JPH11506907A - アポトーシスを変調する新規ペプチドおよび組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞中のアポトーシスを変調することができる新規ペプチドおよび組成物、並びに本発明の新規ペプチドおよび組成物を用いたアポトーシス変調方法に向けられる。一つの側面において、本発明は、BakのBcl-x_Lとの相互作用、およびBcl-x_Lの細胞殺傷活性の両者に必須の「GDドメイン」と称する新規ペプチドに向けられる。GDドメイン機能のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法が提供される。GDドメインは複数の細胞死制御分子の作用に重要な鍵となる蛋白質／蛋白質相互作用を変調するのに必要である。

Description

【発明の詳細な説明】 アポトーシスを変調する新規ペプチドおよび組成物 発明の属する分野 本発明は、一般的には細胞生理学の分野に関し、より特定すれば、プログラム された細胞死またはアポトーシスに関する。本発明の新規ペプチドおよび組成物 は、細胞内のアポトーシスを変調するのに有用である。 発明の背景 プログラムされた細胞死またはアポトーシスの現象は、免疫および神経系の成 熟を含む広い範囲の発生過程の正常な進行に包含され且つ重要であることが知ら れている。アポトーシスは、高い細胞代謝回転速度を有する成人組織においても 投割を演じる（Ellis，R．E.，et al.，Annu．Rev．Cell．Biol．７：663-698（ 1991）；Oppenheim，R．W.，Annu．Rev．Neurosci．14：453-501（1991）；Cohe n，J．J.，et al.，Annu．Rev．Immunol．10：267-293（1992）；Raff，M．C.， Nature 356：397-400（1992））。多くの異なる生理シグナルがこれらに関連し てプログラムされた細胞死を正常に活性化するが、非生理傷害、例えば、照射お よびＤＮＡを損傷する薬剤への暴露も、アポトーシスの引き金となりうる（East man，A.，Cancer Cells ２：275-280（1990）；Dive，C.，et al.，Br．J．Canc er 64：192-196（1991）；Lennon，S．V.，et al.，Cell Prolif．24：203-214 （1991））。 発生におけるその役割に加え、アポトーシスは腫瘍形成に対する重大な細胞セ ーフガードとしての意味を包含されてきた（Wikkiams，G．T.，Cell 65：1097-1 098（1991）；Lane，D．P.，Nature 362：786-787（1993））。特定の条件下で 、細胞は高レベルまたは脱制御されたガン遺伝子の発現に応答してアポトーシス により死ぬ（Askew，D.，et al.，Oncogene ６：1915-1922（1991）；Evans，G ．I.，et al.，Cell 69：119-128（1992）；Rao，L.，et al.，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 89：7742-7746（1992）；Smeyne，R．J.，et al.，Nature 363：16 6-169（1993）；Tanaka，S.，et al.，Cell 77：829-839（1994）；Wu，X.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91：3602-3606（1994））。様々な遺伝障害 による アポトーシスプログラムの抑圧は悪性腫瘍の発生並びに進行に寄与するらしい。 これは、ヒト腫瘍中のp53腫瘍抑圧遺伝子の頻繁な変異により例示される（Levin e，A．J.，et el.，Nature 351：453-456（1991））。野生型p53は、DNAの損傷 によるアポトーシスの十分な誘導に必要であり（Clarke，A．R.，et al.，Natur e 362：849-852（1993）；Lowe，S．W.，et al.，Cell 74；957-967（1993）） 、そして特定のガン遺伝子の構成的発現により誘導される細胞死に必要である（ Debbas，M.，et al.，Genes & Dev．７：546-554（1993）；Hermeking，H.，et al.，Science 265：2091-2093（1994）；Tanaka，S.，et al.，Cell 77：829-83 9（1994）；Wu，X.，et al.，Natl．Acad．Sci．USA 91：3602-3606（1994）） 。多くの共通に使用される化学治療剤の細胞毒性は、野生型p53により介在され る（Lowe，S．W.，et al.，Cell 74：957-967（1993）；Fisher，D．E.，Cell 7 8：539-542（1994））。即ち、p53の機能の喪失は、化学療法の養生法後に現れ る薬剤耐性腫瘍細胞の臨床上重要な問題に貢献するかもしれない。 bcl-2ガン遺伝子の発現産物はアポトーシスによる細胞死の潜在的サプレッサ ーとして機能する（McDonnell，T．J.，et al.，Cell 57：79-88（1989）；Hock enbery，D.，et al.，Nature 348：334-336（1990））。構成的なBcl-2の発現は 、成長因子の回収（withdrawal）、ガン遺伝子の発現、DNAの損傷、および酸化 ストレスを含む逆の刺激（diverse stimuli）により引き金となるアポトーシス を抑圧できる（Vaux，D．L.，et al.，Nature 335：440-442（1988）；Sentman ，C.L.，et al.，Cell 67：879-888（1991）；Strasser，C．L.，Cell 67：889- 899（1991）；Fanidi，A.，et al.，Nature 359：554-556（1992）；Hockenbery ，D.M.，et al.，Cell 75：241-251（1993））。種を越えたBcl-2機能の保存も ある。例えば、線虫Ｃ．エレガンスのced-9遺伝子はbcl-2の構造並びに機能上の 相同物であるらしく（Hengartner，N．O.，et al.，Cell 76：665-676（1994） ）、そしてbcl-2はトランスジェニック動物中においてced-9変異を相補すること ができる（Vaux，D．L.，et al.，Science 258：1955-1957（1991））。これら の観察は、bcl-2が進化において保存された細胞死のプログラムと密接に関連し ていることを示唆する。 bcl-2は、少なくともその幾つかがアポトーシスも変調する関連遺伝子ファミ リーのメンバーであることは知られている。そのうち、bcl-xはbcl-2に高度に相 同性を示し、そして別々にスプライスされて、bcl-x_Lと呼ばれる長い形態、およ び内部欠失を含むbcl-x_sと呼ばれる短い形態を生じる（Boise，L．H.，et al.， Cell 74：597-608（1993））。bcl-x_Lはアポトーシスを抑圧するように機能する が、欠失形態のbcl-x_sはbcl-2の抑圧により提供される細胞死に対する防御を阻 害し（Oltvai，Z．N.，et al.，Cell 74：609-619（1993））、そしてbcl-2を妨 害し-Cアポトーシスを加速させることが示された。bcl-2の変異分析は、Bcl-2が 細胞死の阻害物質として機能するためには、Baxとの相互作用が必要であること を示唆する（Yin，X．-M，et al.，Nature 369：321-323（1994））。 bakと呼ばれるbcl-2関連の遺伝子の単離および特徴は、1994年８月９日に出願 された米国出願番号08/287,427の一部継続出願である1994年10月11日出願の係属 中の米国出願番号08/321,071に記載されており（bakはbcl-yと呼ばれている）、 その開示は引用により本明細書の一部をなす。異所性Bakの発現はサイトカイン の回収に際してIL-3依存性細胞系の死を加速して、Bcl-2により付与されるアポ トーソスに対する防御に対抗する。さらに、強いられたBakの発現は血清を剥奪 された繊維芽細胞のアポトーシスを誘導するのに十分であり、Bakが直接細胞死 の機構を活性化するかまたはそれ自体が該機構の成分となる。 分析された公知の細胞Bcl-2関連遺伝子は異なる発現パターンを有するため、 異なる組織において機能するかもしれない。Bcl-2の発現は成熟免疫系の維持に 必要であるらしいが、他の系列におけるアポトーシス細胞死を支配するかもしれ ない他の遺伝子を同定することが望まれる。さらに、そのような遺伝子によりコ ードされる蛋白質の特定の領域またはドメインの同定は、それらの構造および機 能上の特徴の理解の基礎となり、そして貴重な診断および治療の開発を可能にす る。例えば、腫瘍細胞中でアポトーシスを復帰させるかまたは誘導することがで きる薬剤の同定は（p53腫瘍サプレッサー遺伝子機能の損失は腫瘍形成および臨 床上重要な薬剤耐性により包含されるかもしれない場合）、特にそのような復帰 または誘導がp53の機能に依存しなかった場合に、重要な治療上の有用性がある 。 同様に、例えばbcl-2等のガン遺伝子の抗−アポトーシス機能を妨害することが できる薬剤であってその活性が腫瘍形成および臨床上重要な薬剤耐性により包含 される薬剤の開発は、潜在的に大きな有用性がある。 発明の概要 本発明は、複数の細胞死制御分子の作用に対して一般的に重要な新規蛋白質ド メインに向けられており、Bak分子の特定の部分の小さなサブ配列に対して同定 されてマップされた。本発明者らが「GDドメイン」と名付けた、これまでに認識 されていなかったこの蛋白質ドメインは、BakのBcl-x_Lとの相互作用並びにBakの 細胞殺傷機能の両方に必須である。GDドメインを含むように削除されたBak種は それら自体、トランスフェクションアッセイにおいて、Bcl-x_Lに結合し、且つ細 胞を殺傷するのに十分である。 GDドメインはアポトーシスを誘導する機能を持つ２つの他のBcl-2結合蛋白質 ：BaxおよびBiplaにおいて同定された。Bakに関して、BaxおよびBipla中の相同 なGDドメイン要素の変異は、細胞殺傷機能および蛋白質希有号機能を低下させる 。即ち、GDドメインは、複数の細胞死制御分子の作用に対して重要な鍵となる蛋 白質／蛋白質相互作用を仲介するのに必須である。 一つの側面において、次に、本発明は、細胞のアポトーシス状態を誘導または 変調するのに有用な、GDドメインを含む精製されて単離されたペプチド、および その構造および／または機能を模倣する分子に向けられる。GDドメインの機能を 破壊する化学化合物は、アポトーシス変調薬剤としての有用性を有する。したが って、他の側面において、本発明はGDドメイン機能を破壊することができる薬剤 に向けられる。そのような薬剤は限定されないが、GDドメインに結合する分子、 GDドメインと他の蛋白質の間の相互作用を干渉する分子、および幾つかの様式に おいて変更されたGDドメインを含む分子を包含する。本発明は、GDドメインの機 能を破壊することによりアポトーシスを変調する分子を同定する方法を提供し、 したがって付加的に意図された態様を含む。 さらなる側面において、本発明は、GDドメインを含むペプチドのクローニング 、調製および発現に包含される生成物および方法；GDドメインに特異性を有する 抗 体；およびGDドメインまたはその部分をコードするヌクレオチド配列に関する。 GDドメインを含むペプチドは、それらに対する抗体を生成するのに有用である。 そのような抗体は、例えば心臓組織、肺組織、腫瘍細胞、脳細胞、胎盤、肝臓、 骨格筋、腎臓、および膵臓を含むすべてのヒト組織からの細胞を含む生物検体中 のGDドメイン含有蛋白質を検出および単離するために有用であり、並びにそのよ うな生物検体中のGDドメイン含有蛋白質のアポトーシス活性の変調に有用であり 、本発明のさらなる側面を構成する。 さらなる側面において、本発明は、遺伝子配列を含む発現ベクター、そのよう な発現ベクターで形質転換された宿主、および本発明の組換えGDドメインペプチ ドの生成方法を提供する。 本発明はさらに、不適切な細胞増殖または不適切な細胞死により特徴付けられ る退化的疾患を罹患する個人の細胞および／または組織中のアポトーシスを、そ れぞれ誘導または抑圧する方法に向けられる。不適切な細胞増殖により特徴付け られる退化的疾患は、例えば、炎症性症状、リンパ腫、例えば前立腺増殖、遺伝 子型腫瘍等を含むガンを包含する。不適切な細胞死により特徴付けられる退化的 疾患は、例えば、自己免疫疾患、後天性免疫不全症候群（AIDS）、放射線照射治 療または化学療法による細胞死、神経退化的疾患、例えばアルツハイマー病およ びパーキンソン病等を含む。 本発明は、GDドメインペプチドの存在を検出するための方法、並びに退化的疾 患の診断に対する方法にも関し、該疾患はGDドメインを含む蛋白質の発現の上昇 レベルまたは低下レベルに関連し、正常細胞集団中のそのような蛋白質の期待さ れた発現レベルと比較される。 本発明は、GDドメインを含むペプチドの治療用途に関する。 本発明は、不適切な細胞増殖を安定化させる（即ち、アポトーシスを誘導する ）か、または不適切な細胞死を安定化させる（即ち、アポトーシスを抑圧する） ため、および／またはいずれかの場合に正常細胞の挙動を復帰させるために、そ れぞれ不適切な細胞増殖または不適切な細胞死により特徴付けられる退化的疾患 を罹患する個人に対して、GDドメインペプチドまたはその変異物を含むペプチド を 投与することからなる、細胞のアポトーシス状態を変調する方法にも関する。 他の側面において、本発明は、BakのGDドメインが、Bakのホモダイマー形成お よびヘテロダイマー形成に関与し、且つそれらの形成に十分足りるとの驚くべき 発見に関する。BakのGDドメインのダイマー形成の非限定例は、Bak（ホモダイマ ー形成）、Bax（異なるキラー蛋白質とのヘテロダイマー形成）およびBcl-x_L（ 生存蛋白質とのヘテロダイマー形成）を含む。さらに、この側面におけるBak蛋 白質の非必須領域は、他のBcl-2ファミリーのメンバーに高度な相同性を示す該 蛋白質中のカルボキシル末端半分中の２つのドメイン（Bcl-2相同ドメインＩお よびII）を含む。即ち、GDドメインを含むペプチドは、Bcl-x_LのみならずBakお よびBaxとの相互作用も仲介することができる。 本発明のこれらおよび他の対象および側面は、以下の記載から当業者には明ら かとなろう。 図面の説明 図１．異なる細胞系におけるBakの細胞殺傷機能 示された細胞系を、対照プラスミド（ベクター）またはHA-エピトープ付加Bak （HA-Bak）発現プラスミドの何れかと混合してβ−ガラクトシダーゼマーカープ ラスミドと共にトランスフェクトした。細胞を固定して、X-galでトランスフェ ション後24時間染色し、そして青い細胞（β-ガラクトシダーゼ陽性）の数を顕 微鏡試験により数えた。 図２．Bak欠失変異および末端削除種の細胞殺傷活性の要約 さまざまなBak変異体の構造を模式図で示す。欠失された正確なアミノ酸領域 は左の数字により示される。末端削除された種に残されたBakアミノ酸残基の終 点（底、QVGおよびPEN）は、それら各々の構造の模式図を縁取る数字により示さ れる。Rat-1細胞の殺傷活性は以下のとおりに要約される：＋は野生型Bakと均等 な細胞殺傷活性を示し；−は細胞殺傷活性なしを示し；＋／−は、野生型Bakに 比して細胞殺傷活性が減じられたことを示し、そしてｎｄは実験を行わなかった ことを示す。 図３．BakとBcl-x_Lとの相互作用 Ａ）．Bak／Bcl-x_L相互作用をインビトロにおいて測定した。³⁵Ｓ標識されたイ ンビトロ翻訳Bak（レーン１）を、GST-Bcl-x_L（レーン２）またはGST（レーン３ ）の何れかと混合した。複合体をグルタチオン−アガロースビーズ上で回収して 、結合した³⁵Ｓ標識Bak蛋白質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオー トラジオグラフィーで検出した。 Ｂ）．Bak／Bcl-x_L相互作用を、トランスフェクトされた細胞中において検出し た。エピトープを付加された形態のBakおよびBcl-x_Lを発現するプラスミド（HA- Bakおよび旗付加（flag-tagged）Bcl-x_L）を、COS細胞に対して共にトランスフ ェクトした。HA-Bakはトランスフェクトされた細胞溶解物から免疫沈殿して（抗 HA IP）、関連したBcl-x_Lは抗旗付加抗体を用いたウエスタンブロット分析によ り検出した。 図４．Bak欠失および末端削除種のBcl-x_L結合機能の要約 さまざまなBak変異体の構造を図２に記載されたように模式図で示す。Bak変異 体および末端削除された種がBcl-x_Lと相互作用する能力を以下に示す：＋はイン ビトロおよびトランスフェクトされたCOS細胞中の両方においてBcl-x_Lとの相互 作用能力が野生型Bakと均等であることを示し；−はBcl-x_Lとの相互作用が検出 されなかったことを示し；−／＋は野生型Bakに比して大いに減じられた、イン ビトロのみにおいて検出可能であった相互作用を示す。 図５．BiplaおよびBax中に存在するBakのGDドメインとの相同領域 上部．GDドメイン相同部位（白ボックス）、疎水性セグメント（斜線ボックス ）およびBcl-2相同ドメイン（黒ボックス）による蛋白質の模式構造。 下部．BakのGDドメインに相同のBiplaおよびBax中の領域のアミノ酸配列。強 調された残基は蛋白質の少なくとも２つにおいて同一であり；陰の残基は保存的 なアミノ酸変化を示す。示されたBipla、BakおよびBax欠失変異体中において除 去されたアミノ酸領域も示される（直線）。 図６．GDドメイン欠失変異体の細胞殺傷活性およびBcl-x_Lの要約 細胞殺傷機能およびBcl-x_L結合機能に関するデータは、それぞれ図２および図 ４に示す。 図7．Bak GDドメインのダイマー形成 BakのGDドメインとBakおよびBaxとの相互作用は、本質的にはBakのBcl-x_Lへの 結合に関して記載されたとおりに測定した。GDドメインを包含するBak（PEM）の 部分（残基58-103）をGSTと融合させてGST-PENを作成した。インビトロ翻訳され た³⁵Ｓ標識Bcl-x_L、Bak、BaxおよびBiplaは、GSTのみまたはGST-PENをバクテリ アで発現させた融合蛋白質の何れかとインキュベートした。複合体をグルタチオ ンーアガロースビーズで回収して、洗浄して、そして結合蛋白質をポリアクリル アミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーで検出した。Bcl-x_L、Bak、 およびBaxはすべてGST-PEMと相互作用したがGSTのみとは相互作用しなかった。 即ち、GDドメインはBcl-x_LのみならずBakおよびBaxとの相互作用も仲介すること ができる。 図８．Bak、BaxおよびBipla中のGDドメインをコードするDNA配列 Bak（１−４）、Bax（５−７）およびBipla（８−１０）のGD領域をコードす るDNA配列を、対応するアミノ酸配列と共に示す。各配列の上のヌクレオチド数 は各蛋白質の開始ATGからの開始に基づく。下線の数は、示されたペプチドの最 初と最後のアミノ酸の位置を意味する。 発明の詳細な説明 本明細書にて用いられる技術用語並びに科学用語は、特に定義される場合を除 いて、発明の属する分野の当業者により普通に理解される意味を有する。本明細 書にてなされる引用は、当業者に公知のさまざまな方法論についてなされる。引 用されるそのような公知の方法論を記載する刊行物および他の資料は、完全に記 載されているものとしてその全体を引用により本明細書に編入する。組換えＤＮ Ａ技術の一般的な原理を記載する標準的な文献の研究は、Sambrook，J.，et al. ，モリキュラークローニング（Molecular Cloning）：実験室マニュアル（A Lab oratory Manual），第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、プ レンビュー、ニューヨーク（1989）；McPherson，M．J.，編纂、特異的変異導入 （Directed Mutagenesis）：実践アプローチ（A Practical Approach）、IRLプ レス、オックスフォード（1991）；Jones，J.，アミノ酸とペプチドの合成（Ami no Aci d and Peptide Synthesis）、オックスフォード科学出版、オックスフォード（1 992）；Austen，B．M．and Westwood，O．M．R.，蛋白質標的および分泌（Prote in Targeting and Secretion）、IRL出版、オックスフォード（1991）である。 当業者に公知のあらゆる適切な資料および／または方法は、本発明を実施する際 に利用することができる。しかしながら、好ましい資料および／または方法を記 載する。以下の記載並びに実施例において引用される資料、試薬等は他に注釈が ある場合を除いて、商業上の源から得ることができる。 Bakの公知の生物活性に必要且つ十分であるあしいBak分子内の以前に認識され ていないドメインが、今、同定された。本明細書において「GDドメイン」と呼ば れるこのドメインは、細胞殺傷活性並びにBcl-x_Lとの物理的相互作用を仲介する のに十分である。BakのGDドメインと相同な配列はBaxおよびBipla内にも同定さ れて、これらの蛋白質の細胞殺傷活性およびBcl-x_L結合活性に同様に必要である ことが示された。これらの観察は、Bak、BaxおよびBiplaが、各々の場合におい て各々のGDドメインを含む同様な機構を通して、アポトーシスを変調または制御 することを示唆する。本発明に精通した当業者には理解されるとおり、GDドメイ ンを含む配列は細胞内のアポトーシスを変調するのに有用である。同様に、GDド メインに結合することのできる化合物および組成物は、細胞内のアポトーシス活 性を変調する薬剤として有用である。 本明細書にて用いられるとおり、用語「GDドメイン」は最初にBak中の同定さ れた蛋白質ドメインであって、本明細書においては、BakのBcl-x_Lとの相互作用 並びにBakの細胞殺傷機能に必須であることが示されたドメインであり、且つそ の構造および／または機能を模倣することができるペプチドおよび／または分子 を意味する。好ましい態様において、本発明は、Bakのアミノ酸残基82-94に対応 する以下のアミノ酸配列： を有するペプチド並びにその均等物からなる。「機能均等物」の意味するところ は、GDドメインと実質的に同様な生物活性または免疫特性を有するペプチドを意 味し、そのような活性または特性を有する「断片」、「変更物（variants」）、 「類似物（analogs）」、「相同物（homologs）」、または「化学誘導体」を包 含することを意図する。次に、GDドメインの機能均等物は同一のアミノ酸配列を 共有しなくてよく、そして慣用的または非慣用的アミノ酸の保存的または非保存 的アミノ酸置換も可能である。 本明細書に言及される「保存的」アミノ酸置換は、同様な側鎖を有するアミノ 酸残基の内部変更可能性（Interchangeability）を意味することを意図する。例 えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは脂肪族側鎖 を有するアミノ酸群を形成し、セリンおよびスレオニンは脂肪族ヒドロキシル側 鎖を有するアミノ酸であり、アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有側鎖を 有するアミノ酸であり、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは芳 香族側鎖を有するアミノ酸であり、リジン、アルギニンおよびヒスチジンは塩基 性側鎖を有するアミノ酸であり、そしてシステインおよびメチオニンはイオウ含 有側鎖を有するアミノ酸である。同じ群の別のアミノ酸による与えられた１アミ ノ酸の内部置換は保存的置換と考えられるはずである。好ましい保存的置換群は 、アスパラギン−グルタミン、アラニン−バリン、リジン−アルギニン、フェニ ルアラニン−チロシンおよびバリン−ロイシン−イソロイシンである。 本発明の好ましい態様において、Bakのアミノ酸残基67-94に対応し、唯一Bak の細胞殺傷機能に必要な以下のアミノ酸配列： を有するペプチドが提供される。 他の好ましい態様において、Bakのアミノ酸残基73-103に対応し、唯一Bakの細 胞殺傷機能に十分な以下のアミノ酸配列： を有するペプチドが提供される。 示されるデータは、GDドメインおよびその機能均等物の生物活性がこれらの組 成物の細胞下の位置により影響されることを示す。したがって、本発明の他の好 ましい態様において、本発明のGDドメインペプチドはそれらのＣ末端を適切な疎 水性テイルに融合されるが、Bakのアミノ酸187-211を含んでよい。細胞下の局在 化のための他の適切な手段は、適当な疎水性テイルの選択を含み、Baxのアミノ 酸172-192、Bcl-x_Lのアミノ酸213-233、Bcl-2のアミノ酸220-240、および蛋白質 の脂質化、例えばプレニル化（prenylation）およびアシル化（acylation）（例 えばミリスチル化（myristylation）、パルミチル化（palmitylation））により 導入される疎水性テイルを含み、これらは公知の方法を用いて当業者により用い られるであろう。 本明細書に開示されるGDトメインは、唯一、Bakの細胞殺傷活性およびBcl-x_L 結合活性の両者に関与する。さらに、Bakの機能特性と類似の特性を有する他のB cl-2相互作用蛋白質は、本明細書において、BakのGDドメイン内の配列と相同性 を有する配列を有するアミノ酸領域を含むことが証明される。これらの蛋白質は 、Bakと同様にBcl-2に相互作用するBaxおよびBiplaを含み、両蛋白質はBakのGD ドメイン内の配列と相同性を有する配列を有するアミノ酸領域を含む。Baxにお いて、この領域はアミノ酸59-73を含み、BakのGDドメイン内のアミノ酸74-88と 相同性を有する。蛋白質Biplaも同様に、BakのGDドメイン内の同じ配列（アミノ 酸74-88）と相同性を有するアミノ酸57-71を含むアミノ酸領域を含む。上記のBa xおよびBiplaのGDドメイン領域の欠失は、それらの細胞殺傷活性を損ない、そし てBcl-x_Lへの結合を妨害した。BiplaはドメインＩおよびドメインIIと呼ぶ（文 献によっては「Bcl-2相同ドメイン」または「BHドメイン」ＩおよびIIまたは「B H1」または「BH2」と呼ばれる）、２つの高度に保存された領域に相同な配列を 欠く。これらの２つの保存された領域、および特にドメインＩはBcl-2、Baxおよ び他のBcl-2ファミリーのメンバー中のホモまたはヘテロダイマー形成の指令に おける手段となる。したがって、GDドメインは、Bak、BaxおよびBiplaのような 蛋白質の生物活性には関与するが必ずしもBcl-2ファミリーのメンバーと共有し ない重要な要素を構成し、その活性はBHのドメインＩおよびIIに非依存性である 。これは、GDドメインがBak、BaxおよびBiplaを含む異なる蛋白質ファミリーを 定義することを示唆する。 したがって、さらに好ましい態様において、Baxのアミノ酸59-73に対応する以 下のアミノ酸： を含むペプチドが提供される。他の好ましい態様において、Baxのアミノ酸63-71 に対応するアミノ酸配列： を含むペプチドが提供される。他の好ましい態様において、Baxのアミノ酸52-77 に対応するアミノ酸配列： を含むペプチドが提供される。他の好ましい態様において、Biplaのアミノ酸57- 71に対応するアミノ酸配列： を含むペプチドが提供される。他の好ましい態様において、Biplaのアミノ酸64- 68に対応する以下のアミノ酸配列： を含むペプチドが提供される。他の好ましい態様において、Biplaのアミノ酸50- 77に対応する以下のアミノ酸配列： を含むペプチドが提供される。他の好ましい態様において、Bakのアミノ酸74-88 に対応する以下のアミノ酸配列： を含むペプチドが提供される。 本発明の驚くべき側面は、GDドメインのみがBakのホモダイマー形成並びにBak のBaxおよびBcl-x_Lとのヘテロダイマー形成に十分であるとの発見、および高度 に保存されたBcl-2ファミリーのドメインＩおよびIIがこのダイマー形成に必要 ないとの発見である。これは、GDドメインが直接ダイマー形成を通してBak、Bax およびBcl-x_Lを含む蛋白質の機能を変調できること、およびGDドメインがBcl-2 を含む他の蛋白質の機能も変調できるかもしれないことを示す。 次に、GDドメインの機能上の重要性は、他のBcl-2ファミリーのメンバーまた は他の未だ同定されていない細胞蛋白質とのひとつまたは複数の蛋白質／蛋白質 相互作用を仲介するその能力に関係するらしい。Bcl-2およびBcl-x_Lのような生 存蛋白質は、それらのGDドメインを通して、Bak、BaxおよびBipla等の細胞死を 能動的に促進する蛋白質に結合して、該蛋白質を不活性化することによりアポト ーシスを抑圧することが可能である。この見解を支持することとして、Baxとの 相互作用は、Bcl-2によるアポトーシスの抑圧を必要とするらしい（Yin et al. ，Nature 369：321-323（1994））。第２の可能性は、Bak、BaxおよびBiplaが、 細胞生存を能動的に促進するBcl-2およびBcl-x_Lを含む蛋白質への結合（それら のGDドメインを通して）および不活性化により細胞死を誘導することである。Ba k、BaxおよびBiplaはひとつまたは複数の付加的な細胞蛋白質を結合すること、 およびこの相互作用が細胞死の機能を仲介することも可能である。本発明者は、 特定の理論に拘束されることを意図しない。しかしながら、その作用機構に拘わ らず、Bak、BaxおよびBipla中のGDドメインは、これらの蛋白質／蛋白質相互作 用を仲介するために特に重要である。 GDドメインが仲介する蛋白質／蛋白質相互作用を変調することができる薬剤は 、GDドメインを含むペプチド並びにGDドメインまたはGDドメインを含む蛋白質の 変異体を含んでよい。本明細書にて用いられる「変異体」は、天然のペプチドま たは蛋白質のアミノ酸配列とは少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列 を有するペプチドを意味する。変異体は天然のGDドメインペプチドまたは天然の 蛋白質と同じ生物活性および免疫活性を有してよい。しかしながら、変異体の生 物活性または免疫活性は異なっているかまたは欠いてもよい。例えば、GDドメイ ン変異体は、天然のGDドメインペプチドの特徴である生物活性を欠いてもよいが 、しかしGDドメインに対する抗体を作成するためまたはGDドメインに対する抗体 の検出または精製のための抗原として、あるいは天然のGDドメインペプチドの機 能のアゴニスト（競争的または非競争的）、アンタゴニストまたは部分アゴニス トとして有用かもしれない。 GDドメインが仲介する蛋白質／蛋白質相互作用の変調は、GDドメインペプチド のアゴニストまたはアンタゴニストによっても同じく影響されてよい。GDドメイ ンを含む蛋白質の機能のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための、ペ プチドライブラリー、化合物ライブラリーおよび他の情報のスクリーニングは、 GDドメイン結合、例えばGDドメインホモダイマー形成またはヘテロダイマー形成 を阻害または増大させる潜在的アゴニストまたはアンタゴニストの可能性の検出 アッセイにより達成される。 例えば、高処理スクリーニングアッセイを用いることにより、GDドメインの蛋 白質結合活性を変調する化合物を同定してよい。そのようなスクリーニングアッ セイは、GDドメインにより仲介される蛋白質／蛋白質相互作用に影響することに より、アポトーシスを加速するまたは阻害する化合物の同定を楽にする。例えば 、GST-Bcl-x_LとのBakのGDドメイン相互作用を破壊する化合物のインビトロスク リーンは、ひとつまたは複数の試験される化合物の存在下で標識されたGDドメイ ンペプチドプローブとインキュベートした、GST-Bcl-x_Lでコートされたマルチウ エルプレートを含む。該相互作用を特異的に破壊する分子は、原理上、GDドメイ ンの「リガンド」またはBcl-x_L中のいまだ定義されていない「リセプター」の何 れかに結合することができる。何れかのクラスの化合物はアポトーシス変調薬剤 の候補となるはずである。 即ち、本発明は、GST-Bcl-x_Lでマルチウエルプレートをコートし、そして試験 することが望まれる薬剤の存在下で標識されたGDドメインペプチドプローブと共 に該マルチウエルプレートをインキュベートすることからなる、アポトーシスを 変調可能な薬剤のスクリーニング方を提供するが、但し、GST-Bcl-x_LとのGDドメ イン相互作用の破壊は、該薬剤がアポトーシス変調できることを示す。この方法 により同定された薬剤も本発明の意図された態様である。 適切な標識は、検出可能な標識、例えば酵素、放射性アイソトープ、蛍光化合 物、化学発光化合物、または生物発光化合物を包含する。当業者であれば、他の 適切な標識を知るであろうし、日常の実験を用いてそれを確認するであろう。さ らに、これらの標識のペプチドへの結合は、当業界において公知の標準技術を用 いて達成される。 GDドメインに直接結合する薬剤の高速スクリーンは、固定化されたかまたは「 付加された」組み合わせライブラリーを用いてよい。そのようなライブラリーに 特 異的に結合する薬剤は、Bak/Bcl-x_L相互作用をブロックするそれらの能力に関し て試験される候補である。これまで論じられたとおり、そのような薬剤は、Bak （および／またはBax／Bipla）の機能を直接阻害するかまたは外来のBcl-2/Bcl- x_L（または他のBcl-2ファミリーのメンバー）の効果的な活性を増大させること の何れかにより、アポトーシスのサプレッサーとして機能するかもしれない。そ のような薬剤は、退化的疾患におけるかまたは虚血性損傷に続く異常なアポトー シスを抑圧するのに有用なはずである。 本発明のGDドメインペプチドに対する抗体を用いることにより、GDドメインフ ァミリーの蛋白質の便バーかもしれない構造上関連した免疫交差反応性蛋白質を コードするｃＤＮＡ挿入物を含むクローンを同定するためのｃＤＮＡ発現ライブ ラリーをスクリーンしてよい。ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ発現ライブラリーのスク リーニングは当業界において公知である。同様に、GDドメインペプチドに対する 抗体を用いることにより、このドメインに関連した免疫交差反応性蛋白質を同定 するかまたは精製するか、あるいは例えば患者から得られた組織または細胞、例 えばリンパ腫中の細胞または細胞集団中のGDドメイン含有蛋白質の量を検出また は測定する。そのような測定のための公知の方法は、細胞抽出物の免疫沈殿、続 くPAGE、免疫組織化学法、およびELISA法を含み、それらすべては当業界におい て公知である。 本発明によるアポトーシスの変調は、本明細書にて開示されるGDドメインを含 む蛋白質をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部に相補性の特定のア ンチセンスポリヌクレオチドを用いる方法を含む。そのような相補性のアンチセ ンスポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの付加、欠失、置換および転移を含んで よく、標的配列への特異的なハイブリダイゼーションの存続が提供される。GDド メインを含む蛋白質をコードするｍＲＮＡ種に特異的にハイブリダイズすること ができ、かつ該ｍＲＮＡ種の転写および／またはコードされたポリペプチドの翻 訳を阻害する可溶性アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドは、本 発明による相補アンチセンスポリヌクレオチドとして意図される。GDドメインを 含むペプチドの生成は本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドにより阻害さ れて、そのようなアンチセンスポリヌクレオチドはアポトーシス、老化等を阻害 し、および／または細胞の形質転換された表現型を逆転させるかもしれない。異 種発現カセットを用いることにより、トランスフェクタントまたはトランスジェ ニック細胞中でアンチセンスポリヌクレオチドを生成するかもしれない。アンチ センスポリヌクレオチドは、インビトロ細胞培地またはインビボの間質性（inte rstitial）流体（例えば、循環系を通して）のような標的細胞の外部環境に対す る可溶性オリゴヌクレオチドとして投与されてもよい。アンチセンスポリヌクレ オチドおよびそれらの使用法は当業者には知られており、例えば、Melton，D．A .，編纂、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、コールドスプリングハーバーラボ ラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1988）に記載され ている。 本発明により同定される薬剤の予測された生物活性は、Bak/Bcl-2機能の機構 に関して作成された仮説に依存して変化する。例えば、GDドメインに強固に結合 する薬剤はBak（およびおそらくはBax／Bipla）の機能を阻害すると予測される はずである。Bak（および／またはBax／Bipla）が活性のある細胞死制御分子で あると仮定すれば、GDドメインに強固に結合する薬剤はBcl-2／Bcl-x_Lの結合作 用と同様な機構によりBakの機能を阻害するかもしれない。そのような薬剤は「B cl-2／Bcl-x_L」模倣物からなるはずであり、よって、Bcl-2が証明された防御作 用（例えば損傷またはサイトカイン遮断に対するニューロンの防御）を有する条 件下で、抗アポトーシス活性を示すかもしれない。このクラスの薬剤は、例えば 神経退化疾患および虚血による損傷を含む過剰または不適切な細胞死により特徴 付けられる疾患の処置に有用性を有しうる。 Bcl-2／Bcl-x_L活性が細胞の生存を促進するならば、そしてBakの抑圧が単にそ れら生存蛋白質の結合および不活性化によるならば、この結合を阻害する薬剤は 、Bak（および／またはBax／Bipla）による抑圧を緩和することにより、細胞中 の残りのBcl-2／Bcl-x_Lの活性を効果的に増大させるはずである。これは細胞の 生存も促進するはずであるが、外来のBcl-2／Bcl-x_Lを発現する細胞中において のみである。Bcl-x_Lに結合してそれによりBak（および／またはBax／Bipla）と の 相互作用を阻害する薬剤は、Bcl-x_L（および／またはBcl-2）の細胞死抑圧活性 を阻害するかもしれない。そのような薬剤は「GDドメイン模倣物」からなり、そ してBakの作用と同様の機構の様式により細胞死を促進するはすである。GDドメ イン模倣物はガンの疾患およびウイルス疾患の治療処置に有用なはずである。 GDドメインペプチドのペプチド模倣物も本発明により提供されて、例えばGDド メインを含むタンパク質の機能をブロックするかまたはGDドメイン仲介ダイマー 形成を干渉することにより、アポトーシスを変調する薬剤として機能できる。ペ プチド模倣物は、模倣されたペプチドと類似の特性を有する非ペプチド薬剤を含 むものとして、薬剤工業において共通に理解されている。ペプチド模倣物のデザ インの原理および実施は当業界において知られており、例えば、Fauchere J.，A dv．Drug Res．15：29（1986）；およびEvans et al.，J．Med．Chem．30：1229 （1987）に記載されている。治療上有用なペプチドに類似の構造を有するペプチ ド模倣物を用いることにより、均等な治療または予防作用を生じるかもしれない 。典型的には、そのようなペプチド模倣物は、所望の特性、例えばインビボ化学 損傷抵抗性を変換するかもしれない結合により任意に置換されたひとつまたは複 数のペプチド結合を有する。そのような結合は、-CH₂NH-，-CH₂S-，-CH₂CH₂-，- CH=CH-，-COCH₂-，-CH(OH)CH₂-，および-CH₂SO-を含んでよい。ペプチド模倣物 は、それらの使用上で治療上特に望まれる、高められた薬剤特性（生物学上の半 減期、吸収速度等）、異なる特異性、増大された安定性、生成の経済性、減じら れた抗原性等を示してよい。 本明細書にて論じられるとおり、GDドメインはダイマー形成に関与するモチー フの領域であるらしく、そしてこの活性はGDドメインを含む蛋白質によるアポト ーシスの制御に関連しているかもしれない。Bakは膜にまたがるらしいＣ末端の 疎水性領域を含む。即ち、GDドメインを含む蛋白質の細胞下の局在はインビボに おける細胞死の制御において投割を担うかもしれない。次に、抗原特性の見地か ら、例えば、免疫化学または他の手段により組織／器官から切り出された画分中 のGDドメイン含有蛋白質の検出または測定に本発明を用いることができる。公知 の方法によりGDドメインを含むペプチドを単独またはアジュバントと混合して動 物に免疫することにより、GDドメインペプチドに特異的な抗体を生成することが できる。例えば、哺乳類、例えばウサギをGDドメイン含有ペプチドで免疫し、そ れにより、それに対するポリクローナル抗体の形成を誘導する。モノクローナル 抗体も、公知の方法を用いて生成してよい。そのような抗体を本発明に従い使用 することにより、GDドメイン含有ペプチドの存在および量を検出することができ る。 本発明のGDドメインペプチドは、放射性免疫アッセイおよび酵素免疫アッセイ を含む標準アッセイ手段により、Bak、BCl-x_L、Biplaおよび他の蛋白質の検出に 用いてよい。 当業者には理解されるとおり、GDドメイン含有ペプチドの正確な化学構造は多 くの因子に依存して変更される。例えば、与えられた蛋白質は酸性または塩基性 、あるいは中性の形態で得られてよいが、なぜならイオン化カルボキシル基およ びアミノ基が分子中に見いだされるからである。本発明の目的のために、次に、 天然ペプチドの治療活性または診断活性を保持したあらゆる形態のGDドメイン含 有ペプチドも、本発明の範囲内であることを意図する。 本発明のGDドメインペプチドおよび他の組成物は、当業界において公知の組換 えＤＮＡ技術により生成してよい。例えば、本発明のGDドメインペプチドをコー ドするヌクレオチド配列を適切なＤＮＡベクター、例えばプラスミドに挿入して よく、そしてベクターは適切な宿主を形質転換するのに用いられる。組換えGDペ プチドは発現により宿主中で生成される。形質転換された細胞は原核細胞または 真核細胞であってよい。Bak、BaxおよびBiplaのGDドメインをコードするこの目 的のための好ましいヌクレオチド配列は図８に示される。 GDドメインを含むペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ゲノミックでも ｃＤＮＡでも、ハイブリダイゼーションスクリーニング法を含む慣用法によりク ローンライブラリーから単離してよい。別法として、オリゴヌクレオチド合成の ための公知の化学合成法により合成ポリヌクレオチド配列を構築してよい。その ような合成法は、例えばBlackburn，G．N．and Gait，M．J.，編纂、化学および 生物学における核酸（Nucleic Acids in Chemistry and Biology）、IRL出版、 オックスフォード、英国（1990）に記載されており、市販のオリゴヌクレオチド 合成器を製造者の指示書に従い用いてもよいことは明らかである。一つのそのよ うな製造者はアプライドバイオシステムズ（Applied Bio Systems）である。 本明細書に開示されたヌクレオチド配列に基づくプライマーを用いたポリメラ ーゼチェイン反応（PCR）を用いることにより、ｍＲＮＡプール、ｃＤＮＡクロ ーンライブラリーまたはゲノミックＤＮＡからのＤＮＡ断片を増幅してよい。PC Rヌクレオチド増幅法は当業界において公知であり、例えば、Erlich，H．A.，編 纂、PCRテクノロジー：ＤＮＡ増幅のための原理および適用（Principles and Ap plications for DNA Amplification）、ストックトン出版、ニューヨーク、ニュ ーヨーク（1989）；米国特許第4,683,202号；米国特許第4,800,159号；および米 国特許第4,683,195号に記載されている。さまざまなヌクレオチドの欠矢、付加 および置換が本発明のポリヌクレオチドに導入されてよいことは当業者には理解 され、またGDドメインペプチドをコードするヌクレオチド配列中の変更は、例え ば対立遺伝子の多型性、マイナーな配列決定の誤り等の結果として生じるかもし れないことも当業者には認識されよう。本発明のGDドメインペプチドをコードす るポリヌクレオチドは、例えばハイブリダイゼーションプローブおよびPCRプラ イマーとして有用な短いオリゴヌクレオチドを含んでよい。本発明のポリヌクレ オチド配列はより大きなポリヌクレオチド部分を含んでよく、そしてポリヌクレ オチド結合を通して、異なる蛋白質をコードするひとつまたは複数のポリヌクレ オチド配列をインフレームで融合させてよい。この事象において、発現された蛋 白質は融合蛋白質からなってよい。もちろん、本発明のポリヌクレオチド配列を PCR法において用いることにより、疾患の診断または法医学分析においてGDドメ インペプチドをコードするｍＲＮＡの存在を検出してよい。 GDトメインと相互作用する蛋白質（またはGDドメインを含む蛋白質）をコード するｃＤＮＡは、公知の方法を用いることにより、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを スクリーニングして同定されうる。そのような方法の例は、酵母２ハイブリッド 系（米国特許第5,283,173号、発明者FieldsとSong、1994年２月１日発行；Chien ，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．88：9578（1991））、および大腸菌／BCCP 相 互作用スクリーニング系（Guarente，L.，Proc．Natl．Acad．Sci．90：1639（1 993）およびGermino，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．90．933-937（1993）） を含む。適切なＤＮＡライブラリーは哺乳類、例えばヒト、マウスまたはラット のｃＤＮＡライブラリーを含むであろうし、当業界において知られているとおり 、ＲＮＡおよび単一細胞、組織または器官種または発生段階から生じたｃＤＮＡ を含んでよい。 GDドメインを含む蛋白質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列は、連 結のための平滑末端または互い違いの（staggered）末端、適切な末端を提供す るための制限酵素消化、適合のための粘着末端の埋め込み、不所望なジョイント を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および適切なラーゲースによる連 結を含む慣用技術に従い、ＤＮＡベクターに挿入されてよい。そのような操作の 技術は、例えば、Sambrook，J.，et al.，モリキュラークローニング：ラボラト リーマニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、、プ レインビュー、ニューヨーク（1989）に開示されており、当業界においてよく知 られている。 GDドメインを含む蛋白質またはペプチド中のアミノ酸残基の配列は、共通に用 いられている３文字標記の使用によるかまたは１文字標記により本明細書に標記 される。これら３文字および１文字標記のリストは、テキスト本、例えばBioche mistry，第２版、Lehninger，A.，ワースパブリッシャー（Worth Publishers） 、ニューヨーク、NY（1975）に見いだされる。アミノ酸配列を横に標記する場合 、アミノ末端は左の末端であり、カルボキシル末端は右の末端上に位置すること を意図する。ペプチド中のアミノ酸残基はハイフンにより分離されてよい。その ようなハイフンは、単に配列の標記を楽にすることを意図する。 モデル化された（または実験により決定された）ペプチド構造に基づいた、GD ドメイン模倣物または結合分子の理論的なデザインは、理論的な薬剤デザインの ための公知の方法を用いて当業者により実施されてよい。病理状態、例えば自己 免疫疾患、神経退化的疾患、ガン等を処置するための治療または予防方法は、GD ドメインのホモダイマー形成またはヘテロダイマー形成を特異的に阻害すること ができる治療剤を効果的な量投与することからなり、それにより、GDドメイン含 有蛋白質の生物活性ならびに患者のアポトーシス状態を変調する。 GDドメインを含む削除されたBak分子、例えばQVGまたはPEM並びに最小「GDド メイン」を構成する他の小ペプチド誘導体は、本明細書において、野生型Bakに より示される蛋白質結合活性および細胞殺傷活性を保持することが証明される。 これらの分子またはペプチド模倣物誘導体は、Bak（インビトロアッセイにおい て腫瘍細胞を殺傷することが示された）の高レベルの発現により生成されるのと 同じ生物シグナルを提供することにより、腫瘍細胞中のアポトーシスを誘導する かもしれない。そのような薬剤は、p53の状態とは個別に働くと予測されるはず の新規なクラスの化学治療薬剤を含む。 Bakとの相互作用がBcl-x_Lおよび／または他のBcl-2ファミリーのメンバーの抗 アポトーシス機能の抑圧をもたらすならば、GDドメインペプチドまたはGDドメイ ンの構造を模倣した薬剤は、Bcl-2等の蛋白質の抗アポトーシス機能の阻害剤と して作用しうる。高レベルのBcl-2発現は、さまざまな化学治療剤に対する腫瘍 細胞の耐性に包含されてきた（Fisher et al.，Cancer Res．53：3321-3326（19 93）；Miyashita and Reed，Blood 81：151-157（1993）；Dole et al.，Cancer Res．54：3253-3259（1994））。GDドメイン模倣物の投与は、Bcl-2の機能を抑 圧し、そして伝統的な化学治療剤により誘導されたアポトーシスに対する腫瘍細 胞の感受性を復帰させるかもしれない。さらに、Bcl-2を阻害するBakまたはGDド メイン模倣物は、それら自体、成長および生存し続けるための高レベルのBcl-2 活性に依存した特定の腫瘍、例えば、瀘放性リンパ腫に対して選択的に毒性かも しれない。 本発明のGDドメイン模倣物はウイルス感染と戦うのに有用かもしれない。ＤＮ Ａの断片化に関連した感染細胞のアポトーシスは、ウイルス力価を限定してウイ ルスの増殖を制限することによりウイルス病原に対する重要な防御を提供する（ Vaux et al.，Cell 76：777-779（1984））。この理由から、ウイルスは感染し た宿主細胞のアポトーシスを抑圧するための逆の機構を進化させてきた。エプス タインバールウイルスBHRF-1、アフリカブタコレラウイルス（ASFV）LHW5-HL、 お よびアデノウイルスE1B 19kDのような特定のウイルス蛋白質は、Bcl-2と構造上 および機能上相同らしい。第２のエプスタインバール上の遺伝子LMP1は、潜伏感 染した細胞中における細胞bcl-2遺伝子の発現をトランスに活性化する（Henders on et al.，Cell 65：1107-1115（1991））。これらの場合、ウイルス感染が引 き金となったアポトーシスのシグナルはウイルスの（または細胞の）Bcl-2相同 物の作用によりくい止められるかもしれない。ウイルス／細胞Bcl-2相同物の抗 アポトーシス機能に対抗するBakのGDドメイン模倣物は、感染細胞中でこのブロ ックを緩和してアポトーシスを誘導するように機能してその結果ウイルスの増殖 を阻害するはずである。少なくとも２つの非関連ウイルスによりコードされる抗 アポトーシス蛋白質（EBVのBHRF-1およびアデノウイルスのE1Bの19kD）は、Bak と相互作用することが証明されている。実験の証拠は、E1Bの19kD／Bakの相互作 用の破壊（即ち、GDドメイン模倣物との競争による）が、ウイルスの力価および 生産性複製を減じるはずであるとの結論を支持する。Bakとの相互作用を破壊す るE1Bの19kD内の変異は、対応してE1Bの19kDの抗アポトーシス機能を破壊する。 欠損したE1B 19kD蛋白質をコードするアデノウイルス株は、インビトロにおいて 極めて少ない数の子孫を生じるが、これは感染細胞のアポトーシスによる（Pild er et al.，J．Virol．52：664-671（1984）；Subramanian et al.，J．Biol．C hem.，259：11777-11783（1984））。 ウイルスがアポトーシスシグナル変換経路の封鎖を強いる付加的機構は、p53 サプレッサー蛋白質の不活性化による。ウイルス感染により引き起こされた強制 的細胞増殖は、p53の機能を必要とするアポトーシスシグナルを誘導する（例え ば、Wu and Levine，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91：3602-3606（1994））。 典型的には、p53の機能はウイルス遺伝子産物との物理的相互作用による感染の 間は阻害される。p53結合蛋白質をコードするウイルスの例は、アデノウイルス 、ポリオウイルス、パピローマウイルス、およびサイトメガロウイルスを含む（ Levine et al.，Nature 351：453-456（1991）；Speir et al.，Science 265：3 91-394（1994））。感染細胞はアポトーシスを受け始めるが、しかし細胞死はp5 3機能のウイルスによる阻害により妨害されるかまたは遅延する。アポトーシス シ グナル変換経路のこの封鎖は、p53下流のアポトーシスを変調する薬剤により緩 和するか、迂回することが可能である。BakまたはGDドメイン模倣物はp53とは別 にアポトーシスを変調して、結果的に感染細胞において抑圧された細胞死のシグ ナルを供給するかまたは復帰させるための道を提供する。 細胞膜を通して所望の細胞に治療剤を至らせる送達をもたらすあらゆる投与様 式が、本発明の範囲として意図される。投与部位および細胞は、処置される特定 の疾患の理解に基づき、当業者により選択される。さらに、投薬量、投薬頻度、 および処置期間は、処置される特定の疾患の理解に基づき、当業者により決定さ れて最適化できる。投与の特定の様式も当業者により容易に選択でき、例えば、 治療剤が細胞膜を通過する要求に応じて、経口、静脈内、皮下、筋肉内等を含み うる。薬剤の用量および薬剤の送達の原理は公知であり、例えばAnsel，H．C．a nd Popovich，N．G.，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery System s，第５版、Lea & Febiger，編集、フィラデルフィア、PA（1990）に記載されて いる。例えば、本発明の薬剤を特異的に送達するためにリポソームを利用するこ とが可能である。そのようなリポソームは、標的部位において作用するはずの付 加的な生物活性化合物、例えばドラッグ、放射性アイソトープ、抗体、レクチン および毒素を含むように生成できる。 本発明による使用のための適切な薬剤は、GDドメインペプチド、それらの模倣 物、断片、機能均等物、および／または雑種または変異物、並びに上記あらゆる ものをコードするｃＤＮＡを含むベクターを包含する。薬剤は、単独または他の 適切なドラッグと併用しておよび／または治療の間に投与されうる。 本発明の薬剤は、不適当な細胞増殖または不適当な細胞死またはある場合には 両者により特徴付けられる疾患を含む退化的疾患の処置に適する。不適当な細胞 増殖は、正常な集団中の特定の細胞種の増殖に比して細胞数が統計学上顕著に増 加することを含む。また、不適切な位置に細胞が存在および／または存続するよ うな疾患も含み、例えば急性肺損傷後の肺組織中の繊維芽細胞の存在を含む。例 えば、そのような細胞は侵入性且つ転移性の特性を示し、そして高度に退性であ るガン細胞を含む。そのような細胞は限定されないが、例えば腫瘍細胞を含むガ ン細胞を含む。不適当な細胞死は、正常な集団中の特定の細胞種の存在に比して 細胞数が統計学上顕著に減少することを含む。そのような不十分な実体（underr epresentation）は、例えばAIDS（HIV）等のＴ細胞の不適切な死をもたらす退化 的障害、および不適切な細胞死により特徴付けられる自己免疫疾患によるらしい 。自己免疫障害は、自己抗原に対して向けられた免疫応答により引き起こされる 疾患である。そのような疾患は、自己抗原を含む組織中の免疫学上のコンピテン ト細胞または免疫複合体により引き起こされる炎症性病巣に関係した、自己抗原 に対する循環自己抗体または細胞介在免疫の存在により特徴付けられる。そのよ うな疾患は、全身性エリテマトーデス（SLE）、リウマチ性動脈炎を含む。 免疫学の一般的な原理を記載する標準の関連研究は、Stites，D．P.，and Ter r，A．I.，基礎および臨床免疫学（Basic and Clinical Immunology）、第７版 、Appleton & Lange，編集者、ノルウオーク、CT（1991）；およびAbbas，A．K. ，et al.，細胞および分子免疫学（Cellular and Molecular Immunology）、W． B．Saunders Co.，編集者、フィラデルフィア、PA（1991）を含む。 本明細書に開示されたGDドメインペプチド、模倣物、薬剤等並びにそれらをコ ードするヌクレオチド配列またはそれらの対応アンチセンス配列を含むベクター 、およびそのようなベクターを含む宿主は、疾患の処置のための薬剤の製造に用 いてよい。 GDドメインを含む蛋白質をコードするひとつまたは複数の機能的に傷つけられ た対立遺伝子を有する細胞および非ヒトトランスジェニック動物は、GDドメイン を含む蛋白質のゲノミッククローンからの相同な標的構築物を用いて生じさせて よい。相同な標的構築物を生成する方法は公知であり、例えば、Bradley，et al .，Bio/Technology 10：534（1992）；およびKoh，et al.，Science 256：1210 （1992）に記載されている。例えば、相同な標的の使用によりGDドメインを含む 蛋白質の不活性化対立遺伝子に関して同型接合または異型接合の「ノックアウト 」マウスを生じさせてよい。そのようなマウスは疾患の研究および他の用途のた めの研究材料として有用である。キメラの標的マウスの生成方法は公知であり、 例えば、Robertson，E．J.，編纂、テトラカルシノーマおよび胚の幹細胞（Tera to carcinomas and Embryonic Stem Cells）：実践アプローチ（A Practical Appro ach）、IRL出版、ワシントンD.C.（1987）に記載されており、胚の幹細胞の操作 も記載する。さらに、GDドメインを含む蛋白質のｃＤＮＡまたはゲノミック遺伝 子を用いて、高レベルであるいは選択された転写制御配列の制御下でGDドメイン 含有ポリペプチドを発現するトランス遺伝子を構築してよい。そのようにして構 築されたトランス遺伝子は、公知の方法により細胞およびトランスジェニックな 非ヒト動物に導入することができる。そのようなトランスジェニック細胞および トランスジェニックな非ヒト動物は、アポトーシスを変調する薬剤のスクリーン として用いてよい。 本発明は以下の実施例を参照して特定の側面において、限定のためではなく例 示のために認識されてよい。 実施例 Ａ．方法 １．プラスミドおよびＤＮＡ操作 すべての組換えＤＮＡ法は標準法により実施した。bakのｃＤＮＡ中の欠失はP CR変異導入により導入されて、削除されたBak種はPCRにより構築された（White ，B．A.，編纂、「PCRプロトコル」：現在の方法および応用（Current Methods and Applications）、Methods in Molecular Biology中、ヒューマナ出版、トト ワ、CT（1993））。変異はＤＮＡ配列決定分析により確認された。すべてのBak 誘導体は、アミノ末端にインフルエンザウイルスのヘマグルチニンエピトープを 付加されており、そしてpcDNA-1/Amp，pRcCMVおよびpcDNA-3（インビトロジェン 社）に存在するCMVエンハンサープロモーターから発現された。 ２．一過性トランスフェクションアッセイ 一過性トランスフェクションアッセイの方法は、IL-1β-変換酵素により誘導 されたアポトーシスを検出するために以前に記載された方法と類似している（Mi ura et al.，Cell 75：653-660（1993）；Kumar et al.，Genes Dev ８：1613-1 626（1994）；Wang et al.，Cell 78：739-750（1994））。トランスフェクショ ンの一日前、Rat-1細胞を3.5×10⁴細胞／mlにて24ウエルの皿にプレートした。 次の日、リポフェエクタミン法により、β-ガラクトシダーゼをコードするマー カープラスミド（0.16μg）およびBakをコードする発現プラスミド（0.42μg） で該細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後、細 胞を固定してX-Galで染色することにより、プラスミドＤＮＡを受け取った細胞 中のβ-ガラクトシダーゼ発現を検出した（Miura et al.，前記）。青い細胞の 数を顕微鏡実験により数えて、生存（平らな青い細胞）または死滅（丸い青い細 胞）の何れかを記した。このアッセイにおけるBakの細胞殺傷活性は、β-ガラク トシダーゼプラスミドと対照発現ベクター（即ち、bakのｃＤＮＡ挿入物を含ま ない）との共トランスフェクション（co-transfection）に対する、得られた青 い細胞の数中の大きな減少により表される。 青い細胞の損失がBakの細胞査証活性を反映するとの解釈は、以下のさまざま な観察から指示される。 １．Rat-1細胞は安定なトランスフェクションアッセイにおいて強いられたBak の発現により迅速に殺傷される。 ２．アンチセンス配列でbakのｃＤＮＡを有する対照発現プラスミドまたはさ まざまな非関連cＤＮＡはβ-gal陽性細胞を排除しない。さらに、特定のBak変異 株（即ち、△GD）は、このアッセイにおいて青い細胞を排除する容量を大きく減 じられる。 ３．Rat-1細胞においてアポトーシスを誘導することが以前に示された（Niura et al．前記；Kumar et al．前記；Wang et al．前記）IL-1β-変換酵素も、同 じベクターから発現させた場合にこのアッセイにおいて青い細胞を排除する。 ４．青い細胞の数は、BakをBcl-x_Lと共トランスフェクションすることにより 一部回復することができる。即ち、Bak発現細胞はBcl-x_Lの抗アポトーシス機能 によりある程度救済することができ、そしてBak発現自体はβ-ガラクトシダーゼ 活性を排除しない。 ３．インビトロ蛋白質／蛋白質相互作用の検出 GSTおよびGST-Bcl-x_Lを大腸菌中で発現させて、グルタチオン−アガロースを 用いて親和性クロマトグラフィーにより精製した（Smith and Johnson，Gene 67 ：31-40（1988））。供給者（プロメガ）により記載されたとおりにウサギ網状 赤血球溶解物中にカップルされた転写／翻訳系を用いて、³⁵Ｓ-メチオニンで標 識した蛋白質をインビトロ発現させた。³⁵Ｓ-met-標識蛋白質は、20mlのBSA洗浄 GSH-アガロースビーズ（50％スラリー）と共に４℃において１時間、0.25％のNP -40，142.5mMのNaCl、５mMのMgCl₂および１mMのEGTAを含む10mM Hepesバッファ ー（pH7.2）（NP-40溶解バッファー）0.1ml中で混合することにより予め洗浄し た。ビーズを遠心分離により除き、上清をGSTまたはGST-Bcl-x_L（最終濃度１mM ）と共に４℃において１時間インキュベートした。GST融合蛋白質およびあらゆ る相互作用蛋白質は、さらなる20mlのGSH-アガロースビーズとの１時間のインキ ュベートにより回収された。ビーズを、２回NP-40溶解バッファーで、次にNP-40 を含まないNP-40溶解バッファーで２回洗浄した。SDS-PAGEサンプルバッファー 中で100℃において５分間インキュベートすることにより蛋白質をビーズから溶 出して、４-20％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。電気泳動の後、ゲ ルを固定してフルオログラフィー増強溶液（Amplify；アマーシャム）中でイン キュベートした。ゲルを乾燥させて−70℃のオートラジオグラフィーに供した。 ４．トランスフェクトされた細胞中での蛋白質／蛋白質相互作用の検出 10％子ウシ血清、２％L-グルタミンおよび１％pen/strep（ライフテクノロジ ー社）を付加されたダルベッコ修飾イーグル培地（ライフテクノロジー社）中で COS細胞を生育させた。細胞を2.0×10⁵細胞／35mmウエルで撒いて、供給者によ り記載されたとおりに24時間後にリポフェクタミンを用いて発現プラスミドでト ランスフェクトした。Bak（およびBak変異体）は、そのアミノ末端にHAエピトー プを付加された融合蛋白質として発現された。Bcl-x_Lもアミノ末端エピトープ付 加物（旗（Flag）；コダック）と共に発現された。トランスフェクションから24 時間後、細胞をリン酸バッファー塩で洗浄して、１mM PMSF、１mMペプスタチン および１mg/mlロイペプチンも含むNP-40溶解バッファー中で溶解した。溶解物は 抗HA抗体（12CA5、ベーリンガーマンハイム）と共に１時間、さらに１時間20ml のBSA-洗浄プロテインＡ-アガロースビーズ（50％スラリー）と共にインキュベ ートした。ビーズは、２回NP-40溶解バッファーで洗浄し、そしてNP-40を含まな いNP-40溶解バッファーで２回洗浄した。SDS-PAGEサンプルバッファー中で100℃ において５分間インキュベートすることにより蛋白質をビーズから溶出し、４− 20％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。電気泳動のあと、蛋白質をイモ ビロン-P膜（ミリポア）に移して、膜をPBS中の１％ミルクで１時間ブロックし た。一次抗体（１mg/ml 12CA5、ベーリンガーマンハイム；１：500 DAKO-bcl-2 、124、DAKO；10mg/ml 抗FLAG M2、コダック）を膜と１時間インキュベートし、 二次抗体（0.8mg/ml HRP-結合ヤギ抗マウスIgG；ジャクソンラボラトリー）とさ らに１時間インキュベートした。検出はX-OMAT ARフィルム（コダック）を用い て供給者により記載されたとおりに、高められた化学発光（ECL；アマーシャム ）により実施した。 Ｂ．結果 １．複数の細胞系におけるBakの細胞死機能の検出 強いられたBak発現は、誘導可能なBak発現プラスミドで形質転換された安定な Rat-1細胞系においてアポトーシスを誘導する。多数のbak変異体の細胞殺傷機能 をより迅速に評価するために、一過性トランスフェクションアッセイを用いた。 Rat-1細胞を、β-ガラクトシダーゼコーディング発現プラスミドと、Bakコーデ ィング発現プラスミドあるいはさまざまな対照プラスミドでトランスフェクショ ンした。このアッセイにおけるBakの細胞殺傷活性は、β-galプラスミドを対照 発現ベクターと共にトランスフェクションした場合に対する、得られた青い（β -gal発現）細胞の数の大きな減少により証明された（図１）。青い細胞の除去は 、検出可能なレベルのβ-ガラクトシダーゼ発現に先立ち、トランスフェクトさ れた細胞がbakにより殺傷されたことを示した。 Bak細胞殺傷活性は幾つかのさらなる細胞系において評価された。アポトーシ スを誘導するのにBakが野生型p53を必要とするか否かを決定するために、p53-/- 「ノックアウト」マウスに由来する形質転換繊維芽細胞中で一過性トランスフェ クション実験を実施した。これらの細胞は機能的p53を欠き、そしてg-照射およ びＤＮＡ損傷化学治療剤に応答してアポトーシスを受ける能力が大幅に減じられ る（Lowe et al.，Cell 74：957-967（1993）；Lowe et al.，Nature 362：847- 849（1993））。Bakとβ-galの共トランスフェクションは青い細胞の数を大幅に 減じたことから（図１）、Bakはその細胞殺傷機能を発揮するに際して野生型p53 を必要としないことが示唆される。同様に、HeLa（子宮頚ガン）およびBT549（ 乳ガン）細胞系を用いて実施した一過性トランスフェクション実験は、Bakがこ の前後関係においてヒト腫瘍細胞を殺傷することを証明したことから（図１）、 その活性はげっ歯類繊維芽細胞に限定されないことが示唆される。 ２．細胞殺傷機能に必要なBakドメインの同定 Bakの変異分析を行うことにより、アポトーシスを誘導するのに必要および／ または十分な分子の領域を同定した。Bak蛋白質全体にわたる一連の欠矢変異を 、PCR変異導入により導入して、各変異をRat-1細胞一過性トランスフェクション アッセイ中の細胞殺傷活性に関して試験した。この分析から、Bak分子の多くが この分析により検出されるその細胞死機能に必要不可欠であることを明らかにし た（図２）。驚くことに、Bak蛋白質の非必須領域は他のBcl-2ファミリーのメン バーの高度な相同性を示す、蛋白質のカルボキシル末端側半分中の２つのドメイ ン（Bcl-2相同ドメインＩおよびII）を含む。 カルボキシル末端の疎水性ストレッチのアミノ酸の欠失（残基191-211）は、B akの細胞殺傷機能を一部減じたが排除はしなかった（変異体△C）。この疎水性 「テイル」は、Bakにおいて膜アンカー配列として同様に機能する。実際、一過 的にトランスフェクトされたCOS細胞における△Cの免疫蛍光の研究は、野生型Ba kに比して△C変異体の細胞内分布が変更されることを示しており、ミトコンドリ アにおいて顕著であった。カルボキシル末端の疎水性テイルはBakの細胞殺傷機 能に必要ではないが、該蛋白質の細胞下の正確な局在を保証することにより間接 的に寄与するかもしれない。 △GD欠失に包含されるBak蛋白質のセグメントは（残基82-94）細胞死機能に絶 対必要であるが、何故ならば、この変異は一過性トランスフェクションアッセイ において細胞殺傷活性を欠くからである。特に、β-galとBakの△GDの共トラン スフェクションは、β-galと対照ベクタープラスミドの共トランスフェクション に比して青い細胞を同じかまたはより多く生じた。このドメインのすぐN-末端の 隣 接残基（アミノ酸67-81）の欠矢は細胞死活性を減じたが排除はしなかった（Bak 変異体△PS）。試験された他の欠失変異体（上記の△Cは除く）は細胞殺傷能力 に関して変わらなかった。併せて考えると、これらの結果は、欠失変異体△GDお よび△PS（残基67-94）により規定される共に直線のセグメント（「GDドメイン 」と呼ぶ）は、一過性アッセイにおいて検出されるBakの細胞殺傷活性を唯一必 要としないことを示唆する。 GDドメインが細胞殺傷機能に十分であるか否かを決定するために、それぞれア ミノ酸58-103および73-123に対応する２つの削除されたBak蛋白質誘導体PENおよ びQVGについて、一過性トランスフェクションアッセイにおいて活性の試験をし た。QVGはβ-galと共トランスフェクトした場合に青い細胞の数を減じたことか ら、Rat-1細胞殺傷能力をいくらか保持していることが示唆される。青い細胞の 数の減少は完全長のBakに比して減じられたが、PEMおよびQVGの両者はカルボキ シル末端膜アンカーを欠き、そしてBakの△C変異体との類似性により、変更され た細胞下の局在のため、完全な細胞殺傷機能を同様に示さないはずである。事実 、QVGはその活性に関してBakの△C変異体と類似であった。削除されたBak種の細 胞殺傷機能を改良する試みにおいて、疎水性テイル要素（アミノ酸187-211）をP EMおよびQVGの両者のC-末端に融合させた（それぞれ、PEM+CおよびQVG+C）。各 々の場合、仮想膜アンカーの付加は一過性トランスフェクションアッセイにおい て削除されたBak変異体が青い細胞を減じる能力を改良し、そして野生型Bakと同 等な活性をもたらした（図２）。即ち、これらの結果から、PEMおよびQVGにより 共有される蛋白質ドメイン（残基73-103）はBakの細胞殺傷機能に十分であるこ とが示唆される。 ３．Bcl-x_Lとの相互作用を仲介するBcl-x_Lドメインの同定 他のBcl-2ファミリーのメンバー、例えばBcl-x_Lとの物理的相互作用は、Bakに とってその細胞死機能を及ぼすのに必須であるらしく、そしてBak活性を制御す るらしい。したがって、Bak内のドメインについて、そのBcl-x_L結合活性に必要 および／または十分なものを決定した。BakとBcl-x_Lの相互作用は、インビトロ 蛋白質結合アッセイおよびトランスフェクトされた細胞からの共免疫沈殿により 測定した。インビトロで翻訳された³⁵Ｓ標識Bakは、バクテリアにより発現され たGST-Bcl-x_L融合蛋白質の精製物に結合し、そしてこのインビトロ相互作用の特 異性はBakが精製されたGSTのみには結合しないことから証明された（図３Ａ）。 特異的なBak／Bcl-x_L相互作用は、COS細胞中でのエピトープを付加された形態の BakとBcl-x_Lの共トランスフェクションによっても検出できた。トランスフェク トされた細胞の溶解物からBakを免疫沈殿させて、結合したBcl-x_Lを共沈殿蛋白 質のウエスタンブロット分析により検出した（図３Ｂ）。共に発現されたBcl-x_L の不在下ではBcl-x_Lは免疫沈殿物中に検出されなかったことから、この結合は特 異的であることが示される。 上記Bak欠失変異体を、インビトロおよびトランスフェクトされた細胞中の両 方でBcl-x_L結合能力に関して試験し、その結果を図４に要約する。残基82-94の 欠失（△GD）は、BakがBcl-x_Lと相互作用する能力を完全に減じさせた。Bcl-x_L との相互作用は、隣接するアミノ酸67-81の欠失（△PS変異体）によっても減じ られた。Bcl-x_L解読枠を完全に包含する試験された他の欠失変異体はこれらのア ッセイにおいてBcl-x_L結合能力を保持していた。これらの結果は、△GDおよび△ PS変異体により包含されるBak配列（最大、アミノ酸67-94）を、Bcl-x_Lとの相互 作用を仲介する唯一の重要なものとして同定した。同じBak領域であるGDドメイ ンはBakの細胞殺傷機能に必要であった。 欠失分析により規定されるBak領域が蛋白質結合機能に十分であるか否かを測 定するため、アミノ酸58-103および73-123をそれぞれ含む２つの削除されたBak 種（PEMおよびQVG）をBcl-x_Lとの相互作用能力に関して試験した。PEMおよびQVG の両者はBcl-x_Lに結合したことから、これら削除されたBcl-x_L種両者に共有され る領域（アミノ酸73-103）はBcl-x_Lとの相互作用を仲介するのに十分であったこ とが示される。上記の欠失変異体および削除された種の分析を総合すると、これ らの結果は、残基73-103にわたるBakのアミノ酸配列がBcl-x_Lとの相互作用に必 要かつ十分であることを証明する。上記のとおり、この領域はBakの細胞殺傷機 能にも包含されることから、蛋白質結合機能は細胞殺傷機能とリンクしているか もしれないことが示唆される。 ４．BaxとBipla内に存在するGDドメインに似た機能上重要な配列要素 本明細書に記載されたBakの変異分析から、GDドメインはBakの細胞殺傷活性お よびBcl-x_L結合活性の両者に唯一関与することが証明される。２つの他のBcl-2 相互作用蛋白質であるBaxおよびBiplaは、Bakのそれら特性に似た機能特性を有 する。BaxとBiplaの両者はRat-1細胞中でβ-galと共トランスフェクトされた場 合に青い細胞を減じることから、この前後関係においてアポトーシスも誘導する ことが示唆される。BaxとBiplaは、インビトロおよびトランスフェクトCOS細胞 の両者においてBcl-x_Lとも特異的に相互作用する。これらの機能上の類似性は、 あらゆる構造上の特徴がそれらの類似の生物機能に寄与する３つの蛋白質に共有 されるか否かの試験を促進させた。特に、上に示された分析の見地から、BaxとB iplaがBakのGDドメインに似ており且つそれらの生物活性にも重要である配列を 含むか否かを試験した。 BaxはBcl-2ファミリーのメンバー（Bakを含む）と広範囲に相同であり、BH1お よびBH2に集中して高度の相同性を伴う（Oltvai et al.，Cell 74：609-619（19 93））。Bax中のBH1までのアミノ酸（59-73）のN-端のストレッチは、BakのGDド メイン内の配列（残基74-88）と相同性を有する。Baxとは対照的に、Biplaの一 次配列は公知のBcl-2関連物と類似しておらず、Bcl-2ファミリーに特徴的なBH1 およびBH2に相同な配列を欠く。しかしながら、BiplaはBakおよびBax中のGDドメ イン内において同じ要素と相同な領域（アミノ酸57-71）を含む（図５）。 BaxおよびBipla内のGDドメイン要素がこれら蛋白質の細胞殺傷機能および蛋白 質結合機能にも必須であるか否かを測定した。保存されたGDドメインモチーフを 除去した小さな欠失をBaxおよびBiplaに導入して、それらの変異体がRat-1細胞 を殺傷してBcl-x_Lに結合する能力に関して分析した。この分析から、Bakの△Dの ように、Baxの△DおよびBiplaのΔD変異体はRat-1細胞中においてβ-galと共ト ランスフェクトされた場合に青い細胞を減じる能力を減じられることが明らかと なった。さらに、両変異体はBcl-x_Lと相互作用する能力をもはや有さない（図６ ）。即ち、GDドメイン要素の機能はBak、BaxおよびBiplaにおいて保存されてお り、全部の３細胞の生物活性に必須である。 ５．ＧＤドメインはホモ−およびヘテロオダイマー形成に十分である GDドメインがその生物活性に関連しうる他の蛋白質／蛋白質相互作用を仲介す るか否かを評価するために、GDドメインを包含するBak部分（PEM）（残基58-103 ）をGSTと融合させてGST-PEMを作成した。インビトロ翻訳された³⁵Ｓ標識Bcl-x_L 、Bak、BaxおよびBiplaを、GSTのみ、またはGST-PEMのバクテリアで発現された 融合蛋白質とインキュベートした。GST-PEMドメインとBakおよびBaxの相互作用 は、本質的にはBcl-x_LへのBakの結合に関して記載されたとおりに測定した。複 合体をグルタチオン−アガロースビーズで回収して、洗浄して、ポリアクリルア ミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより結合蛋白質を検出した。 この実験の結果を図６に示す。Bcl-x_L、BakおよびBaxは全てGST-PEMと特異的 に相互作用したがGSTのみとはしなかった。これらの結果から、BakのGSTドメイ ンはBak（ホモダイマー形成）、Bax（異なる殺傷蛋白質とのヘテロダイマー形成 ）およびBcl-x_L（生存蛋白質とのヘテロダイマー形成）の結合に十分であること が証明される。即ち、GSTドメインはBcl-x_Lとの相互作用のみを仲介することが できるばかりでなく、BakおよびBaxとの相互作用も仲介することができる。 本明細書に記載された全ての刊行物は、個々のそれぞれの刊行物が特別に且つ 個別に引用により編入されることが示されるのと同じ範囲で、引用により編入さ れる。 本発明はさらに修飾することができ、そして本出願は、発明の属する分野の公 知または慣習的実施の範囲に含まれるような本開示からのそのような逸脱を含む 、あらゆる変更、使用または採用もカバーすることを意図し、そして請求の範囲 のみに限定されないことを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．GDドメインを含む、単離されて精製されたペプチド。 およびそれらの機能均等物 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されて精製されたペプチ ド。 ３．GDドメインを含み、そして野生型Bakと実質的に均等なRat-1細胞殺傷活性 を示すことを特徴とする、Bak、BaxおよびBiplaからなる群から選択される蛋白 質変異体。 ４．GDドメインを含み、そして野生型Bakと実質的に均等なBcl-x_L結合を示す ことを特徴とする、Bak、BaxおよびBiplaからなる群から選択される蛋白質変異 体。 ５．GDドメインをコードする、単離されて精製されたヌクレオチド。 ６．請求項２記載のペプチドをコードし、そして図８に示す配列である、単離 されて精製されたヌクレオチド。 ７．本質的にGDドメインペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、単 離された組換えＤＮＡ分子。 ８．本質的にGDドメインをコードする組換えＤＮＡ分子からなるベクター。 ９．GDドメインをコードする組換えＤＮＡ分子からなり、該組換え分子のアン チセンスＲＮＡを発現するベクター。 10．請求項８または９記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 11．哺乳類の細胞である、請求項10記載の宿主細胞。 12．（ａ）請求項８記載のベクターを構築し、 （ｂ）工程（ａ）のベクターで適切な宿主細胞を形質転換し、 （ｃ）宿主細胞によるGDドメインペプチドの発現を可能にする条件下にて 宿主細胞を培養し、 （ｄ）工程（ｃ）の宿主から発現されるGDドメインペプチドを単離する ことによりGDドメインペプチドを生成する、単離されたGDドメインペプチドの生 成法。 13．宿主細胞が哺乳類の細胞である、請求項13記載の方法。 14．GDドメインペプチドに対する抗体。 15．ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からなる群から選択される 、請求項14記載の抗体。 16．検出可能なように標識されている、請求項15記載の抗体。 17．検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、コファクター標識、蛍光標識 、常磁性標識、化学発光標識、および金属標識からなる群から選択される、請求 項16記載の抗体。 18．GDドメインをコードする第２ヌクレオチド配列に実質的に相補な第１ヌク レオチド配列を含む、検出可能なように標識されているヌクレオチドプローブ。 19．GDドメインペプチドおよび薬学上受容可能なキャリアーを含む、薬学組成 物。 20．GDドメインを含む第１および第２ペプチドまたは蛋白質並びに薬剤を含む ヘテロダイマー形成アッセイを実施するが、但し、第１および第２ペプチドまた は蛋白質は互いに異なるアッセイであり、 第１ペプチドまたは蛋白質と第２ペプチドまたは蛋白質とのヘテロダイマ ー形成を上記薬剤が阻害するかまたは増大させるかを測定し、ヘテロダイマー形 成の阻害または増大が測定された場合に、薬剤はGDドメイン仲介ヘテロダイマー 形成を変調できることを示す ことからなる、GDドメイン仲介ヘテロダイマー形成を変調できる薬剤を同定する 方法。 21．第１および第２ペプチドまたは蛋白質が、Bak，Bcl-x_L，BaxおよびBipla からなる群から選択される、請求項20記載の方法。 22．GDドメインを含む第１および第２ペプチドまたは蛋白質並びに薬剤を含む ヘテロダイマー形成アッセイを実施するが、但し、第１および第２ペプチドまた は蛋白質は同一であるアッセイであり、 第１ペプチドまたは蛋白質と第２ペプチドまたは蛋白質とのホモダイマー 形成を上記薬剤が阻害するかまたは増大させるかを測定し、ホモダイマー形成の 阻害または増大が測定された場合に、薬剤はGDドメイン仲介ホモダイマー形成を 変調できることを示す ことからなる、GDドメイン仲介ホモダイマー形成を変調できる薬剤を同定する方 法。 23．第１および第２ペプチドまたは蛋白質が、Bak，Bcl-x_L，BaxおよびBipla からなる群から選択される、請求項22記載の方法。 24．請求項20−23のいずれか１項記載の方法により同定された薬剤。 25．免疫交差反応性蛋白質をコードするＤＮＡ挿入物を含むクローンのｃＤＮ Ａ発現ライブラリーをスクリーンするために使用される、GDドメインに対する抗 体。 26．Bcl-2／Bcl-x_L模倣物を含む薬剤。 27．QVG，PEMおよびそのいずれかの誘導体から選択されるGDドメインを含むペ プチド。