ES2249773T3

ES2249773T3 - Nuevo implante y nuevo vector para el tratamiento de enfermedades adquiridas.

Info

Publication number: ES2249773T3
Application number: ES95930578T
Authority: ES
Inventors: Pierre Leroy; Majid Mehtali
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1994-09-13
Filing date: 1995-09-13
Publication date: 2006-04-01
Anticipated expiration: 2015-09-13
Also published as: US20020107869A1; JP4011604B2; CA2199715A1; JP2006320331A; WO1996008574A1; DE69534633D1; DK0781344T3; HK1002284A1; DE69534633T2; JPH10505745A; FR2724320A1; CA2199715C; US20060140920A1; EP0781344B1; US6960469B2; ATE310828T1; JP4014628B2; FR2724320B1; EP0781344A1; AU3390995A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN IMPLANTE DE CELULAS GENETICAMENTE MODIFICADAS QUE COMPRENDEN UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA EXOGENA QUE CODIFICA TODO O PARTE DE UN ANTICUERPO. SE REFIERE TAMBIEN A UN METODO DE PREPARACION DE TAL IMPLANTE ASI COMO A SU UTILIZACION TERAPEUTICA PARA EL TRATAMIENTO O LA PREVENCION DE UNA ENFERMEDAD ADQUIRIDA. SE REFIERE TAMBIEN A UN VECTOR ADENOVIRUS PARA LA EXPRESION DE UNA O VARIAS PROTEINAS CAPACES DE FORMAR UN MULTIMERO, A LAS PARTICULAS VIRALES Y LAS CELULAS QUE LO CONTIENEN ASI COMO A UNA COMPOSICION FARMACEUTICA Y A SU UTILIZACION TERAPEUTICA.

Description

Nuevo implante y nuevo vector para el tratamiento de enfermedades adquiridas.

La presente invención se refiere a un nuevo tipo de implante y a su uso para el tratamiento y la prevención del cáncer o del SIDA. Más particularmente, tiene por objeto un implante que comprende células modificadas genéticamente capaces de expresar y segregar anticuerpos específicos que reconocen a las células cancerígenas o células infectadas, con el fin de inhibir por lo menos parcialmente sus divisiones o propagaciones así como la producción de partículas víricas en las células infectadas. La presente invención se refiere además a un vector adenovírico capaz de dirigir la expresión de una proteína de interés multimérica así como de un anticuerpo o uno de sus derivados.

La posibilidad de tratamientos de enfermedades humanas mediante terapia génica ha pasado en algunos años del estado de las consideraciones teóricas al de las aplicaciones clínicas. El primer protocolo aplicado al ser humano se inició en los Estados Unidos en septiembre de 1990, en un paciente inmunodeficiente genéticamente, por culpa de una mutación que afecta el gen que codifica la adenina desaminasa (ADA). El éxito relativo de este primer experimento ha animado al desarrollo de nuevos protocolos de terapia genética para diversas enfermedades genéticas o adquiridas. Los que están en experimentación hoy en día consisten para la mayoría en transferir ex vivo el gen terapéutico en células del paciente, por ejemplo las células madre de la línea hematopoyética, y después reinyectar al enfermo sus células corregidas. Se trata por lo tanto de una tecnología pesada, no reversible y que presenta el riesgo de reimplantar células transformadas.

Iniciada más recientemente, la tecnología de los neórganos permite paliar los mayores inconvenientes de los protocolos clásicos de terapia génica. Se basa en la reimplantación en el paciente de una estructura artificial, que se puede denominar "implante", y que comprende células vivas, verdaderas "microfábricas" que permiten suministrar in vivo y de manera continua la molécula terapéutica de interés.

Más precisamente, esta estructura artificial está constituida por células vivas, transducidas previamente por un vector vírico que porta el gen terapéutico, que se incluyen en un gel de colágeno que envuelve a un armazón de fibras sintéticas de un material biocompatible (PTFE, politetrafluoroetileno o Gore-TexTM). Este gel contiene igualmente un factor de crecimiento angiogénico (bFGF, factor básico de crecimiento de fibroblastos bFGF (basic Fibroblast Growth Factor). Después de su reimplantación en el animal, el neoórgano se vasculariza generalmente en unos días gracias a las propiedades angiogénicas y tróficas del bFGF. Éste evoluciona entonces hacia una estructura autónoma, provista de un tejido conjuntivo, a veces inervada, y unida a la circulación en la que se vierten las moléculas terapéuticas.

Ya se ha mencionado la posibilidad de utilizar los neoórganos para la terapia génica en varios artículos científicos, así como en la solicitud internacional WO 92/15676. Sin embargo, la tecnología publicada en los documentos de la técnica anterior se dirige sólo al tratamiento de las enfermedades genéticas monogénicas que resultan de la expresión defectuosa e innata de un solo gen, y por lo tanto se ha utilizado solamente para la secreción de moléculas terapéuticas monoméricas como el factor IX, la \alpha_{1}-antitripsina, la ADA, la eritropoyetina (EPO) y la \beta-glucuronidasa. Hasta ahora, esta tecnología no se ha adaptado para la secreción de moléculas terapéuticas más complejas como los anticuerpos.

Se ha descubierto ahora que un implante de fibroblastos, modificados genéticamente por un vector retrovírico para la expresión de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo anti-VIH, una vez reimplantado en un ratón, es capaz de segregar de manera continua en la circulación sanguínea una cantidad importante de anticuerpos funcionales que reconocen a las células infectadas que portan en su superficie el antígeno contra el que está dirigido. La presente invención descansa sobre el hecho de que un fibroblasto es capaz de producir cantidades más o menos estequiométricas de cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo susceptible de asociarse después en tetrámero para formar una molécula funcional. Ofrece la posibilidad de tratar mediante inmunoterapia las enfermedades adquiridas y especialmente el SIDA y el cáncer, dos enfermedades cuya complejidad, gravedad, así como la ausencia de tratamientos realmente satisfactorios, justifican el desarrollo de nuevas tecnologías, tal como el objeto de la presente invención.

La presente invención suministra igualmente vectores adenovíricos capaces de dirigir la expresión de moléculas de interés multiméricas, así como anticuerpos y sus derivados. Se pueden utilizar para producir una inmunotoxina dirigida contra el virus del VIH, e inducir la destrucción selectiva de células infectadas.

Por ello, la presente invención tiene por objeto

Un implante de células modificadas genéticamente que comprende una secuencia nucleotídica exógena que codifica la totalidad o parte de un anticuerpo dirigido contra un antígeno tumoral o un epítopo específico de un microorganismo infeccioso y patógeno, poniéndose dicha secuencia nucleotídica exógena bajo control de los elementos necesarios para su expresión y para la secreción de dicho anticuerpo, fijándose dichas células a una matriz extracelular, y siendo segregado dicho anticuerpo por dicho implante capaz de unirse específicamente a dicho antígeno o dicho epítopo contra el cual está dirigido.

En el sentido de la presente invención, un implante designa cualquier conjunto de células vivas modificadas genéticamente, tales como se definen a continuación, y destinadas a ser implantadas en el cuerpo humano o animal. Se prefiere más particularmente el caso en el que las células se fijan a una matriz extracelular, formando el conjunto una estructura biocompatible y vascularizable. La matriz está compuesta preferentemente de colágeno. Sin embargo, se pueden utilizar otros materiales en el ámbito de la presente invención, en la medida en la que sean biocompatibles. Comprende especialmente (1) un soporte biocompatible como fibras sintéticas de PTFE (politetrafluoroetileno o Gore-Tex) revestidas de una película colagénica a fin de permitir la adhesión celular, (2) un gel de colágeno en el que se incluyen las células en el seno del implante, y (3) un agente angiogénico que favorece la vascularización en el hospedante. El término implante es un término genérico que incluye especialmente los neoórganos y los organoides.

Por otra parte, se puede tratar igualmente de implantes encapsulados, es decir, incluidos en una membrana de porosidad controlada que impide especialmente el paso de las células (células del implante y células del sistema inmunitario del huésped), pero que permite la difusión de la molécula terapéutica, de los nutrientes y de los residuos.

El término "célula modificada genéticamente" se refiere a una célula que ha incorporado material genético exógeno. Este último se puede insertar en el genoma de la célula, o puede estar presente en forma de episoma en el citoplasma o bien en el núcleo celular. La tecnología para introducir un material genético exógeno en una célula es convencional y está al alcance del experto en la materia. Por ello, se han desarrollado numerosos vectores, y se han descrito ampliamente en las obras base de biología molecular al alcance del experto en la materia.

Las células modificadas genéticamente, de uso en el ámbito de la presente invención, comprenden especialmente una secuencia nucleotídica exógena. Esta última puede ser una secuencia natural (ya presente en el genoma de la célula huésped) o heteróloga, pero habrá sido introducida en las células huéspedes mediante las técnicas de ingeniería genética (por lo tanto, de una manera exógena). Se prefiere muy particularmente una secuencia que codifica un producto que normalmente no se expresa en ésta, o, si se expresa, con concentraciones fisiológicas bajas. Conforme a los objetivos de la presente invención, la secuencia nucleotídica exógena codifica la totalidad o parte de un anticuerpo. Un anticuerpo es una proteína (inmunoglobulina) normalmente producida por los linfocitos B, y que reconoce un antígeno extraño particular, y que provoca la respuesta inmunitaria. Un anticuerpo nativo es un tetrámero compuesto de cuatro cadenas proteicas: dos cadenas ligeras (L) y dos cadenas pesadas (H por pesada (Heavy en inglés)), asociadas entre sí mediante puentes de disulfuro. La cadena ligera está constituida por una región variable (V_{L}) en posición N-terminal, y por una región constante (C_{L}) en posición C-terminal; mientras que la cadena pesada comprende, del N hacia el C-terminal, una región variable (V_{H}), seguida de tres regiones constantes (C_{H1}, C_{H2} y C_{H3}). Las regiones correspondientes de las cadenas ligeras y pesadas se asocian para formar dominios distintos. El dominio variable, formado por la asociación de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de una inmunoglobulina, es responsable del reconocimiento del antígeno correspondiente. Los dominios constantes ejercen funciones efectoras implicadas en el desarrollo de la respuesta inmunitaria.

Para los fines de la presente invención, las dos cadenas pesadas y ligeras pueden ser idénticas (anticuerpos nativos). En este caso, se utiliza una secuencia nucleotídica exógena que codifica una cadena pesada y una cadena ligera que se asociarán en tetrámero después de sus síntesis. Sin embargo, se puede utilizar igualmente una secuencia que codifica una sola parte de un anticuerpo, a fin de producir, preferentemente, un fragmento Fab (ab, por unión a antígeno (antigen binding en inglés)) o F(ab')_{2}, Fc (c, por cristalizable), o también scFv (sc, por cadena simple; y v, por variable). Tales fragmentos se describen con detalle en las obras de inmunología como Immunology (tercera edición, 1993, Roitt, Brostoff y Male, ed. Gambli, Mosby), y se representan esquemáticamente en la Figura 1. Haciendo referencia más específicamente al fragmento scFv, éste se puede obtener de una secuencia que codifica una región V_{L} seguida de una región V_{H}, eventualmente con un espaciador (de 1 a 10 restos de aminoácidos neutros y poco voluminosos) entre las secuencias V_{L} y V_{H}.

Igualmente, se puede generar un anticuerpo quimérico (o híbrido) que proviene de la fusión de secuencias de orígenes diversos (especies o tipos de anticuerpos). En particular, se pueden incluir o intercambiar regiones constantes que provienen de anticuerpos de isótopos diferentes, a fin de conferir al anticuerpo quimérico nuevas propiedades, por ejemplo una mejora de la reacción citotóxica. Igualmente se puede tratar de un anticuerpo humanizado que combina por lo menos una parte de las regiones variables de un anticuerpo de ratón, y regiones constantes de un anticuerpo humano. Igualmente se puede fusionar una o varias regiones o partes de regiones variables y/o constantes de cualquier origen, por ejemplo que provienen de cadenas ligeras y/o pesadas en forma de molécula de cadena simple.

Finalmente, otro enfoque consiste en producir un anticuerpo biespecífico que contiene dos dominios variables, por ejemplo, un dominio que reconoce un antígeno transportado por una célula tumoral o infectada, y el otro reconoce una estructura de activación de la respuesta inmunitaria. Esto permite aumentar la actividad de las células asesinas al contacto del tumor o de la célula infectada.

Es obvio que un anticuerpo de uso en la presente invención puede presentar una secuencia ligeramente diferente a la secuencia nativa de un anticuerpo. En la práctica, el denominador común para calificar a un anticuerpo es su función, es decir, su capacidad para unirse específicamente al antígeno contra el que va dirigido. Numerosas técnicas que figuran en las obras generales de inmunología permiten destacar una función anticuerpo, por ejemplo las técnicas ELISA, Western o de fluorescencia. La invención se extiende a un anticuerpo cuya secuencia tiene un grado de homología con la o las secuencias nativas (en el caso de un anticuerpo quimérico) superior al 70%, ventajosamente superior al 80%, preferentemente superior al 90%, más preferentemente superior al 95%. Tal análogo se puede obtener por mutación, supresión, sustitución y/o adición de uno o varios nucleótidos de la o de las secuencias correspondientes.

Conforme a los objetivos de la presente invención, se prefiere utilizar un anticuerpo dirigido contra un antígeno tumoral o un epítopo específico de un microorganismo infeccioso y patógeno, especialmente de un virus, y más particularmente del virus del VIH, y ventajosamente un antígeno fuertemente representado en la superficie de la célula diana. Este tipo de anticuerpo se describe ampliamente en la bibliografía. Se pueden citar especialmente:

-: el anticuerpo monoclonal humano 2F5 (Buchacher et al., 1992, Vaccines, 92, 191-195) que reconoce un epítopo continuo (ELDKWAS) y muy conservado de la glicoproteína transmembranaria gp41 de la molécula de la cubierta del VIH-1,

-: el anticuerpo monoclonal murino 17-1-A (Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 214-218) que reconoce la glicoproteína GA733 presente en la superficie de las células del carcinoma colorrectal humano,

-: un anticuerpo dirigido contra la proteína MUC-1, y

-: un anticuerpo dirigido contra la proteína E6 o E7 del virus HPV (virus de los papilomas humanos (Human Papilloma virus), especialmente de tipo 16 ó 18.

En el ámbito de la presente invención, las secuencias nucleotídicas que codifican un anticuerpo de uso en el ámbito de la presente invención se pueden obtener mediante cualquier técnica convencional de uso en el campo de la ingeniería genética, como la PCR (reacción en cadena de polimerasa (Polymerase Chain Reaction), la clonación y la síntesis química. A título totalmente indicativo, las secuencias que codifican las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo se pueden clonar mediante PCR utilizando oligonucleótidos degenerados que reconocen las secuencias conservadas encontradas en los extremos 5' y 3' de la mayoría de los genes de inmunoglobulinas (Persson et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2432-2436; Burton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10134-10137). Después, la función anticuerpo del producto de expresión se verifica frente a un antígeno específico como se indica anteriormente.

Otro enfoque, por otra parte preferido, consiste en utilizar un anticuerpo modificado por fusión, y una sustancia tóxica o una proteína inmunopotenciadora. Este modo de realización específico permite destruir in vivo, mediante una quimioterapia local (sustancia tóxica), a la célula diana (célula cancerígena o célula infectada) que transporta en su superficie el antígeno específico contra el que está dirigida la parte anticuerpo; o permite mejorar la reacción inmunitaria a su favor (sustancia inmunopotenciadora). En el contexto de la sustancia tóxica, puede ser ventajoso elegir anticuerpos que se puedan endocitar por la célula diana. Es obvio que las secuencias correspondientes se pueden obtener mediante cualquier técnica clásica en el campo de la técnica anterior.

El término "sustancia tóxica" hace referencia a una molécula que tiene una actividad de degradación que inhibe drásticamente el crecimiento celular, o que induce la muerte celular. Se puede tratar de una molécula tóxica en sí misma o de manera indirecta, por ejemplo una proteína que cataliza la síntesis de una sustancia tóxica. Estas moléculas pueden provenir de plantas, de animales o de microorganismos. Obviamente, la función tóxica se puede obtener mediante una sustancia tóxica nativa (tal como se encuentra en la naturaleza) o un análogo de ésta, el cual se puede obtener clásicamente mediante mutación, supresión, sustitución y/o adición de uno o varios nucleótidos de la secuencia nativa. Entre las sustancias tóxicas preferidas, se pueden citar una ribonucleasa, la ricina, la toxina diftérica, la toxina colérica, la timidina quinasa del virus del herpes simple de tipo I (TK-HSV-1), la citosina desaminasa de Escherichia coli o de una levadura de tipo Saccharomyces, y la exotoxina de Pseudomonas. Para ilustrar una proteína inmunopotenciadora (que tiene como función mejorar la reacción inmunitaria del organismo hospedante frente a la célula diana), se pueden citar la proteína CD4, receptor de alta afinidad para el virus del VIH-1, o un receptor Fc para IgG (Fc\gammaR). Su acoplamiento a un anticuerpo dirigido contra un antígeno del virus del VIH o tumoral permitirá, por lo tanto, generar una molécula híbrida que dispone de un ligante que reconoce a una célula asesina y un ligante que reconoce a la célula diana, a fin de promover más eficazmente su eliminación. En este ámbito, se puede utilizar una molécula híbrida que proviene de la fusión entre un anticuerpo anti-VIH y el Fc\gammaR, o entre el dominio extracelular de la molécula CD4 y un anticuerpo anti-CD3. Sin embargo, estos ejemplos no son limitativos, y tales proteínas inmunopotenciadoras son conocidas por el experto en la materia.

Ventajosamente, la función tóxica se obtiene mediante una ribonucleasa, que puede ser de origen procariota o eucariota. Entre las utilizables en el ámbito de la presente invención, se pueden citar la colicina E6, la cloacina de Escherichia coli, la nucleasa de Staphylococcus, la birnasa de Bacillus intermedius, y la nucleasa de Bacillus amyloliquefaciens, también denominada con el nombre de barnasa, cuya secuencia se divulga en Hartley (1988, J. Mol. Biol., 202, 913-915). Sin embargo, se prefiere muy particularmente utilizar la angiogenina humana (Saxena et al., 1991, J. Biol. Chem., 266, 21208-21214; Saxena et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 21982-21986).

Según otra variante, la función tóxica se puede ejercer mediante la TK-HSV-1. Ésta presenta una afinidad mayor con relación a la enzima TK mamífera por algunos análogos de nucleósidos como el aciclovir y el ganciclovir, y les convierten en precursores de nucleótidos tóxicos para la célula. Por lo tanto, sus incorporación en el ADN de las células en estado de replicación permite exterminar específicamente a las células en estado de división, como las células cancerígenas, mediante un efecto tóxico y/o mediante un efecto de proximidad (efecto "by stander" en inglés).

Según otro modo de realización de la invención, se puede utilizar un análogo atenuado que presenta también una función tóxica pero menor con relación a la sustancia tóxica nativa. En el ámbito de la invención se puede utilizar cualquier mutante que presente una actividad de degradación atenuada. En este contexto, se puede utilizar un mutante atenuado de una ribonucleasa que presenta una actividad atenuada en un factor de 10 a 10^{6}, o mejor de 10 a 10^{5} y, de manera muy preferida, de 10^{2} a 10^{4}, con relación a la ribonucleasa nativa de la que deriva. Esta variante se basa en la importante toxicidad de las ribonucleasas con respecto a los ARN celulares, lo que hace difícil las etapas de construcción molecular. A título de ejemplo, se pueden citar los mutantes atenuados de la barnasa K27A (Mossakowska et al., 1989, Biochemistry, 28, 3843-3850) y K27A, L89F (Natsoulis y Boeke, 1991, Nature, 352, 1632-1635). La actividad nucleasa se puede evaluar conforme al método descrito por Shapiro et al. (1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8783-8787). Obviamente, es posible medirla igualmente mediante otras técnicas, como la indicada en el ejemplo 2.

Una construcción particularmente preferida consiste en incluir la secuencia nucleotídica que codifica dicha sustancia tóxica o inmunopotenciadora en 5' o en 3' de la secuencia nucleotídica que codifica la totalidad o parte de un anticuerpo. Se prefiere especialmente el caso en el que se introduce corriente abajo de la secuencia que codifica la cadena pesada de un anticuerpo, siendo esta última suprimida del codón de parada de la traducción, y haciéndose la fusión en el buen cuadro de lectura. La fusión de dos secuencias de manera operacional constituye una técnica clásica de biología molecular al alcance del experto en la materia. Por otra parte, se puede incluir a nivel de la fusión una secuencia de unión capaz de ser rota en el seno de la célula diana para liberar la toxina. En este contexto, el término "secuencia nucleotídica exógena" hace referencia a una secuencia que codifica la totalidad o parte de un anticuerpo eventualmente fusionado a dicha sustancia.

Obviamente, dicha secuencia nucleotídica exógena se pone bajo el control de los elementos necesarios para su expresión. Por "elementos necesarios" se entiende el conjunto de los elementos necesarios para su transcripción en ARN mensajero (ARNm), y para la traducción de este último en proteína. Entre los elementos necesarios para la transcripción, el promotor tiene una importancia particular. De manera general, se recurre a un promotor funcional en una célula eucariota, y especialmente humana. Puede tratarse de un promotor constitutivo o de un promotor regulable, y se puede aislar de un gen cualquiera de origen eucariota o vírico. Por otra parte, un promotor de uso en la presente invención se puede modificar a fin de contener secuencias reguladoras como secuencias activadoras de tipo "potenciadoras". Alternativamente, se puede utilizar un promotor que derive de los genes de inmunoglobulinas cuando se busca seleccionar como diana a una célula huésped linfocitaria. Sin embrago, se prefiere recurrir a un promotor constitutivo que permita una expresión en un gran número de tipos celulares y, especialmente, un promotor de un gen de mantenimiento, tal como el promotor del gen TK-HSV-1, el promotor adenovírico E1A, MLP (por promotor tardío mayor (Major Late promoter, en inglés)), el promotor PGK (fosfoglicerato quinasa) murino o humano, el promotor del gen \beta-actina de rata (ACT), el promotor HPRT (hipoxantil fosforribosil transferasa), el promotor HMG (hidroximetil-glutaril coenzima-A), el promotor RSV (virus del sarcoma de Rous), el promotor precoz del virus SV40 (virus del simio), o también el promotor DHFR (dihidrofolato reductasa). A título indicativo, cuando la secuencia nucleotídica se incorpora en un vector retrovírico, la LTR 5' se puede utilizar como promotor. Sin embargo, se prefiere muy particularmente recurrir a un promotor no retrovírico interno, tales como los especificados anteriormente.

La secuencia nucleotídica exógena puede contener además otros elementos que contribuyen a su expresión tanto a nivel de la transcripción como de la traducción, especialmente una secuencia intrónica flanqueada por las señales de corte y empalme adecuadas, una secuencia de localización nuclear, una secuencia de iniciación de la traducción, los elementos de terminación de la transcripción (señal de poliadenilación), y/o una secuencia que codifica una señal de secreción. Esta última puede ser homóloga, es decir, que provenga del gen que codifica el anticuerpo en cuestión, o heteróloga, es decir, que deriva de un gen cualquiera que codifica un precursor de un producto de expresión segregado. La elección de tales elementos es amplia y será evidente para el experto en la materia.

Para los fines de la presente invención, la secuencia nucleotídica exógena provista de los elementos necesarios para su expresión se introduce en una célula huésped para dar una célula modificada genéticamente. Se puede utilizar cualquier protocolo que permita introducir un ácido nucleico en una célula, como por ejemplo la precipitación con fosfato de calcio, la técnica del DEAE dextrano, la inyección directa del ácido nucleico en la célula huésped, el bombardeo de micropartículas de oro cubiertas de ácido nucleico, o también la utilización de liposomas o de lípidos catiónicos. Sin embargo, en el ámbito de la presente invención, la secuencia nucleotídica exógena se inserta preferentemente en un vector de expresión. En particular, puede ser de tipo plasmídico o derivado de un virus animal, y especialmente de un retrovirus, de un adenovirus, de un virus asociado al adenovirus, o de un virus del herpes. Sin embargo, se prefiere utilizar un vector integrador. La elección de tal vector es amplia, y las técnicas de clonación en el vector elegido están al alcance del experto en la técnica. Igualmente conoce el procedimiento a utilizar para generar partículas víricas infecciosas.

Un primer vector particularmente adaptado para la presente invención es un vector adenovírico (véase a continuación).

Según otra alternativa ventajosa, se utiliza un vector retrovírico. En el ámbito de la presente invención se pueden utilizar los numerosos vectores descritos en la bibliografía, y especialmente los que derivan del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV) o de Friend (FrMuLV). De manera general, a un vector retrovírico de uso en la presente invención se le suprime la totalidad o parte de los genes víricos gag, pol y/o env, y comprende una LTR 5', una región de encapsidación y una LTR 3'. La secuencia nucleotídica exógena se inserta preferentemente en dirección 3' de la región de encapsidación. La propagación de tal vector necesita el uso de líneas de complementación descritas en la técnica anterior, tales como las líneas CRE, GP+E-86, PG13, Psi Env-am-12, pA317 y psi-CRIP.

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Según una forma de realización preferida, y tratando de producir un anticuerpo distinto de una cadena simple (que comprende, por ejemplo, dos cadenas proteicas pesadas y ligeras), se prefiere recurrir a un vector dicistrónico que permite la síntesis de los dos productos de traducción a partir de un único ARNm. La iniciación de la traducción del segundo producto de traducción se asegura, preferentemente, por un sitio IRES (por sitio interno de entrada al ribosoma (internal ribosome entry site, en inglés)). Hoy en día, se han identificado un cierto número de sitios IRES, y se puede citar el del virus de la poliomielitis (Pelletier et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 1103-1112), el del EMCV (virus de la encefalomiocarditis) (Jang et al., J. Virol., 1988, 62, 2636-2643), o los descritos en la solicitud internacional WO93/03143. Sin embargo, se pueden utilizar igualmente otros sitios IRES. Este tipo de construcción se puede adaptar a cualquier vector de uso en el ámbito de la invención.

Uno de los vectores preferidos en el ámbito de la presente invención es un vector retrovírico que comprende de 5' a 3':

(a): una LTR 5' que deriva de un retrovirus,

(b): una región de encapsidación,

(c): una secuencia nucleotídica exógena que comprende:

-: un promotor interno,

-: una primera secuencia que codifica la cadena pesada de un anticuerpo,

-: un sitio de iniciación de la entrada de los ribosomas,

-: una segunda secuencia que codifica la cadena ligera de un anticuerpo, y

(d): una LTR 3' que deriva de un retrovirus.

Otro vector retrovírico preferido comprende una secuencia nucleotídica exógena provista del promotor PGK murino, seguido de una primera secuencia que codifica los dominios I y II extracelulares de la molécula CD4, y de una segunda secuencia fusionada en fase con la primera y que codifica el segmento \gamma3 de la cadena pesada del anticuerpo 2F5 (sCD4-2F5), y, opcionalmente, de una tercera secuencia que codifica la angiogenina humana, unida con la segunda funcionalmente.

Es obvio que se puede invertir el orden de las primera, segunda y tercera secuencias. Por otra parte, como se indica en lo anterior, las secuencia nucleotídica exógena puede comprender una secuencia que codifica una sustancia tóxica o inmunopotenciadora. Esta se insertará preferentemente corriente abajo de la primera secuencia que codifica la cadena pesada de un anticuerpo. Sin embargo, la presente invención no se limita a esta forma de realización específica.

Por otra parte, un vector de uso en el ámbito de la invención puede contener igualmente otros elementos, por ejemplo un gen que codifica un marcador de selección que permite seleccionar o identificar las células huéspedes transfectadas. Se pueden citar el gen neo que confiere una resistencia al antibiótico G418, el gen dhfr, el gen CAT (cloranfenicol acetil transferasa), el gen de la puromicina acetil-transferasa (pac o PURO), o también el gen gpt (xantina guanina fosforribosil transferasa).

Preferentemente se elige una célula modificada genéticamente con el fin de ser tolerada por el sistema inmunitario del organismo hospedante en el que se preve injertar un implante según la invención. En este contexto, se prefiere muy particularmente una célula no tumoral y transfectable. Se puede tratar especialmente de células autólogas extraídas o que derivan de este organismo hospedante, pero también de células que se pueden tolerar después de un tratamiento adecuado químico o genético (por ejemplo, se puede considerar reprimir la expresión de los antígenos de superficie normalmente reconocidos por el sistema inmunitario del organismo hospedante). Se puede igualmente utilizar una célula singénica o una célula alogénica del mismo haplotipo que el organismo hospedante en lo que respecta a los antígenos de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad.

De manera preferida, una célula modificada genéticamente resulta de la introducción de la secuencia nucleotídica exógena en fibroblastos autólogos y, en particular, fibroblastos extraídos de la piel de un organismo hospedante. Sin embargo, se pueden utilizar otros tipos celulares, como las células endoteliales, los mioblastos, los linfocitos y los hepatocitos. Aunque no es una forma de realización preferida, se puede también recurrir a células tumorales (eventualmente atenuadas mediante radioterapia), extraídas de un organismo hospedante que presenta tumores, para modificar su patrimonio genético y volverlas aptas para inhibir o ralentizar la progresión del tumor.

Ventajosamente, un implante según la invención comprende de 10^{6} a 10^{12}, preferentemente de 10^{7} a 10^{11} y, de manera muy preferida, de 10^{8} a 10^{10} células modificadas genéticamente.

La presente invención se refiere igualmente a un método de preparación de un implante según la invención en el que se reúnen las células modificadas genéticamente y una matriz extracelular. Se pueden utilizar técnicas diferentes para generar un implante según la invención. Se prefiere proceder de la manera siguiente: las células modificadas genéticamente se ponen en contacto con una disolución de colágeno líquido, preferentemente de tipo I, de un soporte biocompatible constituido, por ejemplo, de fibras sintéticas de Gore-Tex revestidas de colágeno y de por lo menos un factor de crecimiento angiogénico, por ejemplo el bFGF o el VEGF (Factor de crecimiento del endotelio vascular (Vascular Endotelial Growth Factor). El conjunto se lleva hasta 37ºC a fin de que la disolución de colágeno forme un gel con una red densa que engloba a las células, y después se cultiva 4 a 5 días in vitro a fin de permitir que las células modificadas genéticamente colonicen el implante. Es deseable efectuar la última etapa de cultivo en un medio que contenga por lo menos un factor angiogénico o una combinación de dos o más. De manera general, las técnicas que permiten generar un implante y las condiciones de cultivo son conocidas por el experto en la materia.

Un implante según la invención se destina a ser injertado en un organismo hospedante, animal o, preferentemente, humano, a fin de producir un efecto terapéutico (curativo y/o preventivo). Injertado a un animal de laboratorio, permitirá evaluar especialmente los protocolos terapéuticos aplicables al ser humano. Preferentemente, el sitio de reimplantación es la cavidad peritoneal o subcutánea, intrarraquídea o también intraabdominal.

La invención se extiende igualmente al uso terapéutico de un implante según la invención para la preparación de una composición farmacéutica destinada más particularmente al tratamiento y/o a la prevención de una enfermedad adquirida como el cáncer o una enfermedad infecciosa causada por un microorganismo patógeno (virus, parásito o bacteria). Se dirige especialmente al tratamiento:

-: del cáncer de útero inducido por un virus del papiloma, contra el que se utilizará un implante que comprende fibroblastos autólogos en los que se ha introducido una secuencia que codifica un anticuerpo anti E6 o E7 de HPV (particularmente de tipo 16 ó 18),

-: del cáncer de mama, utilizando un anticuerpo anti-MUC1,

-: del SIDA, utilizando un anticuerpo dirigido contra un epítopo de la glicoproteína de cubierta conservada en numerosos aislados clínicos,

-: de la hepatitis, utilizando un anticuerpo dirigido contra un epítopo del virus de la hepatitis B ó C.

Obviamente, estos anticuerpos se pueden modificar mediante fusión, especialmente con la angiogenina, la barnasa o la TK-HSV-1.

La invención se refiere igualmente a un método de tratamiento o de prevención de las enfermedades adquiridas según el cual se genera in vitro un implante según la invención, y se le injerta a un paciente que necesite tal tratamiento. Los sitios de reimplantación pueden ser variados, como se menciona anteriormente. Una vez que se obtiene el efecto terapéutico deseado, basta con retirar quirúrgicamente el implante del paciente.

Naturalmente, las modalidades del protocolo terapéutico se deben de ajustar por el clínico en función del paciente y de la enfermedad que haya que tratar. Este protocolo puede estar sujeto a numerosas variantes como el número de implantes según la invención a injertar, el sitio de implantación y el tipo de anticuerpo segregado, así como el nivel de expresión. A título totalmente indicativo, se prefiere un nivel de expresión en el suero del paciente de al menos 50 ng/ml de anticuerpo funcional, ventajosamente de al menos 100 ng/ml, preferentemente de al menos 200 ng/ml y, de manera muy preferida, de al menos 500 ng/ml. Un anticuerpo funcional es un anticuerpo capaz de reconocer el antígeno contra el que está dirigido. La funcionalidad se puede poner en evidencia, por ejemplo, mediante ELISA o FACS. Por otra parte, cuando se utiliza un anticuerpo fusionado con la TK-HSV-1, es deseable incluir en el protocolo terapéutico la administración de aciclovir o de ganciclovir con el fin de que se pueda ejercer su efecto tóxico.

Por otra parte, la presente invención se refiere a un vector adenovírico recombinante que comprende una secuencia nucleotídica exógena que codifica la totalidad o parte de un anticuerpo dirigido contra un antígeno tumoral, o un epítopo específico de un microorganismo infeccioso y patógeno, y modificado mediante fusión con una sustancia tóxica o inmunopotenciadora, siendo dicha secuencia nucleotídica puesta bajo control de los elementos necesarios para su expresión, y siendo dicho anticuerpo capaz de unirse específicamente a dicho antígeno o a dicho epítopo contra el que está dirigido. Se refiere igualmente a un vector adenovírico recombinante que comprende una secuencia nucleotídica exógena que codifica la totalidad o parte de una o varias proteínas capaces de formar un multímero en una célula huésped y, preferentemente, un dímero o un tetrámero. Para los fines de la presente invención, se puede utilizar un solo vector recombinante según la invención para luchar contra una infección inducida por un organismo patógeno o contra el establecimiento/propagación de un tumor en un organismo o una célula huésped, y la secuencia nucleotídica exógena codifica la totalidad o parte de al menos un anticuerpo dirigido contra un antígeno tumoral o un epítopo específico de un microorganismo infeccioso y patógeno, siendo dicho anticuerpo capaz de unirse específicamente a dicho antígeno o dicho epítopo contra el que está dirigido.

Un vector adenovírico recombinante según la invención deriva, preferentemente, de un adenovirus humano de serotipo C y, más particularmente, de tipo 2, 5 ó 7. Sin embargo, se puede recurrir igualmente a otros adenovirus, especialmente de origen animal (canino, bovino, murino, aviar, ovino, porcino, o de simio), o a un híbrido entre varias especies. Se pueden citar más particularmente los adenovirus caninos CAV-1 o CAV-2, aviares DAV, o también bovinos Bad de tipo 3 (Zakharchuk et al., 1993, Arch. Virol., 128, 171-176; Spibey y Cavanagh, 1989, J. Gen. Virol., 70, 165-172; Jouvenne et al., 1987, Gene, 60, 21-28; Mittal et al., 1995, J. Gen. Virol., 76, 93-102). En Graham y Prevec (1991, Methods in Mol. Biol., Vol 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Ed: Murria, The Human Press Inc., p. 109-118) se publica la tecnología general que se refiere a los adenovirus.

Una forma de realización ventajosa de la presente invención consiste en utilizar un vector defectuoso para una o varias funciones víricas esenciales para la replicación, por el hecho de la supresión o de la no funcionalidad de uno o varios genes víricos que codifican dicha función. Tal vector, incapaz de replicación autónoma, se propagará en una célula de complementación capaz de suministrar en trans las proteínas, precoces y/o tardías, que no puede producir él mismo y que son necesarias para la constitución de una partícula vírica infecciosa. Este último término designa una partícula vírica que tiene la capacidad de infectar una célula huésped y de hacer penetrar en ella el genoma vírico. A título ilustrativo, para propagar un vector adenovírico defectuoso para la función E1, se recurre a una célula de complementación, tal como la línea 293, capaz de suministrar en trans el conjunto de la proteínas codificadas por la región E1 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). Obviamente, un vector según la invención puede comprender supresiones suplementarias, especialmente en la región E3, no esencial, a fin de aumentar las capacidades de clonación, pero igualmente en las regiones E2, E4, L1-L5 esenciales (véase la solicitud internacional WO94/28152). Las funciones defectuosas se pueden complementar con la ayuda de una línea celular o de un virus auxiliar.

A un vector adenovírico preferido según la invención se le suprime la mayoría de las regiones E1 y E3, y porta, en el lugar de la región E1, un casete de expresión que comprende:

(a) un promotor, el intrón del gen de la \beta-globina humana (BGL), las secuencias que codifican la cadena ligera del 2F5, el sitio IRES del virus EMCV y la cadena pesada del 2F5, y después el sitio de poliadenilación del gen de la \beta-globina humana, o

(b) un promotor, el intrón del gen de la \beta-globina humana, las secuencias que codifican la molécula sCD4-2F5 eventualmente fusionada en C-terminal y en el mismo cuadro de lectura con la angiogenina humana.

Entre los promotores factibles en el ámbito de la presente invención, se pueden citar el promotor precoz adenovírico E1A, el promotor tardío MLP (Major Late Promoter), el promotor murino o humano PGK (fosfoglicerato quinasa), el promotor precoz del virus SV40, el promotor del virus RSV (virus del sarcoma de Rous), un promotor activo específicamente en las células tumorales, y, finalmente, un promotor activo específicamente en las células infectadas.

La invención se refiere igualmente a una partícula adenovírica infecciosa así como a una célula huésped eucariota que comprende un vector adenovírico recombinante según la invención. Ventajosamente, dicha célula huésped es una célula de mamífero y, preferentemente, una célula humana, y puede comprender dicho vector en forma integrada en el genoma o no integrada (episoma). Puede tratarse de una célula primaria o tumoral de origen hematopoyético (célula madre totipotente, leucocito, linfocito, monocito o macrófago, etc.), muscular, hepático, epitelial o fibroblástico.

Una partícula vírica infecciosa según la invención se puede preparar según cualquier técnica convencional en el campo de la técnica (Graham y Prevect, 1991, supra), por ejemplo, mediante cotransfección de un vector y de un fragmento adenovírico en una célula apropiada, o también por medio de un virus auxiliar que suministra en trans las funciones víricas no funcionales. Se puede considerar igualmente generar el vector vírico in vitro en Escherichia coli (E. coli) mediante unión o también mediante recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la solicitud francesa 94 14470).

La invención tiene igualmente por objeto una composición farmacéutica que comprende, a título de agente terapéutico o profiláctico, un vector adenovírico, una partícula vírica infecciosa o una célula huésped eucariota según la invención, en asociación con un soporte farmacéuticamente aceptable. La composición según la invención se destina, en particular, al tratamiento preventivo o curativo de enfermedades adquiridas tales como los cánceres, las enfermedades víricas como el SIDA, la hepatitis B ó C, o las infecciones víricas recurrentes provocadas por el virus del herpes.

Una composición farmacéutica según la invención se puede preparar de manera convencional. Particularmente, se asocia una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico o profiláctico con un soporte tal como un diluente. Una composición según la invención se puede administrar por vía local, sistémica o por aerosol. Se prefiere especialmente la administración intramuscular, intratumoral, intrapulmonar y, muy particularmente, la inyección intravenosa. La administración se puede realizar en dosis única o repetida una o varias veces tras un cierto intervalo de tiempo. La vía de administración y las dosificaciones apropiadas varían en función de diversos parámetros, por ejemplo, del individuo o de la enfermedad a tratar, o también del o de los genes de interés a transferir. En particular, las partículas víricas según la invención se puede formular en forma de dosis comprendidas entre 10^{4} y 10^{14} ufp (unidades formadoras de placas), ventajosamente 10^{5} y 10^{13} ufp y, preferentemente, 10^{6} y 10^{11} ufp. Igualmente, la formación puede incluir un coadyuvante o un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Finalmente, la presente invención se refiere al uso terapéutico o profiláctico de un vector adenovírico, de una partícula vírica infecciosa o de una célula huésped eucariota según la invención, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cuerpo humano o animal y, preferentemente, mediante terapia génica. Según una primera posibilidad, el medicamento se puede administrar directamente in vivo (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, en un tumor accesible, en los pulmones mediante aerosol, etc.). Igualmente, se puede adoptar el enfoque ex vivo que consiste en extraer células del paciente (células madre de la medula ósea, linfocitos de la sangre periférica, células musculares, etc.), infectarlas in vitro según las técnicas de la técnica anterior, y readministrarlas al paciente.

La invención se refiere igualmente a un método de tratamiento o de prevención de las enfermedades adquiridas, según el cual se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector adenovírico recombinante, de una partícula adenovírica infecciosa o de una célula huésped según la invención, a un paciente que necesite de tal tratamiento.

La invención se ilustra a título de ejemplo no limitativo haciendo referencia a las figuras siguientes:

La Figura 1 es una representación esquemática de la estructura de un anticuerpo y de los fragmentos F(ab) y Fc.

La Figura 2 es una representación esquemática del vector pTG4370 que permite la expresión del anticuerpo 2F5.

La Figura 3 es una representación esquemática del vector pTG6356 que permite la expresión del anticuerpo 17-I-A acoplado con la barnasa nativa.

La Figura 4 es una representación esquemática del vector pTG6357 que permite la expresión del anticuerpo 17-I-A acoplado con la barnasa atenuada K27A.

La Figura 5 es una representación esquemática del vector pTG6355 que permite la expresión del anticuerpo 17-I-A.

La Figura 6 es una representación esquemática de la estructura de la proteína membranaria CD4.

La Figura 7 es una representación del esquema de construcción de las secuencias que codifican la molécula híbrida sCD4-2F5.

La Figura 8 es una representación esquemática del vector retrovírico pTG8338 que permite la expresión de la molécula híbrida sCD4-2F5.

La Figura 9 es una representación esquemática del vector pTG8373 que comprende las secuencias que codifican la molécula de fusión sCD4-2F5.

La Figura 10 es una representación esquemática del vector adenovírico pTG8357 que permite la expresión de la molécula híbrida sCD4-2F5.

La Figura 11 es una representación esquemática del vector adenovírico pTG8376 que permite la expresión de la molécula de fusión sCD4-2F5-angiogenina.

Ejemplos

Las construcciones siguientes, descritas a continuación, se realizan según las técnicas generales de ingeniería genética y de clonación molecular, detalladas en Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), o según las recomendaciones del fabricante cuando se utiliza un kit comercial. En cuanto a la reparación de los sitios de restricción, el llenado de los extremos 5' protuberantes se puede realizar con la ayuda del fragmento Klenow de la ADN polimerasa de Escherichia coli (E. coli) y la destrucción de los extremos 3' protuberantes en presencia de la ADN polimerasa del fago T4, o por tratamiento mediante nucleasa S1 seguido de una reparación mediante el Klenow. Las técnicas de PCR son conocidas por el experto en la materia, y se describen ampliamente en PCR Protocols, a guide to methods and applications (Ed: Innis, Gelfand, Sninsky y White, Academic Press, Inc.).

Las etapas de clonación que utilizan plásmidos bacterianos se efectúan preferentemente por paso en la cepa E. coli XL1-Blue (Stratagène), y las que se refieren a los vectores derivados del fago M13 por paso en E. coli NM522. Las mutagénesis se realizan mediante oligodesoxinucleótidos sintéticos con la ayuda de un kit comercial (por ejemplo, Amersham, RPN1523) y según las recomendaciones del fabricante.

Ejemplo 1

Preparación de un implante que segrega el anticuerpo 2F5 y que se destina a una inmunoterapia antiSIDA A. Construcción de un vector retrovírico dicistrónico para la expresión y la secreción del anticuerpo 2F5 anti-VIH

El vector base de las construcciones es el pLXSP que deriva de pLXSN (Miller y Rosman, 1989, BioTechniques, 7, 980-988). Este último es un vector retrovírico que comprende la LTR 5' del MoMuSV (virus murino del sarcoma de Moloney (Moloney Murine Sarcoma Virus), una región de encapsidación retrovírica, sitios múltiples de restricción, el gen neo de resistencia a la neomicina, bajo control del promotor SV40, y la LTR 3' del MoMuLV. El vector pLXSP se obtiene después, por una parte, de la sustitución del fragmento NheI-KpnI de la LTR 3' de pLXSN por un fragmento análogo que proviene de la LTR 3' del MPSV (Myélo Proliférative Sarcoma Virus) aislado del vector pMPSV.H-2K.IL-2R (Takeda et al., 1988, Growth Factors, 1, 59-66), y, por otra parte, de la introducción del gen de resistencia a puromicina en sustitución del gen neo. El gen puromicina se obtiene de pBabe Puro descrito en Morgenstern y Land (1990, Nucleic Acids Res., 18, 3587-3596).

El vector pLXSP se digiere mediante EcoRI y HpaI, y se introduce un fragmento EcoRI-PstI (después de la reparación del sitio PstI), aislado de pKJ-1 (Adra et al., 1987, Gene, 60, 65-74). Este fragmento porta el promotor del gen PGK de ratón. Después de la ligación, se obtiene el vector pTG2663. Éste se somete a una digestión mediante las enzimas ClaI y BamHI, a fin de eliminar el casete de expresión del gen puromicina. Después del tratamiento con el Klenow, y de la ligación, se obtiene el vector pTG2673 en el que se reconstituye el sitio BamHI.

El vector pTG2676 se obtiene por clonación del fragmento HindIII-EcoRI que comprende el ADNc que codifica la cadena ligera (LC) del anticuerpo monoclonal 2F5 en el plásmido Bluescript SK+ (Stratagène). Éste se puede clonar por PCR de un banco de ADNc que proviene de ARNm del hibridoma 2F5 (Buchacher et al., 1994, AIDS Research and Human Retroviruses, 10, 359-369; Katinger, 1992, Septième Colloque des Cent Gardes, 299-303), utilizando cebadores adecuados complementarios a las secuencias que flanquean el codón iniciador de la traducción y el codón de parada, tales como los cebadores OTG5168 y OTG5169 (SEC ID nº: 1 y 2). Se aísla del pTG2676 un fragmento XhoI-BamHI que porta el ADNc LC 2F5, que se inserta en el vector pTG2673 digerido anteriormente por las mismas enzimas, para generar pTG4336.

Este último se linealiza por la enzima NcoI y se somete a una ligación con, por una parte, el fragmento NcoI-EcoRI que proviene del pTG2677 y que porta el ADNc que codifica la cadena pesada (HC) del anticuerpo 2F5, y, por otra parte, el fragmento EcoRI-NcoI purificado de pTG4369 y que porta el sitio IRES de EMCV. El vector pTG2677 es un pBluescript SK+ en el que se ha introducido entre los sitios HindIII y EcoRI el ADNc HC 2F5 que porta los mismos extremos. Este último se ha obtenido mediante PCR del banco anterior, con la ayuda de los cebadores OTG5170 y OTG5171 (SEC ID nº: 3 y 4). En cuanto al vector pTG4369, éste proviene igualmente de la clonación en el pBluescript SK+ del fragmento XbaI-ClaI que corresponde al IRES EMCV (Jang et al., 1988, supra). La triple ligación genera el vector pTG4370 (Figura 2). Opcionalmente, el casete de expresión del gen puromicina se puede reintroducir en la parte plasmídica de pTG4370, con el fin de facilitar las etapas de selección. Se obtiene pTG6368.

Se generan partículas víricas infecciosas de la manera siguiente:

La línea de complementación ecótropa GP+E-86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120-1124) y las células diana NIH3T3 (células fibroblásticas de ratón), disponibles en el ATCC, se cultivan a 37ºC en presencia de 5% de CO_{2} en un medio DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) que contiene 10% de suero fetal de ternera (SVF) (GibcoBRL), 1 mM de glutamina, 1% de aminoácidos no esenciales y 40 \mug/l de gentamicina (medio DMEM completo). En vísperas de la transfección, las células GP+E-86 se ponen en cultivo a razón de 5 x 10^{5} células por caja de 10 cm. Al día siguiente, se transfectan 20 \mug de plásmido pTG4370 linealizado y 1 \mug de vector de selección (por ejemplo el vector pLXSP que porta el gen de resistencia a la puromicina), según el método tradicional con fosfato de calcio. Al día siguiente (D+1) las células se lavan según los métodos de la técnica anterior, y se ponen en un medio nuevo durante 48 horas antes de ser cultivadas a partir de D+3 en medio selectivo (5 \mug/ml de puromicina).

Al final de aproximadamente 2 semanas de selección, son visibles en la caja clones celulares resistentes al antibiótico. Éstos se aíslan según la técnica de la técnica anterior, y las células se resuspenden en medio selectivo en placas de cultivo de 96 pocillos. Se seleccionan los mejores clones productores de anticuerpos utilizando el método ELISA descrito a continuación, y los sobrenadantes se titulan en células diana NIH3T3. Para ello, en la víspera de la infección, éstas se siembran a 10^{5} células por pocillo. Las infecciones víricas se efectúan según el protocolo clásico descrito en la bibliografía. El método de titulación es el denominado del punto límite. El método ELISA permite titular la cantidad de anticuerpos funcionales 2F5 que reconocen al epítopo diana (ELDKWAS). Éste se sintetiza químicamente.

Rápidamente, se diluye una disolución de péptido (2 mg/ml) 2000 veces en un tampón (Na_{2}CO_{3} 15 mM, NaHCO_{3} 35 mM, pH 9,6), y se disponen 100 \mul en el fondo de cada pocillo de una placa de microtitulación, y se incuban a 4ºC durante 16 horas. Después de extensos lavados en un tampón PBS + 0,05% Tween-20, los pocillos se saturan mediante 50 \mul de BSA 1% disuelta en un tampón PBS 1 h a 37ºC. Después del lavado, se añaden 100 \mul de la muestra a ensayar o de una disolución de contraste. La placa se incuba 2 h a temperatura ambiente, y se lava extensamente con el tampón PBS-Tween 20. Después, se añaden 100 \mul de un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con la peroxidasa (concentración 0,8 mg/ml; Jackson Immuno Research Laboratories Inc, PA), diluida 1000 veces en un tampón PBS, 1% BSA. Después de 2 h a temperatura ambiente y de extensos lavados, la actividad enzimática peroxidasa se revela por adición de 100 \mul de la preparación siguiente (Na_{2}HPO_{4} 0,066 M, C_{6}H_{8}O_{7} 0,035 M pH 5, 0,04% de ortofenilendiamina y 0,014% de peróxido de hidrógeno). La reacción se detiene mediante 150 \mul de H_{2}SO_{4} 1M. La absorbancia se mide a 490 nm.

La disolución de contraste se obtiene de una fuente comercial (Virus Testing Systems, Houston) o de un sobrenadante de hibridoma concentrado sobre Centricon. La disolución de anticuerpo (1 \mug/ml) se diluye de 2 en 2 en un suero fetal de ternera. La absorbancia se mide para cada una de las diluciones, y se establece la curva de contraste (ng de anticuerpo en función de la absorbancia). Se determinan así los clones más productivos.

B. Preparación del implante 1/ Extracción y cultivo de fibroblastos primarios

Se efectúan biopsias de piel en ratones hembra BALB/C de 2 a 3 días. Sin embargo, otras líneas de ratones pueden convenir igualmente. Después de una disociación mecánica basta, el extracto se coloca en 30 ml de medio DMEM completo, en presencia de 5000 unidades de dispasa (Collaborative Medical Products) y de 1% de colagenasa (Sigma). Tras 2 horas a 37ºC, la mezcla se diluye, y se recolectan las células mediante centrifugación, se lavan cuidadosamente antes de ser resuspendidas en un medio RPMI 1640 (Gibco BRL). Tras aproximadamente una semana de cultivo, los fibroblastos primarios se infectan mediante los sobrenadantes de cultivo de los clones productores seleccionados según la etapa (A), según el protocolo clásico. Se puede igualmente reimplantar células fibroblásticas NIH3T3, como modelo. Se cultivan como se indica anteriormente, y se infectan de manera convencional. La presencia del anticuerpo 2F5 en los sobrenadantes de células NIH3T3 infectadas por uno de los clones productores se ha seguido mediante el ensayo de ELISA, y se ha evaluado a 500 ng/ml/24h, o sea, una productividad de más de 1 \mug/10^{6} células/24h.

2/Preparación de un neoórgano

Las fibras de PTFE anteriormente sometidas a autoclave (Gore Inc, AZ) se ponen, en primer lugar, en presencia de una disolución de colágeno de cola de rata (disolución al 0,5 mg/ml en ácido acético 0,1 N), durante 2 horas a vacío. Después, se extienden en el fondo de un pocillo (placa de 12 pocillos), se esterilizan con UV, se rehidratan mediante tampón PBS durante una noche antes de ser tratadas 2 horas a temperatura ambiente con factores angiogénicos (10 ml de PBS que contiene 2 \mug de bFGF y 1 \mug de VEGF por aproximadamente 100 mg de fibras).

Paralelamente, los fibroblastos (primarios o NIH3T3) infectados se tripsinan rápidamente. Se resuspenden 1,5 x 10^{7} células en 0,2 ml de medio, y después se añaden 2 ml de la mezcla siguiente por pocillo: 200 \mul de RPMI 10x, 24 \mul de bicarbonato de sodio 7,5%, 5 \mul de Hepes 1 M, 20 \mul de gentamicina, 20 \mul de glutamina, 2 \mul de bFGF (10 ng/\mul), 2 \mul de EGF (Factor de Crecimiento Epidérmico (Epidermal Growth Factor) (10 ng/\mul), 1,5 ml de colágeno (2 mg/ml), 12 \mul de NaOH (10 N) y 15 \mul de H_{2}O. Después de 30 a 60 minutos de incubación a 37ºC, se observa una polimerización de la mezcla. Ésta se cultiva a 37ºC durante aproximadamente 4 días, en presencia, para la última noche, de factores angiogénicos (bFGF y VEGF).

C. Reimplantación del implante

Se introducen uno o dos implantes en la cavidad peritoneal de ratones hembra BALB/c o bien de ratones Swiss atímicos. Un mes después de su implantación, se verifica que estén unidos al tejido adiposo de la cavidad abdominal, y que estén vascularizados. Por otra parte, se toman muestras de sangre regularmente a lo largo del mes siguiente de la implantación, y la cuantificación del anticuerpo 2F5 mediante ELISA (según la técnica descrita anteriormente) da valores del orden de 20 ng/ml de suero en los ratones singénicos BALB/c, y sobrepasan los 100 ng/ml de suero en los ratones atímicos. El nivel de anticuerpo se mantiene durante un periodo de más de 6 a 7 semanas después de las implantación.

La eficacia de los anticuerpos 2F5 para inhibir la infección vírica por VIH se evalúa en ratones SCID (Severe Combined Immuno Deficiency). Se trata de ratones inmunodeficientes que no poseen células T, ni células B maduras, que, por otra parte, se pueden humanizar mediante introducción de células o tejidos humanos. Este tratamiento les hace infectables por el virus del VIH (Namikawa et al., 1988, Science, 242, 1684-1686).

Se implantan uno a dos neoórganos que segregan el anticuerpo 2F5 en la cavidad abdominal de ratones SCID humanizados mediante inyección intraperitoneal de células linfocitarias humanas CEM A3 (40 x 10^{6} células). Tres a cinco semanas después del injerto, los ratones se ensayan mediante el virus del VIH (1000 TCID_{50} de VIH1 aislado Bru por vía intravenosa). Las células del animal se recuperan 3 días después de la infección, y se cultivan. El sobrenadante celular se extrae a intervalos de tiempo regulares, y se determina la actividad de transcriptasa inversa. Se constata que las células humanas están protegidas contra la infección por el VIH, y que la protección se mantiene durante todo el experimento (50 días). En efecto, la actividad de transcriptasa inversa se sitúa por debajo del nivel de detección en los ratones injertados con los implantes que segregan el anticuerpo 2F5 (comportamiento similar al testigo no infectado). Estos datos demuestran una inhibición de la replicación del VIH en los animales que producen el 2F5 en su circulación sanguínea.

Ejemplo 2

Preparación de un implante para una inmunoterapia anti-cáncer A. Construcción del vector retrovírico dicistrónico para la expresión y la secreción del anticuerpo 17-I-A

En primer lugar, el plásmido pBluescript SK+ se digiere mediante NotI, y después se somete a un tratamiento mediante el gran fragmento Klenow de la ADN polimerasa, antes de ser religado sobre sí mismo. Se genera el vector pTG6336, en el que se ha destruido el sitio NotI. Paralelamente, el ADNc que codifica la cadena ligera del anticuerpo 17-I-A se aísla mediante PCR de un banco de ADNc construido a partir de ARNm aislado de las células del hibridoma 17-I-A (Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 214-218; Herlyn et al.,1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1438-1442). A título indicativo, este anticuerpo está dirigido contra un epítopo de la glicoproteína transmembranaria GA733-2 (Szala et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3542-3546), presente en la superficie de las células del carcinoma colorrectal humano. La PCR utiliza los cebadores OTG6114 y OTG6115 (SEC ID nº: 5 y 6), obtenidos a fin de introducir sitios de restricción que facilitan las etapas de clonación ulteriores, los sitios EcoRI y NcoI en 5' y los sitios BglII y XbaI en 3', respectivamente. Después de la verificación sobre gel de agarosa, el fragmento de PCR así generado se digiere mediante EcoRI y XbaI, y después se clona en el pTG6336 entre estos mismos sitios. Se genera el pTG6339.

Este último se digiere mediante EcoRI y NcoI, y se liga al fragmento EcoRI-NcoI de pTG4369 que porta el sitio IRES, para dar pTG6343. Se introduce en este último el ADNc que codifica la cadena pesada del anticuerpo 17-I-A desprovista del codón de parada, en cuyo lugar se inserta un pequeño espaciador que codifica los residuos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. El ADNc HC 17-I-A se obtiene mediante PCR a partir del banco anterior de ADNc y utilizando los oligonucleótidos OTG6192 y OTG6194 (SEC ID nº: 7 y 8). La inserción del fragmento de PCR digerido por SalI-EcoRI permite generar el pTG6346.

Este último se linealiza mediante NotI, y después se liga a un fragmento NotI que porta la secuencia que codifica la barnasa, para dar pTG6347. El gen que codifica la barnasa se obtiene mediante PCR, a partir de una preparación de ADN genómico de Bacillus amyloliquefaciens y de los cebadores OTG5147 y OTG5148 (SEC ID nº: 9 y 10). Los oligonucleótidos se han concebido a fin de introducir un sitio de restricción NotI en 5' del codón correspondiente al primer aminoácido de la barnasa madura, y en 3' del codón de parada. Se verifica que la secuencia del fragmento PCR así generado está conforme con la publicada en Harley (1988, J. Mol. Biol., 202, 913-915).

Paralelamente, el fragmento NotI se inserta en un vector de tipo M13, por ejemplo el vector M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene, 26, 91-99), en el que anteriormente se ha introducido un sitio NotI en el seno de los sitios de clonación mediante mutagénesis dirigida. La modificación de sitios de restricción por mutagénesis dirigida es una técnica conocida por el experto en la materia. El vector así obtenido se somete a una mutagénesis dirigida con la ayuda del oligonucleótido OTG5299 (SEC ID nº: 11), a fin de modificar el residuo lisina (Lis o K), en posición 27 de la barnasa nativa, por un residuo alanina (Ala o A). Después, se aísla el fragmento NotI modificado, que se introduce como anteriormente en el vector pTG6346, para dar pTG6348.

El fragmento SalI - BglII, aislado del vector pTG6347 o pTG6348, se transfiere en el vector pTG2673, digerido anteriormente por XhoI y BamHI. Se obtienen los vectores pTG6356 y pTG6357, respectivamente (Figuras 3 y 4).

Por otra parte, se construye un vector dicistrónico que contiene las secuencias que codifican el HC 17-I-A, el IRES EMCV seguido de LC 17-I-A. El fragmento HC provisto de un codón de parada se obtiene mediante PCR del vector pTG6346 con los oligonucleótidos OTG6192 (SEC ID nº: 7) y OTG6193 (SEC ID nº: 12). Este fragmento PCR, que está provisto de sitios SalI y EcoRI en sus extremos 5' y 3', respectivamente, se inserta en el vector pTG6343, digerido por las mismas enzimas, para dar el pTG6345. El fragmento SalI-BglII de este último se clona entre los sitios XhoI y BamHI del pTG2673. Se obtiene el vector pTG6355 (Figura 5).

Se generan partículas víricas mediante transfección de las células GP+E-86 con los vectores pTG6355, pTG6356 y pTG6357 (cotransfección con pLXSP), según la técnica descrita en el ejemplo 1, con la diferencia de que se ensayan los clones transfectados para la producción de anticuerpo 17-I-A como se indica a continuación. Se reparten 100 \mul de anticuerpo de cabra antiinmunoglobulina murina (Southern Biotechnology), diluidos anteriormente 100 veces en un tampón (80 mM Na_{2}CO_{3}, 200 mM NaHCO_{3}, pH 9,6), en los pocillos de una placa de microtitulación (Nunc), y se incuban una noche a 4ºC. Los anticuerpos no absorbidos se eliminan mediante lavados extensos con un tampón PBS 1X, 10 mM EDTA, 0,05% Tween 20. Los pocillos se saturan por adición de 200 \mul de una disolución PBS 1X, 1% BSA (Bovine Serum Albumine), 1 h a 37ºC. Después de esta etapa, la placa se lava nuevamente, y después el intervalo de testigo (diluido en PBS 1X, 1% BSA) o los sobrenadantes de cultivo a ensayar se disponen y se incuban durante 2 h a temperatura ambiente en agitación. Después de varios lavados, las placas se incuban con 100 \mul de un anticuerpo de cabra anti-Ig_{2}a, (isotipo del 17-I-A), acoplado con la biotina (Southern Biotechnology), diluido 5000 veces en un tampón PBS 1X, 1% BSA. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente en agitación, el exceso se elimina mediante 8 lavados, y después se distribuyen 100 \mul de una disolución de peroxidasa-estreptavidina (Amersham), diluida 1000 veces. Después de una incubación de 45 min., seguida de extensos lavados, la actividad enzimática se revela mediante adición de 100 \mul de la disolución de sustrato (para una placa: 12,5 ml de tampón 25 mM citrato, 50 mM Na_{2}HPO_{4}, pH 5; 1 pastilla de 5 mg de OPD (ortofenoldiamina, Sigma); 5 \mul de H_{2}O_{2} 35%). La reacción se detiene mediante adición de 25 \mul por pocillo de H_{2}SO_{4} 3 M. Se lee entonces la absorbancia a 490 nm.

La cantidad de anticuerpo presente en los sobrenadantes de cultivo se establece en función de un intervalo de contraste preparado según lo siguiente: se inyectan las células del hibridoma 17-I-A a ratones "atímicos". Después de la formación de la ascitis, se extrae el líquido ascítico a partir del cual se purifica el anticuerpo 17-I-A por paso en una columna de proteína A sefarosa. Se trata de una técnica convencional al alcance del experto en la materia. Se prepara una disolución de anticuerpo 17-I-A purificado, con una concentración de 1 \mug/ml, y después se diluye de 2 en 2 en un tampón PBS. Se mide la absorbancia para cada una de las diluciones, y se establece la curva de contraste (ng de anticuerpo en función de la absorbancia). Los clones más productivos segregan, según el vector transfectado, de 200 a 900 ng de anticuerpo 17-I-A/10^{6} células/24h.

B. Preparación del implante

Las células NIH3T3 se infectan mediante los clones más productivos (que provienen de la transfección de las células GP+E-86 por los vectores pTG6355, pTG6356 y pTG6357), y los sobrenadantes de cultivo se ensayan mediante ELISA para la secreción de anticuerpo 17-I-A. Se observa un porcentaje de anticuerpo que varía de 100 a 1000 ng/10^{6} células/24h, según las construcciones.

Por otra parte, se verifica que el anticuerpo producido reconoce el antígeno GA733 expresado por las células SW948. Para ello, se utiliza la técnica de citometría de flujo. Las células SW948 (ATCC CCL237) se cultivan en medio DMEM completo. Se despegan por acción de la tripsina, se cuentan, y después se reparten 5x10^{5} células en pocillos de una placa de 96 pocillos. Esta placa se centrifuga 1 min. a 1000 rpm, sin ralentizar, para separar las células. Se elimina el sobrenadante, y después se centrifuga la placa y las células se resuspenden en 100 \mul de tampón FACS (PBS catiónico 1X, 1% BSA, 0,1% \gamma-globulinas humanas, 5 mM EDTA). Se centrifuga nuevamente la placa, y se elimina el sobrenadante. Entonces, las células se resuspenden en el sobrenadante de cultivo a ensayar o en una dilución del anticuerpo testigo en un tampón FACS, y se incuban 1 h a 4ºC. Se realizan entonces 4 lavados en las condiciones descritas anteriormente, y después las células se resuspenden en 100 \mul de un fragmento F(ab')_{2} de cabra anti-inmunoglobulina de ratón, acoplado con la fluoresceína (DTAF) (Jackson Immuno Research Laboratories), diluido 100 veces en un tampón FACS. Una nueva incubación de 1 h a 4ºC permite que el anticuerpo se fije. El exceso se elimina entonces mediante 4 lavados, y finalmente las células se resuspenden en 300 \mul de PBS catiónico 1X antes de ser analizadas con un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson). Se observa que todos los sobrenadantes NIH3T3 ensayados (que resultan de la infección con los 3 tipos de partículas víricas) segregan un anticuerpo capaz de fijarse sobre la proteína diana GA733.

En el caso de construcciones en las que el anticuerpo se fusiona a la barnasa, o a la versión atenuada de ésta (pTG6356 y pTG6357), es interesante poder verificar que el anticuerpo fusionado tiene una actividad nucleásica. Para ello, se sigue la degradación de un ARNt. Se añaden 100 \mul de sobrenadantes a ensayar, o de una disolución de Rnasa A de concentración conocida (como testigo de reacción), a 200 \mul de 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,5 mg/mg de BSA y 1 mg/ml final de ARNt, y se incuban a 37ºC durante 30 min. Entonces, los tubos se colocan en hielo y se añaden 700 \mul de ácido perclórico al 6% para precipitar el ARNt durante 10 min. en hielo. Una centrifugación de 10 min. a velocidad máxima, a 4ºC, permite separar el ARNt, dejando en suspensión los nucleótidos libres liberados por acción de la enzima. Se lee entonces la absorbancia de estos nucleótidos a 260 nm.

El implante se puede constituir según el método indicado en el ejemplo 1 por incorporación de fibroblastos murinos primarios o mediante células NIH3T3 transducidas con los vectores pTG6355, pTG6356 o pTG6357.

Ejemplo 3

Preparación de un implante que segrega una inmunoadhesina y destinado a una inmunoterapia antiSIDA

Se trata aquí de producir una inmunoadhesina que resulta de la fusión de una molécula "adhesiva", que liga la glicoproteína del virus del VIH, y de una inmunoglobulina que estabiliza la estructura y que confiere una inmunidad no específica. La parte adhesiva deriva de la proteína membranaria CD4 (estructura representada en la Figura 6) de la que se retiene la parte N-terminal (secuencia señal y dominios I e II de la región extracelular). Varios estudios han mostrado que son capaces de ligar ellos solos la gp120, de bloquear la interacción y la penetración del VIH en las células diana CD4^{+} (Traunecker et al., 1988, Nature, 331, 84-86; Deen et al., 1988, Nature, 331, 82-84; Hussey et al., 1988, Nature, 331, 78-81; Fisher et al., 1988, Nature, 331, 76-78). La parte inmunoglobulínica está constituida por la región \gamma3 constante (región eje -CH2-CH3) del anticuerpo 2F5. La molécula híbrida se denomina en lo sucesivo como sCD4-2F5.

La construcción se realiza de la manera siguiente (véase Figura 7)

Las secuencias que codifican la región sCD4 (secuencia señal - dominios I e II) se aíslan clásicamente mediante PCR. Como matriz, se utiliza el ADNc CD4 descrito en la bibliografía (obtenido a partir de ARNm de células CD4^{+}), o un plásmido de la técnica anterior, en el que se clona el ADNc (Jay Maddon et al., 1985, Cell, 42, 93-104), que se hibrida a los cebadores OTG7094 y OTG7095 (SEC ID nº: 13 y 14). La primera permite introducir un sitio XhoI y secuencias consenso de tipo Kozak corriente arriba del ATG iniciador de CD4, y la segunda porta nucleótidos que corresponden, por una parte, al extremo C-terminal del dominio II CD4 y, por otra parte, al extremo N-terminal de la región eje del 2F5 HC. La reacción se desarrolla en 25 ciclos (1 min. a 94ºC, 2 min. a 50ºC y 3 min. a 72ºC).

Las secuencias que codifican el segmento \gamma3 constante del 2F5 HC se amplifican igualmente mediante PCR. Se utiliza el plásmido pTG2677 y los cebadores OTG7097 y OTG7096 (SEC ID nº: 15 y 16). La primera es complementaria a OTG7095, y la segunda recubre el sitio XmaI situado en el seno de la región CH3.

Los productos PCR así generados se extienden sobre 30 pb. Se rehibridan y se someten a una segunda reacción de amplificación que se desarrolla en 2 etapas: en primer lugar, una amplificación lineal para extender el producto rehibridado (10 ciclos: 1 min. a 94ºC, 2 min. a 37ºC y 3 min. a 72ºC), seguido de una amplificación exponencial en presencia de los cebadores OTG7094 y OTG7096 (SEC ID nº: 13 y 16) (20 ciclos: 1 min. a 94ºC, 2 min. a 50ºC y 3 min. a 72ºC).

El producto final se inserta entre los sitios XhoI y XmaI de pTG2677 para dar pTG8332, a fin de reconstituir la molécula sCD4-2F5 completa. Ésta se corta mediante escisión por digestión XhoI-BamHI, y se clona en dirección 3' del promotor PGK murino, en el vector pTG6368. Se obtiene pTG8338 (Figura 8).

Las células NIH3T3 se transfectan mediante 10 \mug de pTG8338 linealizado por BglII. Dos días después, las células se cultivan en concentración creciente de puromicina (5 a 75 \mug/ml). La expresión de la proteína sCD4-2F5 se verifica mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo que reconoce o bien la parte CD4 (Leu3A; Becton Dickinson) o bien la parte 2F5 (anticuerpo monoclonal de ratón anti-región eje de una IgG3 humana; Interchim), y un conjugado constituido por un anticuerpo de burro anti-Ig de ratón acoplado a la fluoresceína (Jackson Laboratories). Se observa que aproximadamente un 30% del conjunto celular expresa un nivel detectable de inmunoadhesina. Por esta razón, los clones productivos se aíslan mediante dilución clonal.

La producción de las partículas víricas se efectúa en las células GP+E-86 transfectadas según el protocolo clásico y seleccionadas en presencia de puromicina. Después, las células diana NIH3T3 se infectan mediante el sobrenadante celular, y los análisis de inmunofluorescencia confirman la expresión del transgen en el 100% de las células.

La cuantificación se realiza mediante ELISA. En primer lugar, se disponen 500 ng de glicoproteína de cubierta gp160 del virus VIH-1 para fijar la parte CD4 de la molécula CD4-2F5. Se produce por vía recombinante, tal como se indica en la solicitud internacional WO92/19742. Después, se añade el sobrenadante a cuantificar y, finalmente, un anticuerpo dirigido contra la parte 2F5 (anticuerpo de cabra anti-Ig humana conjugado con la peroxidasa; Interchim). La disolución de contraste está constituida por la inmunoadhesina recombinante purificada de los sobrenadantes de cultivo sobre columna de sefarosa-proteína G con alto rendimiento (Pharmacia). Se mide una productividad superior a 10 \mug/ml/24h/10^{6} células en los sobrenadantes de las células NIH 3T3 infectadas. Este ensayo indica igualmente que la proteína es capaz de fijar la gp160 y, por lo tanto, sería apta para ligar el virus del VIH a fin de ejercer su función terapéutica.

Las células NIH3T3 infectadas se amplifican por cultivo en frascos F175. Se generan 4 organoides que contienen cada uno aproximadamente 10^{7} células, aplicando la tecnología detallada en el ejemplo 1, y se injertan en la cavidad peritoneal de 4 ratones hembra BALB/c atímicos. La secreción de la inmunoadhesina en el suero se sigue hasta 5 semanas después de la implantación (cuantificación mediante ELISA). Los resultados indican una concentración del orden de 100 a 200 \mug/ml y una secreción continua durante el experimento.

Ejemplo 4

Preparación de un implante que segrega una proteína que resulta de la fusión de la inmunoadhesina sCD4-2F5 y de la angiogenina humana

La angiogenina es una proteína plasmática de 14,1 kDa que pertenece a la familia de las enzimas ribonucleolíticas. Sin embargo, su acción lítica es más limitada que la de la ribonucleasa A de referencia (Rnasa A), y muestra una marcada preferencia por algunos ARNs (especialmente para los ARNs ribosómicos 18S y 28S, y los ARNs de transferencia). El gen y el ADNc ya se han clonado desde hace una década (Kurachi et al., 1985, Biochemistry, 74, 5494-5499).

La fusión de las secuencias que codifican la angiogenina corriente abajo de sCD4-2F5 debería permitir la síntesis de una proteína capaz de seleccionar y destruir las células infectadas por el VIH. Éstas se han obtenido mediante PCR del plásmido pHAG1 (Kurachi et al., 1985, supra), con la ayuda de los cebadores OTG10089 y OTG10090 (SEC ID nº: 17 y 18) que comportan en sus extremos 5' los sitios de restricción EcoRI y BamHI situados respectivamente en 5' del primer codón de la proteína madura y en 3' del codón de parada.

Por razones de impedimento estérico, se elige introducir un espaciador entre las dos entidades. La reacción PCR se efectúa con la ayuda de la matriz pTG2677 y de los oligonucleótidos OTG10087 y OTG10088 (SEC ID nº: 19 y 20), a fin de amplificar la parte del gen 2F5 que se extiende del sitio XmaI (en el seno de CH3) hasta el codón de parada. El cebador OTG10088 está concebido para eliminar el codón de parada e introducir en 3' un sitio BamHI, así como el espaciador que codifica los residuos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.

Los dos fragmentos PCR obtenidos, flanqueados por un sitio BamHI, se ligan juntos. Se aísla el fragmento XmaI-EcoRI, que se inserta primero en el pBluescript, a fin de verificar la secuencia, y finalmente en el vector pTG8332, para reconstituir la secuencia de fusión completa "sCD4-2F5-Angiogenina". Se obtiene pTG8373 (Figura 9). El bloque completo se puede cortar mediante digestión XhoI-BglII, y se clona en el vector retrovírico pTG6368 linealizado mediante XhoI y BamHI. Las partículas víricas pueden estar constituidas como anteriormente, y los organoides se pueden generar a partir de células diana infectadas NIH 3T3 o fibroblastos primarios.

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Ejemplo 5

Preparación de un vector adenovírico que expresa la inmunoadhesina sCD4-2F5

Se indican a continuación los fragmentos de genoma adenoviral utilizados en las construcciones descritas, precisamente según sus posiciones en la secuencia nucleotídica del genoma del adenovirus de tipo 5 (Ad5), tal como se publica en el banco de datos Genebank con la referencia M73260.

El intrón y la señal de poliadenilación (pA) del gen humano de la \beta-globina se obtienen del vector pBCMG/neo (Karasuyama, 1988, Eur. J. Immuno., 18, 97-104; Karasuyama, 1989, J. Exp. Med. 169, 13-25), y se introducen en el plásmido pREP4 (In Vitogen^{TM}) en dirección 3' de la LTR 3' del virus RSV. El casete "promotor RSV-intrón-pA \beta-globina" se aísla del vector anterior en forma de un fragmento SalI-BamHI, y se inserta en el vector pTG9350. Este último proviene de la clonación de las secuencias genómicas del Ad5 que se extiende de los nucleótidos 1 a 458 y 3328 a 5788 en el p polyII (Lathe et al., 1987, Gene, 57, 193-201).

Se introduce en el vector pTG8346, obtenido en la etapa anterior, (entre el intrón y el pA) un poliligador provisto de sitios múltiples de clonación (EcoRI, XhoI, NotI, XbaI, SpeI, BamHI, EcoRV, HindIII, ClaI, KpmI y BglII), para crear pTG8347.

Las secuencias que codifican la proteína híbrida sCD4-2F5 se aíslan del vector pTG8338 (Ejemplo 3) mediante digestión XhoI-BamHI, y se introducen en el vector pTG8347 separado mediante ruptura por XhoI y BglIII, para generar pTG8349, el cual permite sus expresiones bajo control del promotor RSV.

Se utiliza la técnica de recombinación homóloga in vitro (descrita en la solicitud francesa 94 14470) para reconstituir el genoma completo del vector recombinante. Para ello, se utiliza el vector pTG4656 que comprende el genoma del Ad5 al que se le han suprimido las regiones E1 y E3 (Ad5 1 a 458 - promotor MLP Ad2 - gen LacZ - pA SV40 - Ad5 3329 a 28529 y 30470 a 35935). Igualmente puede ser conveniente cualquier otro vector adenovírico E1^{-} E3^{-}, como los descritos en la solicitud internacional WO94/28152. Las células BJ5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580) se cotransforman mediante pTG4656 linealizado por la enzima ClaI (10 a 20 ng) y el fragmento PacI-BstXI purificado de pTG8349 (exceso molar de 10 veces aproximadamente). La recombinación a nivel de las secuencias adenovíricas homólogas lleva a la sustitución del casete LacZ de pTG4656 por el de sCD4-2F5 (Promotor RSV - intrón \beta-globina - gen sCD4-2F5 - pA \beta-globina) que porta el fragmento que proviene de pTG8349. Se genera el vector pTG8357 (Figura 10).

Los virus recombinantes se obtienen mediante transfección de pTG8357 en las células 293 (ATCC CRL1573). Se seleccionan 5 placas que se amplifican mediante cultivo en frascos F25 en presencia de células 293 frescas. Después de 5 días, las células infectadas se recogen y se someten a un análisis de HIRTH (Gluzman y Van Doren, 1983, J. Virol., 45, 91-103), a fin de verificar la presencia del transgen. Brevemente, el análisis de HIRTH consiste en una extracción del genoma adenoviral, un precipitación del ADN vírico, una digestión con una enzima de restricción apropiada, una transferencia sobre membrana y una hibridación con una sonda radioactiva capaz de hibridarse con las secuencias sCD4-2F5. Se observa una señal positiva para los 5 adenovirus analizados.

Se constituye un lote adenovírico consecuente mediante amplificación sucesiva en las células 293, se purifica sobre dos gradientes de cloruro de cesio, y se dializa. Este lote se puede utilizar en el ámbito de ensayos clínicos antiSIDA.

Ejemplo 6

Preparación de un vector adenovírico que expresa la inmunoadhesina citotóxica sCD4-2F5-angiogenina

Las secuencias que codifican la proteína de fusión sCD4-2F5-angiogenina se cortan por escisión del vector
pTG8373 (Ejemplo 4) mediante digestión XboI-BglII, y se clonan a nivel de los mismos sitios, en el vector pTG8347 (Ejemplo 5). Se obtiene el vector pTG8376 (Figura 11) que se puede someter a la recombinación homóloga con un vector adenovírico, por ejemplo pTG4656, para producir los adenovirus recombinantes defectuosos que expresan la inmunoadhesina citotóxica dirigida contra las células infectadas por el virus del VIH.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Transgene S.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): DIRECCIÓN: 11 rue de Molsheim

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(C): CIUDAD: Estrasburgo

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(E): PAÍS: Francia

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(F): CÓDIGO POSTAL: 67082

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELEFONO: (33) 88 27 91 00

\vskip0.500000\baselineskip

(H): FAX: (33) 88 22 58 07

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo implante y nuevo vector para el tratamiento de enfermedades adquiridas

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(iii): NUMERO DE SECUENCIAS: 20

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(iv): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE SOPORTE: Casete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG5168

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGCTTCC ATGGACATGA GGGTC

\hfill

25

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

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(D): CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iii): ANTI-SENTIDO: SÍ

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(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG5169

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGAATTCCT AACACTCTCC CCTGT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG5170

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAGCTTCC ATGGAGTTGG GTCTG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG5171

\vskip0.800000\baselineskip

: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAATTCTC ATTTAGCCGG AGACA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG6114

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAATTCCA CCATGGGCAT CAAGATG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG6115

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTCTAGATC TAACACTCAT TCCTGTTGAA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG6192

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTCGACCA CCATGGATGG AGCAGAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG6194

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGAATTCGC GGCCGCGCTC CCTCCGCCAC CTTTACCCGG AGT

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG5147

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTGGCGGC CGCCGCACAG GTTATC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG5148

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGCGGCCG CTTTTTTCGT TATCTGAT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG5299

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACATTACAG CCTCAGAAGC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG6193

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGAATTCTC ATTTACCCGG AGT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ADNc CD4 humano

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG7094

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCTCGAGC CACCATGAAC CGGGGAGTCC CTTTT

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ADNc CD4 humano

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG7095

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAAGATTTG GGCTCCTGGA AAGCTAGCAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ADNc de la cadena pesada del anticuerpo 2F5

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis (oTG7097)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGCTAGCTT TCCAGGAGCC CAAATCTTGT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ADNc de la cadena pesada del anticuerpo 2F5

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis (oTG7096)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGCCCGGG ATGGGGGCAC GGTGTACACC TGTGGT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ADNc de la angiogenina humana

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis (oTG10089)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGATCCC AGGATAACTC CAGGTAC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ADNc de la angiogenina humana

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis (oTG10090)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGAATTCT TACGGACGAC GGAAAAT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ADNc de la cadena pesada del anticuerpo 2F5

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis (oTG10087)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCCCCATC CCGGGAGGAG ATGACCAAGA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

: (A) LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMEROS DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ADNc de la cadena pesada del anticuerpo 2F5

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: oligonucleótido de síntesis (oTG10088)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGATCCC CCGCCACCTT TACCGGAGA CAGGGA

\hfill

36

Claims

1. Implante de células modificadas genéticamente que comprende una secuencia nucleotídica exógena que codifica la totalidad o parte de un anticuerpo dirigido contra un antígeno tumoral o un epítopo específico de un virus, siendo dicha secuencia nucleotídica exógena puesta bajo el control de los elementos necesarios para su expresión y para la secreción de dicho anticuerpo, siendo dichas células fijadas a una matriz extracelular, y siendo dicho anticuerpo, segregado por dicho implante, capaz de unirse específicamente a dicho antígeno o a dicho epítopo contra el cual está dirigido.

2. Implante según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo se selecciona de entre el grupo constituido por:

-: un anticuerpo nativo,

-: un anticuerpo quimérico,

-: un fragmento de anticuerpo, y especialmente un fragmento Fab, F(ab')_{2}, o también scFv, y

-: un anticuerpo biespecífico.

3. Implante según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho anticuerpo se modifica por fusión con una sustancia tóxica o inmunopotenciadora.

4. Implante según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha sustancia tóxica se selecciona de entre una ribonucleasa, y especialmente la ribonucleasa de Bacillus amyloliquefaciens, la ricina, la toxina diftérica, la toxina colérica, la timidina quinasa del virus del herpes simple, la citosina desaminasa de Escherichia coli o de una levadura del gen Saccharomyces, la exotoxina de Pseudomonas, y la angiogenina humana, o un análogo de dichas sustancias.

5. Implante según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica exógena, puesta bajo control de los elementos necesarios para su expresión y para la secreción de dicho anticuerpo, es transportada por un vector que deriva de un plásmido, de un retrovirus, de un virus del herpes, de un adenovirus o de un virus asociado al adenovirus, siendo dicho vector introducido en dichas células modificadas genéticamente por transfección.

6. Implante según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho vector es dicistrónico.

7. Implante según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho vector es retrovírico y comprende de 5' a 3':

(a): una LTR 5' que deriva de un retrovirus,

(b): una región de encapsidación,

(c): una secuencia nucleotídica exógena que comprende:

-: un promotor interno,

-: una primera secuencia que codifica la cadena pesada de un anticuerpo,

-: un sitio de iniciación de la entrada de los ribosomas,

una segunda secuencia que codifica la cadena ligera de un anticuerpo, y

una LTR 3' que deriva de un retrovirus.

8. Implante según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica exógena comprende además una tercera secuencia que codifica una sustancia tóxica o inmunopotenciadora fusionada corriente abajo y de manera operacional a la segunda secuencia.

9. Implante según una de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende células autólogas modificadas genéticamente.

10. Implante según la reivindicación 9, que comprende fibroblastos modificados genéticamente.

11. Implante según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque comprende de 10^{6} a 10^{12}, preferentemente de 10^{7} a 10^{11}, células modificadas genéticamente.

12. Método de preparación de un implante según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se ponen en contacto las células modificadas genéticamente y una matriz extracelular.

13. Uso de un implante según una de las reivindicaciones 1 a 11, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la prevención de una enfermedad adquirida.

14. Uso de un implante según la reivindicación 13, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la prevención de una enfermedad infecciosa, y especialmente del SIDA, o del cáncer.

15. Vector adenovírico recombinante que comprende una secuencia nucleotídica exógena que codifica la totalidad o parte de un anticuerpo dirigido contra un antígeno tumoral o un epítopo específico de un microorganismo infeccioso y patógeno, y modificado por fusión con una sustancia tóxica o inmunopotenciadora, siendo dicha secuencia nucleotídica puesta bajo el control de los elementos necesarios para su expresión, y siendo dicho anticuerpo capaz de unirse específicamente a dicho antígeno o a dicho epítopo contra el cual está dirigido.

16. Vector adenovírico recombinante según la reivindicación 15, caracterizado porque dicho anticuerpo se selecciona de entre el grupo constituido por un anticuerpo nativo, un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo, y, especialmente, un fragmento F(ab')_{2}, Fc o también scFv, y un anticuerpo biespecífico.

17. Vector adenovírico recombinante según la reivindicación 15, caracterizado porque dicha sustancia tóxica se selecciona de entre una ribonucleasa, y especialmente la ribonucleasa de Bacillus amyloliquefaciens, la ricina, la toxina diftérica, la toxina colérica, la timidina quinasa del virus del herpes simple, la citosina desaminasa de Escherichia coli o de una levadura del género Saccharomyces, la exotoxina de Pseudomonas, y la angiogenina humana, o un análogo de dichas sustancias.

18. Vector adenovírico recombinante según la reivindicación 15, caracterizado porque dicho anticuerpo se modifica por fusión con una sustancia inmunopotenciadora.

19. Vector adenovírico recombinante que comprende una secuencia nucleotídica exógena que codifica la totalidad o parte de una o varias proteínas de interés capaces de formar un multímero, tal como un dímero o un tetrámero, en una célula huésped, siendo dicha secuencia nucleotídica exógena puesta bajo el control de los elementos necesarios para su expresión, siendo dicho vector derivado de un adenovirus de origen humano, canino, aviar, bovino, murino, ovino, porcino o de simio, o también de un híbrido que comprende fragmentos de genoma adenoviral de diferentes orígenes, y estando dicho vector caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica exógena codifica la totalidad o parte de por lo menos un anticuerpo dirigido contra un antígeno tumoral o un epítopo específico de un microorganismo infeccioso y patógeno, siendo dicho anticuerpo capaz de unirse específicamente a dicho antígeno o a dicho epítopo contra el cual está dirigido.

20. Vector adenovírico recombinante según la reivindicación 19, caracterizado porque dicho anticuerpo se modifica por fusión con una sustancia tóxica o inmunopotenciadora.

21. Vector adenovírico recombinante según una de las reivindicaciones 15 a 18, derivado de un adenovirus de origen humano, canino, aviar, bovino, murino, ovino, porcino o de simio, o también de un híbrido que comprende fragmentos de genoma adenoviral de diferentes orígenes.

22. Vector adenovírico recombinante según una de las reivindicaciones 15 a 21, caracterizado porque es defectuoso para la replicación.

23. Vector adenovírico recombinante según la reivindicación 22, caracterizado porque está por lo menos desprovisto de la totalidad o parte de la región E1 y, de manera opcionalmente, de la totalidad o parte de la región E3.

24. Vector adenovírico recombinante según la reivindicación 22 ó 23, que comprende una secuencia nucleotídica exógena que codifica la cadena pesada del anticuerpo 2F5, un elemento IRES y la cadena ligera del anticuerpo 2F5; siendo dicha secuencia nucleotídica exógena puesta bajo el control de los elementos necesarios para su expresión.

25. Vector adenovírico recombinante según la reivindicación 22 ó 23, que comprende una secuencia nucleotídica exógena que codifica la secuencia señal y los dominios I e II extracelulares de la proteína CD4 fusionados funcionalmente a la región \gamma3 constante (región eje - CH2 y CH3) de la cadena pesada del anticuerpo 2F5.

26. Vector adenovírico recombinante según la reivindicación 22 ó 23, que comprende una secuencia nucleotídica exógena que codifica la secuencia señal y los dominios I e II extracelulares de la proteína CD4 fusionados funcionalmente a la región \gamma3 constante (región eje - CH2 y CH3) de la cadena pesada del anticuerpo 2F5, y fusionada funcionalmente a la angiogenina humana madura.

27. Vector adenovírico recombinante según una de las reivindicaciones 15 a 26, caracterizado porque los elementos necesarios para la expresión comprenden un promotor seleccionado de entre el grupo constituido por el promotor precoz adenovírico E1A, el promotor tardío MLP (Major Late Promoter), el promotor murino o humano PGK (fosfoglicerato quinasa), el promotor precoz del virus SV40, el promotor del virus RSV (virus del sarcoma de Rous), un promotor activo específicamente en las células tumorales, y finalmente un promotor activo específicamente en las células infectadas.

28. Partícula vírica infecciosa que comprende un vector adenovírico recombinante según una de las reivindicaciones 15 a 27.

29. Célula huésped eucariota que comprende un vector adenovírico recombinante según una de las reivindicaciones 15 a 27, o una partícula vírica infecciosa según la reivindicación 28.

30. Composición farmacéutica que comprende un vector adenovírico recombinante según una de las reivindicaciones 15 a 27, una partícula vírica infecciosa según la reivindicación 28, o una célula huésped eucariota según la reivindicación 29, en asociación con un soporte farmacéuticamente aceptable.

31. Composición farmacéutica según la reivindicación 30, que comprende 10^{4} a 10^{14} pfu.

32. Composición farmacéutica según la reivindicación 30 ó 31, caracterizada porque está en forma inyectable.

33. Uso de un vector adenovírico recombinante según una de las reivindicaciones 15 a 27, de una partícula vírica infecciosa según la reivindicación 28, o de una célula huésped eucariota según la reivindicación 29, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento y/o a la prevención del cuerpo humano o animal mediante terapia génica.

34. Uso según la reivindicación 33, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento y/o a la prevención de las enfermedades adquiridas, y especialmente de los cánceres y del SIDA.

35. Uso según la reivindicación 34, para la preparación de una composición farmacéutica administrable por vía intravenosa o intratumoral.