfectadas; -, no se detecta interacción con Bcl-x; -/+, interacción muy disminuida respecto a Bak de tipo salvaje y podría detectarse sólo in vitro.

Figura 5 Regiones homólogas para el dominio GD de Bak se encuentran en Bip1a y Bax

Parte superior. Estructuras esquemáticas de las proteínas con las posiciones de la homología del dominio GD (cuadros en blanco), segmento hidrofóbico (cuadros rayados) y dominios de homología de Bcl-2 (cuadros en negro).

Parte inferior. Secuencia aminoácida de las regiones en Bip1a y Bax, homóloga con el dominio GD de Bak. Los residuos (de aminoácidos) marcados son idénticos en, por lo menos, dos de las proteínas; los residuos sombreados indican cambios de los aminoácidos conservadores. Se muestran, asimismo, (líneas continuas) las regiones aminoácidas que se han eliminado en los mutantes de deleción indicados de Bip1a, Bak y Bax.

Figura 6 Sumario de la eliminación celular y de las actividades de unión de Bcl-x_{L} de los mutantes de deleción del dominio GD

Los datos para la eliminación celular y la función de unión de Bcl-x_{L} se sumarizan tal como se describe en la Figura 2 y en la Figura 4, respectivamente.

Figura 7 Dimerización del dominio GD de Bak

Las interacciones del dominio GD de Bak con Bak y Bax se midieron esencialmente tal como se describe para la unión de Bak a Bcl-x_{L}. Una parte de Bak (PEM) que comprende el dominio GD (residuos 58-103) se fusionó a GST, para crear GST-PEM. Bcl-x_{L} marcado con ^{35}S, Bak, Bax y Bip1a, traducidos in vitro, se incubaron con sólo GST, o con las proteínas de fusión GST-PEM expresadas bacterialmente. Los complejos se capturaron con perlas de glutatión-agarosa, se lavaron, y se detectaron proteínas unidas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y autoradiografía. Bcl-x_{L}, Bak y Bax interaccionan todas específicamente con GST-PEM, pero no con sólo GST. Así, el dominio GD puede mediar la interacción no sólo con Bcl-x_{L} sino asimismo con Bak y Bax.

Figura 8 Secuencia de ADN que codifica el dominio GD en Bak, Bax y Bip1a

Las secuencias de ADN que codifican las regiones del dominio GD para Bak (1-4), Bax (5-7) y Bip1a (8-10), se muestran junto con su correspondiente secuencia aminoácida. Los números de nucleótidos por encima de cada secuencia están basados empezando en el ATG iniciador para cada proteína. El número subrayado se refiere a la posición del primer y del ultimo aminoácido del péptido que se muestra.

Descripción detallada de la invención

Los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente memoria tienen los significados tal como son entendidos habitualmente por el experto en la materia, al cual pertenece la presente invención, si no se considera de otro modo. En la presente memoria, se hace referencia a diversas metodologías conocidas por los expertos en la materia. Las publicaciones y otros materiales que establecen dichas metodologías conocidas a las cuales se hace referencia, se incorporan en su totalidad a la presente memoria, como referencia.

Los trabajos estándar de referencia que establecen los principios generales de la tecnología del ADN recombinante incluyen Sambrook, J., et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York (1989); McPherson, M.J., Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991); Jones, J., Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford (1992); Austen, B.M. and Westwood, O.M.R., Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford (1991). Cualesquiera materiales y/o procedimientos apropiados conocidos por los expertos en la materia, pueden utilizarse para llevar a cabo la presente invención; sin embargo, se describen los materiales y/o los procedimientos preferidos. Los materiales, reactivos y similares a los que se hace referencia en la descripción siguiente y en los ejemplos, pueden obtenerse de fuentes comerciales, si no se indica de otra forma.

Un dominio previamente no reconocido en el interior de la molécula Bak que parece ser tan necesario como suficiente para las actividades biológicas conocidas de Bak, se ha identificado ahora. Este dominio, que se denomina en la presente memoria "dominio GD", es suficiente para mediar la función de eliminación celular y la interacción física con Bcl-x_{L}. Secuencias homólogas al dominio GD de Bak se han identificado asimismo en el interior de Bax y Bip1a y muestran que son requeridas de forma similar para la eliminación celular y las actividades de unión de Bcl-x_{L} de estas proteínas. Estas observaciones sugieren que Bak, Bax y Bip1a modulan o regulan la apoptosis mediante un mecanismo similar que, en cada caso, implica sus respectivos dominios GD. Como apreciarán los expertos en la materia que están familiarizados con la presente invención, las secuencias que comprenden el dominio GD son útiles para modular la apoptosis en las células. De manera similar, los compuestos y las composiciones que son capaces de unirse al dominio GD son útiles como agentes para la modulación de la actividad apoptósica en las células.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "dominio GD" se refiere a un dominio proteico que se identificó primero en Bak, que se ha demostrado en la presente memoria que es esencial para la interacción de Bak con Bcl-x_{L} y para la función de Bak eliminadora de células y para los péptidos y/o moléculas capaces de imitar su estructura y/o función. En una forma de realización preferida, la presente invención comprende un péptido que tiene la siguiente secuencia aminoácida:

GDDINRRYDSEFQ [SEC ID nº: 1]

que corresponde a los residuos aminoácidos 82-94 de Bak.

Sus equivalentes funcionales pueden ser asimismo útiles.

"Equivalentes funcionales" significa un péptido que posee una actividad biológica o características inmunológicas sustancialmente similares a las del dominio GD, y se tiene la intención de incluir "fragmentos", "variantes", "análogos", "homólogos", o "derivados químicos" que posean dichas actividades o características. Los equivalentes funcionales del dominio GD, entonces, pueden no compartir una idéntica secuencia aminoácida, y son posibles las sustituciones aminoácidas conservadoras o no conservadoras de los aminoácidos convencionales o no convencionales.

La referencia en la presente memoria a sustitución aminoácidas "conservadoras" quiere significar la capacidad de intercambio de residuos aminoácidos que tengan cadenas laterales similares. Por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina conforman un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas; serina y treonina son aminoácidos que tienen cadenas laterales alifático-hidroxílicas; asparagina y glutamina son aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amidas; fenilalanina, tirosina y triptófano son aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas; arginina e histidina son aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas; y cisteína y metionina son aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre. Intercambiar un aminoácido de un grupo dado con otro aminoácido del mismo grupo se consideraría una sustitución conservadora. Grupos preferidos de sustitución conservadora incluyen asparagina-glutamina, alanina-valina, lisina-arginina, fenilalanina-tirosina y valina-leucina-isoleucina.

En una forma de realización preferida de la invención, se proporciona un péptido que tiene la siguiente secuencia aminoácida:

PSSTMGQVGRQLAIIGDDINRRYDSEPQ [SEC ID nº: 2]

que corresponde a los residuos aminoácidos 67-94 de Bak, que son necesarios únicamente para la función eliminadora celular de Bak.

En otra forma de realización preferida, se proporciona un péptido que tiene la siguiente secuencia aminoácida:

QVGRQLAIIGDDINRRYDSEFQTMLQHLQPT [SEC ID Nº: 3]

que corresponde a los residuos aminoácidos 73-103 de Bak, suficientes para la función eliminadora celular de Bak.

Estos datos indican que la actividad biológica del dominio GD y de sus derivados funcionales se verá afectada por la localización subcelular de estas composiciones. De acuerdo con esto, en otra forma de realización preferida de la invención, los péptidos del dominio GD de la invención habrán fusionado a su extremo C terminal una apropiada cola hidrofóbica, que puede comprender los aminoácidos 187-211 de Bak. Otros medios apropiados para lograr la localización subcelular, incluyen la selección de apropiadas colas hidrofóbicas, tales como los aminoácidos 172-192 de Bax, los aminoácidos 213-233 de Bcl-x_{L}, los amianoácidos 220-230 de Bcl-2, y las colas hidrofóbicas introducidas mediante la lipidación proteica (Casey, T. J., Science, 268: 221-225 (1995)) tal como la prenilación y la acilación (por ejemplo, miristilación, palmilación), que pueden utilizarse por los expertos en la materia utilizando procedimientos conocidos.

El dominio GD que se da a conocer en la presente memoria está únicamente implicado tanto en la eliminación de células como en la actividad de unión Bcl-x_{L} de Bak. Además, en la presente memoria se demuestra que otras proteínas que interactúan con Bcl-2, con propiedades funcionales que recuerdan a las de Bak, contienen regiones de aminoácidos que poseen secuencias que aportan homología a secuencias en el interior del dominio GD de Bak. Estas proteínas comprenden Bax y Bip1a que, como Bak, interactúan con Bcl-2 y ambas proteínas contienen regiones aminoácidas que aportan homología a las secuencias en el interior del dominio 6D de Back. En Bax, esta región comprende los aminoácidos 59-73, que aporta homología a los aminoácidos 74-88 en el interior del dominio GD de Bak. La proteína Bip1a contiene, de modo similar, una región aminoácida que comprende los aminoácidos 57-71 que aportan homología a las mismas secuencias (aminoácidos 74-88) en el interior del dominio GD de Bak. La deleción de las regiones del dominio GD de Bip1a y de Bax identificadas anteriormente impidió la actividad eliminadora de células y previno la unión a Bcl-x_{L}. A Bip1a le faltan secuencias homólogas para las dos regiones muy conservadas, denominadas Dominio I y Dominio II (a las que también se hace referencia en la literatura como "dominios de Homología Bcl-2" o "dominios BH" I y II, o "BH1" y "BH2"). Se ha sugerido que estas dos regiones conservadas, y especialmente el Dominio I, juegan un papel decisivo en establecer la homo y la heterodimerización en Bcl-2, Bax, y otros miembros de la familia Bcl-2. De acuerdo con esto, el dominio GD constituye un elemento clave que está implicado en la actividad biológica de proteínas tales como Bak, Bax y Bip1a, que no tiene necesariamente nada en común con los miembros de la familia Bcl-2, cuya actividad es independiente de los dominios BH I y II. Esto sugiere que el dominio GD define una familia diferente de proteínas, que incluye Bak, Bax y Bip1a.

De acuerdo con esto, en otra forma de realización preferida, se proporciona un péptido que comprende los aminoácidos siguientes:

LSECLKRIGDELDSN [SEC ID nº: 4]

que corresponden a los aminoácidos 59-73 de Bax. En otra forma de realización preferida, se proporciona un péptido que comprende la secuencia aminoácida:

LKRIGDELD [SEC ID nº: 5]

que corresponde a los aminoácidos 63-71 de Bax. En otra forma de realización preferida, se proporciona un péptido que comprende la secuencia aminoácida:

QDASTKKLSECLKRIGDELDSNMELQ [SEC ID nº: 6]

que corresponde a los aminoácidos 52-77 de Bax. En otra forma de realización preferida, se proporciona un péptido que comprende la secuencia aminoácida:

LALRLACIGDEMDVS [SEC ID nº: 7]

que corresponde a los aminoácidos 57-71 de Bip1a. En otra forma de realización preferida, se proporciona un péptido que comprende la secuencia aminoácida:

IGDEM [SEC ID nº: 8)

que corresponde a los aminoácidos 64-68 de Bip1a. En otra forma de realización preferida, se proporciona un péptido que comprende la secuencia aminoácida:

CMEGSDALALRLACIGDEMDVSLRAPRL [SEC ID nº: 9]

que corresponde a los aminoácidos 50-77 de Bip1a. En otra forma de realización preferida, se proporciona un péptido que comprende la secuencia aminoácida:

VGRQLAIIGDDINRR [SEC ID nº: 10]

que corresponde a los aminoácidos 74-88 de Bax.

Un aspecto sorprendente de la presente invención lo constituye el descubrimiento de que el dominio GD solo es suficiente para la homodimerización de Bak, así como también para la heterodimerización de Bak con Bax y Bcl-x_{L}, y de que los Dominios I y II altamente conservados de la familia Bcl-2 no son necesarios para esta dimerización. Esto indica que el dominio GD puede modular la función de las proteínas, incluyendo Bak, Bax y Bcl-x_{L} directamente mediante la dimerización, pudiendo asimismo modular de este modo la función de otras proteínas incluyendo Bcl-2.

La importancia funcional del dominio GD, entonces, está relacionada probablemente con su capacidad para mediar una o más interacciones proteína/proteína con otros miembros de la familia Bcl-2, o con otra u otras proteínas celulares todavía no identificadas. Es posible que las proteínas de supervivencia como Bcl-2 y Bcl-x_{L} supriman la apoptosis uniendo e inactivando proteínas que promueven activamente la muerte celular, tales como Bak, Bax y Bip1a, mediante sus dominios GD. En apoyo de esta hipótesis, la interacción con Bax parece ser necesaria para que Bcl-2 suprima la apoptosis (Yin et al., Nature 369:321-323 (1994)). Una segunda posibilidad es que Bak, Bax y Bip1a induzcan la muerte celular uniendo (a través de sus dominios GD) e inactivando proteínas, incluyendo Bcl-2 y Bcl-x_{L}, que promueven activamente la supervivencia celular. Es posible asimismo que Bak, Bax y Bip1a unan una o más proteínas celulares adicionales y que esta interacción medie la función de muerte celular. Este inventor no tiene la intención de sustentar una teoría particular; sin embargo, a pesar de su (o sus) mecanismos de acción, el dominio GD de Bak, Bax y Bip1a es de importancia capital para mediar estas interacciones proteína/proteína.

Los agentes capaces de modular las interacciones proteína/proteína mediadas por el dominio GD pueden incluir péptidos que comprenden el dominio GD, así como mutantes del dominio GD o de proteínas que comprendan el dominio GD. Un "mutante", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un péptido que tiene una secuencia aminoácida que difiere de la del péptido o proteína que se encuentran naturalmente, en por lo menos un aminoácido. Los mutantes pueden tener la misma actividad inmunológica y biológica que el péptido o la proteína con dominio GD que se encuentran de modo natural. Sin embargo, la actividad inmunológica o biológica de los mutantes puede diferir o faltar. Por ejemplo, a un mutante con dominio GD le puede faltar la actividad biológica que caracteriza al péptido con dominio GD que se encuentra de forma natural, pero puede ser útil como antígeno para hacer que se eleven los anticuerpos contra el dominio GD o para la detección o purificación de anticuerpos contra el dominio GD, o como un agonista (competitivo no competitivo), antagonista, o agonista parcial de la función del péptido con dominio GD que se encuentra naturalmente.

La modulación de las interacciones proteína/proteína mediadas por el dominio GD puede llevarse asimismo a cabo por agonistas o antagonistas de los péptidos con dominio GD. El rastreo de bibliotecas peptídicas, bibliotecas de compuestos y de otros bancos de información, para identificar agonistas o antagonistas de la función de proteínas que comprenden el dominio GD, se realiza con ensayos para detectar la capacidad de los agonistas o antagonistas potenciales para inhibir o aumentar la unión del dominio GD, es decir, la homodimerización o heterodimerización del dominio GD.

Por ejemplo, los ensayos de rastreo de alto rendimiento pueden utilizarse para identificar compuestos que modulan la función de unión proteica del dominio GD. Dichos ensayos de rastreo facilitan la identificación de compuestos que aceleran o inhiben la apoptosis influenciando las interacciones proteína/proteína mediadas por el dominio GD. Por ejemplo, un rastreo in vitro para compuestos que interrumpen la interacción del dominio GD de Bak con GST- Bcl-x_{L}, comprende placas multipocillo revestidas con GST-Bcl-x_{L} que se incuban con una sonda peptídica con el dominio GD marcado en presencia de uno o más compuestos que vayan a ensayarse. Las moléculas que interrumpen específicamente la interacción, podrían, en principio, unirse al dominio GD "ligando", o al dominio del receptor "todavía no identificado" en Bcl-x_{L}. Cada uno de los compuestos constituiría un agente candidato a la modulación de la apoptosis.

De este modo, el procedimiento de la invención puede utilizarse, por ejemplo, para rastrear un agente capaz de modular la apoptosis, comprendiendo dicho procedimiento de rastreo el revestimiento de una placa multipocillo con GST-Bcl-x_{L} e incubando la placa multipocillo revestida con una sonda peptídica con el dominio GD marcado en presencia de un agente que se desea lleve a cabo el ensayo, en el que la interrupción de la interacción del dominio GD con GST-Bcl-x_{L} indica que dicho agente puede modular la apoptosis. Los agentes que se identifican mediante este procedimiento se consideran asimismo formas de realización de la invención.

Marcadores apropiados incluyen un marcador detectable tal como una enzima, isótopo radioactivo, compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, o un compuesto bioluminiscente. Los expertos en la materia conocerán otros marcadores apropiados o podrán establecerlos empleando la experimentación rutinaria. Además, la unión de estos marcadores a los péptidos se lleva a cabo utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica.

Un rastreo de alta velocidad para los agentes que se unen directamente al dominio GD puede utilizar bibliotecas inmovilizadas o bibliotecas "marcadas" combinatoriamente. Los agentes que se unen específicamente a dichas bibliotecas son candidatos a ensayarse respecto a su capacidad para bloquear las interacciones Bak/ Bcl-x_{L}. Tal como se ha considerado anteriormente, dichos agentes puede funcionar como supresores de la apoptosis, inhibiendo directamente la función de Bak (y/o de Bax/Bip1a), o aumentando la actividad efectiva del Bcl-2/ Bcl-x_{L} (o de otro miembro de la familia Bcl-2). Dichos agentes serán útiles para suprimir la apoptosis aberrante en trastornos degenerativos o después de lesiones isquémicas.

Los anticuerpos contra los péptidos con dominio GD de la invención pueden utilizarse para rastrear bibliotecas de expresión de cADN, para identificar clones que contengan inserciones de cADN que codifiquen proteínas de reacción cruzada inmunológica relacionadas estructuralmente que puedan ser miembros de la familia de proteínas de dominio GD. El rastreo del cADN y de las bibliotecas de expresión del ARNm es conocido en la técnica. De modo similar, los anticuerpos contra los péptidos de dominio GD se utilizan para identificar o purificar proteínas de reacción cruzada inmunológica relacionadas con este dominio, o para detectar o determinar la cantidad de proteínas que contiene el dominio GD en una célula no en una población celular, por ejemplo, en tejidos o células tales como linfocitos, obtenidos a partir de un paciente. Los procedimientos que se conocen para dichas mediciones incluyen la inmunoprecipitación de extractos celulares, seguidos por PAGE, detección in situ mediante procedimientos inmunohistoquímicos, y procedimientos ELISA, todos los cuales son bien conocidos en la técnica.

La modulación de la apoptosis puede ser llevada a cabo mediante procedimientos que utilicen polinucleótidos antisentido específicos complementarios a la totalidad o a parte de las secuencias nucleótidas que codifican proteínas que comprenden el dominio GD que se ha dado a conocer en la presente memoria. Dichos polinucléotidos antisentido complementarios pueden incluir adiciones, deleciones, sustituciones y trasposiciones de nucléotidos, siempre que persista la hibridación específica a la secuencia diana. Los oligonucléotidos ARN o ADN antisentido solubles que pueden hibridizarse específicamente a los tipos de ARNm que codifican proteínas o péptidos de la invención, y que evitan la transcripción de los tipos de ARNm y/o la traducción del polipéptido codificado, son considerados como polinucléotidos antisentido complementarios, según la invención. la producción de proteínas que comprenden el dominio GD es inhibida por los polinucleótidos antisentido según la invención, y dichos polinucléotidos antisentido pueden inhibir la apoptosis, la senectud y similares, y/o invertir el fenotipo transformado de las células. Un casete heterólogo de expresión puede utilizarse para producir polinucléotidos antisentido en una célula transfectante o transgénica. Los polinucléotidos antisentido pueden asimismo administrarse como oligonucleótidos solubles al entorno externo de la célula diana, tal como el medio de cultivo de células in vitro o el líquido intersticial (por ejemplo, a través del sistema circulatorio) in vivo. Los polinucleótidos antisentido y su utilización son conocidos por los expertos en la materia, y se describen, por ejemplo, en Melton, D.A. Ed., Antisense RNA and DNA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988).

La actividad biológica prevista de los agentes identificados según la invención varía, dependiendo de las suposiciones realizadas en lo que respecta al mecanismo de la función de Bak/Bcl-2. Por ejemplo, se puede predecir que un agente que se une estrechamente al dominio GD inhibirá la función de Bak (y quizás de Bax/Bip1a). Asumiendo que Bac (y/o Bax/Bip1a) constituye la molécula reguladora activa de la muerte celular, un agente que bloquea estrechamente el dominio GD, puede inhibir la función de Bak mediante un mecanismo similar a la acción de la unión de Bcl-2/Bcl-x_{L}. Dichos agentes comprenderán imitadores "Bcl2/Bcl-x_{L}" y podrían, por tanto, mostrar una actividad antiapoptósica bajo condiciones en las que Bcl-2 posee un efecto protector demostrado (por ejemplo, protección de las neuronas contra las lesiones o la ausencia de citoquinas). Los agentes de este tipo podrían ser útiles para tratar enfermedades caracterizadas por la muerte celular excesiva o inapropiada, incluyendo, por ejemplo, las enfermedades neurodegenerativas y las lesiones resultantes de la isquemia.

Si la unión de Bcl-2/Bcl-x_{L} promueve activamente la supervivencia celular, y si la represión de Bak se debe simplemente a su unión y a la inactivación de estas proteínas de supervivencia, entonces, un agente que evitara esta unión, aumentaría de modo efectivo la actividad del Bcl-2/Bcl-x_{L} residente en una célula, aliviando la represión llevada a cabo por Bak (y/o por Bax/Bip1a). Esto promovería asimismo la supervivencia celular, pero sólo en células que expresaran la Bcl-2/ Bcl-x_{L} endógena. Los agentes que se unen a Bcl-x_{L} y evitan, por lo tanto, su interacción con Bak ( y/o con Bax/Bip1a) podrían inhibir la actividad supresora de la muerte celular de Bcl-x_{L} (y/o de Bcl-2). Dichos agentes comprenderían "imitadores del dominio GD" y promoverían la muerte celular de un modo similar, desde el punto de vista mecánico, a la acción de Bak. Los agentes imitadores del dominio GD serían útiles en el tratamiento terapéutico del cáncer y de las enfermedades víricas.

Los imitadores peptídicos del péptido de dominio GD son también proporcionados por la presente invención, y pueden actuar como medicamentos para la modulación de la apoptosis bloqueando, por ejemplo, la función de las proteínas que comprenden el dominio GD o interfieren con la dimerización mediada por el dominio GD. En la industria farmacéutica, se entiende habitualmente que los imitadores peptídicos incluyen medicamentos que tienen propiedades análogas a las del péptido que se imita. Los principios y prácticas del diseño de los imitadores peptídicos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Fauchere J., Adv. Drug. Res 15:29 (1986); y Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Los imitadores peptídicos que muestran una estructura similar con los péptidos terapéuticamente útiles, pueden utilizarse para producir un efecto equivalente terapéutico o profiláctico. Típicamente, dichos imitadores peptídicos tienen una o más uniones peptídicas que se reemplazan opcionalmente por una unión que puede convertir propiedades deseables tales como la resistencia a la fragmentación química in vivo. Tales uniones pueden incluir -CH_{2}NH-,
-CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2}, -CH=CH-, -OCH_{2}-, H(OH)CH_{2}-, y -CH_{2}SO-. Los imitadores polipeptídicos pueden mostrar una potenciación de las propiedades farmacológicas (vida media biológica, tasas de absorción, etc), distintas especificidades, aumentos de la estabilidad, economías de producción, antigenicidad disminuida y similares, lo que hace su utilización terapéutica particularmente deseable.

Tal como se considera en la presente memoria, el dominio GD parece consistir en un área de motivos implicados en la dimerización, y esta actividad puede estar relacionada con la regulación de la apoptosis por las proteínas que comprende el dominio GD. Bak posee una región hidrofóbica C-terminal que aparece se extiende por la membrana. De este modo, la localización subcelular de las proteínas que contiene el dominio GD puede jugar un papel en la regulación de la muerte celular programada in vivo. Es posible, entonces, utilizar la invención para la detección o la determinación de las proteínas que comprenden el dominio GD, por ejemplo, en fracciones de excisiones orgánicas y/o tisulares, mediante técnicas inmunoquímicas u otras, en vista de sus propiedades antigénicas. La inmunización de animales con péptidos que comprenden el dominio HD solo o conjuntamente con adyuvantes mediante procedimientos conocidos, puede producir anticuerpos específicos para el péptido del dominio GD. El antisuero obtenido mediante procedimientos convencionales puede utilizarse con este propósito. Por ejemplo, un mamífero tal como un conejo, puede ser inmunizado con un péptido que comprende el dominio GD, induciendo por tanto la formación de anticuerpos policlonales. Anticuerpos monoclonales pueden generarse asimismo utilizando procedimientos conocidos. Dichos anticuerpos pueden utilizarse según la invención, para detectar la presencia y cantidad de péptidos que comprenden el dominio GD.

Los péptidos del dominio GD de la invención pueden utilizarse para la detección de Bak, Bcl-x_{L}, Bip1a y de otras proteínas mediante ensayos estándar que incluyen tadioinmunoensayos e inmunoensayos enzimáticos.

Los expertos en la materia podrán apreciar que la estructura química exacta de los péptidos que comprende el dominio GD variará, dependiendo de varios factores. Por ejemplo, una proteína dada puede obtenerse como una sal sódica o básica, o en forma neutra, ya que en la molécula se encuentran grupos carboxílicos y aminos ionizables. Para el propósito de la invención, entonces, cualquier forma de los péptidos que comprenda el dominio GD que conserve la actividad diagnóstica o terapéutica del péptido que se encuentra de modo natural, tiene la intención de ser incluida en el alcance de la presente invención.

Los péptidos del dominio GD y otras composiciones de la presente invención pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante que se conocen en la técnica. Por ejemplo, secuencias nucleótidas que codifican péptidos del dominio GD de la invención pueden insertarse en un vector de ADN apropiado, tal como un plásmido, y utilizar el vector para transformar un huésped apropiado. El péptido GD recombinante se produce en el huésped mediante la expresión. El huésped transformado puede ser una célula procariótica o eucariótica. Las secuencias nucleótidas con este fin que codifican los dominios GD de Bak, Bax y Bip1a, se muestran en la figura 8.

Los polinucléotidos que codifican péptidos que comprenden el dominio GD pueden ser genómicos o cADN, aislados a partir de bibliotecas clónicas mediante procedimientos convencionales, que incluyen procedimientos de rastreo mediante hibridización. Alternativamente, secuencias polinucleótidas sintéticas pueden construirse mediante procedimientos sintéticos químicos conocidos para la síntesis de oligonucleótidos. Dichos procedimientos sintéticos se describen, por ejemplo, en Blackburn, G.M. y Gait, M.J., Ed, Nucleic Acids in Chemistry and Biology, IRL Press, Oxford, England (1990), y será evidente que los sintetizadores oligonucleótidos disponibles comercialmente pueden utilizarse asimismo según las instrucciones del fabricante. Uno de dichos fabricantes es Applied Bio Systems.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando iniciadores basados en los datos de la secuencia nucleótida dados a conocer en la presente memoria, puede utilizarse para amplificar fragmentos de ADN a partir de los conjuntos de ARNm, bibliotecas de clones cADN, o ADN genómico. Los procedimientos de amplificación PCR de nucleótidos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Erlich, H.A. Ed., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, New York, New York (1989); Patente U.S. nº 4.683.202; Patente U.S. nº 4.800.159; and Patente U.S. nº 4.683.195. Varias deleciones de nucleótidos, adiciones y sustituciones, pueden incorporarse a los polinucléotidos de la invención tal como resultará evidente para los expertos en la materia, quienes reconocerán asimismo que la variación en la secuencia nucleótida que codifica los péptidos del dominio GD puede tener lugar como resultado de, por ejemplo, polimorfismos alélicos, errores secuenciales poco importantes, y similares. Los polinucleótidos que codifican los péptidos del dominio GD de la invención pueden incluir oligonucleótidos cortos que son útiles, por ejemplo, como sondas de hibridización e iniciadores PCR. Los polinucleótidos de la invención pueden comprender asimismo una parte de un polinucleótido más voluminoso y, mediante la unión de polinucleótidos, pueden fusionarse, en un marco de lectura, con una o más secuencias polinucléotidas que codifican distintas proteínas. En este caso, la proteína que se expresa puede comprender una proteína de fusión. Por supuesto que las secuencias polinucleótidas de la invención pueden utilizarse en el procedimiento PCR para detectar la presencia de ARNm que codifica los péptidos del dominio GD, en el diagnóstico de una enfermedad o de un análisis forense.

Los cADN que codifican proteínas que interaccionan con el dominio GD (o proteínas que contienen el dominio GD) pueden identificarse rastreando bibliotecas de expresión del cADN, utilizando procedimientos conocidos. Ejemplos de dichos procedimientos incluyen el sistema bihíbrido de la levadura (Patente U.S. nº 5.283.173, de los inventores Fields y Song, publicado el 1 de febrero de 1994; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:9578 (1991); y el sistema de rastreo interactivo E. coli/BCCP (Guarente, L., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1639 (1993) y Germino, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 90: 933-937 (1993)). Bibliotecas apropiadas de cADN incluirán bibliotecas cADN de mamíferos, tales como la humana, de la rata o del ratón, que pueden contener cADN producido a partir del ARN y de una célula única, tejido o tipo de órgano, o estado de desarrollo, tal como se conocen en la técnica.

Una secuencia nucleótida que codifica una proteína o péptido que comprende el dominio GD, puede insertarse en un vector de ADN según las técnicas convencionales, que incluyen extremos redondeados o extremos empalmados para la unión, digestión enzimática de restricción para proporcionar extremos apropiados, rellenado de los extremos cohesivos de forma apropiada, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones no deseadas, y unión con ligasas apropiadas. Las técnicas para dichas manipulaciones se dan a conocer, por ejemplo, por Sambrook, J., et al, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York (1989), y son bien conocidas en la técnica.

La secuencia de residuos aminoácidos en una proteína o péptido que comprende el dominio GD se diseña en la presente memoria utilizando sus designaciones de tres letras empleadas habitualmente, o designándola mediante una única letra. Puede encontrarse una lista de estas designaciones de tres o de una letra en libros de texto tales como Biochemistry, Second Edition, Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY (1975). Cuando la secuencia aminoácida es listada horizontalmente, se procura que el extremo amino se sitúe en el extremo izquierdo, mientras que el extremo carboxilo se procura que esté en el extremo derecho. Los residuos de aminoácidos en un péptido pueden estar separados por guiones. Se procura que dichos guiones puedan facilitar solamente la presentación de una secuencia.

El diseño racional de los imitadores del dominio GD o de moléculas de unión, basado en una estructura peptídica modelada (o determinada experimentalmente), puede llevarse a cabo por los expertos en la materia, utilizando procedimientos conocidos de diseño racional de medicamentos. Los procedimientos terapéuticos o profilácticos para tratar diversas situaciones patológicas, tales como las enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, cáncer y similares, pueden realizarse administrando una cantidad efectiva de un agente terapéutico, capaz de inhibir específicamente la homodimerización o la heterodimerización del dominio GD, modulando de este modo la actividad biológica del dominio GD que contiene proteínas, y el estado apoptósico en un paciente.

En la presente memoria se demuestra que moléculas Bak truncadas que comprenden el dominio GD, tales como QVG o PEM, así como otros pequeños derivados peptídicos, que constituyen un dominio GD "mínimo", conservan las funciones de eliminación celular y de unión proteica mostradas por la Bak de tipo salvaje. Estas moléculas, o derivados peptidomiméticos, pueden inducir la apoptosis en células tumorales suministrando la misma señal biológica producida por una expresión de Bak de alto nivel (que se ha mostrado mata a las células tumorales en el ensayo in vitro). Dichos agentes comprenden una nueva clase de medicamentos quimioterapéuticos que pronosticarían poder operar independientemente del estado de p53.

Si la interacción con Bak da lugar a la supresión de la función antiapoptósica de Bcl-x_{L} y/o de otros miembros de la familia Bcl-2 los péptidos del dominio G, entonces, o los agentes que imitan la estructura del dominio GD, pueden actuar como inhibidores de la función antiapoptósica de proteínas como Bcl-2. La expresión de Bcl-2 de alto nivel se ha implicado en la resistencia de las células tumorales a diversos medicamentos quimioterapéuticos (Fisher, et al., Cancer Res. 53: 3321-3326 (1993); Miyashita y Reed, Blood 81:151-157 (1993); Dole et al., Cancer Res. 54:3253-3259 (1994). La administración de los imitadores del dominio GD puede suprimir la función de Bcl-2 y restaurar la sensibilidad de las células tumorales a la apoptosis inducida por los agentes quimioterapéuticos tradicionales. Además, los imitadores del dominio GD o de Bak que inhiben Bcl-2, pueden ser selectivamente tóxicos ellos mismos a ciertos tumores, tales como el linfoma folicular, que dependen de una actividad Bcl-2 de alto nivel para su crecimiento y supervivencia continuados.

Los imitadores del dominio GD de la invención pueden ser útiles asimismo para combatir las infecciones víricas. La apoptosis de las células infectadas, cuando se asocia con la fragmentación del ADN, proporciona una importante defensa contra la patogénesis vírica, limitando los títulos virales y restringiendo la propagación vírica (Vaux, et al, Cell 76:777-779 (1994). Por esta razón, los virus han desarrollado diversos mecanismos para suprimir la apoptosis de las células huéspedes infectadas. Las proteínas de ciertos virus, tales como las del virus BHRF-1 de Epstein-Barr, del Virus LHW5-HL de la Fiebre Porcina Africana, y del Adenovirus E1B 19kD, parecen constituir homólogos funcionales o estructurales de Bcl-2. Un segundo gen del virus Epstein-Barr, LMP1, transactiva la expresión del gen bcl-2 celular en las células infectadas de forma latente (Henderson, et al., Cell 65:1107-1115 (1991). En estos casos, la señal apoptósica desencadenada por la infección vírica puede mantenerse controlada por la acción de un homólogo viral (o celular) de Bcl-2. Un dominio GD mimético de Bak que se opone a la función antiapoptósica del homólogo Bcl-2 viral/celular, podría servir para aliviar este bloqueo e inducir la apoptosis en las células infectadas y, en consecuencia, inhibir la propagación viral. Se ha demostrado que proteínas antiapoptósicas codificadas por lo menos por dos virus relacionados, (EBV BHRF1 y el Adenovirus E1B 19kD), interaccionan con Bak. La evidencia experimental apoya la conclusión de que interrumpiendo la interacción E1B 19kD/Bak (es decir, compitiendo con un dominio GD imitador) se reducirían los títulos virales y la replicación productiva. Las mutaciones en E1B 19kD que interrumpen la interacción con Bak, abolen correspondientemente la función antiapoptósica de E1B 19k. Las cepas adenovíricas que codifican proteínas defectuosas de E1B 19kD producen una cantidad mucho más pequeña de progenies virales in vitro, debido a la apoptosis de las células infectadas (Pilder, et al, I. Virol. 52:664-671 (1984); Subramanian, et al, J. Biol. Chem, 259: 11777-11783 (1984).

Un mecanismo adicional por el que los virus imponen un bloqueo sobre la vía transductora de la señal apoptsósica es mediante la inactivación de la proteína supresora tumoral p53. La proliferación celular forzada causada por la infección viral induce una señal apoptósica que requiere la función de p53 (véase por ejemplo, Wu y Levine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3602-3606 (1994). Típicamente, la función de p53 es derogada durante la infección por la interacción física con un producto génico viral. Ejemplos de virus que codifican proteínas p53 de unión incluyen adenovirus, poliomavirus, papilomavirus, y citomegalovirus (Levine, et al, Nature 351:453-356 (1991); Speir et al, Science 265:391-394 (1994). Las células infectadas son "preparadas" para experimentar apoptosis, pero la muerte celular se evita o retrasa por la inhibición vírica de la función de p53. Es posible que este bloqueo en la vía transductora de la señal apoptósica podría aliviarse, o desviarse, mediante un agente que module la línea de salida de p53 de la apoptosis. Los imitadores de Bak o del dominio GD, inducen la apoptosis independientemente de p53, y proporcionan, en consecuen-
cia, una vía para ejecutar o restaurar la señal de muerte celular que queda suprimida en las células infectadas.

Cualquier modo de administración que dé lugar al suministro del agente terapéutico a través de la membrana celular y en el interior de la célula deseada puede utilizarse para suministrar los péptidos y el agente de la invención. El sitio de administración y las células serán seleccionados por el experto en la técnica, que se basará en el conocimiento del trastorno particular que vaya a ser tratado. Además, la dosis, la frecuencia de ésta, y la duración del tratamiento, pueden determinarse y optimizarse por un experto en la técnica, dependiendo del trastorno degenerativo particular que vaya a ser tratado. El modo particular de administración puede seleccionarse asimismo fácilmente por un experto en la técnica, y puede incluir, por ejemplo, el oral, intravenoso, subcutáneo, intramuscular, etc, requiriéndose que el agente terapéutico atraviese la membrana celular. Son conocidos y descritos los principios de la dosificación farmacéutica y del suministro de medicamentos, por ejemplo, en Ansel, H.C. y Popovich, N.G., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition, Lea & Febiger, Publisher, Philadelphia, PA (1990). Es posible, por ejemplo, utilizar liposomas para suministrar específicamente los agentes de la invención. Dichos liposomas pueden producirse de forma que contengan compuestos bioactivos adicionales y similares, tales como medicamentos, radioisótopos, anticuerpos, lectinas y toxinas, que actuarían en el sitio diana.

Agentes apropiados de la invención incluyen péptidos del dominio GD e imitadores, fragmentos, equivalentes funcionales y/o híbridos o mutantes de los mismos, así como vectores que contienen cADN que codifica cualquiera de los mencionados anteriormente. Dichos agentes pueden administrarse solos o en combinación con, y/o a la vez que otros medicamentos apropiados y/o sesiones terapéuticas.

Los agentes de la presente invención son apropiados para el tratamiento de trastornos degenerativos, que incluyen trastornos caracterizados por una inapropiada proliferación celular o una inapropiada muerte celular, o, en algunos casos, ambas. La inapropiada proliferación celular incluirá el aumento estadísticamente significativo en el número de células, comparado con la proliferación de este tipo celular particular en la población normal. Asimismo, se incluyen trastornos en los que una célula se encuentra y/o persiste en una localización inapropiada, por ejemplo, la presencia de fibroblastos en el tejido pulmonar después de una lesión aguda pulmonar. Por ejemplo, dichas células incluyen las células cancerosas que mostrarán las propiedades de invasión y metástasis y son altamente anaplásicas. Dichas células incluyen pero no se limitan a células cancerosas que incluyen, por ejemplo, células tumorales. La muerte celular inapropiada incluirá una disminución estadísticamente significativa en el número de células, comparado con la presencia del tipo celular particular en la población normal. Dicha disminución representativa puede deberse a un trastorno degenerativo particular, que incluye, por ejemplo, al SIDA, (HIV), que da lugar a una muerte inapropiada de las células T, y a enfermedades autoinmunes caracterizadas por una muerte celular inapropiada. Las enfermedades autoinmunes son trastornos causados por una respuesta inmune dirigida contra los antígenos propios. Dichas enfermedades se caracterizan por la presencia de autoanticuerpos circulantes o de una inmunidad mediada celularmente contra autoantígenos, conjuntamente con lesiones inflamatorias causadas por células inmunológicamente competentes o complejos inmunes en tejidos que contienen los autoantígenos. Dichas enfermedades incluyen el lupus eritematoso sistémico (SLE) y la artritis reumatoidea.

Los trabajos estándar de referencia que establecen los principios generales de inmunología incluyen Stites, D. P., y Terr, A.I., Basic and Clinical Immunology, 7th Ed., Appleton & Lange, Publisher, Norwalk, CT (1991); y Abbas, A.K. et al., Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders, Co., Publisher, Philadelphia, PA (1991).

Los péptidos del dominio GD, imitadores, agentes y similares que se dan a conocer en la presente memoria, así como los vectores que comprenden secuencias nucleótidas que los codifican o sus secuencias antisentido correspondientes, y los huéspedes que comprenden dichos vectores, pueden utilizarse en la preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades.

Las células y los animales transgénicos no humanos que tienen uno o más alelos funcionalmente dañados, que codifican una proteína que comprende el dominio GD, pueden generarse utilizando constructos diana homólogos a partir de clones genómicos de proteínas que comprenden el dominio GD. Los procedimientos para la producción de constructos diana homólogos son conocidos y se describen, por ejemplo, en Bradley et al, Bio/Technology 10:534 (1992); y Koh, et al, Science 256:1210 (1992). Por ejemplo, se pueden generar ratones "con genes inactivados" que son homocigóticos o heterocigóticos para un alelo inactivado de una proteína que comprende el dominio GD, utilizando dianas homólogas. Dichos ratones son útiles como agentes para la investigación de enfermedades y para otros usos. Procedimientos para producir ratones diana quiméricos son conocidos y se describen, por ejemplo, en Robertson, E.J. Ed., Teratocarcinomas and Embryonic Stem cells: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1987), que describe asimismo la manipulación de las células troncales del embrión. Además, pueden construirse transgenes para expresar a niveles altos polipéptidos que comprenden el dominio GD, o bajo el control de secuencias seleccionadas del control de la transcripción, utilizando el cADN o el gen genómico de una proteína que comprende el dominio GD.GD. Los transgenes construidos de este modo pueden introducirse en células y animales no transgénicos mediante procedimientos conocidos. Dichas células transgénicas y los animales transgénicos no humanos pueden utilizarse como pantallas para los agentes que modulan la apoptosis.

La invención puede apreciarse en ciertos aspectos haciendo referencia a los ejemplos siguientes, a título ilustrativo no limitativo.

a. Métodos i. Manipulaciones plasmídicas y del ADN

Todos los procedimientos del ADN recombinante se llevaron a cabo mediante procedimientos estándar. Las deleciones en el bak cADN se introdujeron mediante mutagénesis PCR, y los tipos de Bak truncados se construyeron mediante PCR (White, B.A., Ed, "PCR Protocols: Current Methods and Applications", en, Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, CT (1993). Las mutaciones se confirmaron mediante análisis secuencial del ADN. Todos los derivados de Bak se marcaron en el extremo amino con el epítopo hemoaglutinínico del virus de la gripe, expresán-
dose a partir del promotor potenciador de CMV presente en pcDNA-1/Amp, p pRcCMV y pcDNA-3 (Invitrogen, Inc).

ii. Ensayo de transfección transitoria

El procedimiento de transfección transitoria es similar al previamente descrito para detectar la apoptosis inducida por el enzima conversor de IL-1\beta (Miura, et al, Cell 75:653-660 (1993); Kumar et al, Genes Dev. 8:1613-1626 (1994); Wang et al., Cell 78: 739-750 (1994). Un día antes de llevar a cabo la transfección, se sembraron células Rat-1 en placas de 24 pocillos, a razón de 3,5 x 10^{4} células /pocillo. Al día siguiente, las células se transfectaron con un plásmido marcador que codificaba la \beta-galactosidasa (0,16 \mug), en combinación con un plásmido de expresión que codificaba Bak (0,42 \mug) mediante el procedimiento de la Lipofectamina (Gibco/BRL). A las 24 horas después de la transfección, las células se fijaron y tiñeron con X-Gal para detectar la expresión de la \beta-galactosidasa en las células que recibieron el ADN plasmídico (Miura, et al, supra). El número de células azules se contó mediante examen microscópico y se clasificó como células vivas (células azules planas) o muertas (células azules redondeadas). La actividad eliminadora celular de Bak en este ensayo se manifiesta por una gran reducción en el número de células azules obtenidas, respecto a la cotransfección del plásmido \beta-gal con un vector control de expresión (es decir, sin la inserción de bak cADN).

La interpretación de que la pérdida de las células azules refleja la función de eliminación celular de Bak, es apoyada por diversas observaciones:

1.

Las células Rat-1 son eliminadas rápidamente por la expresión forzosa de Bak en los ensayos de transfección estable;

2.

Los plásmidos de la expresión de control que albergan el cADN bak en la orientación antisentido, o varios cADNs no relacionados, no eliminan las células positivas \beta-gal. Además, ciertos mutantes Bak (es decir, \DeltaGD) tienen una capacidad muy disminuida para eliminar las células azules en este ensayo;

3.

La enzima IL-1\beta-conversora,que previamente se ha mostrado que induce la apoptosis en las células Rat-1 (Miura, et al, supra; Kumar et al, supra; Wang et al, supra), elimina asimismo las células azules en este ensayo cuando se expresa a partir del mismo vector;

4.

El número de células azules puede restaurarse parcialmente mediante la cotransfección de Bak con Bcl-x_{L}. Así, las células que expresan Bak pueden rescatarse hasta cierto grado mediante la función antiapoptósica de Bcl-x_{L} y la expresión de Bak, per se, no elimina la actividad de la \beta-galactosidasa.

iii. Detección de las interacciones proteína/proteína in vitro

GST y GST- Bcl-x_{L} se expresaron en E. coli y se purificaron mediante cromatografía de afinidad utilizando glutation-agarosa (Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988)). Las proteínas marcadas con S^{35}-metionina se expresaron in vitro utilizando un sistema acoplado transcripción/traducción en lisados de reticulocitos de conejos, tal como se describe por el proveedor (Promega). Las proteínas marcadas S^{35}-met se preeliminaron mezclando con 20 ml de perlas GSH-agarosa lavadas con BSA (50% de lechada) a 4ºC durante 1 hora en 0,1 ml de tampón Hepes 10 mM, pH 7,2, que contenía NP-40 al 0,25%, 142,5 mM NaCl, 5 mM MgCl_{2}, y 1 mM EGTA (tampón de lisis NP-40). Las perlas se eliminaron mediante centrifugación y los sobrenadantes se incubaron con GST o GST-Bcl-x_{L} (concentración final 1 mM) a 4ºC durante 1 hora. Las proteínas de fusión de GST y cualesquiera proteínas interactuantes se recuperaron mediante incubación durante 1 hora con otros 20 ml de perlas de GSH-agarosa. Las perlas se lavaron 2 veces con tampón de lisis NP-40, seguido por dos lavados con tampón de lisis NP-40 sin NP-40. Las proteínas se eluyeron a partir de las perlas mediante incubación en un tampón de muestra SDS-PAGE a 100ºC durante 5 minutos, cargándose en geles de SDS-poliacrilamida al 4-20%. Después de la electroforesis, los geles se fijaron e incubaron en una solución de potenciación fluorográfica (amplificador; Amersham). Los geles se secaron y se sometieron a autoradiografía a -70ºC.

iv. Detección de interacciones proteína/proteína en células transfectadas

Se hicieron crecer las células COS en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Life Technologies, Inc), suplementado con suero de ternera bovina al 10%, L-glutamina al 2% y pen/estrep al 1% (Life Technologies, Inc). Las células se sembraron a razón de 2,0 x 10^{5} células/pocillo de 35 mm y se transfectaron con plásmidos de expresión 24 horas más tarde, utilizando Lipofectamina tal como se describe por el proveedor (Life Technologies, Inc). Bak (y sus mutantes) se expresaron como una proteína de fusión con el epítopo HA marcado en su grupo amino terminal. Bcl-x_{L} se expresó asimismo con un epítopo amino terminal marcado (Flag; Kodak). A las 24 horas de la postransfección, las células se lavaron con solución salina tamponada de fosfato y se lisaron en tampón de lisis NP-40 que también contenía 1 mM PMSF, 1 mM pepstatina, y 1 mg/ml de leupeptina. Los lisados se incubaron con anticuerpo anti-HA (12CA5, Boehringer Mannheim) durante 1 hora y con 20 ml con perlas de preoteína A-agarosa lavadas con BSA (lechada del 50%). Las perlas se lavaron dos veces con tampón de lisis NP-40, seguido por dos lavados con tampón de lisis NN-40 sin NP-40. Las proteínas se eluyeron a partir de las perlas mediante incubación en un tampón de muestra SDS-PAGE a 100ºC durante 5 minutos, cargándose en geles de SDS-poliacrilamida al 4-20%. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore) y se bloquearon mediante incubación durante 1 hora con una solución de leche al 1% en PBS. El anticuerpo primario (1 mg/ml 12CA5, Boehringer Mannheim; 1:500 DAKO-bcl-2, 124, DAKO; 10 mg/ml Anti-FLAG M2, Kodak), se incubó con las membranas durante 1 hora, seguido por el anticuerpo secundario (0,8 mg/ml de IgG de cabra antirratón conjugado con HRP; Laboratorio Jackson) durante otra hora. La detección se realizó mediante quimiluminiscencia potenciada (ECL; Amersham), tal como se describe por el proveedor, utilizando una película X-OMAT AR (Kodak).

b. Resultados i. Detección de la función de muerte celular de Bak en progenies celulares múltiples

La expresión forzosa de bak induce la apoptosis en las progenies celulares estables Rat-1 transfectadas con un plásmido inducible bak de expresión. Para evaluar más rápidamente la función eliminadora celular de un gran número de mutantes bak, se utilizó un ensayo de transfección transitoria. Las células Rat-1 se transfectaron con un plásmido marcador que codifica la \beta-galactosidasa, en combinación con un plásmido de expresión que codifica Bak, o varios plásmidos de control. La actividad eliminadora celular de Bak en este ensayo se manifestó por una gran reducción en el número de células azules (que expresan \beta-gal), obtenidas respecto a la cotransfección del plásmido \beta-gal con un vector control de expresión (Figura 1). La eliminación de las células azules indicó que las células transfectadas fueron eliminadas por bak previamente a que se expresaran niveles detectables de \beta-galactosidasa.

La actividad eliminadora celular de Bak se evaluó en varias progenies celulares adicionales. Para determinar si Bak requiere p53 de tipo salvaje para inducir la apoptosis, se llevó a cabo un experimento de transfección transitoria en fibroblastos transformados derivados de un ratón con genes p53-/-inactivados. A estas células les falta el p53 funcional y están afectadas en gran medida en su capacidad para experimentar la apoptosis en respuesta a la g-irradiación y a los medicamentos quimioterapéuticos que dañan al ADN (Lowe, et al, Cell 74:957-967 (1993); Lowe, et al., Nature 362: 847-849 (1993). La cotransfección de Bak con \beta-gal redujo en gran medida el número de células azules (Figura 1), indicando que a Bak no le hace falta el p53 de tipo salvaje para ejercer su función eliminadora celular. De modo similar, los experimentos de transfección transitoria realizados en las progenies celulares Hela (carcinoma cervical) y BT549 (carcinoma de mama) demostraron que Bak puede eliminar a las células tumorales humanas en este contexto (Figura 1), indicando que su actividad no se limita a los fibroblastos de los roedores.

ii. Identificación de los dominios de Bak que son necesarios para la función eliminadora celular

Se emprendió un análisis mutacional de Bak para identificar regiones de la molécula que son necesarias y suficientes para inducir la apoptosis. Se introdujeron una serie de mutaciones de deleción que se extendían por la totalidad de la proteína Bak, mediante mutagénesis PCR, ensayándose cada mutante respecto a la actividad celular eliminadora en un ensayo de transfección transitoria en células Rat-1. Este análisis reveló que gran parte de la molécula de Bak no es necesaria para la función eliminadora celular detectada mediante este ensayo (Figura 2). Sorprendentemente, las regiones que no son esenciales de la proteína Bak incluyen los dos dominios en la mitad terminal carboxílica de la proteína que muestra el grado más alto de homología con otros miembros de la familia Bcl-2 (dominios I y II de homología de Bcl-2).

La deleción del tramo hidrofóbico carboxi-terminal de los aminoácidos (residuos 191-211) disminuyó parcialmente, pero no eliminó, la función eliminadora celular de Bak (mutante \DeltaC). Esta "cola" hidrofóbica sirve probablemente como una secuencia de anclaje membranoso en Bak. En verdad, los estudios de inmunofluorescencia de \DeltaC en las células COS transfectadas transitoriamente mostraron que la distribución intracelular del mutante \DeltaC estaba alterada (citoplásmica difusa) respecto al tipo salvaje Bak, que aparece ampliamente mitocondrial. La cola hidrofóbica terminal carboxilo no es necesaria para la función eliminadora celular de Bak, pero puede contribuir indirectamente, asegurando la apropiada localización subcelular de la proteína.

Un segmento de la proteína Bak abarcado por la deleción \DeltaGD (residuos 82-94) es necesario absolutamente para la función eliminadora celular, ya que este mutante está desprovisto de actividad eliminadora celular en el ensayo de transfección transitoria. Específicamente, la cotransfección de \beta-gal con Bak \DeltaGD produjo muchas, o más, células azules que la cotransfección de \beta-gal con el plásmido vector de control. La deleción de residuos colindantes (aminoácidos 67-81) inmediatamente N-terminales a este dominio, redujo, pero no eliminó, la actividad eliminadora celular (mutante Bak \DeltaPS). Todos los otros mutantes de deleción que se ensayaron (con excepción de \DeltaC, anteriormente considerado) no se vieron alterados en su capacidad deliminadora celular. Tomados en conjunto, estos resultados indican que se requiere únicamente un segmento co-lineal (denominado el "dominio GD") definido por los mutantes de deleción \DeltaGD y \DeltaPS (residuos 67-94) para la función eliminadora de Bak detectada en el ensayo transitorio.

Para determinar si el dominio GD es suficiente para la función eliminadora celular, se ensayaron, respecto a la actividad en el ensayo de transfección transitorio, dos derivados proteicos Bak truncados, PEM y QVG, que corresponden a los aminoácidos 58-103 y 73-123, respectivamente. QVG redujo significativamente el número de células azules cuando se cotransfectó con \beta-gal, indicando que algo de la capacidad para eliminar las células Rat-1 se conserva. Mientras que la reducción en el número de células azules se redujo respecto al Bak completo (de longitud total), tanto a PEM como a QVG les faltaba el anclaje carboxi-terminal de la membrana y, análogamente al mutante \DeltaC de Bak, no mostrarían una función eliminadora celular total, debido a una localización subcelular alterada. Verdaderamente, QVG fue similar la mutante \DeltaC Bak con respecto a su actividad. Haciendo un esfuerzo para mejorar la capacidad eliminadora celular de los tipos truncados de Bak, el elemento hidrofóbico de la cola (aminoácidos 187-211) se fusionó con el extremo C de PEM y QVG (PEM+C y QVG+C, respectivamente). En cada caso, la unión del anclaje putativo a la membrana mejoró la capacidad de los mutantes Bak truncados para eliminar las células azules en el ensayo de transfección, y dio lugar a una actividad comparable a Bak de tipo salvaje (Figura 2). Así, estos resultados indican que un dominio proteico compartido por PEM y QVG (residuos 73-103) es suficiente para la función eliminadora celular de Bak.

iii. Identificación de los dominios de Bak que median la interacción con Bcl-x_{L}

La interacción física con otros miembros de la familia Bcl-2, tales como Bcl-x_{L} puede ser esencial para que Bak ejerza su función eliminadora celular, o puede regular la actividad de Bak. Por tanto, los dominios con Bak se examinaron para determinar los que son necesarios y/o suficientes para su actividad de unión con Bcl-x_{L}. La interacción de Bak con Bcl-x_{L} se midió tanto mediante un ensayo in vitro de unión proteica como mediante coinmunoprecipitación a partir de células transfectadas. Bak marcado con ^{35}S traducido in vitro se une a una proteína de fusión GST- Bcl-x_{L} expresada bacterialmente y purificada, y la especificidad de esta interacción in vitro se demostró por el fallo de Bak para unirse sólo a la GST purificada (figura 3A). Una interacción específica Bak/ Bcl-x_{L} podría detectarse también cotransfectando formas epitópicas marcadas de Bak y Bcl-x_{L} en células COS. Bak se inmunoprecipitó a partir de lisados de células transfectadas y la Bcl-x_{L} asociada se detectó mediante análisis de transferencia Western de proteínas co-precipitadas (Figura 3B). Bcl-x_{L} no se detectó en inmunoprecipitados en ausencia de Bak coexpresada, demostrando que la unión es específica.

Los mutantes de deleción de Bak descritos anteriormente se ensayaron respecto a su capacidad de unión a Bcl-x_{L}, tanto in vitro como en las células COS transfectadas, sumarizándose los resultados en la Figura 4. La deleción de los residuos 82-94 (mutante \DeltaGD) eliminó completamente la capacidad de Bak para interaccionar con Bcl-x_{L}. La interacción con Bcl-x disminuyó asimismo por deleción de los aminoácidos colindantes 67-81 (mutante Bak \DeltaPS).

Todos los demás mutantes de deleción que se ensayaron, que comprendían el marco abierto de lectura entero, conservaban la capacidad para unirse al Bcl-x en estos ensayos. Estos resultados identifican las secuencias Bak abarcadas por los mutantes \DeltaGD y \DeltaPS (de manera máxima, los aminoácidos 67-94) como los únicos importantes en mediar la interacción con Bcl-x_{L}. La misma región de BaK, el dominio GD, fue necesaria para la función eliminadora celular de Bak.

Para determinar si la región Bak definida mediante análisis de deleción es suficiente para la función de unión proteica, dos tipos truncados de Bak (PEM y QVG), comprendiendo los aminoácidos 58-103 y 73-123 respectivamente, se ensayaron respecto a su capacidad para interaccionar con Bcl-x_{L}. Tanto PEM como QVG se unieron a Bcl-x_{L}, indicando que la región compartida por estos dos tipos truncados de Bak (aminoácidos 73-103) eran suficientes para mediar la interacción con Bcl-x_{L}. Junto con el análisis de los mutantes de deleción y de los tipos truncados que se han descrito anteriormente, estos resultados demuestran que las secuencias aminoácidas de Bak que se extienden a través de los residuos 73-103 son ambas necesarias y suficientes para la interacción con Bcl-x_{L}. Tal como se ha descrito anteriormente, esta región está implicada asimimo en la función eliminadora celular de Bak, indicando que la función de unión proteica puede relacionarse con la función de eliminación celular.

iv. Elementos secuenciales funcionalmente significativos que se parecen al dominio GD se encuentran en Bax y Bip1a

El análisis mutacional de Bak que se describe en la presente memoria, demuestra que el dominio GD está implicado únicamente en la eliminación celular y en las actividades de unión a Bcl-x_{L} de Bak. Las otras dos proteínas interaccionantes Bcl-2, Bax y Bip1a, tienen propiedades funcionales que se parecen a las de Bak. Tanto Bax como Bip1a eliminan las células azules cuando son cotransfectadas con las células \beta-gal y Rat-1, indicando que también inducen apoptosis en este contexto. Bax y Bip1a interaccionan asimismo específicamente con Bcl-x_{L}, tanto in vitro como en las células COS transfectadas. Estas similitudes funcionales dieron lugar al examen de si cualquier característica estructural está compartida por las tres proteínas que contribuya a sus funciones biológicas similares. Específicamente, a la luz del análisis presentado anteriormente, se examinaron Bax y Bip1a para determinar si contienen secuencias que se parecen al dominio GD de Bak y son también importantes para sus actividades biológicas.

Bax muestra una extensa homología con los miembros de la familia Bcl-2 (incluyendo Bak), centrándose el grado más alto de homología alrededor de BH1 y BH2 (Oltvai et al. Cell 74:609-619 (1993). Un segmento de aminoácidos (59-73) N-terminales a BH1 en Bax lleva la homología a secuencias (residuos 74-88) en el interior del dominio GD de Bak (Figura 5). Al contrario que en Bax, la secuencia primaria de Bip1a no se parece a los parientes conocidos de Bcl-2, y le faltan las secuencias homólogas a BH1 y BH2 que son características de la familia Bcl-2. Sin embargo, Bipla contiene una región (aminoácidos 57-71) que es homóloga para el mismo elemento en el interior del dominio GD en Bak y Bax (Figura 5).

Los elementos del dominio GD en el interior de Bax y Bip1a se evaluaron para determinar si eran críticos asimismo para la eliminación celular y para las funciones de unión proteica de estas proteínas. Pequeñas deleciones que eliminaron los motivos del dominio GD conservado se introdujeron en Bax y Bip1a, analizándose entonces los mutantes respecto a su capacidad para eliminar las células Rat-1 y la unión a Bcl-x_{L}. Este análisis reveló que, como Bak \DeltaGD, los mutantes Bax\DeltaGD y Bip1a \DeltaGD se ven privados de su capacidad para eliminar las células azules cuando son cotransfectados con \beta-gal en las células Rat-1 (Figura 6). Además, ambos mutantes ya no tienen la capacidad para interaccionar con Bcl-x_{L} (Figura 6). De este modo, la función del elemento del dominio GD se conserva en Bak, Bax y Bip1a, y es crítico para las actividades biológicas de la totalidad de las tres proteínas.

v. El dominio GD es suficiente para la formación de homo y héterodímeros

Para evaluar si el dominio GD media otras interacciones proteína/proteína que podrían ser importantes para su actividad biológica, una parte de Bak (PEM), que comprende el dominio GD (residuos 58-103), se fusionó con GST, para crear GST-PEM. Bcl-x_{L}, Bak, Bax y Bip1a marcados con ^{35}S traducidos in vitro se incubaron con sólo GST. o con la proteína de fusión GST-PEM expresada bacterialmente. Las interacciones del dominio GD con Bak y Bax se midieron esencialmente tal como se describe en la presente memoria para la unión de Bak a Bcl-x_{L}. Los complejos se capturaron con perlas de glutatión-agarosa, se lavaron, y las proteínas unidas se detectaron mediante electroforesis en gel poliacrilamida y autoradiografía.

Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 6. Bcl-x_{L}, Bak y Bax interaccionaron todos específicamente con GST-PEM, pero no con sólo GST. Estos resultados demuestran que el dominio Bak GD es suficiente para unir a Bak (homodimerización), Bax (heterodimerización con una proteína eliminadora distinta) o Bcl-x_{L} (heterodimerización con una proteína superviviente). Así, el dominio GD es capaz de mediar interacciones no sólo con Bcl-x_{L}, sino asimismo con Bak y Bax.

No interacciona con Bip1a.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: INMUNOGEN, INC.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos péptidos y composiciones que modulan la apoptosis

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 34

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DIRECCIÓN: Hale and Dorr

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(B)

CALLE: 1455 Pennsylvania Avenue, N.W.

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(C)

CIUDAD: Washington

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(D)

ESTADO: D.C.

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(F)

CP: 20004

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(v)

MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0., versión # 1.25

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PARA SER ASIGNADO

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: ADJUNTO

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/440,391

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 12 MAYO 1995

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

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(A)

NOMBRE: WIXON, HENRY N.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32,073

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(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: 104322.147 PCT

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 202-942-8400

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 202-942-8484

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

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(B)

TIPO: ácido nucléico

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 1:

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\sa{Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg Tyr Asp Ser Glu Phe Gln}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Ser Ser Thr Met Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly}

\sac{Asp Asp Ile Asn Arg Arg Tyr Asp Ser Glu Phe Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg}

\sac{Tyr Asp Ser Glu Phe Gln Thr Met Leu Gln His Leu Gln Pro Thr}

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(2)INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

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(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 4:

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\sa{Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

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(B)

TIPO: ácido nucléico

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 5:

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\sa{Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 26 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly}

\sac{Asp Glu Leu Asp Ser Asn Met Glu Leu Gln}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 7:

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\sa{Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 8:

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\sa{Ile Gly Asp Glu Met}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Asp Leu Ala Cys Ile Gly}

\sac{Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Pro Ala Asp Pro Glu Met Val Thr Leu Pro Leu Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys}

\sac{Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln}

\sac{Leu Ser Glu Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Pro Gln Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg}

\sac{Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn Met Glu Leu Gln Arg Met Ile Ala}

\sac{Ala Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gln Pro Ser Ser Thr Met Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile}

\sac{Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg Tyr Asp Ser Glu Phe Gln Thr Met}

\sac{Leu Gln His Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg}

\sac{Tyr Asp Ser Glu Phe Gln Thr Met Leu Gln His Leu Gln Pro Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Ser Ser Thr Met Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly}

\sac{Asp Asp Ile Asn Arg Arg Tyr Asp Ser Glu Phe Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGGACGGC AGCTCGCCAT CATCGGGGAC GACATCAACC GACGC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg}

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGACGACA TCAACCGACG CTATGACTCA GAGTTCCAG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg Tyr Asp Ser Glu Phe Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 78 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lts Arg Ile Gly}

\sac{Asp Glu Leu Asp Ser Asn Met Glu Leu Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGAGCGAGT GTCTCAAGCG CATCGGGGAC GAACTGGACA GTAAC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCAAGCGCA TCGGGGACGA ACTGGAC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 29:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly}

\sac{Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGCCCTGC GGCTGGCCTG CATCGGGGAC GAGATGGACG TGAGC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGGGGACG AGATG

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Gly Asp Glu Met}

Claims (22)

1. Péptido aislado constituido por una proteína truncada seleccionada de entre el grupo constituido por Bak, Bax y Bip1a o sus mutantes, caracterizado porque el péptido comprende el dominio GD y muestra actividad de eliminación celular y unión de Bcl-x_{L}; siendo el dominio GD de Bak QLAIIGDDIN, siendo el dominio GD de Bax, CLKRIG
DELD, y siendo el dominio GD de Bip1a RLACIGDEMD.

2. Péptido aislado y purificado que presenta una secuencia aminoácida seleccionada de entre el grupo constituido por

GDDINRRYDSEFQ (SEC ID nº: 1)

PSSTMGQVGRQLAIIGDDINRRYDSEFQ (SEC ID nº: 2)

QVGRQLAIIGDDINRRYDSEFQTMLQHLQPT (SEC ID nº 3)

LSECLKRIGDELDSN [SEC ID nº: 4]

LKRIGDELD [SEC ID nº: 5]

QDASTKKLSECLKRIGDELDSNMELQ [SEC ID nº: 6]

LALRLACIGDEMDVS [SEC ID nº: 7]

IGDEM [SEC ID nº: 8]

CMEGSDALALRLACIGDEMDVSLRAPRL [SEC ID nº: 9] y

VGRQLAIIGDDINRR [SEC ID nº: 10]

3. Polinucleótido aislado constituido por una secuencia nucleótida que codifica un péptido según la reivindicación 1 ó 2, o su secuencia nucleótida complementaria.

4. Polinucléotido según la reivindicación 3, que presenta una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 31 o SEC ID nº: 33.

5. Molécula aislada de ADN recombinante constituida esencialmente por una secuencia nucleótida según la reivindicación 3 ó 4.

6. Vector constituido esencialmente por una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 5.

7. Vector que comprende una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 5, en el que dicho vector expresa un ARN antisentido.

8. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 6 ó 7, en la que opcionalmente dicha célula huésped es una célula de mamífero.

9. Procedimiento para producir el péptido aislado según la reivindicación 1 ó 2, que comprende las etapas siguientes:

a)

construir un vector según la reivindicación 6;

b)

transformar una célula huésped apropiada con el vector de la etapa (a);

c)

cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión del péptido mediante la célula huésped; y

d)

aislar el péptido expresado por la célula huésped de la etapa (c);

en el que se produce el péptido aislado, en el que opcionalmente la célula huésped es una célula de mamífero.

10. Anticuerpo producido contra un péptido según la reivindicación 1 ó 2, en el que preferentemente el anticuerpo es seleccionado de entre el grupo constituido por un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal.

11. Anticuerpo según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo es marcado de manera detectable, en el que preferentemente el marcador detectable es seleccionado de entre el grupo constituido por: un radiomarcador, un marcador enzimático, un marcador cofactor, un marcador fluorescente, un marcador paramagnético, un marcador quimioluminiscente, y un marcador metálico.

12. Sonda nucleótida marcada de manera detectable, que comprende una primera secuencia nucleótida que es sustancialmente complementaria a una segunda secuencia nucleótida que codifica un péptido según la reivindicación 1 ó 2.

13. Composición farmacéutica que comprende un péptido según la reivindicación 1 ó 2 y un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Procedimiento para identificar un agente capaz de modular la heterodimerización mediada por el dominio GD, que comprende las etapas siguientes:

llevar a cabo un ensayo de heterodimerización que incluye una primera y una segunda proteína o polipéptido, en el que el dominio GD se caracteriza por cualquiera de las secuencias SEC ID nº: 2, 4, 6, 7, 9 y 10, y en el que dichas primera y segunda proteína o polipéptido son diferentes, y un agente;

determinar si dicho agente inhibe o aumenta la heterodimerización de dicha primera proteína o polipéptido a dicha segunda proteína o polipéptido;

en el que si la inhibición o el aumento de la heterodimerización está determinada, indica que dicho agente es capaz de modular la heterodimerización mediada por el dominio GD.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicha segunda proteína o polipéptido es seleccionado de entre el grupo constituido por Bak, Bcl-x_{L}, Bax y Bip1a.

16. Procedimiento para identificar un agente capaz de modular la homodimerización mediada por el dominio GD, que comprende las etapas siguientes:

llevar a cabo un ensayo de homodimerización que incluye una primera y una segunda proteína o polipéptido, en el que el dominio GD se caracteriza por cualquiera de las secuencias SEC ID nº: 2, 4, 6, 7, 9 y 10, y en el que dichas primera y segunda proteína o polipéptido son los mismos, y un agente;

determinar si dicho agente inhibe o aumenta la homodimerización de dicha primera proteína o polipéptido para dicha segunda proteína o polipéptido;

en el que, si la inhibición o el aumento de la homodimerización está determinada, indica que dicho agente es capaz de modular la homodimerización mediada por el dominio GD.

17. Agente seleccionado de entre los péptidos del dominio GD, e imitadores, fragmentos, equivalentes funcionales y/o híbridos o mutantes de los mismos, así como de los vectores que contienen cADN que codifica cualquiera de los anteriores, identificado mediante el procedimiento según la reivindicación 14 o la reivindicación 16, para la utilización terapéutica en los trastornos degenerativos, cuando se administra solo o en combinación con y/o a la vez que, otros medicamentos apropiados.

18. Utilización de un anticuerpo contra un péptido del dominio GD, seleccionado de entre la SEC ID nº: 1 a 10, para rastrear una biblioteca de expresión del cADN o los clones que comprenden inserciones de ADN que codifican proteínas de reacción cruzada inmunológica.

19. Agente según la reivindicación 17, que comprende una molécula capaz de unirse a una proteína antiapoptósica seleccionada de entre el grupo constituido por Bcl-2 y Bcl-x_{L}, en el que la unión induce o modula el estado apoptósico de una célula.

20. Péptido que comprende el dominio GD seleccionado de entre el grupo constituido por SEC ID nº 3, aminoácidos 58 a 103 y aminoácidos 73 a 123 de Bak, equivalente de manera sustancial al del Bak de tipo salvaje.

21. Péptido según la reivindicación 1, la reivindicación 2 o la reivindicación 20 para su utilización como medicamento.

22. Utilización de un péptido según la reivindicación 1, la reivindicación 2 ó la reivindicación 20, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de los trastornos degenerativos caracterizados por una división celular inapropiada o una muerte celular inapropiada.