JPH06509943A - 移植したレトロウイルス産生細胞を用いるインビボでの遺伝子導入 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 移植したレトロウィルス産生細胞を用いるインビボでの遺伝子導入発　明　の　 技　術　分　野 本発明は、移植したレトロウィルス産生細胞からインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で 遺伝子を導入するための組み変えＤＮＡ技術に関するものである。特に本発明は 、脳腫瘍細胞を化学療法剤に対して感受性を持つように、修飾した産生細胞を用 いて脳！！層の治療を行う方法に関する。

発　明　の　背　景 脳！！瘍は、特に若年層に於ける疾病と死亡の最大の原因である。そのうえ脳腫 瘍にかかるケースがなんらかの理由で増加しているようにみうけられる。脳腫瘍 の原因は不明ではあるが、放射線や汚染物質、電磁場などが疑われている。脳腫 瘍のほとんどは手術が不可能であり、かりに手術できるとしても腫瘍を除去する 手術は非常に難しく、また微細な操作を要するので、手術後に神経系の障害が残 ることもしばしばある。脳腫瘍のより効果的な化学療法が必要とされる由縁であ る。

脳腫瘍を治療するひとつの可能な方法は、まだほとんど開拓されてはいないもの の、抗癌剤を産生ずる細胞を脳神経に移植することである。この方法によれば薬 物の投与回数を減らし、を髄−脳関門によって起こるドラッグデリバリ−にまつ わる複雑な問題を避けて通れるというメリットもある。（Ｒｏｓｅｓｔｅｉｎ、 　５ｃｉｅｎｃｅ２３５：　７７２−７７４　（＋９８７）参照）当該事項にか かわるこのような必須の要因についての理解がすすみ、十分検討された結果、脳 内移植は中枢神経機能の研究に携わる神経生物学者や脳！１１１などの中枢神経 疾患の治療法を研究している医師たちにとっても、妥当で信頼できる手法になっ てきた。

過去数十年における神経生物学の進歩とあいまって、分子生物学に対する理解が 進み、洗練された分子遺伝学的手法が発達した結果、ヒトの疾病一般について新 たな洞察が加えられるようになった。その結果、医療に携わる科学者と遺伝学者 は多くのヒトの疾病について生化学レベルならびに遺伝学レベルで深く理解でき るようになった。多くのヒトの遺伝病の正常および異常な生化学的特徴が明らか になり、関係する遺伝子が単離同定され、初期のモデルから進歩して、変異細胞 に機能をもったワイルドタイプの遺伝子を導入し、疾病の発現を抑えることがで きるまでになった。（この点に関しては、＾ｎｄｅｒｓｏｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ 　２２６：　４０１−４０９（１９８４）を参照されたい。）　このアプローチ を動物全体に発展させたもの、すなわち機能を持うた遺伝子を薬剤として利用し てインビボで疾病の発現を抑えること、これは”遺伝子治療”と呼ばれるように なった。（この点に関しては、Ｆｒ１ｅ遺伝子治療は次のような仮定にもとづい ている。すなわち、疾病の発現を抑えることは、在住変異遺伝子の発現を修飾す ることによってか、あるいは新たな遺伝情報を欠陥を持っているか損傷を受けて いる細胞または組織にインビボで導入することにより達成できる。

インビボにおける遺伝子治療の実験手順はすでに以下の文献に記載されている。

参照文献として、例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ａｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃ ｅ　２４　：　１５７５−１５７８　（１９８８）、及び胃ｏ１ｆｆ　ｅｔ　ａ ｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。ＪＣＢｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８６：　９０１ １−９０１４　（＋９８９）が挙■■ れ、これらの文献の記載はこの明細書中に参照文献として組み入れられる。また 、本件出願と同時にアメリカ合衆国特許庁に継続している、Ｇａｇｅによってな された米国特許出願シリアルナンバー０７／２８５，１９６号の「遺伝子的に修 飾された細胞を移植して、中枢神経系の欠陥、疾病、あるいは損傷を治療するた めの方法」と題された特許出願が１９８８年１２月１５日に提出されており、こ の出願の記載についても本件明細書中に参照文献として紹み入れろ。

抗ウィルス剤のアシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）すなわち９−　（（２−ハ イドロキノエトキノ）メチル）グアニア　（９−（（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈ ｏｘｙ）ｓｅｔｈｙｔ）ｇｕａｎｉｎｅ）　％ならびにガンンクロビル（ｇａｎ ｃｙｃｌｏｖｉｒ）すなわち９−　（（２−ハイドロキシ−１−ハイドロキノメ チル）エトキン）グアニン（９−（（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ−ト（ｈ ｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ）■ｅｔｈｙ　ｌ）ｇｕａｎ　１ｎｅ ）は、ヘルペスウィルスの複製を阻害するのに有効であり、これはヘルペスウィ ルス（ＨＳＶ−ＴＫ）のゲノムにコードされていてヘルペスウィルスに感染した 細胞によって産生されるチミジンキナーゼが、これらの薬物をＤＮＡ合成をイン ビボで阻害する中間体に代謝するためである。ＨＳＶ−ＴＫをレトロウィルスベ クターを使って！！瘍細胞に導入すると、マウスサルコーマから腫瘍が縮小した という報告（この点に関しては勤ｏｆｔｅｎ　＆　ｆｅｌｌｓ、　Ｊ、　Ｎａｔ ｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎｓｔ、、　８２：　２９７−３００　（＋９９０）を 参照されたい。）があり、また、ネオプラスミック　ＢＡＬＢ／ｃ　ネズミセル ラインの増殖を抑制することも明らかにされている（この点に関しては、Ｍｏｏ ｌｔｅｎ、　Ｃａｎ５ｅｒ　Ｒｅｓ、　４６．５２７−５８１を参照されたい。

）有効なベクターを使って細胞に遺伝子を導入し、この遺伝的に修飾した細胞を 脳内に移植し、ＨＳＶ−ＴＫなとの治療用遺伝子をａｍに導入することによって インビボで脳ｌ！瘍を治療させる手法を開発することは有用であろう。

発　明　の　要　約 本発明は、治療用遺伝子を脳腫瘍細胞に導入することによって、腫瘍細胞を死滅 させる方法を提供するものである。一般的に、本発明の方法はっぎのような（１ ）〜（４）の工程、即ち、 （１）選択マーカーと複製に必要な少なくともひとつの遺伝子とを備えたレトロ ウィルスを産生細胞に導入する工程であって、前記レトロウィルスに対応するプ ロウィルスのＤＮＡが前記産生細胞のゲノムに組み込まれることによって、前記 複製に必要な少な（ともひとつの遺伝子が一つの治療用遺伝子あるいは複数の治 療用遺伝子で置換されて修飾されたレトロウィルスを産生させるようにすること を特徴とするレトロウィルスを導入する工程、（２）前記修飾されたレトロウィ ルスがゲノムの一部として導入されるような産生細胞を選択する工程、 （３）前記産生細胞を前記腫瘍細胞の近傍に移植する工程であって、これにより 前記腫瘍細胞が前記修飾されたレトロウィルスで感染を受け、前記一つの治療用 遺伝子あるいは複数の治療用遺伝子が前記腫瘍細胞に導入されることを特徴とす る産生細胞を移植する工程、（４）前記ａｍ細胞に導入された前記一つの治療用 遺伝子あるいはＷｉ数の治療用遺伝子によって前記ＲｆＮ細胞を死滅させる代謝 産物に代謝されるような物質を投与することによって前記！ｌ湛細胞を死滅させ る工程、を含んでいる。

ｌ！ｌｌ細胞としてはグリオーマ細胞がありうる。導入される遺伝子のひとつに ・＼ルベスシンブレックスチミジンキナーゼ（ｈａｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　 ｔｈｙｗ＋１ｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　：　ＨＳＶ−ＴＫ）が考えられる。物質 は、９−（（２−ハイドロキシエトキン）メチル）グアニン（８−（（２−ｈｙ ｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）ｇｕａｎｉｎｅ）及び９−（（２−ハ イドロキン−１−（ハイドロキシメチル）ニドキン）メチル）グアニン（９−（ Ｃ２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ　ｌ　）ｅｔｈｏｘｙ ）ｍｅｊｈｙ　Ｉ）ｇｕａｎ　ｉｎｅ　）から選択できる。ＨＳＶ−ＴＫを導入 するための好ましいレトロウィルスベクターは、ＮｅｏＲ遺伝子と、チミジンキ ナーゼプロモーター、ＳＶ４０アーリーリージョンプロモーター−エンハンサ− （ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ　ｒｅｇｉｏｎ　ｐｒｏＩｌｏｊｅｒ−ｅｎｈａｎｃｅ ｒ）　％イムノグロブリン！鎖のエンハンサ−の中からなるグループから選択さ れるコントロールエレメントとを備えている。レトロウィルスはをロニーネズミ 白血病ウィルスから誘導できる。

特に本発明はインビボで腫瘍細胞の複製を抑える方法に関するものであり、以下 の（１）〜（４）の工程、即ち、 （１）選択マーカーとへルペスンンブレックス　チミジンキナーゼをコートする 遺伝子とを備えたレトロウィルスベクターを産生細胞に導入する工程であって、 この導入により前記レトロウィルスベクターに対応するプロウィルスのＤＮＡが 前記産生細胞のゲノムに組み込まれて、前記レトロウィルスの複製に必要な少な くともひとつの遺伝子がヘルベスンンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子で置換 されて修飾されたレトロウィルスを産生させるようにすることを特徴とするレト ロウィルスベクターを導入する工程、（２）前記へルベスンンブレックス　チミ ジンキナーゼ遺伝子を運搬する産生細胞を選択する工程、 （３）前記修飾されたレトロウィルスを運搬する前記産生細胞を前記ａｍ細胞の 近傍に移植する工程であって、これによりＲ２腫［細胞が前記修飾されたレトロ ウィルスで感染されて、前記ヘルペスシンプレプラス　チミジンキナーゼ遺伝子 が前記腫瘍細胞に導入されることを特徴とする産生細胞を移植する工程、 （４）９−　（（２−ハイドロキシエトキン）メチル）グアニン（９−（（２− ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ　）ｇｕａｎｉｎｅ）及び９−　（ （２−ハイドロキシ−１−（メチル）エトキン）メチル）グアニン（９−（（２ −ｈｙｄｒｏｘｒｌ−（ｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｔ）ｇｕａｎ ｉｎｅ）からなるグループから選択される抗癌剤を投与する工程であって、前記 抗癌剤は、前記へルベスノンプレックス　チミジンキナーゼによって前記ＩＩ瘍 細胞の複製を阻害する代謝産物に代謝されることを特徴とする抗癌剤を投与する 工程、を含んでいる。

図面の簡単な説明 第１図は、組み換えられたベクターＮＴＫ、ＳＴＫ、及びμＴＫの直線状の制限 酵素マツプを概略的に示した図である。それぞれのベクターは、ヘルペスシンプ レックスウィルス　チミジンキナーゼ遺伝子を運搬している。（ＬＴＲ＝長末端 反復配列；　ＨＳＶ−ＴＫ＝ヘルペスシンプレックスウィルス　チミジンキナー ゼ遺伝子；　ＮＥＯ＝ＮｅｏＲ遺伝子：　Ｘ＝Ｘｈｏ　Ｉ　＋４ト：　Ｃ＝ＣＩ ａＩ　サイト；５＝ＳａｌＴ　サイト：　Ｐｒｘ＝ＨＳＶ−ＴＫ　プロモーター ；　５Ｖ＝ＳＶ４０　プロモーター−エンハンサ−；　Ｅμ＝免疫免疫グロブ９ 鎖 第２図は、Ｃ６グリオーマ細胞の生存数を示すグラフである。グリオーマ細胞単 独、あるいはへルペスンンプレックスＴｇＧを組み入れた種々のレトロウィルス ベクターを運搬しているグリオーマ細胞の生存数について、アシクロビルの濃度 を増加させた場合の変化を示すグラフである。

第３図は、レトロウィルス誘導のβガラクトンダーゼ　リポータベクターｐＬＺ ＲＮＬの概略図である。（Ｌａｃ　ｚ＝エンエリチア　コリ　β−がラクトシダ ーゼ遺伝子（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａ ｓｅｇｅｎｅ）：　ＬＴＲ＝長末端反復配列；　ＲＳＶ　ＬＴＲ＝ロウスサルコ ーマウィルス長末端反復配列：　Ｎｅ。

＝ＮｅｏＲｉｌ伝子；　ＡＭＰ”＝アンビン９２選択性のβ−ラクタマーゼ遺伝 子；ｐＢＲ３２２０ｒｉ　＝プラスミドｐＢＲ３２２複製の開始点）発明の詳細 な説明 ここに述べる発明が十分に理解されるように以下に詳細な説明を述べる。本発明 は少なくともひとつの選ばれた治療用遺伝子をヒトの腫瘍細胞にインビボ（」ｖ ｉｖｏ）で導入し、ｌ１ｉｉ瘍の発現や抗癌治療に対する挙動を変えるプロセス に関するものである。特に本発明は遺伝学的に修飾したレトロウィルスの産生細 胞を移植することによってヒトの腫瘍を治療する方法に関するものである。ここ で遺伝学的に修飾したレトロウィルスの産生細胞とは以下のように定義できる。

すなわち治療用遺伝子を組み込まれたレトロウィルスを持ち、この細胞の複製を 傷害する変異レトロウィルスを産生じてこれを近隣の細胞に感染させ、治療用遺 伝子を一個あるいは複数個導入する細胞である。このようなレトロウィルスの産 生細胞は、ウィルスの複製に必要な遺伝子の少なくともひとつが治療用遺伝子で 置換されたような修飾された変異レトロウィルスを持っているのである。このよ うに産生細胞は変異レトロウィルスを産生し、近隣の！！瘍細胞にこれを感染さ せ、治療用遺伝子をこの感染した近隣のｌ！瘍細胞に移す。典型的には腫瘍細胞 は、感染した治療用遺伝子のひとつによって代謝されて殺！！瘍性の代謝物質に なる化学物質を投与することで死滅させられる。

たとえばレトロウィルスの産生細胞は、ヘルペスシンプレックスウィルス　チミ ジンキナーゼ（Ｈ５Ｖ−ＴＫ）をコードする遺伝子を含むレトロウィルスベクタ ーを持っている。この遺伝子はそれを持つ細胞を、ＤＮＡ合成合成阻害剤アンピ ロビルａｃｙｃ　Ｉｏｖ　ｉ　ｒ　：　９−（（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘ ｙ）ｓｅｔｈｙ　ｌ）ｇｕａｎ　１ｎｅ）あるいはその類書■■ あるガン／クロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ　：　９−（（２−ｈｙｄｒｏｘ ｙ−１−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ）＋{ ｅｔｈｙｌ）ｇｕａｎｉｎｅに感受性にする。これらの薬剤は、ヘルペスンンプ レプラスチミジンキナーゼによって細胞のＤＮＡ合成を阻害する中間体に特異的 に変換されるため、この遺伝子を持つ細胞はこれらの薬物に感受性になり、薬剤 投与によって腫瘍細胞は死滅する。

■、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒ○）でのドナー細胞への遺伝子導入レトロウィ ルスベクターを使ってインビトロで遺伝子をドナー細胞に導入する一般的な方法 は既に知られている（この点に関しては、Ｇａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｈ、　 ８６．１ｎ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏ ｌ、　７８．００．６５＋−８５８，１９８８を参照されたい。

なお、この文献の記載は参照文献として、その内容をこの明細書中に含むものと する。また、同時に米国特許庁に継続中の米国特許出願シリアルナンバー０７／ ２８５．１９６号、　Ｇａｇｅ、　５ｕｐｒａも参照のこと。）。この方法には 以下の基本的な段階が含まれる。

（１）治療用遺伝子で、それが発現することにより目的とする疾病の症状に効果 があると思われる適当なものを選ぶ段階。

（２）遺伝子を導入するのに適した有効なベクターを開発する段階。

（３）プライマリ−カルチャーまたは確立されたセルラインからドナー細胞を３ １製する段階。

（４）ドナーを移植され、新しい表現型を発現している細胞がインビボにて生き 続け、治療用遺伝子産物を安定にかつ効果的に産生じ、移植した細胞の近傍にあ る細胞に遺伝子を導入できることを明らかにする段階。

（５）移植によって重篤な副作用が起きないことを明らかにする段階。

（６）宿主となる動物に表現型の上で望ましい効果、たとえばｌ１ｉｌ！細胞が 薬剤に対して感受性になるというような効果が現れることを明らかにする段階。

Ａ、ドナー細胞の遺伝学的な修飾 以下に述べるレトロウィルスベクターを使ってドナー細胞を遺伝学的に修飾し、 これを脳内に移植する方法は発明を具体的に説明するためのものであって、典型 的な用法をここに記載されている。しかし、これ以外の方法も利用できることは 当業者には明かであろう。

細胞を改良するのに使われる技術、すなわちベクターないしはそれに類するもの を構築する技術のほとんどが当業者の間で広（行われており、当業者のほとんど は、個々の実験条件や実験手法を記述した標準的な操作書を知っているであろう 。しかし簡便のために記した以下のパラグラフはガイドラインとして役立つであ ろう。

ｌ、乏’７５〒１（社）１沢 ここに記載したちの以外のベクターも使用できるかもしれないが、本発明の方法 で使用するのに適した望ましいベクターは、ウィルス（レトロウィルスを含む） ベクターである。ウィルスのベクターは以下の基準に適合する。

（１）ベクターはドナー細胞に感染できるが、宿主になれるものの範囲が適当な ウィルスベクターを選ばなければならない。

（２）ベクターは容易に選択できて、それをｙｐｍしているドナー細胞が単離で き、クローン化できなければならない。

（３）ベクターは導入する殺ＷｆＭ遺伝子が標的とする腫瘍細胞以外の細胞に対 してほとんどダメージを与えないものでなければならない。

ネズミレトロウィルスベクターは、外来遺伝子を効率よく哺乳動物の細胞に導入 し、そして発現させる効果的で有用な、現時点では最もよく性質の分かった手段 である。これらのベクターは非常に広範囲の宿主ならびに細胞型に導入でき、十 分合理的と考えられるメカニズムで宿主ゲノムの任意の位置に組み込むことがで き、遺伝子を安定かつ効果的に発現し、しかもほとんどの条件下で宿主細胞を殺 したり明かな損傷を与えたりしない。

２、ベクターを構築するための一般的な方法望ましい治療用遺伝子コードとコン トロール配列を含む適当なベクターを構築するには当業者によく知られた標準的 な結合ならびに制限的切断技術を利用する（この点に関しては、Ｓａ禦ｂｒｏｏ ｋ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　 i２ｃｌ　ｅｄ、。

＋９８９）を参照されたい。）。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列、ないしは合 成オ゛ノゴヌクレオチドを切断し、修飾し、そして望ましい形に再結合される。

位置特異的にＤＮＡを切断することは、当業者に一般によく知られた条件下、適 当な制限酵素（ないしは酵Ｓ）で処理することによって行われるが、詳細はこれ ら重版の制限酵素のＩ！ｌ造者によって個々に特定されている。（この点に関し てはＮ　ｅ、ｇ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｐｒｏｄｕｃ ｔ　Ｃａｔａｌｏｇ、を参照されたい。）一般に、約ｌμｇのプラスミドないし はＤＮＡ配列は、約２０μＩの緩衝液中にお０て、■ユニットの酵素で切断され る。典型的には過剰の制限酵素を使って完全ζこ基質ＤＮＡを切断する。

約１時間から２時間、約３７℃でインキュベートすれば十分である力（、これ以 外のヴアリエーノｅンも可能である。インキュベージぼンの後、フェノール／ク ロロフォルムでタンパクを抽出して除き、その後エーテルで抽出し、核酸を水フ ラク７．ンからエタノールで沈澱させて回収する。切断したフラグメントのサイ ズセバレーノヨンは、必要に応じて、標準的な方法でポリアクリルアミドゲルま たはアガロースゲル電気泳動によって行うことができる。サイズ七、＜レージ「 ンにツイテの一般的な記載は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ　 ６５：４９９−５６０　（１９８０）ζこ記載されている。

制限的に切断したフラグメントをプラント末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）にするに は、旦。

ｃｏｌｉのＤＮＡ　ポリメラーゼＩ（フレノウフラグメント（ｔｈｅ　Ｘｌｅｎ ｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ））の大きなフラグメントを使って、４つのデオキシリ ボヌクレオシドトリフｔスフエート（ｄＮＴＰｓ）の存在下、１５分から２５分 、２０℃から２５℃で、５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）　（ｐＨ７，６）中にて 、５０ｍＭのＮａＣ１，６ｍＭのＭｇＣｌ２．６ｍＭのＤＴＴおよび５−１０μ ＭのｄＮＴＰｓとともにインキユベートすればよい。フレノウフラグメントは４ つのｄＮＴＰｓ存在下においても、５°付着末端は埋めていくが、突き出た一本 鎖の３′末端は切っていく。ｄＮＴＰｓのうちのひとつだけ、ないしは選んだい （つかのｄＮＴＰｓだけを与え、付着末端の性質から予想される可能性の範囲内 ならば、必要に応じて選択的に鎖を修復することもできる。フレノウフラグメン トで処理した後、混合物をフェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノールで 沈澱させる。適当な条件下、Ｓ１ヌクレアーゼないしはＢａｔ−３１で処理すれ ば任意の一本鎖部分を加水分解することができる。

結合生成は１５−５０μｍの体積で以下のような標準的な条件および温度で行う 。２０ｍＭのＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　（＋）Ｈ７，５）　、１０ｍＭのＭｇＣ１ ２，１０ｍＭのＤＴＴ、３３ｍｇ／ｍ　ｌのＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ｍＭのＮ　 ａ　ＣＩ　、および付着末端の結合には０℃において４０ａＭのＡＴＰｌｏ、０ １−０．０２　（Ｊｅ１ｓｓ）ユニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼを作用させるか 、あるいはプラント末端の結合には１４℃で、１ｍＭのＡＴＰ、　０．３−０． ６　（Ｗｅｉｓｓ）　ユニーｔ　ｈのＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させる。分子間 で付着末端を結合させるには通常計３３−１００μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度（計５ ５−１Ｏ０ｎの末端濃度）で行う。分子間でプラント末端を結合するには、通常 １０倍から３０倍モル過剰のリンカ−を用いて計１μＭ末＊ｍ度で行う。

「ベクターフラグメント」を用いてベクターを構築するには普通、ベクターフラ グメントをバクテリアのアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシの小 腸から調製したアルカリフォスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して５′フオスフエ ートを除き、ベクターの再結合を防ぐ。加水分解はｐＨ８で約１５０ｍＭのトリ ス中、Ｎａ”イオンとＭ　ｇ　２＋イオンの存在下、１ｍｇのベクターあたり約 １ユニツトのＢＡＰあるいはＣＩＰを用いて６０℃で約１時間かけて行う。核酸 フラグメントを回収するには試料をフェノール／クロロフｔルムで抽出し、エタ ノールで沈澱させる。ベクターの再結合を抑える別の方法は、不要のフラグメン トを過剰の制限酵素で加水分解して両末端を除去してしまうことである。

ｃＤＮＡまたは配列の修飾を要するゲノムのＤＮＡからベクターを調製するには 、プライマーを用いた位置特異的な突然変異を利用する。これは望ましい突然変 異を起こさせたために対合しない短い部分を除き、突然変異させられるべき一本 鎖のファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使って行う 。簡単には合成オリゴヌクレオチドを、ファージＤＮＡに相補的な鎖を合成する ためのプライマーとして使い、その結果生成する２本１１ＤＮＡをファージの宿 主バクテリアに導入する。ファージを導入したバクテリアを培養し、これを寒天 上部にまき、ファージを持つ単一細胞からプラークを生成させる。

理論的には新しくできるプラークの５０％が一本鎖の変異したファー：；ＤＮＡ を持ち、５ｏ％かもとからの配列を持つはずである。生成したプラークは、オリ ジナルな鎖と完全な塩基対が形成できるハイプリダイゼーン式ンは安定に生成す るが、そうでないハイプリダイゼーンコンはできないような温度で、キナーゼで 加水分解した合成プライマーとハイブリッドさせる。プローブとハイブリッドし たプラークを集め、培養し、そのＤＮＡを回収する。

レトロウィルスベクターを調製する方法は以下の文献に記されている。（Ｙｅｅ ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍ　、　Ｏｎ　０ ｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　Ｖｏｌ、　Ｌｌ、　１１Ｌ　＋０Q１”＋０２６ （＋９８６）；　豐ｏ１ｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳ　＾　８４：　３３４４−３３４８　（１９８V）；　Ｊ して今日では、これらの方法は数多くの実！！ｌ室において日常的に用いられて いる。

レトロウィルスベクターは、レトロウィルスロングターミナルリピート（長末端 反復配列：　ＬＴＲ）やパブケージング配列（ｐｓｌ）％ならびにバクテリア中 で複製するためのプラスミド配列、また真核細胞の中で複製するために必要なＳ Ｖ４０アーリープロモーター（ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔａｒ）およ びエンハンサ−のようなその他の配列を持つ。ウィルスゲノムの残りの多くの部 分は除去し、別のプロモーターや遺伝子で置換する。ＤＮＡ構成物（ＤＮＡ　ｃ ｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）がパブケージングセルラインに導入されると、ベクターは ＲＮＡとしてウィルスパーティクルの中にパッケージされる。ここで言うＤＮＡ 構成物とは、ロープントの細胞（ｒｏｄｅｎｔｃｅｌｌｓ）に感染するウィルス パーティクルを産生ずるｐｓｉ（’Ｆ）２や、広範囲の種に感染するパーティク ルを産生ずるＶＡＮやＰＡ１２が含まれる。

好ましいウィルスベクターにおいては、治療用遺伝子がウィルスのＬＴＲプロモ ーター−エンハンサ−シグナルやインターナルプロモーターのコントロールの下 にあり、ベクターはレトロウィルスのＬＴＲＯ中の保存されているシグナルによ って宿主細胞のゲノムに効率よく導入される。トランスミブシプルなウィルスを 調製するには、組換えＤＮＡ分子を持つ変異ベクターを産生細胞セルラインにト ランスフェクトする。この産生細胞セルラインはウィルスの転写遺伝子をトラ７ ７、ミッンブルなウィルスパーティクル（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ　ｖｉｒ ｕｓ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）にパブケージングするのに必要な機能はすべて持っ ているが、プロウィルスのＲＮＡ転写遺伝子をマチュアなウィルスパーティクル （ｍａｔｕｒｅ　ｖｉｒｕｓ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）に組み入れるために不可欠 なパッケージングシグナルは欠いている細胞である。その酵素（且立工）などが ある。これらが欠けているため、ヘルパーからの転写遺伝子はウィルスパーティ クルや産生細胞にパッケージされず、空のウィルスパーティクルだけが生成する ことになる。しかし、変異レトロウィルスベクターをカルシウムフォスフェート を使って産生細胞に導入する場合は、呈立工や見立ヱヤｐ旦遺伝子は治療用遺伝 子（Ｘ）で置換されているものの、１）ｓ１配列はそのままあるので、このパフ ケージング配列によって転写遺伝子はトランス（ｔｒａｎｓ）にパッケージされ る（この点に関しては、Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｒ ｏｌ、　５２二４５６−４６７　（＋９７３）を参照されたい。）。このような 細胞は、ふたつのプロウィルス配列を持ち、これらが宿主細胞ゲノムの異なる場 所に組み込まれる。新たに導入されたプロウィルスから転写されるＲＮＡはパブ ケージング配列を持っているので、トランスに生じたウィルスの機能を使ってそ れらはウィルスパーティクルに効率よく組み入れられる。理想的にはその結果、 レプリヶーシＷンーコンビテント（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏ■ｐｅｔｅｎ ｔ）なワイルドタイプのヘルパーウィルスを含まない治療用遺伝子を持つ感染性 のパーティクルがこれらの細胞によって産生される。遺伝子治療の全てのケース とは言わないまでも多くの場合、ヘルパーウィルスの産生はおそらく好ましくな い。と言うのは、それができると宿主となる動物のリンパ系やその他の組織に感 染や増殖性の疾病が広がる恐れがあるからである。

望ましくは、本発明によるプロセスに利用するのに適したレトロウィルスベクタ ーは、レトロウィルスベクターに対応するプロウィルスＤＮＡを産生細胞のゲノ ムに導入して、複製のために必要な遺伝子の少な（ともひとつが感染させるべき 遺伝子で置換されるように修飾した（欠損させた）レトロウィルスを再生させた ものであろう。

ヘルペスウィルスは感染しても潜行性で、神経細胞に病害を与えないことが明ら かになっているので、ヘルペスを基にしたベクター、たとえばＨ３Ｖ−１を使う ことができる。同様に、これ以外のヒトおよび動物のウィルスで、たとえば狂犬 病ウィルス（ｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ）や麻疹ウィルス（ｍｅａｓｌｅｓ）お よびその他のパラミキソウイルス（ｐａｒａｓｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）ならびに ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）など、中枢神経系の細胞に効果的に感染するも のについて理解が進んだので、これを使って育用な！ｉｌｌ、発現用ベクターを 開発することも可能である。狂犬病ウィルスを除く多くの場合、これらのウィル スは真に神経細胞をめがけて感染するものではないが、宿主細胞になりうるもの の範囲がひろいのである。それらは感染による代謝および生理学的効果が中枢神 経系の細胞に最も大きく現れるので、神経細胞選択的に現れるというべきである 。それゆえこれらのウィルスに由来するベクターの多くは宿主になりつる細胞の 範囲がオーバーラツプし、中枢神経特異的に発現させるためには目的とする細胞 に特異的な適当なエンハンサ−やプロモーターならびにその他の配列を使わなけ ればならない。たとえばＪＣウィルスをオリゴデンドログリアに特異的に発現（ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ）するよう調節する配列や、グリア特異的にプロテオリピドプロテインを発現（ ｇｌｉａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させる配列、ならびに グリアフィブリルアシディックプロティ７　（ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｔｌｌａｒ ｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　：　ＧＦＡＰ）遺伝子、およびその他考え られるマウスの中枢神経系に特異的な機能を調色する配列などである。

脳！！瘍の治療のために細胞に遺伝子を導入するのに使えるほかのウィルスベク ターには、モロニーネズミ白血病ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）：ＪＣやＳＶ４０、 ポリオーマ、アデノウィルスのようなバールウィルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ ｅｓ）　；エプスタイン−バールウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒ ｕｓ　：　Ｅ　Ｂ　Ｖ）　：ウシ乳頭腫ウィルスＩ型（ＢＰＶ）のような乳頭腫 ウィルス（ｐａｐｔｌｌｏ＊ａ　ｖｉｒｕｓｅｓ）　：種痘ウィルス（ｖａｃｃ ｉｎｉａ）　；狂犬病およびポリオウィルス、ならびにその他のヒトおよび動物 のウィルスなどがある。

本発明のプロセスに特に適したレトロウィルスベクターは、勤。１ｔｅｎ　＆　 ｆｅｌｌｓ。

Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎｓｔ、、　８２：　２９７−３００　（ １９９０）に記されており、この引用をもってその内容をこの明細書に含める。

これらのベクターはレトロウィルスのＬＴＲターミナルリピートを保持しており 、ネオマイシンアナログＧ４１８に対する耐性を与えるＮｅｏＲ遺伝子を含み、 またコントロールエレメントの下にあるＨ５Ｖ−ＴＫ遺伝子を持っている。ＮＴ Ｋベクターのコントロールエレメントは、Ｈ５Ｖ−ＴＫのプロモーターそのもの である。ＳＴＫベクターのコントロールエレメントは、ＳＶ４０アーリーリージ Ｓンプロモーターとエンハンサ−である。μＴＫベクターのコントロールエレメ ントは、免疫グロブリン重鎖のエンハンサ−である。

これらのベクターを構築するには構成物ｐＴＫ由来のＨ５Ｖ−ＴＫ配列を、Ｎｅ ｏＲを含んでいるｐＬＮＬ８に挿入する（この点に関しては、Ｂｅｎｄｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６１：　１６３９−１６４６　（１９８７）を参照され たい。）。ｐＴＫを構築する際には、Ｂｇｌ　ＩＩならびに」【エンドヌクレア ーゼ制限酵素を用いて、ｐＬＰＭＫＬからＨ５Ｖ−ＴＫをコードする領域を削除 しくこの点に関しては、Ｈ。

ｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｔ、、　！ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ、閘ｅｄ、、　４：　１５７ −１６８　（＋９８７）を参照のこと。）、息±ＡＩのあった位置にＸｈｏ　Ｉ りンカーを付加し、１呈±　ＩＩ−±　１の位置にＲ６を挿入しくこの点に関し ては、Ｘｏｏｌｔｅｎ　＆　Ｂｒｏｄｅｕｒ、　Ｐｒｏｃ　＾■、＾５ｓｏｃ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　２９：　４６１　（＋９８８）を参照のこと。）、 これをＨ３Ｖ−ＴＫプロモーターに連結する。ここからプロモーターをコードす る配列をＢａｍ　Ｈｒおよび入ｈｏ　Ｉで削除し、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで加水分解 （その後、Ｘｈｏ　Ｉリンカ−が付加される。）シ、そしてＢａｍ　Ｈｌで加水 分解した後プラスミドｐＢＲ３２２に挿入した。

ＮＴＫベクターを構築する際には、Ｂ　ａ　ｍ　Ｈｒで加水分解した後、ｄＡＴ ＰとｄＧＴＰで一本鎖部分を埋め、さらに見上ａｌで加水分解してｐＴＫからフ ラグメントを削除する。そしてＸｈｏ　Ｉで加水分解後、ｄＣＴＰとｄＧＴＰで 一本鎖部分を埋め、さらに立上ａｌで加水分解されたｐＬＮ６にこれを挿入した 。

ＳＴＫベクターを構築する際には、１）ＴＫの１工±　１１一旦旦旦　Ｒｒ７ラ グメントを、プラスミドｐＵＣ１３に挿入する。ここからＨ３Ｖ−ＴＫをコード する配列をＨｉｎｄ　ＩＩＩと見上ａｌで削除し、Ｓ■４０アーリーリージ、ン プロモーターエンハンサーを含むＩ）　ＬＳＤ　Ｌ　（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　５：　４３１−４３７　（＋９８５））のＨｉｎｄ　ｌｌｌ−立 上ａｌフラグメントに連結する。

この連結でできるフラグメントを旦ａｍＨＩで加水分解後、ｄＡＴＰとｄＧＴＰ で一本鎖部分を埋めてから旦±ａＩで加水分解する。ｘｈ旦　■で加水分解して から、ｄＣＴＰとｄＧＴＰで一本鎖部分を埋め、ざらにＣｌａ　Ｉで加水分解し たｐＬＮ６にこれを挿入する。

μＴＫベクターを構築するには、完全に埋まった旦ｃｏ　Ｒ１およびＳａ土■サ イトでつながったフラグメントの中にある免疫グロブリン重鎖エンノ）ンサーを 、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩで加水分解し一本鎖部分を埋めた後、５ａｌｌで加水分解し たｐＴＫに挿入する。ここからＳａｔ　Ｉ　Ｃｌａ　ＩフラグメントをＳａ±■ とＣ１ａ　Ｉで加水分解したＩ）ＬＮＬ６に挿入する。

これらのベクターは第１図に示されており、そこには一連のＮｅｏＲ遺伝子、コ ントロールエレメント、およびＨ５Ｖ−ＴＫ遺伝子が描かれている。第１図ζこ おいてＸ、Ｃ，及びＳは、それぞれエンドヌクレアーゼ制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ、Ｃ １ａ　［１Ｓ△±　１の切断位置を表しており、上記のようにして一本鎖部分を 埋めた後、この位置からもとのプラスミドｐＬＮＬ６にさまざまなフラグメント が挿入される。

略号ＰｒＫ、ＳＶ、ＥｕはそＦＬぞれＨ８Ｖ−ＴＫプロモーター配列、ＳＶ４０ プロモーター−エンハンサ−配列、および免疫グロブリン重鎖エンハンサーを表 している。

その他の適当なベクターも遺伝子工学技術、たとえば上記のような制限的エンド ヌクレアーゼによる切断と連結、によって調製できる。典型的ζこｉよこれらの ベクターはレトロウィルスのＬＴＲ配列を持っており、レトロクイルレスの複製 に必要なｉＬ呈一旦互上や立ユヱのような遺伝子の少な（ともひとつが以下のも ので置換されている。

（１）　ｒＩｍ乳動物の細胞の中で働くコントロールエレメントに機能的に１ノ ンクしたＨ５Ｖ−ＴＫ遺伝子のような治療用遺伝子。

（２）選択マーカー。

挿入された遺伝子はもともとレトロウィルスの持っていた配列ととも↓こＬＴＲ 配列によって並べられる。

コントロールエレメントはどのような真核生物のプロモーターまたはエンハンサ ーでもよく、これにはたとえば七ロ二−ネズミ白血病つィルスのプロモーター− エンハンサ−エレメントや、ヒトのサイトメガロウィルスのエンハンサー、ある いはワタシュア症のＲ７，５プロモーターなどがある。ある場合、たとえ４ｆモ ロニーネズミ白血病ウイルスのプロモーター−エン／％ンサーエレメントのよう な場合、これらのプロモーターーエンノＡンサーエレメントはＬＴＲ配列の中力 １、あるいは隣接した位置にある。

選択マーカーは典型的にはカナマイシンやネオマイシン、テトラサイクリン、ア ンビンリンのような薬物に耐性のマーカーである。これらのマーカーは一般ζこ バクテリアのプラスミドに由来する。望ましいのは、ベクターをプロウィルスと して産生細胞に組み入れることにより、この細胞が、レブリケーンタンコンビテ ントなワイルドタイプのヘルパーウィルスがな（、複製遺伝子に突然変異を起こ して治療用遺伝子を導入した感染性のパーティクルを産生ずるようにすることで ある。

Ｂ、産生細胞の選択 移植を行うための産生細胞を選択する際には、発現遺伝子の性質、ベクターの特 性、及び目的とする表現型の産物がかなりの比重でもって関係している。レトロ ウィルスのベクターは、効果的な感染、組み入れ、遺伝子の発現のために細胞分 裂及びＤＮＡ合成を必要としていると考えられるため（この点に関しては、冒ｅ ｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、２ｎｄ　Ｅｄ、 、豐ａｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ奄獅■ Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８５）を参照されたい 。）、かりにこのようなベクターが用いられるならば、産生細胞は例えばプライ マリ−の繊維芽細胞カルチャーやあるいは確立されたセルラインなどの、活発な 成長過程にある細胞が好ましい。

即ちこのような活発な成長過程にある細胞としては、嗅覚の粘膜や成長して−） たり反応性であったりする神経１ｓ（ｇｌｉａ）などの選ばれた領域に存在する ような複製過程にある胚形成期の神経細胞やあるいは複製過程にある成熟期の神 経細胞などである。この他の用いることができる産生細胞としては、繊維芽細胞 、神経、神経膠細胞、ケラチン生成細胞、肝細胞、結合組繊細胞、脳室上衣細胞 、クローム親和性細胞、また他の崎乳動物の細胞が含まれ、それらは本発明の方 法を用いて遺伝子操作及び移植を行うために感染させることのできる細胞である 。好適な産生細胞は、繊維芽細胞である。静止状態であって、非−複製状態の標 的細胞が感染可能な状態になるようにする方法を応用すれば、他の多くの細胞タ イプを、ウィルスを用いた形質導入のための標的細胞として利用できるようにす ることができる。例えば、この方法を改良して行えば、成体ラットの肝細胞のプ ライマリ−カルチャーに連続的にレトロウィルスベクターを感染させることがで きるようになるし、また同様の方法を用いれば、他の数多くの細胞についても応 用することができるようになる（この点に関しては、ＷｏｌＮ　ａｔ　ａｔ、、 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４：　３３４４−３３４８　（＋９８７）を参照された い。）。

Ｈ５Ｖ−ＴＫ遺伝子を運搬する不完全なレトロウィルスを産出させるためには、 産生細胞としてはｌ！維芽細胞、あるいは神経膠細胞を用いることが好ましい。

■、産生細胞によって仲介される腫瘍治療のメカニズム修飾されたレトロウィル スを運搬する産生細胞が分裂している腫瘍細胞の近傍に移植されると、この腫瘍 細胞は、治療効果のある遺伝子を運搬する修飾されたレトロウィルスによって感 染を受ける。治療効果のある遺伝子はＨ５Ｖ−ＴＫであることが好ましく、それ は細胞が、代謝拮抗物質であるアシクロビル（９−（（２−ハイドロキンエトキ シ）メチル）グアニン）あるいはガンシクロビル（９−（（２−ハイドロキン− １−（ハイドロキシメチル）エトキシ）メチル）グアニン）に対する感受性を持 つようにする。これらの薬物は、哺乳動物細胞に対しては通常は非−毒性であり 、Ｈ５Ｖ−ＴＫによって産生されるチミジンキナーゼ酵素によって、ＤＮＡ合成 をブロックしかつこれらを運搬する細胞の成長を阻害する中間体に代謝される。

従って、Ｈ５Ｖ−ＴＫ遺伝子を導入することは、例えば脳細胞などの非常に特異 的な形態をし、本質的に非−分裂性の細胞からなるバックグラウンドの中に存在 する例えば！！瘍細胞などの異常に早（分裂する細胞を死滅させる効果的な手段 となる。

移植を行うにあたっては、産生細胞を適切に調製する必要がある。例えば本発明 にかかる遺伝子的に修飾された産生細胞を注入する場合には、皮膚のサンプルか ら得られる繊維芽細胞などの細胞が、その細胞を増殖維持することのできる適切 な培養培地、例えばウノ胎児の血清を含む溶液であってコンフルエントになるま で増殖させることができる培地に植え付けられる。その細胞は、例えばＯ３゜５ ％のトリプシンを合音するリン酸緩Ｗ１塩（ＰＢＳ）などの緩衝溶液が用いられ ている培ｉ基質から採取され、不活化されたトリプシンに５％の血清を加えたＩ ｒｒ＋＋ｒ／ｍｌのグルコース、０．１ｍｇ／ｍｌのＭｇＣｌ□、Ｏ，Ｉｍｇ／ ｍｌのＣａＣｌ２　（フンプリーｒ、　Ｐ　Ｂ　Ｓ　）を＠濁させたＰＢＳなど の緩衝液に中に置かれる。この細胞を遠心分離の際に用いられるＰＢＳを用いて 洗浄し、続いてトリプシンを含まないコンプリートＰＢＳに再Ｉ！！ｓさせ、注 入にふされしい適切な密度に調整される。ＰＢＳの代わりに、ポスト細胞と生理 学的に適合するように浸透圧がバランスが保たれている溶液を用いて懸濁し、ポ ストの中にその産生細胞をいれることができる。

Ｂ、移植を行うためのホスト細ｍｏｓｇホスト細胞は、産生細胞を移植する目的 で適切に調製されな（ではならない。

このｒｌｌｌｌは移植を行うために用いられるポストとなる脳内の部位に依存し て決まる。適当な血流を存することと、紐感染であることとが確保されていなく てはならない。

Ｃ１移植のメカニズム 本発明の方法は、腫瘍に侵されている中枢神経系（ＣＮＳ）の領域に、例えばＨ ３Ｖ−ＴＫからなる治療効果のある遺伝子挿入物を合音する産生細胞を、脳内移 植しようとするものである。神経の移し変え（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ）あるいは「移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）　Ｊでは、中枢神経系、あるいは血管腫 またはホストとなる脳の表面の硬膜下へ細胞を移植することによって行われる。

うまく移植を行う条件は、（１）移植の実行可能性があること、（２）移植部位 において移植片が保持されること、そして（３）移Ｗ部位Ｉこおける病理学士の 反応が最小限であること、が挙げられる。

例えば胚形成期の脳組織に対し、種々の神経組織をポストとなる脳に移植するた めの方法は、Ｎｅｕｒａｌ　Ｇｒａｆｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍａｍｍａｌｉ ａｎ　ＣＮＳ、　ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ　ａｎｄ　５ｔｅｎ■■ ｉ、　ｅｄｓ、、　（１９８５）　Ｏａｓ、　Ｃｈ、　３、Ｉｌ＋）、　２３− ３０：　Ｆｒｅｅｄ、　Ｃｈ、　４．　ｐｐ、　３１−４０G　５ｔｅｎｅｖｉ ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｈ、　５．　ｐｐ、　４１−５０：　Ｂｒｕｎｄｉｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｃｈ、　６．　ｐｐ、　５１−６０：　Ｄａｖ奄п@ｅｔ　ａｌ、 。

Ｃｈ、７．　ｐｐ、　６１−７０：　Ｓｅｉｇｅｒ、Ｃｈ、８．　ｐｐ、　７ｔ −７７（１９８５）：　ｉｎ　Ｇａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　aｒａｉ Ｌと５ｅａｒｃｈ　（＋９８８）、　５ｕｙ１；及び同時に米国特許庁に継続し ている米国特許出願シリアルナンバー第０７／２８５，１．９６号（Ｇａｇｅ、 　５ｕｐｒａ、の出願）に記載されており、これらの文献の記載は参―文献とし てこの明細書中に含まれるものとする。これらの手法の中には、実質Ｍ縁由移植 、例えばホストとなる脳内への移植（この操作は脳の外側、あるいは実質組織外 の移植と比較される。）が含まれ、それはホストとなる脳内△・組織を注入ある いは挿入することによって行われる手法であって、この手法によれば移植の度ご とに脳の実質組織に対処させることができる（Ｄａｓ、　５ｕｐｒａ）。

実質組織内に移植するためには二通りのメインの手法がある。一つ目の手法はホ ストとなる脳の実質内に産生細胞を注入する工程からなり、また二つ目の手法は 外科的手法によって開口部を形成してホストとなる脳の実質を露出し、そしてそ の開口部に移植片を挿入する工程からなる（Ｄａｓ、　５ｕｐｒａ）。この二と おりの方法はいずれも、移植した際、移植片とホストとなる脳の組織との間には 脳の実質が存在したままである。そして両者の方法とも、移植片と脳の腫瘍に侵 されている領域との間で容易に解剖学的な一体化が起こる。

また別法としては、その移植片をたとえば大脳の脳室内などの脳の空洞内に入れ るか、あるいは硬膜下、即ち、軟膜を介在するかあるいは蜘蛛膜と軟膜とを介在 することによってホストとなる脳の実質内から分離されているところで、ホスト となる脳の実質の表面に入れるかの手法をとることができる。空洞内への移植は 、産生細胞を注入することによって行うこともできるし、また３０％のコラーゲ ンなどからなる基質内でその細胞を成長させ、移植片が非極在化するのを阻止す るように空洞に移植される固体組織のプラグ（ｐｌｕｇ）を形成することによっ て行うこともできる。硬膜下への移植に際しては、細胞は硬膜のスリットを形成 した後、脳の表面の周りに注入される。ホストとなる脳のなかの選択された領域 に注入する場合には、穴をあけ、挿入するマイクロシリンジの針状部分を硬膜を 貫通して挿入することによって行われる。このマイクロシリンジはステレオタキ シツク（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）なフレームに取り付けられており、３次元の ステレオタキシツクな座標を用いることによって、脳のなかの目的とする局所に その針状部分を位置づけることができるように構成されている。

細胞の＠濁液がシリンジに吸引され、そして麻酔ががけられている移植患者に投 与される。多数の注入がこの手法を用いて行われる。このドナー組織の年齢、即 ち成長段階は、移植の後の細胞の生存の可能性に影響を及ぼしている。

細胞の懸濁を用いたこのような方法によれば、脳の中のあらかじめ決められた部 位への遺伝子的に修飾された産生細胞の移植が可能になる。そしてその方法は比 較的、非外傷性の方法であって、数種類の異なる部位に同じ細胞の懸濁液を用い て同時に多数の移植を行うことを可能にして０るとともに、異なる解剖学的な領 域で細胞が混合することを許容している。

キャビティー（ｃａｖｉｔｙ）に移植を行う際には、例えば、脳を覆っている骨 を取り除いてゲルフオーム（ｇｅｌｆｏａ層）などの物質で血流を止める、即ち ５ｔｅｎｅｖ　ｉらの文献（Ｓｔｅｎｅｖｉ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｕｐｒａ）に 記載されている手法を行うことによって、移植用のキャビティーを形成すべく、 中枢神経系（ＣＮＳ）の外側表面に近い領域から組織が取り除かれる。そのキャ ビティーを形成するためには吸引装置を用いればよい。−個以上の移植片を、細 胞の注入法あるいは固体組織の植え付は法を利用して、−個の同一のキャビティ ー内に入れることもできる。

Ｄ、遺伝　発現のレベルと適合度 移碩後の産生細胞から産生された改変レトロウィルスを用いて感染された細胞内 で起こる遺伝子の発現レベルは、副面されなくてはならない。腫瘍細胞を死滅さ せるような望ましい効果の達成を確実にするためにはその発現レベルは十分に高 くなくてはならないが、正常の細胞に対して害になるほど発現レベルが高くなっ てはいけない。遺伝子の発現レベルは、改変レトロウィルス内のコントロールエ レメントを適切に選択することによってコントロールすることができる。

更にこの遺伝子の発現は正確でなくてはならず、即ちそれは、望ましくない融合 生成物がないこと、また転写を経て読み取る翻訳が行われないことを意味してい る。このファクターについても、ベクターを［２する際にコントロールすること ができる。

ここに説明されている本発明について、更に十分なる理解を助けるために、次に 実施例が示されている。この実施例は、例示の目的で記載されているのであって 、本発明の範囲を限定するように構成されているのではないことを理解しておく べきである。

Ｈ３Ｖ−ＴＫ遺伝子を運搬するネズミ（Ｍｕｒｉｎｅ）のレトロウィルスベクタ ーである、即ち５ＴＫ１ＮＹＫ、及びｔｔＴＫベクターは、［ｌｒ、　Ｆ、　Ｌ 、　Ｍｏｏｌｔｅｎがら得られた。このベクターのプラスミドフオームを、ψ− ２細胞にトランスフェクシｙンした（この点に関しては、Ｍａｎｎ　ｅｔ　ａｔ 、、Ｃｅ１ｌ　３３：１５３−１５９　（１９８３）を参照されたい。）。この 細胞を１ｍｇ／ｍｌのネオマイフンアナログｃ４１８を用いて選択することによ って、クローニングされたネオマイシン細胞ラインを単離することができた。こ のネオマイシン細胞ラインは、得られるウィルスに、Ｃｌ４１８耐性とＨ３Ｖ− ＴＫ活性を形質導入する能力がある。ウィルスの力価は限定希釈法（ｌｉｍｉｔ ｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）によって測定され、−個の細胞あた り５０ｐｆｕ以上の大きさであることが分かった。ψ−２細胞を用いることで期 待されるような、レプリケーノぎンーコンビテントウィルスは検出されなかった 。

ψ−２細胞によって生産されるｌｌＩ製可能な改変ウィルスは、ｃ６神経Ｉｇｌ １１１１１細胞を感染させるのに用いられる。感染させる細胞を、４μｇ／ｍ　 ｌのポリプレンを添加した１０％の胎児のラン血清を加えたＤＭＥ中で培養し、 そしてＴ７５フラスコ中で約６０−７０％コンフルエントに達するまで、あるい は１ｍｌあたり約２Ｘ１０６個の細胞数になるまで増殖させた。その細胞を、− 個の細胞あたり約１００ｐｆｕのウィルスを用いて感染させた。この感染させた 細胞を２４時間、１０％の胎児ウシ血清と抗体とを合音するゲルベフコの培地を 用いて培養した。

続いてそれを、溶液１ｍｌ中１ｍｇのＧ４１８として培養することによって、ベ クター誘導遺伝子を発現する細胞を選択することができた。

それぞれのベクターを用いてＣ６神経膠細胞を感染させて得られたクローン体ｉ ｔ、ｏ、＋、−ｔｏｏμｇ／ｍ　ｌの範囲の濃度に調整されたアシクロビルで３ 日間、処理された。その結果が第２図に示されている。それぞれのベクターは、 神経謬細胞を、アシクロビルに対する感受性を持つようにした。

同様の結果は３日間、サイトドキシティー分析（細胞毒分析）を行った際にも得 られた。Ｈ５Ｖ−ＴＫ遺伝子を欠損する細胞の５０％に対してアシクロビルの阻 害用量は、Ｈ３Ｖ−ＴＫを運搬する細胞に対する０、５ｍｇ／ｍｌに比較して、 １０ｍｇ／ｍ１以上大きかった。

正常の脳細胞はレトロウィルスの感染に抵抗性を示すため、これらのインビト三 での結果は、インビボにおいて腫瘍細胞を殺す能力のある遺伝子が選択的に脳内 のｌｌ１１細胞に導入することができる一方で、正常細胞への導入はほとんどな いことを示唆している。

実　施　例　■ インビボにおけるＣ６神経１ｇＭ瘍細胞への遺伝子の導入インビボにおけるＣ６ 神経膠細胞への遺伝子の導入について示した。修飾されたモロニーーネズミ白血 病ウィルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）が、インビボで遺伝子を０６神経ｇｌ！瘍細胞へ 導入する遺伝子を運搬するレトロウィルスベクターとして用いられた。これらの 実施例においては、β−ガラクトシダーゼ（Ｚ　ｌ　ａｃ）のリポータ遺伝子を 運搬するベクターを用いた。このβ−ｇａｌベクターは、ＬＴＲプロモーターの コントロール下にあるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダー ゼ（Ｚｌａｃ）遺伝子と、ＳＶ４０アーリープロモーターのコントロール下にあ るトランスホゾ：／　（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）のＴｎ５ネオマイシン耐性遺伝 子（ＮｅｏＲ）とを運搬しており、ｐＬＺＮＲＬをデザインしている。このプラ スミドの基本的なエレメントは、第３図に示されているように、モロニーネズミ 白血病ウィルスのＬＴＲプロモーターのコントロール下にある３、１−ｋｂのＥ 、ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ｌａｃ　Ｚ）と、ロウスサルコーマ ウィルスのＬＴＲプロモーターのコントロール下にあるネオマイシン耐性遺伝子 （Ｎｅｏ）と、アンビンリン選択性のβ−ラクタマーゼ遺伝子（ＡＭＰＱ）と、 及びプラスミド複製の開始点（ｐＢＲ３２２０ｒ　ｉ）である。ウィルスを、ψ −２８Ａ、Ｇ　２−４産生細胞によって、−個の細胞あたり５０１）ｆｕ以上の 大きさで産生させた（この点に関しては、５ｈｉｓｏｈａｒａ　ａｔ　ａｌ、、 　Ｍｏ１．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　５：　２７１−７８　（１９８９）を参照 されたい。）。この感染させた細胞を、１０％のウシ胎児の血清に、４００μｇ ／ｍｌの０４１８を、１０％のＣｏ２存在下で添加したＤＭＥ中にて増殖させた 。頭蓋内の０６腫瘍を発生させるため、スプレーツードウレイラット（Ｓｐｒａ ｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ　ｒａｔｓ）の基底がングリアに、１０５個のｌ！［細胞 をハミルトンマイクロンリンジを用いて滅菌条件にてステレオタキンブクに植え 付けた。１週間たった時点で、β−ガラクトシダーゼ産生細胞を１０６個の細胞 数の濃度で、その発生させた頭蓋内のＨｆ１ｒに注入した。コントロールとして の非−ウィルス産生細胞も、そのラットの脳！ｌ瘍に注入した。７日間、インビ ボで共に培養した後、その動物を殺してから５％のバラホルムアルデヒドを潅流 させた。脳と腫瘍を取り出し、組織学的な実験を行った。

層部分を切断し、産生細胞の育無による腫瘍細胞の違いを、組織化学的分析及び 免疫組織化学的な分析を行って調べた。組織化学的な染色方法は、β−ガラクト シダーゼを検出する方法であって、５−プロモー４−クロロ−３−インドリル− β−Ｄ−ガラクトシド、即ち２％の溶液中に含まれるβ−ガラクトシダーゼに対 する発色性の基質を用いて脳の断片をインキュベートし、結果的にβ−１ａｃ遺 伝子を発現する細胞内に青色を発色させる方法であった。免疫組織化学的な手法 では、ラットの脳プロティンであるネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に特異的に結合す るプライマリ−抗体が用いられ、この際この抗体は、ラットの脳とＣ６脳腫瘍細 胞に対して特異的に結合していた。このサンプルを、０．１Ｍのトリス緩衝液に ０゜２５％のトリトンＸ−１００を添加した溶液中で、プライマリ−抗体ととも に一晩インキユベートした。この際の抗体の希釈度は、１：２０００であった。

プライマリ−抗体を検出するためのセカンダリ−抗体としては、ＦＩＴＣ−ラベ ルされたヒツジ−抗ウサギのＩｇＧ抗体が用いられた。インキュベーン１ンは、 ｐＨ７゜４のホスフェート緩衝塩中で２時間かけて行われた。

前述の実験では、Ｃ６１１瘍細胞と正常の脳細胞とが両方ともβ−ｇａｌに対し て陰性であることを示した。ネスチンが存在するか存在しないかを検出する免疫 組織化学的染色法を行うと、このプロティンが脳内ならびにＣ６脳腫瘍細胞内に は存在しているが、この実験で用いたφ−２−ＢＡＧ　２−４産生細胞の中には 存在していないことがわかった。脳腫瘍のコントロールのラットでは、β−ｇａ １は陰性であった。β−ｇａｌレトロウィルス産生細胞が注入されたラットの脳 ！１１１では、β−ｇａ１は陽性であった。ふたつのタイプの細胞は、β−ｇａ ｌに対して陽性であり、ネスチンに対して陽性の細胞と、ネスチンに対して陰性 の細胞であることがわかった。０．０１％以下のほんのわずかの！！瘍細胞が、 β−ｇａｌに対して陽性であり、−万ネスチンに対しては陽性のままであった。

これらの細胞は、インビボで遺伝子導入を行うのに最も適切なＩｌ！瘍細胞であ る。これらの結果は、！！瘍細胞へのインビボにおける遺伝子導入が、適切な産 生細胞を移植することによっＣ行われることを示している。

本発明の目的及び精神から逸脱しない範囲内において、これまでに述べたような 本発明に対して種々の修飾や変形を加えることができることは明らかである。

ここに記載された特殊な実施例は、−例として挙げたにすぎない。本発明は、請 求の範囲の構成要件によってのみ限定がなされるものである。

第１図 ＴＫ ＴＫ 第２図 ７シ７０ビｊし　μ９／ｍ１ 第３図 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／８６ ／／　Ａ　６１　Ｋ　３７１５２　８３１４−４ＣＩ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の（ａ）〜（ｄ）の工程からなり、哺乳動物の増殖過程の腫瘍細胞を死 滅させるべく、少なくとも一個の治療用遺伝子を前記腫瘍細胞に導入する方法。 （ａ）選択マーカーと複製に必要な少なくとも一個の遺伝子とを備えたレトロウ ィルスを産生細胞に導入する工程であって、この導入により前記レトロウィルス に対応するプロウィルスのＤＮＡが前記産生細胞のゲノムに組み込まれて、前記 複製に必要な少なくとも一個の遺伝子が一個の治療用遺伝子あるいは複数の治療 用遺伝子で置換されて修飾されたレトロウィルスを産生させるようにすることを 特徴とするレトロウィルスを導入する工程。 （ｂ）前記修飾されたレトロウィルスがゲノムの一部として導入されるような産 生細胞を選択する工程。 （ｃ）前記産生細胞を前記腫瘍細胞の近傍に移植する工程であって、これにより 前記腫瘍細胞が前記修飾されたレトロウィルスで感染を受け、前記一個の治療用 遺伝子あるいは複数の治療用遺伝子が前記腫瘍細胞に導入されることを特徴とす る産生細胞を移植する工程。 （ｄ）前記腫瘍細胞に導入された前記一個の治療用遺伝子あるいは複数の治療用 遺伝子によって前記腫瘍細胞を死滅させる代謝産物に代謝されるような物質を投 与することによって前記腫瘍細胞を死滅させる工程。
2. ２．前記腫瘍細胞が、グリオーマ細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項 記載の治療用遺伝子の導入方法。
3. ３．前記一個の治療用遺伝子が、ヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼであ ることを特徴とする請求の範囲第２項記載の治療用遺伝子の導入方法。
4. ４．前記物質が、９−（（２−ハイドロキシエトキシ）メチル）グアニン（９− （（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）ｇｕａｎｉｎｅ）及び９ −（（２−ハイドロキシ−１−（ハイドロキシメチル）エトキシ）メチル）グア ニン（９−（（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｅｔ ｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）ｇｕａｎｉｎｅからなるグループから選択される物質 であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の治療用遺伝子の導入方法。
5. ５．前記レトロウィルスが、ＮｅｏＲ遺伝子とチミジンキナーゼプロモーター、 ＳＶ４Ｏアーリーリージョンプロモーター及びエンハンサー（ＳＹ４Ｏ　ｅａｒ ｌｙ　ｒｅｇｉｏｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｅｎｈａｎｃｅｒ）、イムノグロブリ ン重鎖のエンハンサーの中からなるグループから選択されるコントロールエレメ ントとを備えていることを特徴とする請求の範囲第３項記載の治療用遺伝子の導 入方法。
6. ６．前記レトロウィルスは、モロニーネズミ白血病ウィルスから誘導されること を特徴とする請求の範囲第３項記載の治療用遺伝子の導入方法。
7. ７．前記産生細胞は、成熟したウイルス粒子にプロウイルスのＲＮＡ転写体をキ ャプシッドで包むために必要なパッケージ信号を欠損しているプロウイルスを有 しており、一方、前記レトロウィルスベクターは、完全なパッケージ信号配列を 備えていることを特徴とする請求の範囲第１項記載の治療用遺伝子の導入方法。
8. ８．下記（ａ）〜（ｄ）の工程からなり、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞の複 製を抑制する方法。 （ａ）選択マーカーとヘルベスシンプレックスチミジンキナーゼをコードする遺 伝子とを備えたレトロウィルスベクターを産生細胞に導入する工程であって、こ の導入により前記レトロウィルスベクターに対応するプロウィルスのＤＮＡが前 記産生細胞のゲノムに組み込まれて、前記レトロウィルスの複製に必要な少なく とも一個の遺伝子がヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子で置換され て修飾されたレトロウィルスを産生させるようにすることを特徴とするレトロウ ィルスベクターを導入する工程。 （ｂ）前記ヘルベスシンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子を運搬する産生細胞 を選択する工程。 （ｃ）前記修飾されたレトロウィルスを運搬する前記産生細胞を前記腫瘍細胞の 近傍に移植する工程であって、これにより前記腫瘍細胞が前記修飾されたレトロ ウィルスで感染されて、前記ヘルベスシンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子が 前記腫瘍細胞に導入されることを特徴とする産生細胞を移植する工程。 （ｄ）９−（（２−ハイドロキシエトキシ）メチル）グアニン及び９−（（２− ハイドロキシ−１−（メチル）エトキシ）メチル）グアニンからなるグループか ら選択される抗癌剤を投与する工程であって、前記抗癌剤は、前記ヘルベスシン プレックスチミジンキナーゼによって前記腫瘍細胞の複製を阻害する代謝産物に 代謝されることを特徴とする抗癌剤を投与する工程。
9. ９．前記産生細胞は、実質内移植されることを特徴とする請求の範囲第８項記載 の腫瘍細胞の複製を抑制する方法。
10. １０．前記実質内移植が、前記ホストとなる脳実質内に前記産生細胞を注入する ことによって行われることを特徴とする請求の範囲第９項記載の腫瘍細胞の複製 を抑制する方法。