ES2709481T3 - Vectores recombinantes - Google Patents

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Douglas Jolly
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Christopher Logg
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Abstract

Un retrovirus recombinante competente en replicación que comprende: una proteína GAG retrovírica; una proteína POL retrovírica; una envoltura retrovírica; y un polinucleótido retrovírico que comprende una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 19 o 22

Description

DESCRIPCION
Vectores recombinantes
Campo tecnico
La presente divulgacion se refiere a vectores retrovmcos competentes en replicacion para tratar la proliferacion celular. La divulgacion se refiere adicionalmente al uso de dichos vectores retrovmcos competentes en replicacion para el suministro y expresion de acidos nucleicos heterologos.
Antecedentes
Los metodos eficaces de suministro de genes y acidos nucleicos heterologos a las celulas y sujetos ha sido un objetivo de los investigadores para el desarrollo cientffico y para posibles tratamientos de enfermedades y trastornos.
Tai et al (Molecular Therapy Vol. 12, No. 5, pp. 842-850) desvela que una terapia genetica suicida multidclica de inyeccion unica mediante vectores retrovmcos competentes en replicacion consigue un beneficio de la supervivencia a largo plazo en el glioma experimental.
Wang et al (Human Gene Therapy 14:117-127) desvela la transferencia genetica restringida al tumor y altamente eficaz para gliomas malignos mediante vectores retrovmcos competentes en replicacion.
Stewart et al (RNA (2003), 9:493-501) describe un silenciamiento genetico estable suministrado por lentivirus mediante ARNi en celulas primarias.
Chen et al (Virology 377 (2008) 265-272) desvela la inhibicion de la replicacion del virus de la enfermedad de Marek mediante un ARN de interferencia basado en un vector retrovmco.
Sumario
En un aspecto, la presente invencion proporciona un retrovirus recombinante competente en replicacion que comprende:
una protema retrovmca GAG;
una protema retrovmca POL;
una envoltura retrovmca; y
un polinucleotido retrovmco que comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 10 o 22. Mas generalmente, la divulgacion proporciona un retrovirus recombinante competente en replicacion (RCR) que comprende: una protema retrovmca GAG; una protema retrovmca POL; una envoltura retrovmca; un polinucleotido retrovmco que comprende secuencias de repeticiones terminales largas (LTR) en el extremo 3' de la secuencia de polinucleotido retrovmca, una secuencia promotora en el extremo 5' del polinucleotido retrovmco, siendo dicho promotor adecuado para la expresion en una celula de mairnfero, un dominio de acido nucleico gag, un dominio de acido nucleico pol, y un dominio de acido nucleico env; un casete que comprende un sitio interno de entrada en el ribosoma (IRES) unido operativamente a un polinucleotido heterologo, en el que el casete se posiciona a 5' de las LTR 3' y a 3' del dominio de acido nucleico env que codifica la envoltura retrovmca; y secuencias actuantes cis necesarias para la transcripcion inversa, empaquetamiento e integracion en una celula diana, en la que el RCR mantiene una competencia de replicacion mas alta despues de 6 pasajes en comparacion con un vector pACE (SEQ ID NO: 21). En un aspecto de la divulgacion, la secuencia de polinucleotido retrovmca se deriva del virus de la leucemia murina (MLV), virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus de la leucemia felina (FeLV) o virus de la leucemia del Gibon (GALV). En otro aspecto de la divulgacion, el MLV es un MLV anfotropico. En otro aspecto mas de la divulgacion, el retrovirus es un oncorretrovirus o un retrovirus gamma. En otro aspecto mas de la divulgacion, la celula diana es una celula que tiene un trastorno proliferativo celular. El trastorno proliferativo celular se puede seleccionar de entre el grupo que consiste en, pero no se limita a, cancer de pulmon, cancer de colonrecto, cancer de mama, cancer de prostata, cancer del tracto urinario, cancer uterino, cancer cerebral, cancer de cabeza y cuello, cancer pancreatico, melanoma, cancer de estomago y cancer ovarico, artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunitarias. En un aspecto de la divulgacion, el promotor comprende un promotor de c Mv que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19, 20 o 22 desde el nucleotido 1 a aproximadamente el nucleotido 582. En un aspecto adicional de la divulgacion, el promotor comprende un polinucleotido del dominio CMV-R-U5. En un aspecto de la divulgacion, el dominio CMV-R-U5 comprende el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano unido a una region R-U5 de MLV. En otro aspecto de la divulgacion, el polinucleotido del dominio CMV-R-U5 comprende una secuencia como ese expone en la SEQ ID NO: 19, 20 o 22 desde aproximadamente el nucleotido 1 a aproximadamente el nucleotido 1202 o las secuencias que son al menos un 95% identicas a una secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 19, 20 o 22, en la que el polinucleotido promociona la transcripcion de una molecula de acido nucleico unida operativamente al mismo. En otro aspecto de la divulgacion, el gag y pol del polinucleotido se derivan de un oncorretrovirus o un retrovirus gamma. El dominio de acido nucleico gag puede comprender una secuencia desde aproximadamente el nucleotido 1203 a aproximadamente el nucleotido 2819 de la SEQ ID NO: 19, 20 o 22 o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 99,8 % de identidad con la misma. El dominio pol puede comprender una secuencia desde aproximadamente el nucleotido numero 2820 a aproximadamente el nucleotido 6358 de la SEQ ID NO: 19, 20 o 22 o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, 99 %, o 99,9 % de identidad con la misma. En un aspecto de la divulgacion en dominio env codifica una protema env anfotropica. El dominio env puede comprender una secuencia desde aproximadamente el nucleotido numero 6359 a aproximadamente el nucleotido 8323 de SEQ ID NO: 19, 20 o 22 o una secuencia que tenga al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 99,8 % de identidad con la misma. El dominio IRES del vector puede ser cualquier IRES, sin embargo, en un aspecto de la divulgacion el IRES se deriva de un virus de la encefalomiocarditis. En un aspecto adicional de la divulgacion, el IRES comprende una secuencia desde aproximadamente el nucleotido numero 8327 a aproximadamente el nucleotido 8876 de la SEQ ID NO: 19 o 22 o una secuencia que tenga al menos un 95 %, 98 % o 99 % de identidad con la misma.
El vector puede comprender cualquier numero de polinucleotidos heterologos. Por ejemplo, el polinucleotido heterologo puede comprender una citocina, un ARNip, un miARN o moleculas de ARNi, una secuencia de direccionamiento, un dominio de union, un gen citotoxico, un anticuerpo de cadena sencilla o cualquier combinacion de los mismos. Cuando el polinucleotido heterologo es para un ARN no traducido tal como un ARNip, miARN o ARNi entonces no es necesario un IRES, pero se puede incluir para otro gen de ARN traducido, y se puede utilizar cualquier clase de retrovirus. En un aspecto mas de la divulgacion, el polinucleotido heterologo comprende un polinucleotido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15 o 17. En un aspecto adicional de la divulgacion, la secuencia heterologa codifica un polipeptido que comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4. El acido nucleico heterologo tiene el codon optimizado humano y codifica un polipeptido como se exponen en la SEQ ID NO: 4. En un aspecto adicional de la divulgacion, el acido nucleico heterologo comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19 o 22 desde aproximadamente en nucleotido numero 8877 a aproximadamente 9353. En un aspecto de la divulgacion, la LTR 3' se deriva de un oncorretrovirus o un retrovirus gamma. En un aspecto adicional de la divulgacion, la LTR 30 comprende un dominio U3-R-U5. En un aspecto adicional mas de la divulgacion, la LTR 3' comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19 desde aproximadamente el nucleotido 9405 a aproximadamente 9998 o una secuencia que es al menos un 95 %, 98 %, o 99,5 % identica a la misma.
La divulgacion proporciona un polinucleotido que comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19, 20 o 22.
La divulgacion proporciona un polinucleotido aislado que comprende de 5' a 3' : una fusion CMV-R-U5 del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano con una region R-U5 del MLV; un PBS, sitio de union del cebador para la transcriptasa inversa; un sitio de corte y empalme 50; una senal de empaquetamiento y ; una secuencia codificante de gag para el antfgeno espedfico del grupo del MLV; una secuencia codificante de pol para la polimerasa poliproteica de MLV; un sitio de corte y empalme 3'; una secuencia codificante env 4070A para la protema de envoltura de la cepa 4070A del MLV; un sitio interno de entrada en el ribosoma (IRES)del virus de la encefalomiocarditis; una secuencia codificante de la citosina desaminasa modificada; un tracto polipurina; y una repeticion larga U3-R-U5 del MLV.
La divulgacion proporciona un metodo de tratamiento de un sujeto con un trastorno proliferativo celular que comprende poner en contacto al sujeto con un polinucleotido que codifica un polipeptido de la divulgacion que tiene una actividad citosina desaminasa en condiciones de manera que el polinucleotido se exprese, y poner en contacto al sujeto con 5-fluorocitosina.
La divulgacion tambien proporciona un metodo de tratamiento de un trastorno proliferativo en un sujeto que comprende poner en contacto al sujeto con un retrovirus de la divulgacion, en el que la secuencia de acido nucleico heterologo codifica una protema terapeutica que inhibe la proliferacion de una celula neoplasica. En un aspecto de la divulgacion, el retrovirus comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4, 12, 14, 16, o 18.
Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se exponen en los dibujos acompanantes y la descripcion posterior. Otras caractensticas, objetos y ventajas seran evidentes a partir de la descripcion y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
Las Figuras 1A-C muestra un alineamiento de la citosina desaminasa de levadura de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) y una citosina desaminasa de la divulgacion (SEQ ID NO: 4) y otras secuencias de la divulgacion.
La Figura 2 muestra un grafico de datos de destruccion celular que demuestran que los vectores son mas eficaces en comparacion con el CD original de tipo silvestre. El grafico tambien muestra que el nuevo armazon modificado (T5.0007) es mas eficaz en la destruccion que el antiguo armazon (pACE-CD). Tambien se muestra una tabla que cataloga las distintas construcciones de vector y sus nombres.
Las Figuras 3A-D muestran (a) un esquema del vector retrovmco recombinante de la divulgacion; (b) un mapa de plasmido de un polinucleotido de la divulgacion; (c y d) una secuencia de un polinucleotido de la divulgacion (SEQ ID NO: 19).
La Figura 4 muestra que se observan niveles mas altos de protema yCD2 en comparacion con la protema yCD de tipo silvestre en celulas U-87 infectadas.
La Figura 5 muestra que un vector de la divulgacion es geneticamente estable despues de 12 ciclos de pasajes vmcos como se evalua utilizando una amplificacion por PCR. La figura tambien demuestra que los vectores de la divulgacion son mas estables despues de pasajes mas largos en comparacion con el vector pACE-CD (Kasahara et al.). En particular, el pAC3-CD es mas estable que el pACE-CD, que demuestra que el armazon cambiado ha hecho mas estable al vector. Ademas, el pACE-YCD1 (T5.0001) y -yCD2 (T5-0002) son mucho mas estables que el pAC-YCD demostrando que pequenos cambios silentes en la secuencia codificante del transgen pueden tener un efecto muy grande sobre la estabilidad, dando lugar a propiedades superiores. El T5.0003 es el menos estable y T5.0004 y T5.0005 parecen aproximadamente equivalentes al pACE-CD, que ha demostrado su eficacia en tumores de raton (W. Wang et al. Hum Gene Ther 14:1172003, Tai et al. Mol Ther 12:8422005). La Figura 6 muestra (A) ensayos de destruccion celular; y (B) actividad espedfica citosina desaminasa de las celulas infectadas con diferentes vectores. (A) muestra que la citosina desaminasa y el vector de la divulgacion destruye las celulas infectadas al menos tan bien o quiza mejor que el pACE-CD original cuando las celulas U87 infectadas se exponen a niveles crecientes de 5-FC. (B) muestra que la actividad espedfica de CD de la divulgacion (T5.0007, T5.0001, y T5.0002) todas aumentan en comparacion con pACE-CD (T5.0000), y estan en el orden T5.0000<T5.0007<T5.0001<T5.0002.
La Figura 7 muestra tumores U-87 tratados con el vector CD de la divulgacion in vivo y explantados de ratones tratados con 4 ciclos de 5-FC siguen siendo sensibles al farmaco.
La Figura 8 muestra la informacion de dosificacion y efecto terapeutico en un analisis de supervivencia de Kaplan-Meyer en un modelo de raton de cancer cerebral.
La Figura 9 muestra la informacion de dosificacion y efecto terapeutico en un analisis de supervivencia de Kaplan-Meyer en un modelo de raton singenico.
Las Figuras 10A-D muestran esquemas de la generacion de distintas realizaciones de la divulgacion que comprenden el polipeptido con actividad CD, OPRT y UPRT.
Figura 11: A. es un mapa de vector esquematico del armazon pAC3 de un vector retrovmco MLV que contiene secuencias de polinucleotidos del precursor humano primario miR-128-1, el precursor humano primario miR-128-2 y el precursor humano miR-129 unido a un promotor H1 humano, denominado pAC3-miR128-1, pAC3-miR-128-2, y pAC3-H1-shRNAmiR128, respectivamente. B. es un mapa de un vector esquematico del armazon pAC3-YCD2 del vector retrovmco MLV que contiene secuencias de polinucleotido de un precursor humano miR-128 unido a un promotor H1 humano, denominado pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128.
Figura 12: A. muestra una comparacion de las cineticas de replicacion de vectores que contienen miR-128 (pAC3-miR-128-1, pAC3-miR-128-2, y, pAC3-H1-shRNAmiR128) en celulas HT1080 de fibrosarcoma humano analizadas por qPCR. El grafico se genera graficando los valores C(t) invertidos obtenidos de la qPCR frente a distintos momentos durante la replicacion vmca. B. muestra una comparacion de las cineticas de replicacion de vectores que conteman el miR-128 (pAC3-miR-128-1, pAC3-miR-128-2, y, pAC3-H1-shRNAmiR128) en celulas U87-MG de glioma humano analizadas por qPCR. El grafico se genero graficando los valores de C(t) invertido obtenidos de la qPCR frente a distintos momentos durante la replicacion vmca.
La Figura 13 muestra una cuantificacion relativa de la expresion de miR-128 maduro de celulas transducidas con vectores que conteman miR-128.
La Figura 14 muestra una cuantificacion relativa de la expresion del gen Bmi-1 de celulas transducidas con vectores que conteman miR-128.
La Figura 15 es un mapa de vector esquematico del vector retrovmco MLV pAC3-emd que contema una unica copia de la secuencia 142-3pT, denominado pAC3-emd-142-3pT y repeticiones en tandem de 4 de 142-3pT, denominado pAC3-emd-142-3pT4X.
La Figura 16 es un mapa de vector esquematico del vector retrovmco MLV pAC3-YCD2 que contema una unica copia de la secuencia 142-3pT, denominado pAC3-YCD2-142-3pT y repeticiones en tandem de 4 de 142-3pT, denominado pAC3-YCD2-142-3pT4X.
Figura 17: A. muestra una comparacion de las cineticas de replicacion de vectores que conteman 142-3pT (pAC3-emd-142-3pT pAC3-emd-142-3pT4X, pAC3-/CD2-142-3pT y pAC3-/CD2-142-3pT4X) y sus vectores parentales (pAC3-emd y pAC3-YCD2) en celulas HT1080 de fibrosarcoma humano analizadas por qPCR. El grafico se genera graficando los valores de C(t) invertidos obtenidos de la qPCR frente a distintos momentos durante la replicacion vmca. B. muestra una comparacion de las cineticas de replicacion de vectores que conteman GFP (pAC3-emd, pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X) en celulas HT1080 de fibrosarcoma humano analizadas por analisis de citometna de flujo de la expresion de GFP en distintos momentos durante la diseminacion del vector.
Figura 18: A. muestra una comparacion de las cineticas de replicacion de vectores que conteman 142-3pT (pAC3-emd-142-3pT pAC3-emd-142-3pT4X, pAC3-/CD2-142-3pT y pAC3-/CD2-142-3pT4X) y sus vectores parentales pAC3-emd y pAC3-YCD2) en celulas HT1080 de fibrosarcoma humano analizadas por qPCR. El grafico se genera graficando los valores de C(t) invertidos obtenidos de la qPCR frente a distintos momentos durante la replicacion vmca. B. muestra una comparacion de las cineticas de replicacion de vectores que conteman GFP (pAC3-emd, pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X) en celulas U87-MG de glioma humano analizadas por analisis de citometna de flujo de la expresion de GFP en distintos momentos durante la diseminacion del vector.
La Figura 19 muestra las cineticas de replicacion de un vector que contienen la GFP (pAC3-emd) en celulas hematopoyeticas de raton y humanas por analisis de citometna de flujo de la expresion de GFP en distintos momentos durante la diseminacion del vector.
Figura 20: A. muestra una comparacion de las cineticas de replicacion de vectores que conteman GFP (pAC3-emd, pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X) en linfocitos T EL4 de raton analizadas por analisis de citometna de flujo de la expresion de GFP en distintos momentos durante la diseminacion del vector. B. muestra una comparacion de las cineticas de replicacion de vectores que conteman GFP (pAC3-emd, pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X) en linfocitos T SUP-T1 humanos analizadas por analisis de citometna de flujo de la expresion de GFP en distintos momentos durante la diseminacion del vector. C. muestra una comparacion de la cinetica de replicacion de vectores que conteman GFP (pAC3-emd, pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X) en monocitos U937 humano analizadas por analisis de citometna de flujo de la expresion de GFP en distintos momentos durante la diseminacion del vector.
Las Figuras 21A y 21B son fotos de las imagenes del MRI obtenidas a partir de un perro paciente durante la infusion CED intratumoral de Toca 511 y gadolinio. Notese el gran tumor del lado izquierdo de la imagen que comprime ambos lados del cerebro y desplaza las estructuras de la lmea media hacia la derecha. Las areas blancas son la infusion de gadolinio-Toca 511. La Figura 21B muestra la colocacion de los dos cateteres en el tumor.
La Figura 22 es un mapa de vector esquematico de los vectores retrovmcos MLV que codifican el IFN-gamma humano (hIFNg) y el IFN-gamma de raton (mIFNg), respectivamente, en un armazon pAC3.
La Figura 23 muestra la expresion de mIFN-gamma a nivel de ARN de la lmea celular HT1080 del fibrosarcoma humano infectadas con el vector pAC3-mINFg. La expresion se detecta por RT-PCR.
La Figura 24 muestra la expresion de hIFN-gamma proteico secretado por la lmea celular HT1080 de fibrosarcoma humano infectadas con un vector pAC3-hIFNg.
La Figura 25 muestra la expresion de mIFN-gamma proteico secretado por la lmea celular HT1080 de fibrosarcoma humano infectadas con un vector pAC3-mIFNg.
La Figura 26 muestra los analisis de citometna de flujo de la expresion de GFP en celulas U87 despues del suministro intratumoral o intravenoso del vector AC3-GFP en un modelo de raton desnudo. Las celulas se miden por citometna de flujo por porcentaje de positivos a GFP. Las celulas aisladas de los cerebros intactos de ratones desnudos, las celulas U87 del cultivo celular, o celulas U87 transducidas con una multiplicidad de infeccion de 1 con AC3-GFP (V) in vitro sirven como controles. Del ejemplo de referencia 27 (inyeccion iv del vector GFP). La Figura 27 muestra un histograma del analisis que se hizo tambien en los grupos 1, 3, y 5 del ejemplo de referencia 27 (inyeccion iv del vector con GFP) para medir la distribucion de la senal de GFP en celulas U87 aisladas. La expresion de GFP es de las celulas tumorales U87 aisladas de los cerebros de raton 14 dfas despues del tratamiento con el vector.
La Figura 28 es un mapa de vector esquematico de los vectores retrovmcos MLV que codifican la IL-2 humana en el armazon pAC3.
Sfmbolos de referencia similares en los distintos dibujos indican elementos similares.
Descripcion detallada
Como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de “un”, “una”, y “el” incluye los referentes plurales a menos de que el contexto dicte claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “una celula” incluye una pluralidad de dichas celulas y la referencia a “el agente” incluye referencias a uno o mas agentes conocidos por los expertos en la tecnica, y asf.
Tambien, el uso de “o” significa “y/o” a menos de que se establezca otra cosa. De manera similar, “comprender”, “comprende”, “que comprende”, “incluir”, “incluye”, y “que incluye” son intercambiables y no pretenden ser limitantes. Se entendera ademas que cuando las descripciones de distintos aspectos de la divulgacion utilizan la expresion “que comprende”, los expertos en la tecnica entenderan que, en algunos casos espedficos, un aspecto de la divulgacion se puede describir alternativamente utilizando la expresion “que consiste esencialmente en” o “que consisten en”.
A menos de que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos o cientfficos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente el experto habituado en la tecnica a la que pertenece la presente divulgacion.
Los textos generales que describen las tecnicas de biologfa molecular utiles en el presente documento, incluyendo el uso de vectores, promotores y muchos otros topicos relevantes, incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Volume 152, (Academic Press, Inc., San Diego, Calif.) ("Berger"); Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2d ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado a lo largo de 1999) ("Ausubel").Ejemplos de protocolos suficientes para dirigir a los expertos a traves de los metodos de amplificacion in vitro, incluyendo la reaccion en cadena de polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de ligasa (LCR), amplificacion de Qp-replicasa y otras tecnicas mediadas por ARN polimerasas (por ejemplo, NAS-BA), por ejemplo, para la produccion de los acidos nucleicos homologos de la divulgacion se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, as ^como en Mullis et al. (1987) Pat. de EE. UU. N.° 4.683.202; Innis et al., eds. (1990). Protocolos de PCR: A Guide to Methods and Applications (Academic Press Inc. San Diego, Calif.) ("Innis"); Arnheim & Levinson (oct. 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35: 1826; Landegren et al. (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4:560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117; y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Se describen metodos mejorados para la clonacion de acidos nucleicos amplificados in vitro en Wallace et al., Pat. de EE. UU. N.° 5.426.039. Se resumen los metodos mejorados para la amplificacion de grandes acidos nucleicos por PCR en Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685 y las referencias citadas en este, en el que se generaban amplicones de PCR de hasta 40 kb. Un experto en la tecnica apreciara que se puede convertir esencialmente cualquier ARN en un ADN de cadena doble adecuado para la digestion por restriccion, la expansion por PCR y la secuenciacion utilizando una transcriptasa inversa y una polimerasa. Vease, por ejemplo, Ausubel, Sambrook y Berger, supra.
La divulgacion proporciona metodos y composiciones utiles para el suministro de un gen o protema a una celula o sujeto. Dichos metodos y composiciones se pueden utilizar para tratar distintas enfermedades y trastornos en un sujeto incluyendo el cancer y otras enfermedades y trastornos proliferativos. La divulgacion proporciona la replicacion de vectores retrovmcos competentes para el suministro genetico.
Los terminos “vector”, “construccion de vector” y “vector de expresion” significa el vehmulo por el que la secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen ajeno) se puede introducir en una celula huesped, de manera que transforma el huesped y promocionan la expresion (por ejemplo, la transcripcion y traduccion) de la secuencia introducida. Los vectores comprenden normalmente el ADN de un agente transmisible en el que se inserta el ADN ajeno que codifica una protema por tecnologfa de enzimas de restriccion. Un tipo comun de vector es un “plasmido”, que en general es una molecula autocontenida de ADN de cadena doble que puede aceptar facilmente un ADN adicional (ajeno) y que se puede introducir facilmente en una celula huesped adecuada. Se ha descrito un gran numero de vectores, incluyendo plasmidos y vectores fungicos, para la replicacion y/o expresion en una variedad de huespedes eucariotas o procariotas. Ejemplos no limitantes incluyen plasmidos pKK (Clonetech), plasmidos pUC, plasmidos pET (Novagen Inc., Madison, Wis.), plasmidos pRSET o pREP (Invitrogen, San Diego, Calif.), o plasmidos pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.), y muchas celulas huesped adecuadas, utilizando metodos desvelados o citados en el presente documento o conocidos de otra manera por los expertos en la tecnica relevante. Los vectores de clonacion recombinante a menudo incluiran uno o mas sistemas de replicacion para la clonacion o expresion, uno o mas marcadores para la seleccion del huesped, por ejemplo, resistencia a antibioticos, y uno o mas casetes de expresion.
Los terminos “expresar” o “expresion” significa que se permite o causa la informacion de un gen o secuencia de ADN se vuelva manifiesta, por ejemplo, produciendo una protema activando las funciones celulares implicadas en la transcripcion y traduccion de un gen o secuencia de ADN correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en o por una celula para formar un “producto de expresion” tal como una protema. El propio producto de expresion, por ejemplo, la protema resultante, tambien se puede decir que se “expresa” en la celula. Un polinucleotido o polipeptido se expresa recombinantemente, por ejemplo, cuando se expresa o produce en una celula huesped ajena bajo el control de un promotor ajeno o nativo, o en una celula huesped nativa bajo el control de un promotor ajeno.
La divulgacion proporciona vectores vmcos competentes en replicacion que contienen un polinucleotido heterologo que codifica, por ejemplo, una citosina desaminasa o mutante de la misma, un miARN o ARNip, una citocina, un dominio de union de anticuerpo, etc., que se pueda suministrar a una celula o sujeto. El vector vmco puede ser un vector adenovmco, un vector de sarampion, un vector del herpes, un vector retrovmco (incluyendo un vector lentivmco), un vector rhabdovmco tal como un vector vmco de la estomatitis vesicular, un vector retrovmco, un vector de virus del valle Seneca, un vector de poxvirus (incluyendo vectores derivados de vaccinia o viruela animal), un vector de parvovirus (incluyendo un vector AAV), un vector de alfavirus u otros vectores conocidos por el experto en la tecnica (vease tambien ,por ejemplo, Concepts in Genetic Medicine, ed. Boro Dropulic y Barrie Carter, Wiley, 2008, Hoboken, NJ.; The Development of Human Gene Therapy, ed. Theodore Friedmann, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold springs Harbor, New York, 1999; Gene and Cell Therapy, ed. Nancy Smyth Templeton, Marcel Dekker Inc., New York, New York, 2000 y Gene Therapy: Therapeutic Mechanism and Strategies, ed. Nancy Smyth Templetone y Danilo D Lasic, Marcel Dekker, Inc., New York, New York, 2000).
El vector vmco puede ser un vector retrovmco competente en replicacion o que infecta solo las celulas de marnffero en replicacion. El vector retrovmco competente en replicacion puede comprender un sitio interno de entrada en el ribosoma (IRES) 5' del polinucleotido heterologo que codifica, por ejemplo, una citosina desaminasa, miARN, ARNip, citocina, receptor, anticuerpo o similares. Cuando el polinucleotido heterologo codifica un ARN no traducido tal como un ARNip, miARN, o ARNi entonces no es necesario un IRES, pero se puede incluir para otro gen traducido, y se puede utilizar cualquier tipo de retrovirus (vease posteriormente). El polinucleotido puede estar a 3' de un polinucleotido ENV de un vector retrovmco.
Se proporcionan las celulas huesped transfectadas con un vector retrovmco competente en replicacion de la divulgacion. Las celulas huesped incluyen celulas eucariotas tales como celulas de levadura, celulas de insecto o celulas animales. Las celulas huesped tambien incluyen celulas procariotas tales como las celulas bacterianas.
Tambien se proporcionan celulas huesped modificadas que se han transducido (transformado o transfectado) con un vector proporcionado en el presente documento (por ejemplo, un vector retrovmco competente en replicacion). Las celulas huesped modificadas se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados segun sea apropiado para activar los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar un polinucleotido codificante. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son los que se utilizaban anteriormente con la cela huesped seleccionada para la expresion, y sera evidente para los expertos en la tecnica y en las referencias citadas en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, Sambrook, Ausubel y Berger, asf como, por ejemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3a ed. (Wiley-Liss, New York) y las referencias citadas en el presente documento.
Ejemplos de huespedes de expresion apropiados incluyen: celulas bacterianas, tales como E. coli, B. subtilis, Streptomyces, y Salmonella typhimurium; celulas fungicas, tal como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Neurospora crassa; celulas de insectos tales como de Drosophila y Spodoptera frugiperda; celulas de marnffero tales como CHO, COS, BHK, HEK293, br de melanoma de Bowes; o celulas o explantes vegetales, etc. Se pueden utilizar celulas o lmeas celulares humanas, sin embargo, puede ser deseable clonar vectores y polinucleotidos en celulas huesped no humanas para los fines de la secuenciacion, amplificacion y clonacion.
La divulgacion tambien proporciona vectores retrovmcos competentes en replicacion que tienen una estabilidad aumentada con respecto a los vectores retrovmcos anteriores. Dicha estabilidad aumentada durante la infeccion y replicacion es importante para el tratamiento de trastornos de proliferacion celular. La combinacion de eficacia de transduccion, estabilidad del transgen y selectividad de diana se proporciona por el retrovirus competente en replicacion. Las composiciones y metodos proporcionan estabilidad de la insercion y mantienen la actividad de transcripcion del transgen y la viabilidad de la traduccion del polipeptido codificado.
La divulgacion proporciona vectores retrovmcos modificados. Los vectores retrovmcos modificados se pueden derivar de miembros de la familia Retroviridae. La familia Retroviridae consiste en tes grupo: los espumavirus (o virus espumosos) tales como el virus espumoso humano (HFV); los lentivirus, asf como virus visna de la oveja; y los oncovirus (aunque no todos los virus de este grupo son oncogenicos). El termino “lentivirus” se utiliza en su sentido convencional para describir un genero de virus que contienen transcriptasa inversa. Los lentivirus incluyen los “virus de inmunodeficiencia” que incluyen el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tipo y tipo 2 (VIH-1 y VlH-2) y virus de inmunodeficiencia de simios (SIV). Los oncovirus adicionalmente se han subdividido historicamente en los grupos A, B, C y D basandose en la morfologfa de las partmulas, segun se observa por bajo el microscopio electronico durante la maduracion vmca. Las partmulas tipo-A representan las partmulas inmaduras de los virus tipo D de Banda que se ven en el citoplasma de celulas infectadas. Estas partmulas no son infecciosas. Las partmulas tipo B brotan como virion maduro desde la membrana plasmatica por que se envuelven en partmulas tipo A intracitoplasmaticas. En la membrana poseen un centro toroidal de 75 nm, a partir del cual proyecta largas espfculas glicoproteicas. Despues de brotar, las partmulas tipo B contiene un centro electrodenso localizado excentricamente. El virus prototipo de tipo B es el virus del tumor mamario del raton (MMTV). No se pueden observar partmulas intracitoplasmaticas en las celulas infectadas por virus del tipo C. A su vez, las partmulas maduras brotan directamente de la superficie celular mediante una condensacion en forma creciente lunar de “C” que entonces se cierra en sf mismo y se encierra por la membrana plasmatica. Las espfculas glicoproteicas de la envoltura pueden estar visibles, junto con un centro uniformemente electrodenso. El brote puede producirse a partir de la superficie de la membrana plasmatica o directamente en vacuolas intracelulares. Los virus de tipo C son los mas comunmente estudiados e incluyen muchos de los virus de leucemia aviar y murina (MLV). El virus de leucemia bovina (BLV) y los virus de leucemia de celulas T humanas de tipo I y II (HTLV-I/II) se clasifican de manera similar a las partmulas de tipo C debido a la morfologfa de su brote a partir de la superficie celular. No obstante, tienen tambien una morfologfa hexagonal regular y estructuras del genoma mas complejas que los virus de tipo C prototfpicos tales como los virus de leucemia murina (MLV). Las partfculas de tipo B se parecen a las partfculas de tipo B en que muestran estructuras tipo anillo en el citoplasma de la celula infectada, de la cual brotan a partir de la superficie celular, pero el virion incorpora espfculas glicoproteicas de superficie cortas. Los centros electrodensos tambien se localizan excentricamente en las partfculas. El virus de mono Mason Pfizer (MPMV) es el virus prototipo del tipo D.
Los retrovirus se han clasificado de distintas maneras pero la nomenclatura se ha convencionalizado en la ultima decada (vease, ICTVdB - The Universal Virus Database, v 4 en la World Wide Web (www) en ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/ y el libro de texto "Retroviruses" Eds Coffin, Hughs y Varmus, Cold Spring Harbor Press 1997). El vector retrovmco competente en replicacion puede comprender un Ortorretrovirus o mas normalmente un vector retrovmco gamma.
Los retrovirus se definen por la forma en que replican su material genetico. Durante la replicacion el ARN se convierte en ADN. A continuacion de la invencion de la celula se genera una molecula de cadena doble a partir de dos moleculas de ARN que se lleva a cabo en la partmula vmca por el proceso molecular conocido como transcripcion inversa. El ADN que se forma llega a integrarse covalentemente en el genoma de la celula huesped como un provirus, desde el que se expresan ARN vmcos con la ayuda de los factores celulares y/o vmcos. Los ARN vmcos expresados estan empaquetados en partmulas y se liberan como viriones infecciosos.
La partmula retrovmca esta compuesta por dos moleculas de ARN identicas. Cada genoma de tipo silvestre tiene una molecula de ARN de cadena sencilla, en sentido positivo, que esta protegida en el extremo 5' y poliadenilada en la cola 3'. La partmula de virus diploide contiene las dos cadenas de a Rn formando un complejo con protemas gag, enzimas vmcas (productos geneticos pol) y moleculas de ARNt del huesped en una estructura 'central' de protemas gag. Rodeado y protegiendo esta capside hay una bicapa lipfdica, derivada de las membranas de la celula huesped y que contiene protemas de la envoltura vmca (env). Las protemas env se unen a un receptor celular para el virus y la partmula vmca entra normalmente en la celula huesped mediante endocitosis mediada por un receptor y/o la fusion con la membrana.
Despues, la envoltura externa se corta, el ARN vmico se copia en ADN por transcripcion inversa. Esto esta catalizador por la enzima transcriptasa inversa codificada por la region pol y utilizan el ARNt de la celula huesped empaquetado en el virion como cebador para la smtesis de ADN. De esta manera el ARN genomico se convierte en ADN genomico mas complejo.
El ADN lineal de doble cadena producido por transcripcion inversa puede tener que circularizarse o no en el nucleo. El provirus ahora tiene dos repeticiones identicas en cada extremo conocidas como las repeticiones terminales largas (LTR). Los extremos de las dos secuencias de LTR produce el sitio de reconocimiento por un producto pol -la integrasa proteica- que cataliza la integracion, de manera que el provirus siempre esta unido a dos pares de bases (pb) del ADN del huesped a partir de los extremos de las LTR. Se ve una duplicacion de las secuencias celulares en los extremos de ambas LTR. Reminiscentes del patron de integracion de elementos geneticos que se transponen. La integracion se crefa que se produda aleatoriamente en el genoma de la celula diana. Sin embargo, modificando las repeticiones terminales largas es posible controlar la integracion de un genoma retrovmco.
La transcripcion, corte y empalme de ARN y traduccion del ADN vmico integrado esta mediado por las protemas de la celula huesped. Se generan transcripciones cortadas y empalmadas de manera distinta. En el caso de las protemas vmcas de los retrovirus humanos VIH-1/2 y HTLV-I/II tambien se utilizan para regular la expresion genetica. La interaccion entre los factores celulares y vmcos es un factor en el control de la latencia del virus y la secuencia temporal en la que los genes vmicos se expresan.
Los retrovirus se pueden transmitir horizontal y verticalmente. La transmision infecciosa eficaz de los retrovirus necesita la expresion en la celula diana de receptores que reconocen espedficamente las protemas de la envoltura vmca, aunque los virus pueden utilizar rutas de entrada no espedficas independientes del receptor con baja eficacia. Ademas, el tipo celular diana puede ser capaz de soportar todos los estadios del ciclo de replicacion una vez que el virus se ha unido y penetrado. La transmision vertical se produce cuando el genoma vmco llega a integrarse en la lmea germinal del huesped. El provirus pasara entonces de generacion en generacion como si fuera un gen celular. Po lo tanto, los provirus endogenos llegan a establecerse de manera que frecuentemente permanecen latentes que pueden ser capaces de activarse cuando el huesped se expone a agentes apropiados.
Como se ha mencionado anteriormente, se hace referencia al ADN integrado intermedio como provirus. La terapia genetica o sistemas de suministro genetico anteriores utilizan metodos y retrovirus que necesitan la transcripcion del provirus y el ensamblaje en virus infecciosos mientras esta en presencia de un virus auxiliar apropiado o en una imea celular que contiene las secuencias apropiadas que hacen posible la encapsidacion sin la produccion coincidente de un virus auxiliar contaminante. Como se describe posteriormente, un virus auxiliar no es necesario para la produccion del retrovirus recombinante de la divulgacion, ya que las secuencias para la encapsidacion se proporcionan en el genoma proporcionando de esta manera un vector retrovmco competente en replicacion para el suministro o terapia genetica.
Los vectores retrovmcos competentes en replicacion existentes tambien tienden a perderse de una celula infectada o celula huesped durante la transmision horizontal o vertical y durante la replicacion. Esto puede deberse en parte a la presencia de secuencias extranucleotfdicas que incluyen repeticiones o que reducen la eficacia de una polimerasa.
El genoma retrovmco y el ADN provmico de la divulgacion tienen al menos tres genes: el gag, el pol, y el env, estos genes pueden estar flanqueados por una o dos repeticiones terminales largas (LTR), o en el provirus estan flanqueados por dos repeticiones terminales largas (LTR) y secuencias que contienen secuencias cis-actuantes tales como psi. El gen gag codifica las protemas estructurales internas (matriz, capside y nucleocapside); el gen pol codifica la ADN polimerasa dirigida por ARN (transcriptasa inversa), proteasa e integrasa; y el gen env codifica las glicoprotemas de la envoltura. Las LTR 5' y/o 3' sirven para promocionar la transcripcion y la poliadenilacion de los ARN del virion. La LTR contiene todas las demas secuencias cis-actuantes necesarias para la replicacion vmca. Los lentivirus tienen genes adicionales que incluyen vif, vpr, tat, rev, vpu, nef, y vpx (en VIH-1, VIH-2 y/o SIV).
Adyacentes a la LTR 5' estan las secuencias necesarias para la transcripcion inversa del genoma (el sitio de union del cebador en ARNt) y para la encapsidacion eficaz del ARN vmco en partmulas (el sitio Psi). Si las secuencias necesarias para la encapsidacion (o empaquetamiento del ARN retrovmco en un virion infeccioso) se pierden del genoma vmco, el resultado es un defecto cis que evita la encapsidacion del ARN genomico vmco) Este tipo de vector modificado es el que se ha utilizado normalmente en los sistemas de suministro genetico anteriores (es decir, sistemas que caredan de elementos que son necesarios para la encapsidacion del virion).
La divulgacion proporciona un retrovirus recombinante capaz de infectar una celula que no esta en division, una celula en division, o una celula que tiene un trastorno proliferativo. El retrovirus recombinante competente en replicacion de la divulgacion comprende una secuencia de polinucleotido que codifica un GAG vmco, un POL vmco, un ENV vmco, un polinucleotido heterologo precedido por un sitio interno de entrada en el ribosoma (IRES) encapsulados en el virion.
La frase celula “que no esta en division” se refiere a una celula que no esta en mitosis. Las celulas que no estan en division se pueden bloquear en cualquier punto del ciclo celular, (por ejemplo, G0/G1, Gi /s, G2/m), a condicion de que la celula no se este dividiendo activamente. Para la infeccion ex vivo, se puede tratar una celula en division para bloquear la division celular por tecnicas convencionales utilizadas por los expertos en la tecnica, incluyendo, radiacion, tratamiento con afidocolina, privacion de suero e inhibicion de contacto. Sin embargo, se debena entender que la infeccion ex vivo a menudo se lleva a cabo sin bloquear las celulas ya que muchas celulas ya estan detenidas (por ejemplo, las celulas madre). Por ejemplo, un vector lentivmco recombinante es capaz de infectar cualquier celula que no este en division, independientemente del mecanismo utilizado para bloquear la division o el punto del ciclo celular en el que la celula se bloquee. Ejemplos de celulas que no se estan dividiendo preexistentes en el cuerpo incluye las celulas neuronales, musculares, dgado, piel, corazon, pulmon y medula osea, y sus derivados. Para celulas en division se pueden utilizar vectores oncorretrovmcos.
Por celula “en division” se quiere decir una celula sometida a mitosis activa, o meiosis. Dichas celulas en division incluyen las celulas madre, celulas cutaneas (por ejemplo, fibroblastos y queratinocitos), gametos, y otras celulas en division conocidas en la tecnica. De particular interes y englobadas en la expresion celula en division son las celulas que tienen trastornos proliferativos, tales como las celulas neoplasicas. La expresion, “trastorno proliferativo celular” se refiere a una afeccion caracterizada por un numero anormal de celulas. La afeccion puede incluir el crecimiento celular hipertrofico (la multiplicacion continua de celulas que resulta en un sobrecrecimiento de una poblacion celular en un tejido) e hipotrofico (una falta o deficiencia de celulas en un tejido) o un flujo o migracion excesiva de celulas en un area de un cuerpo. Las poblaciones celulares no necesariamente son de celulas transformadas, tumorigenicas o malignas, sino que pueden incluir tambien celulas normales. Los trastornos proliferativos celulares incluyen trastornos asociados con un sobrecrecimiento de tejidos conjuntivos tales como distintas afecciones fibroticas, incluyendo escleroderma, artritis y cirrosis hepatica. Los trastornos proliferativos celulares incluyen los trastornos neoplasicos tales como carcinomas de cabeza y cuello. Los carcinomas de cabeza y cuello incluinan, por ejemplo, carcinoma de la boca, esofago, garganta, laringe, glandula tiroides, lengua, labios, glandulas salivares, nariz, senos paranasales, nasofaringe, puente nasal superior y tumores sinusales, estesioneuroblastoma, cancer de celulas escamosas, melanoma maligno, carcinoma seno nasal no diferenciado (SNUC), cerebro (incluyendo glioblastomas) o neoplasias sangumeas. tambien se incluyen carcinomas de los ganglios linfaticos regionales incluyendo los ganglios linfaticos cervicales, ganglios linfaticos prelarmgeos, ganglios linfaticos pulmonares yuxtaesofagicos y ganglios linfaticos submandibulares (Harrison's Principles of Internal Medicine (eds., Isselbacher, et al., McGraw-Hill, Inc., 13a Edicion, ppl850-1853, 1994). Otros tipos de canceres incluyen, pero no se limitan a, cancer de pulmon, cancer de colon-recto, cancer de mama, cancer de prostata, cancer del tracto urinario, cancer uterino, linfoma, cancer oral, cancer pancreatico, leucemia, melanoma, cancer de estomago, cancer de piel y cancer ovarico. La enfermedad proliferativa celular tambien incluye la artritis reumatoide (O'Dell NEJM 350:2591 2004) y otros trastornos autoinmunitarios (Mackay et al NEJM 345:3402001) que se caracterizan a menudo por la proliferacion inapropiada de celulas del sistema inmunitario.
La secuencia de acido nucleico heterologa esta unida operativamente a un IRES. Como se utiliza en el presente documento, la expresion secuencia de acido nucleico “heterologa” o transgen se refiere (i) a una secuencia que no existe normalmente en un retrovirus de tipo silvestre, (ii) una secuencia que se origina de una especie ajena, o (iii) si es de la misma especie, puede estar modificado sustancialmente de su forma original. De manera alternativa, una secuencia de acido nucleico sin cambiar que no se expresa normalmente en una celula es una secuencia de acido nucleico heterologa.
Dependiendo del uso que se pretenda del vector retrovmco de la divulgacion cualquier numero de secuencias de acido nucleico o polinucleotido heterologa se puede insertar en el vector retrovmco. Por ejemplo, para los estudios in vitro se utilizan marcadores geneticos o se pueden utilizar genes indicadores, incluyendo, moleculas de resistencia a antibioticos y fluorescentes (por ejemplo, GFP). Las secuencias de polinucleotido adicionales que codifican cualquier secuencia de polipeptido deseada tambien se puede insertar en el vector de la divulgacion. Cuando se desea el suministro in vivo de una secuencia de acido nucleico heterologa se pueden utilizar secuencias terapeuticas como no terapeuticas. Por ejemplo, la secuencia heterologa puede codificar una molecula terapeutica incluyendo moleculas antisentido (miARN, ARNip) o ribozimas dirigidas a un gen particular asociado con un trastorno proliferativo celular u otra enfermedad o trastorno asociado a un gen, la secuencia heterologa puede ser un gen suicida (por ejemplo, HSV-tk o PNP o citosina desaminasa; sea modificada o no modificada) un factor de crecimiento o una protema terapeutica (por ejemplo, el Factor IX, IL-2, y similares). Otras protemas aplicables a la divulgacion se identifican facilmente en la tecnica.
En un aspecto de la divulgacion, el polinucleotido heterologo en el vector comprende una citosina desaminasa que se ha optimizado para la expresion en una celula human. En un aspecto adicional de la divulgacion, la citosina desaminasa comprende una secuencia que tiene el codon optimizado para seres humanos y termoestabilidad aumentada) en comparacion con una citosina desaminasa de tipo silvestre. En otro aspecto mas de la divulgacion, el polinucleotido heterologo codifica una construccion de fusion que comprende una citosina desaminasa (sea con el codon humano optimizado o no optimizado, sea mutada o no mutada) unida operativamente a un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad UPRT u OPRT. En otro aspecto de la divulgacion, el polinucleotido heterologo comprende un polinucleotido de CD de la divulgacion (por ejemplo, las SEQ ID NO:3, 5, 11, 13, 15, o 17).
Un vector retrovmco competente en replicacion puede comprender un polinucleotido heterologo que codifica un polipeptido que comprende una citosina desaminasa (como se describe en el presente documento) y puede comprender adicionalmente un polinucleotido que comprende una molecula de miARN o ARNip sea como parte de la transcripcion primera del promotor vmco o unida a un promotor, que puede ser espedfica del tejido o tipo celular.
Los microARN (miARN) son ARN pequenos, no codificantes. Se localizan en intrones de genes codificantes o no codificantes, exones de genes no codificantes o regiones intergenicas. Los genes de miARN se transcriben por la ARN polimerasa II que genera polinucleotidos precursores llamados precursores primarios de miARN (pri-miARN). El pri-miARN del nucleo se procesa por la ribonucleasa Drosha para producir el precursor de miARN (pre-miARN) que forma una estructura corta ahorquillada. Posteriormente, el pre-miARN se transporta al citoplasma mediante la Exportina 5 y se procesa adicionalmente por otra ribonucleasa llamada Dicer para generar un miARN maduro, activo.
Un miARN maduro tiene aproximadamente 21 nucleotido de longitud. Ejerce una funcion uniendose a la region 3' no traducida del ARNm de genes diana y suprimiendo la expresion proteica sea por represion o por traduccion proteica o degradacion de ARNm. El miARN esta implicado en procesos biologicos que incluyen el desarrollo, proliferacion celular, diferenciacion y progresion del cancer. Los estudios del perfil de miARN indican que algunas expresiones de miARN son espedficos del tejido o estan enriquecidos en ciertos tejidos. Por ejemplo, se ha demostrado que las expresiones de miR-142-3p, miR-181 y miR-223 estan enriquecidos en tejidos hematopoyeticos en seres humanos y ratones (Baskerville et al., 2005 RNA 11,241-247; Chen et al., 2004 Science 303, 83-86).
Se ha observado que algunos miARN estan regulados positivamente (miARN oncogenicos) o regulados negativamente (represores) en varios tumores (Spizzo et al., 2009 Cell 137, 586e1). Por ejemplo, el miR-21 esta sobre expresado en el glioblastoma, cancer de pulmon, prostata, colon, estomago, esofago, y de cuello uterino, leiomiosarcoma uterino, CLBCL, cancer de cabeza y cuello. Por el contrario, se ha expuesto que los miembros de let-7 esta regulado negativamente en el glioblastoma, canceres de pulmon, mama, gastrico, de ovario, prostata y colon. El restablecimiento de la homeostasis de la expresion de miARN en el cancer es un mecanismo imperativo para inhibir o invertir la progresion del cancer.
Una consecuencia de las funciones vitales moduladas por los miARN en los canceres, se enfocan en el desarrollo potencial de estrategias terapeuticas se han dirigido hacia la inhibicion mediada por antisentido (antigomeros) de los miARN oncogenicos. Sin embargo, la sustitucion de miARN puede representar una estrategia igualmente eficaz. En esta estrategia, los miARN mas utiles terapeuticamente son los que se expresan con bajos niveles en tumores, pero con un alto nivel, y portanto tolerado, en tejidos normales.
Los miARN que estan regulados negativamente en los canceres podnan ser utiles como agentes anticancer. Los ejemplos incluyen miR-128-1, let-7, miR-26, miR-124, y miR-137 (Esquela-Kerscher et al., 2008 Cell Cycle 7, 759­ 764; Kumar et al., 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105, 3903-3908; Kota et al., 2009 Cell 137, 1005-1017; Silber et al., 2008 BMC Medicine 6:14 1-17). Se ha informado de que la expresion de miR-128 esta enriquecida en el sistema nervioso central y se ha observado que esta regulada negativamente en gliomas (Sempere et al., 2004 Genome Biology 5: R13.5-11; Godlewski et al., 2008 Cancer Res 68: (22) 9125-9130). El miR-128 se codifica mediante dos genes distintos, el miR-128-1 y el miR-128-2. Ambos se procesan en la una secuencia madura identica. Se ha informado de que Bmi-1 y E2F3a son las dianas directas del miR-128 (Godlewski et al., 2008 Cancer Res 68: (22) 9125-9130; Zhang et al., 2009 J. Mol Med 87:43-51). Ademas, se ha observado que la expresion de Bmi-1 esta regulada positivamente en una variedad de canceres humanos, incluyendo gliomas, linfomas de celulas en mantel, cancer de pulmon de celulas no pequenas, linfoma no Hodgkin de celulas B, cancer de mama, colorrectal y de prostata. Ademas, se ha demostrado que el Bmi-1 es necesario para la autorrenovacion de celulas madre en diversos tejidos, incluyendo las celulas madre neuronales, asf como la poblacion de celulas “tipo-madre” en los gliomas.
Aunque ha habido varias demostraciones in vitro de las posibilidades de la inhibicion mediada por miARN de la funcion celular, ha sido diffcil suministrar estos como oligonucleotidos o en vectores vmcos tan eficazmente como era necesario para tener efectos in vivo (por ejemplo, Li et al. Cell Cycle 5:2103-21092006), como pasaba con otras moleculas. Los vectores no replicantes no parecen ser lo suficientemente eficaces en cualquier caso para conseguir el suministro de un gen terapeutico en una parte significativa de los tumores. Sin embargo, tampoco es simple saber como utilizar vectores replicantes para suministrar agentes del tipo miARN. En particular, no esta claro como incorporar secuencias ARN extra en el ARN del genoma de retrovirus competentes en replicacion y mantener la eficacia de replicacion y guardar establemente la adicion incorporada en el genoma.
Los vectores retrovrncos y lentivmcos deficientes en replicacion se han utilizado para expresar establemente primiARN mediante un promotor de polimerasa II tal como CMV o LTR y se demostro la produccion de miARN maduro. Sin embargo, estos vectores no tienen que ir a traves del ciclo de vida completo del retrovirus o lentivirus muchas veces, como se necesita en los vectores replicantes. El genoma tiene que ser capaz de acomodar muchos mas eventos que la simple entrada, integracion y transcripcion. Los problemas asociados con el uso de un virus basado en ARN para expresar miARN incluyen; (1) la integridad del ARN del genoma vmco en una etapa despues de la transcripcion durante el procesamiento del ARN; (2) la estabilidad del casete insertado durante la replicacion; y (39 el procesamiento adecuado del pri-miARN como parte del ARN vmco transcrito desde el promotor de LTR que produce el miARN maduro.
Por lo tanto, la incorporacion de promotores de ARN polimerasa tipo III tal como el promotor U6 y el H1 en los vectores retrovrncos y lentivmcos no replicantes se ha utilizado ampliamente para expresar ARN de interferencia pequenos (ARNip) funcionales que producen un ARN estructurado en una horquilla corta (Bromberg-White et al., 2004 J Virol 78:9, 4914-4916; Sliva et al., 2006 Virology 351, 218-225; Haga et al., 2006, Transplant Proc 38(10):3184-8). La secuencia del bucle es escindida por Dicer produciendo los ARNip maduros que tiene 21-22 nucleotidos de longitud. El ARNhp puede expresarse establemente en las celulas para regular negativamente la expresion del gene diana. Sin embargo, en la incorporacion de dichos casetes en un vector retrovmco recombinante competente en replicacion, la expresion y el procesamiento con Dicer para producir miARN maduro sigue siendo problematico. En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un vector retrovmco recombinante competente en replicacion que contiene una secuencia de polinucleotido heterologa de un precursor primario de miARN.
En un aspecto adicional de la divulgacion en precursor primario de miARN es de origen humano. En otro aspecto de la divulgacion el precursor primario de miARN esta corriente abajo del gen env.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un vector retrovmco recombinante competente en replicacion que contiene una secuencia de polinucleotido heterologa del precursor primario humano miR-128-2 (SEQ ID NO: 32) corriente abajo del gen env. Se pueden incorporar miARN que estan regulados negativamente en canceres en el vector para el suministro genetico terapeutico. Por ejemplo, let-7, miR-26, miR-124, y miR-137 (Esquela-Kerscher et al., 2008 Cell Cycle 7, 759-764; Kumar et al., 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105, 3903-3908; Kota et al., 2009 Cell 137, 1005-1017; Silber et al., 2008 BMC Medicine 6:141-17).
En otro aspecto mas, la presente divulgacion proporciona un vector retrovmco recombinante competente en replicacion que contiene una secuencia de polinucleotido heterologa del pre-miR-128 humano estructurado en horquilla corta unido a un promotor H1 humano (SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34) corriente abajo del gen env. Se pueden incorporar miARN que estan regulados negativamente en los canceres en el vector para el suministro genetico terapeutico. Por ejemplo, let-7, miR-26, miR-124, y miR-137 (Esquela-Kerscher et al., 2008 Cell Cycle 7, 759-764; Kumar et al., 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105, 3903-3908; Kota et al., 2009 Cell 137, 1005-1017; Silber et al., 2008 BMC Medicine 6:141-17).
Los acidos nucleicos antisentido son moleculas de ADN o ARN que son complementarios de al menos un parte de una molecula de ARNm espedfica (Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990). En la celula, los acidos nucleicos antisentido se hibridan con el ARNm correspondiente, formando una molecula de doble cadena. Los acidos nucleicos antisentido interfieren en la traduccion del ARNm, ya que la celula no traducira un ARNm que sea de cadena doble. Los oligomeros antisentido de aproximadamente 15 nucleotidos son los preferidos, ya que se sintetizan facilmente y es menos probable que causen problemas que las moleculas mas grandes cuando se introducen en la celula diana. El uso de los metodos antisentido para inhibir la traduccion in vitro de genes es bien conocido en latecnica (Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988).
El acido nucleico antisentido puede utilizarse para bloquear la expresion de una protema mutante o un producto genetico dominantemente activo, tal como una protema precursora de amiloide que se acumula en la enfermedad de Alzheimer. Dichos metodos son utiles tambien para el tratamiento de la enfermedad de Huntington, Parkinson hereditario, y otras enfermedades. Es de particular interes el bloqueo de genes asociados con trastornos proliferativos celulares. Los acidos nucleicos antisentido tambien son utiles para la inhibicion de protemas asociadas con toxicidad.
El uso de un oligonucleotido para parar la transcripcion se conoce como la estrategia triple ya que el oligomero se enrolla alrededor de la doble helice de ADN, formando una helice de tres cadenas. Por lo tanto, estos compuestos triples se pueden disenar para que reconozcan un unico sitio en un gen escogido (Maher, et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991).
Las ribozimas son moleculas de ARN que poseen la capacidad de escindir espedficamente otro ARN de cadena sencilla de manera analoga a las ADN endonucleasas de restriccion. Mediante la modificacion de secuencias de nucleotido que codifican estos ARN, es posible modificar moleculas que reconocen secuencias de nucleotido espedficas en una molecula de ARN y escindirla (Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1988). Una ventaja principal de esta estrategia es que, debido a que son espedficas de la secuencia, solamente se activan ARNm con secuencias particulares.
Como se utiliza en el presente documento, la expresion “ARN de interferencia” (ARNi) se refiere al proceso de silenciamiento genetico postranscripcional espedfico de secuencia mediado por acidos nucleicos de interferencia cortos (ARNip o microARN (miARN)). La expresion “agente capaz de mediar la interferencia de ARN” se refiere a ARNip, asf como a vectores ADN y ARN que codifican los ARNip cuando se transcriben en una celula. El termino ARNip o miARN significa que engloba cualquiera molecula de acido nucleico que es capaz de mediar la interferencia de ARN espedfica de secuencia, por ejemplo, un ARN de interferencia corto (ARNip), ARN de doble cadena (dsARN), micro-ARN (miARN), ARN horquillado corto (ARNhp), oligonucleotido de interferencia corto, acido nucleico de interferencia corto, oligonucleotido modificado de interferencia corto, ARNip modificado qmmicamente, ARN de silenciamiento genetico postranscripcional (ptgsARN), y otros.
El intervalo adecuado de diseno la longitud del tallo de un duplex horquillado incluye longitudes de tallo de 20-30 nucleotidos, 30-50 nucleotidos, 50-100 nucleotidos, 100-150 nucleotidos, 150-200 nucleotidos, 200-300 nucleotidos, 300-400 nucleotidos, 400-500 nucleotidos, 500-600 nucleotidos, y 600-700 nucleotidos. El intervalo adecuado para el diseno de longitudes de bucle de un duplex horquillado incluye longitudes de 4-25 nucleotidos, 20-50 nucleotidos, o mas largos si la longitud del tallo del duplex horquillado es sustancial. En ciertos contextos, las estructuras horquilladlas con regiones duplicadas son mas largas de 21 nucleotidos pueden promover un silenciamiento dirigido por ARNip eficaz, independientemente de la secuencia y longitud del bucle.
Los vectores retrovmcos replicantes de la divulgacion se puede utilizar para tratar una enfermedad expresando un ARNip o miARN modificados (Dennis, Nature, 418: 1222002) que apaga o disminuye la expresion de genes clave que gobiernan la proliferacion o supervivencia de celulas enfermas incluyendo las celulas tumorales. Dichas dianas incluyen genes como Rad 51 una enzima central en la reparacion del ADN, y sin la cual el crecimiento celular se restringe drasticamente. Otras dianas incluyen muchas de las moleculas de la ruta de senalizacion que controla el crecimiento celular (Marquez & McCaffrey Hum Gene Ther. 19:272008). El ARNip o miARN pueden combinarse con la expresion de un gen citotoxico del mismo o diferente vector retrovmco de la divulgacion. Un ejemplo de un gen citotoxico adecuado comprende una citosina desaminasa o una citosina desaminasa modificada de la divulgacion.
En el uso, los vectores retrovmcos se replican a lo largo del tumor u otro tejido diana y antes de que se produzca la inhibicion del crecimiento el virus primero se integra en el genoma huesped y continua produciendo virus despues de que el crecimiento de esa celula se inhiba. Los metodos para la seleccion de secuencias de miARN o ARNip se conocen en la tecnica. La caractenstica clave en general del diseno eficaz de secuencias de ARNip o miARN habitualmente es evitar los efectos “fuera de la diana”. Sin embargo, el uso de vectores replicantes que sean altamente espedficos de celulas tumorales tales como los de la divulgacion, estos efectos secundarios no son muy importantes, ya que se espera que las celulas eventualmente mueren. Un vector retrovmco de esta divulgacion se puede producir utilizando celulas de otras especies para las que la protema correspondiente no se direcciona significativamente. Dichas celulas incluyen las lmeas celulares de perro o lmeas celulares de pollo. De manera alternativa el virus se produce por transfeccion transitoria en celulas derivadas de 293 humanas u otra lmea celular que permita una transfeccion transitoria eficaz. Para este uso, el virus no necesita utilizar un IRES, y la secuencia de ARNip o miARN puede insertarse simplemente en un sitio conveniente del genoma vmco. Este sitio incluye la region corriente abajo de la envoltura y corriente arriba de la LTR 3' del retrovirus replicante. De manera alternativa se pueden insertar unidades de transcripcion pollll en el genoma vmco con el ARNip o miARN apropiado, normalmente corriente abajo del gen de envoltura 3'. Se pueden insertar varias secuencias diferentes de ARNip o miARN para asegurar la regulacion negativa eficaz del gen diana o la regulacion negativa de mas de un gen. Las secuencias y dianas adecuadas se pueden obtener de fuentes conocidas por los expertos en la tecnica. Por ejemplo:
• La base de datos MIT/ICBP siRNA http:(//)web.mit.edu/sirna/ - La base de datos de ARNip del MIT [Instituto de Tecnologfa de Massachusetts]/ICBP [Programa de Biologfa del Cancer integrativo] es un esfuerzo universitario amplio para catalogar estos reactivos validados experimentalmente y hacer que esa informacion este disponible para otros investigadores, tanto dentro como fuera de la comunidad del MIT. (Instituto de Tecnologfa de Massachusetts).
• RNAi Central - http:(//)katahdin.cshl.org:9331/RNAi_web/ scripts/main2.pl, Recursos de ARNi, que incluyen herramientas de diseno de ARNip y ARNhp (Hannon Lab, Cold Spring Harbor Laboratory)
• The RNAi Web - http:(//)www.rnaiweb.com/ Recurso general.
• siDIRECT - http:(//)genomics.jp/sidirect/ Programa de diseno de ARNip espedfico de diana en lmea para ARN de interferencia de mairnferos (Universidad de Tokyo, Japon).
• siRNA Database - Una base de datos de ARNip exhaustiva que contiene dianas del ARNip contra todas las secuencias de ARNm a lo largo de una variedad de organismos. Parte del sitio de internet Protein Lounge systems biology).
• Base de datos de ARNip y Recursos para estudios del ARN de interferencia (//)www.rnainterference.org/
• siRNA Selector - http:(//)www.bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm. Un conjunto de reglas utilizado para evaluar la funcionalidad del ARNip basandose en parametros termodinamicos (Khvorova et al., 2003, Schwarz et al., 2003) y los determinates relacionados con la secuencia desarrollados por Dharmacon (Reynolds et al., 2004). La especificidad se determina utilizando BLAST contra las bases de datos UniGene (Wistar Institute) • siRNA Target Finder http:(//)www(.)ambion.com/techlib/misc/ siRNA_finder.html (Ambion).
Los retrovirus replicantes de la divulgacion tambien pueden expresar dianas para ARNip de origen natural que tienen la expresion restringida a tipos celulares particulares de manera que la replicacion del vector esta significativamente inhibida en esos tipos celulares. La generacion de un vector retrovmco recombinante competente en replicacion basado en el virus de leucemia murina permite un alto nivel de transduccion y por tanto una alta eficacia de suministro genetico in vivo. Un problema principal del uso de un vector retrovmco competente en replicacion ha sido la diseminacion incontrolada del virus como se ha informado previamente (Donahue et al., J. Exp Med. 1992, 176:1124-1135; Calmes et al., Blood 2005, 106: 2530-2533; Seggewiss et al., Blood 2006, 107: 3865-3867). Debido a la naturaleza del virus, la diseminacion vmca se puede conseguir inicialmente en las celulas linfaticas y posteriormente se disemina a los tejidos perifericos. Con fines antitumorales algunas lelas del cuerpo que se replican naturalmente en cierto nivel son las celulas hematopoyeticas, las celulas de la lamina intestinal, y algunas celulas endoteliales. Estos son entonces sitios donde el virus que esta en circulacion podna infectar productivamente. En general esto sena no deseable. Cualquier infeccion remota de celulas tales como estas se pueden inhibir incluyendo una diana para los miARN de origen natural o por una combinacion de miARN en estos tipos celulares. Ya se ha demostrado alguna fiabilidad del uso de miARN dianas (Brown et al. Nat Biotechnol. 200725:1457-67). Estas dianas son secuencias de ARN pequeno con un coincidente homologo de las secuencias de miARN de origen natural. Estas secuencias se pueden insertar en cualquiera sitio conveniente en los vectores de la presente invencion sin que tenga, en general, una consecuencia perjudicial significativa para la viabilidad del vector, en una celula distinta de la del tipo deseado. Los vectores se pueden producir y utilizar como se describe en el presente documento.
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un vector retrovmco recombinante competente en replicacion que contiene una unica copia de la secuencia diana miR-142-3p (142-3pT, SEQ ID NO: 35) corriente abajo del transgen, tal como yCD2 o GFP, unida al IRES. Ademas de miR181 y miR-223, se puede incorporar la secuencia diana de otro tejido o celula enriquecidos en miARN en el vector para restringir la diseminacion vmca de manera espedfica al tejido o tipo celular. Por ejemplo, las expresiones de miR-133 y miR-206 estan altamente enriquecidas en las celulas musculares (Kelly et al., 2008 Nature Medicine 14:11 1278-1283).
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un vector retrovmco recombinante competente en replicacion que contiene 4 copias del 142-3pT (SEQ ID NO: 36) corriente abajo del transgen, tal como yCD2 o GFP, unida al IRES. Ademas de miR181 y miR-223, se puede incorporar la secuencia diana de otro tejido o celula enriquecidos en miARN en el vector para restringir la diseminacion vmca de manera espedfica al tejido o tipo celular. Por ejemplo, las expresiones de miR-133 y miR-206 estan altamente enriquecidas en las celulas musculares. La presente divulgacion proporciona la flexibilidad de una unica, multiples o una combinacion de secuencias de miARN diana y de esta manera proporciona una restriccion de la diseminacion vmca incontrolada de una manera espedfica del tejido y/o la celula in vitro e in vivo (por ejemplo, en las celulas hematopoyeticas y/o musculares) (Kelly et al., 2008 Nature Medicine 14:11 1278-1283).
El miARN diana se puede insertar a 3' del transgen pero antes de la LTR 3' o corriente arriba del IRES pero despues del extremo 3' de la envoltura. En general, la diana no se insertara en las secuencias codificantes de protema.
En mas aspectos adicionales de la divulgacion, el polinucleotido heterologo puede comprender una citocina tal como una interleucina, un interferon gamma o similares. Las citocinas que se pueden expresar de un vector retrovmco de la divulgacion incluyen, pero no se limitan a, IL-1 alfa, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, y IL-21, anti-CD40, CD40L, IFN-gamma y TNF-alfa, formas solubles del TNF-alfa, linfotoxina-alfa (LT-alfa, tambien conocida como TNF-beta), LT-beta ( que se encuentra formando un complejo heterotnmero LT-alfa2-beta), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-gamma (Publicacion Internacional N.° WO 96/14328), AIM-I (Publicacion Internacional N.° WO 97/33899), endocina-alfa (Publicacion Internacional N.° WO 98/07880), OPG, y neutrocina-alfa (Publicacion Internacional N.° WO 98/18921, OX40, y factor de crecimiento de nervios (NGF), y formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD40 y 4-IBB, TR2 (Publicacion Internacional N.° WO 96/34095), DR3 (Publicacion Internacional N.° WO 97/33904), Dr4 (Publicacion Internacional N.° WO 98/32856), TR5 (Publicacion Internacional N.° WO 98/30693), TRANK, TR9 (Publicacion Internacional N.° WO 98/56892),TR10 (Publicacion Internacional N.° WO 98/54202), 312C2 (Publicacion Internacional N.° WO 98/06842), y Tr 12, y formas solubles de CD154, CD70, y CD153. Las protemas angiogenicas pueden ser utiles en algunos aspectos de la divulgacion, particularmente para la produccion de protema a partir de lmeas celulares. Dichos factores angiogenicos incluyen, pero no se limitan a, Factor de crecimiento derivado de glioma (GDGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas A (PDGF-A), actor de crecimiento derivado de plaquetas B (PDGF-B), factor de crecimiento placentario (PlGF), Factor de crecimiento placentario 2 (PlGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), Factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGF-2), Factor de crecimiento endotelial vascular B (VEGF-B), Factor de crecimiento endotelial vascular B-186 (VEGF-B186), Factor de crecimiento endotelial vascular -D (VEGF-D), Factor de crecimiento endotelial vascular -D (VEGF-D), y Factor de crecimiento endotelial vascular -E (VEGF-E). Tambien se pueden suministrar factores de crecimiento de fibroblastos mediante un vector de la divulgacion e incluyen, por no se limitan a, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, Fg F-12, FGF-13, FGF-14, y FGF-15. Se pueden suministrar factores de crecimiento hematopoyetico utilizando vectores de la divulgacion, dichos factores de crecimiento incluyen, pero no se limitan a factor estimulante de colonias de granulocitos macrofagos (GM-CSF) (sargramostim), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) (filgrastim), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF, CSF-1), eritropoyetina (epoetina alfa), factor de celulas madre (SCF, ligando c-kit, factor acero), factor estimulante de colonias de megacariocitos, protemas de fusion PIXY321 (a GMCSF/IL-3) y similares.
En general, el virus recombinante de la divulgacion es capaz de transferir una secuencia de acido nucleico en una celula diana.
La expresion “secuencia de acido nucleico reguladora” se refiere colectivamente a secuencias promotoras, senales de poliadenilacion, secuencias de terminacion de la transcripcion, dominios reguladores corriente arriba, ongenes de replicacion, amplificadores y similares, que colectivamente proporciona la replicacion, transcripcion y traduccion de una secuencia codificante en una celula receptora. No todas estas secuencias de control tienen que estar siempre presentes a condicion de que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una celula huesped adecuada. Un experto en la tecnica puede identificar facilmente la secuencia de acido nucleico reguladora a partir de bases de datos publicas y materiales. Ademas, un experto en la tecnica puede identificar una secuencia reguladora que es aplicable para el uso que se pretende, por ejemplo, in vivo, ex vivo, o in vitro.
Un sitio interno de entrada en el ribosoma (“IRES”) se refiere a un segmento de acido nucleico que promueve la entrada o retencion de un ribosoma durante la traduccion de una secuencia codificante habitualmente a 3' del IRES. En algunos aspectos de la divulgacion el IRES puede comprender un sitio receptor/donante de corte y empalme, sin embargo, los IRES preferidos carecen de un sitio receptor/donante de corte y empalme. Normalmente, la entrada de los ribosomas en el ARN mensajero tiene lugar mediante la proteccion localizada en el extremo 5' de todos los ARNm de eucariotas. Sin embargo, existen excepciones a esta regla universal. La ausencia de una proteccion en algunos ARNm vmcos sugiere la existencia de estructuras alternativas que permiten la entrada en los ribosomas en un sitio interno de estos ARN. Hasta la fecha, se han identificado varias de estas estructuras, denominadas IRES teniendo en cuenta su funcion, en la region 5' no codificante de ARNm vmcos no protegidos, tal como los de, en particular, picornavirus tales como el virus de la poliomielitis (Pelletier et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 1103-1112) y el virus EMCV (virus de la encefalomiocarditis (Jang et al., J. Virol., 1988, 62, 2636-2643). La divulgacion proporciona el uso de un IRES en el contexto de un vector retrovmco competente en replicacion.
La expresion “region promotora” se utiliza en el presente documento en su sentido ordinario para referirse a una region de nucleotidos que comprende una secuencia de ADN reguladora, donde la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripcion de una secuencia codificante corriente abajo (en direccion 3'). La secuencia reguladora puede ser homologa o heterologa respecto a la secuencia genetica deseada. Por ejemplo, se pueden utilizar un amplio intervalo de promotores, incluyendo promotores vmcos o de mairnfero, como se ha descrito anteriormente.
La secuencia de acido nucleico heterologa esta normalmente ajo el control del promotor de LTR-amplificador de senales o un promotor interno, y las senales retenidas en la LTR retrovmca puede seguir haciendo eficaz la integracion del vector en el genoma de la celula huesped. En consecuencia, los vectores retrovmcos recombinantes de la divulgacion, se pueden insertar las secuencias deseadas, los genes y/o fragmentos geneticos en varios sitios y bajo diferentes secuencias reguladoras. Por ejemplo, un sitio de insercion puede ser el sitio proximal de amplificador/promotor vmco (es decir, el locus genetico dirigido por LTR 5'). De manera alternativa, se pueden insertar las secuencias deseadas en un sitio distal de la secuencia reguladora (por ejemplo, la secuencia IRES a 3' del gen env) o cuando estan presentes dos o mas secuencias heterologas, una secuencia heterologa puede estar bajo el control de una primera region reguladora y una segunda secuencia heterologa bajo el control de una segunda region reguladora. Otros sitios distales incluyen secuencias promotoras vmcas, donde la expresion de la secuencia o secuencias deseadas es mediante corte y empalme del cistron proximal del promotor, se puede utilizar un promotor heterologo interno como SV40 o CMV, o un sitio interno de entrada en el ribosoma (IRES).
En un aspecto, el genoma retrovmco de la divulgacion contiene un IRES que comprende un sitio de clonacion corriente abajo del IRES por insercion de un polinucleotido heterologo/deseado. En un aspecto de la divulgacion, el IRES se localiza a 3' del gen env en el vector retrovmco, pero a 5' del polinucleotido heterologo deseado. En consecuencia, se puede unir operativamente un polinucleotido heterologo que codifica un polipeptido deseado al IRES.
En otro aspecto de la divulgacion, una secuencia de polinucleotido dirigido se incluye como parte del vector retrovmco recombinante de la divulgacion. La secuencia de polinucleotido dirigido es un ligando dirigido (por ejemplo, hormonas peptidicas tales como heregulina, anticuerpos de cadena sencilla, un receptor o un ligando de un receptor), y elemento regulador espedfico de tejido o espedfico de un tipo celular (por ejemplo, un promotor o amplificador espedfico de tejido o espedfico de un tipo celular), o una combinacion de un ligando dirigido y un elemento regulador espedfico de tejido/espedfico de un tipo celular. Preferentemente, el ligando dirigido esta unido operativamente a la protema env del retrovirus, creando una protema env retrovmca quimerica. Las protemas GAG vmca, POL vmca y ENV vmca se pueden derivar de cualquier retrovirus adecuado (por ejemplo, derivado de MLV o lentivirus). En otro aspecto de la divulgacion, protema ENV vmca no se deriva de un retrovirus (por ejemplo, de CMV o VSV).
En un aspecto, el retrovirus recombinante de la divulgacion se modifica geneticamente de manera que el virus se dirige a un tipo celular particular (por ejemplo, celulas de musculo liso, celulas hepaticas, celulas renales, fibroblastos, queratinocitos, celulas madre mesenquimaticas, celulas de medula osea, condrocitos, celulas epiteliales, celulas intestinales, celulas mamarias, celulas neoplasicas, celulas de glioma, celulas neuronales y otras conocidas en la tecnica) de manera que el genoma recombinante del vector retrovmco se suministra a una celula diana que no se divide, una celula diana en division, o una celula diana que tiene un trastorno proliferativo.
En un aspecto, el vector retrovmco se dirige a la celula uniendose a las celulas que tiene una molecula en la superficie externa de la celula. Este metodo de direccionamiento del retrovirus utiliza la expresion de un ligando de direccionamiento en el revestimiento del retrovirus para ayudar al direccionamiento del virus a las celulas o tejidos que tiene un receptor o molecula de union que interactua con el ligando de direccionamiento en la superficie del retrovirus. Despues de la infeccion de una celula por el virus, el virus inyecta su acido nucleico en la celula y el material genetico del retrovirus puede integrarse en el genoma de la celula huesped.
En otro aspecto, el direccionamiento utiliza elementos reguladores espedficos de la celula o especifico dl tejido para promover la expresion y trascripcion del genoma vmco en una celula dirigida que utiliza activamente los elementos reguladores, como se describe mas completamente posteriormente. El material genetico del retrovirus trasferido se transcribe entonces y se traduce en protemas en la celula huesped. El elemento regulador de direccionamiento esta unido normalmente a la LTR 5' y/o 3', creando una LTR quimerica.
Insertando un polinucleotido heterologo de interes en el vector vmco de la divulgacion, junto con otro gen que codifica, por ejemplo, el ligando de un receptor de una celula diana espedfica, el vector es ahora espedfico de la diana. Los vectores vmcos pueden hacerse espedficos de la diana adjuntando, por ejemplo, un azucar, un glicolfpido, o una protema. El direccionamiento se puede conseguir utilizando un anticuerpo que dirige el vector vmco. Los expertos en la tecnica conoceran, o facilmente pueden concebir, secuencias de polinucleotido espedficas que se puedan insertar en el genoma vmco o protemas que se pueden anadir a la envoltura vmca para permitir el suministro espedfico de la diana del vector vmco que contiene la secuencia de acido nucleico de interes.
Por lo tanto, la divulgacion incluye en un aspecto, una protema env quimerica que comprende una protema ENV retrovmca unida operativamente a un polipeptido de direccionamiento. El polipeptido de direccionamiento puede ser una molecula receptora espedfica de la celula, un ligando para un receptor espedfico de una celula, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra un epttopo antigenico espedfico de una celula o cualquier otro ligando facilmente identificado en la tecnica y que sea capaz de unirse o interactuar con una celula diana. Ejemplos de polipeptidos de direccionamiento o moleculas incluyen anticuerpos bivalentes que utilizando biotina-estreptavidina como o enlazadores (Etienne-Julan et al., J. Of General Virol., 73, 3251-3255 (1992); Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 9079-9083 (1989)), virus recombinantes que contengan en su envoltura una secuencia que codifica una region variable de un anticuerpo de cadena sencilla contra un hapteno (Russell et al., Nucleic Acids Research, 21, 1081­ 1085 (1993)), clonacion de ligandos de hormonas peptfdicas en la envoltura del retrovirus (Kasahara et al., Science, 266, 1373-1376 (1994)), construcciones quimericas EPO/env (Kasahara et al., 1994), un anticuerpo de cadena sencilla contra el receptor de la lipoprotema de baja densidad (LDL) en la envoltura de MLV ecotropico, que da como resultado la infeccion espedfica de celulas HeLa que expresan el receptor de LDL (Somia et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92, 7570-7574 (1995)), de manera similar se puede alterar el intervalo del huesped de ALV por la incorporacion de un ligando de integrina, haciendo que el virus sea capaz ahora de cruzarse entre especies para infectar espedficamente las celulas de glioblastoma de rata (Valsesia-Wittmann et al., J. Virol. 68, 4609-4619 (1994)), y Dornberg y colaboradores (Chu y Dornburg, J. Virol 69, 2659-2663 (1995)) han informado del direccionamiento espedfico del tejido del virus de necrosis esplenica (SNV), un retrovirus aviar, que utiliza envolturas que contienen anticuerpos de cadena sencilla dirigido contra marcadores tumorales.
La divulgacion proporciona un metodo de produccion de un retrovirus recombinante capaz de infectar una celula diana que comprende la transfeccion de una celula huesped adecuada con lo siguiente: un vector que comprende una secuencia de polinucleotido que codifica una gag vmca, una pol vmca y una env vmca, y un polinucleotido heterologo, unido operativamente unido a una secuencia de acido nucleico reguladora , y la recuperacion del virus recombinante.
El retrovirus y metodos de la divulgacion proporcionan un retrovirus competente en replicacion que no necesita un virus auxiliar o una secuencia de acido nucleico o protemas adicionales con el fin de propagarse y producir viriones. Por ejemplo, las secuencias de acido nucleico del retrovirus de la divulgacion codifican, por ejemplo, un grupo espedfico de antigeno y transcriptasa inversa, (e integrasa y enzimas proteasas necesarias para la maduracion y la trascripcion inversa), respectivamente, como se ha expuesto anteriormente. La gag y pol vmcas se pueden derivar de un lentivirus, tal como el VIH o un oncovirus o un retrovirus gamma tal como MoMLV. Ademas, el genoma de acido nucleico del retrovirus de la divulgacion incluye una secuencia que codifica una protema de la envoltura vmca (ENV) El gen env se puede derivar de cualquier retrovirus. La env puede ser una protema de la envoltura anfotropica que permite la transduccion de celulas de ser humano y otras especies, o puede ser una protema de envoltura ecotropica que es capaz de transducir solamente celulas de raton y rata. Ademas, puede ser deseable dirigir el virus recombinante por union de la protema de la membrana con un anticuerpo o un ligando particular para dirigirse a un receptor de un tipo celular particular. Como se ha mencionado anteriormente, los vectores retrovmcos se pueden hacer para que sean espedficos de diana insertando, por ejemplo, un glicolfpido o una protema. El direccionamiento se consigue a menudo utilizando un anticuerpo para dirigir el vector retrovmco a un antfgeno sobre un tipo celular particular (por ejemplo, un tipo celular que se encuentra en ciertos tejidos o un tipo celular de cancer). Los expertos en la tecnica sabran, o pueden concebir facilmente sin excesiva experimentacion, metodos espedficos para conseguir el suministro de un vector retrovmco a una diana espedfica. En un aspecto de la divulgacion, el gen env se deriva de un no retrovirus (por ejemplo, CMV o VSV). Ejemplos de genes env derivados de retrovirus incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del gibon (GaLV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Tambien se pueden utilizar otros genes de env tales como el del virus de estomatitis vesicular (VSV9) (Protema G), envoltura de citomegalovirus (CMV), o hemaglutinina (HA) del virus de la gripe.
En un aspecto de la divulgacion, el genoma retrovmco se deriva de un oncorretrovirus, y mas particularmente un oncorretrovirus de mairnfero. Por “derivado” se quiere decir que la secuencia de polinucleotido parental es un oncovirus de tipo silvestre que se ha modificado mediante la insercion o retirada de secuencias de origen natural (por ejemplo, insercion de un IRES, insercion de un polinucleotido que codifica un polipeptido o acido nucleico de interes, el intercambio de un promotor mas eficaz de un retrovirus o virus diferente en lugar del promotor de tipo silvestre, y similares).
A diferencia de los retrovirus recombinantes producidos por metodos convencionales en la tecnica que son deficientes y necesitan asistencia con el fin de producir partmulas vmcas infecciosas, la divulgacion proporciona un retrovirus que es competente en replicacion.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona vectores retrovmcos que se direccionan utilizando secuencias reguladoras. Las secuencias reguladoras espedficas de la celula o el tejido (por ejemplo, promotores) se pueden utilizar para dirigir la expresion de secuencias geneticas en poblaciones celulares espedficas. Los promotores vmcos y de mamffero adecuados para la divulgacion se han descrito en otra parte del presente documento. En consecuencia, la divulgacion proporciona un retrovirus que tiene elementos promotores espedficos del tejido en el extremo 5' del genoma retrovmco. Normalmente, los elementos/secuencias espedficas del tejido estan en la region U3 de la LTR del genoma retrovmco, incluyendo, por ejemplo, promotores y amplificadores espedficos de la celula o el tejido para celulas neoplasicas (por ejemplo, amplificadores y promotores espedficos de las celulas tumorales), y promotores inducibles (por ejemplo, tetraciclina).
Las secuencias de control de la transcripcion de la divulgacion tambien pueden incluir las secuencias de control de la transcripcion de origen natural que se asocian naturalmente con un gen que codifica un superantfgeno, una citocina o una quimiocina.
En algunas circunstancias, puede ser deseable regular la expresion. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes promotores vmcos con fuerzas de actividad variables dependiendo del nivel de expresion deseado en celulas de marnffero, se utiliza a menudo el CMV temprano inmediato para proporcionar una fuerte activacion transcripcional. Tambien se han utilizado versiones modificadas del promotor de CMV que son menos potentes cuando se desean niveles de expresion reducidos del transgen. Cuando se desea la expresion de un transgen en celulas hematopoyeticas, se pueden utilizar promotores retrovmcos tales como las LTR de MLV y MMTV. Otros promotores vmcos que se pueden utilizar incluyen SV40, RSV LTR, HIV-1 y HIV-2 LTR, promotores de adenovirus tales como de las regiones E1A, E2A, o MLP, AAV LTR, virus del mosaico de la coliflor, hSV-TK, y virus del sarcoma aviar.
De manera similar, los promotores selectivos o espedficos de tejido se pueden utilizar para efectuar la transcripcion en tejidos o celulas espedficos de manera que se reduzca la toxicidad potencial o los efectos no deseables a los tejidos no dirigidos. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores tales como el PSA, probasina, fosfatasa acida prostatica o calicrema glandular espedfica de prostata (hK2) para dirigir la expresion genetica a la prostata. La protema accesoria Whey (WAP) se puede utilizar para la expresion en tejido mamario (Andres et al., PNAs 84:1299­ 1303, 1987). Otros dominios promotores/reguladores que se pueden utilizar se exponen en la Tabla 1.
“Elementos reguladores espedficos de tejido” son elementos reguladores (por ejemplo, promotores) que son capaces de dirigir la transcripcion de un gen en un tejido mientras que se mantiene sobre todo “silente” en otros tipos tisulares. Se entendera, sin embargo, que los promotores espedficos de tejido pueden tener una cantidad detectable de actividad de “fondo” o de “base” en los tejidos donde estan silentes. El grado en el que un promotor se activa selectivamente en un tejido diana se puede expresar como una relacion de selectividad (actividad en un tejido diana/actividad en un tejido de control). A este respecto, un promotor espedfico de tejido util en la practica de la divulgacion normalmente tiene una relacion de selectividad de mas de aproximadamente 5. Preferentemente, la relacion de selectividad es mayor de aproximadamente 15.
En ciertas indicaciones, puede ser deseable activar la transcripcion en momentos espedficos despues de la administracion del retrovirus recombinante competente en replicacion de la divulgacion (RRCR). Esto se puede hacer con promotores que son regulables por hormonas o citocinas. Por ejemplo, en aplicaciones terapeuticas en donde la indicacion es un tejido gonadal donde se producen o enrutan esteroides espedficos, el uso de promotores regulados por androgenos o estrogenos puede ser ventajoso. Dichos promotores que son regulables por hormonas incluyen MMTV, MT-1, ecdisona y RuBisco. Se pueden utilizar otros promotores regulados por hormonas tales como los que responden a hormas tiroideas, pituitarias y adrenales. Los promotores que responden a citocinas y protemas inflamatorias que se pueden utilizar incluyen quininogeno K y T (Kageyama et al., 1987), c-fos, TNF-alfa, protema C-reactiva (Arcone et al., 1988), haptoglobina (oliviero et al., 1987), seroamiloide A2, C/EBP alfa, IL-1, IL-6 (Poli y Cortese, 1989), Complemento C3 (Wilson et al., 1990), IL-8, alfa-1 glicoprotema acida (Prowse y Baumann, 1988), alfa-1 antitripsina, lipoprotema lipasa (Zechner et al., 1988), angiotensinogeno (Ron et al., 1990), fibrinogeno, c-jun (inducibles por esteres de forbol, TNF-alfa, radiacion UV, acido retinoico y peroxido de hidrogeno), colagenasa (inducida por esteres de forbol y acido retinoico), metalotionema (inducible por metales pesados y glucocorticoides), estromelisina (inducible por ester de forbol, interleucina-1 y EGF), alfa-2 macroglobulina y alfa-1 antiquimiotripsina. Promotores espedficos de tumor tales como osteocalcina, elemento que responde a hipoxia (HRE), MAGE-4, CEA, alfa-fetoprotema, GRP78/BiP y tirosinasa tambien se pueden utilizar para regular la expresion genetica en celulas tumorales.
Ademas, esta lista de promotores no se debena considerar como exhaustiva o limitantes, los expertos en la tecnica conoceran otros promotores que se pueden utilizar en conjuncion con los promotores y metodos desvelados en el presente documento.
TABLA 1 PROMOTORES ESPECIFICOS DE TEJIDO
Tejido Promotor
Pancreas Insulina Elastina Amilasa pdr-1 pdx-1 glucocinasa
Albumina PEPCK HBV amplificador a fetoprotema apolipoprotema C a-1 antitripsina vitelogenina, NF-AB Transtiretina
Musculo Miosina cadena H creatina cinasa muscular Distrofina Calpama p94 troponina 1 rapida alfaesqueletico actina
Piel Queratina K6 Queratina K1
Pulmon CFTR citoqueratina humana 18 (K18) protemas surfactantes pulmonares A, B y C CC-10 P1
Musculo liso sm22 a SM-alfa-actina
Endotelio Endotelina-1 E-selectina factor de von Willebrand TIE (Korhonen et al., 1995) KDR/flk-1
Melanocitos Tirosinasa
Lipoprotema lipasa (Zechner et al., 1988) Adipsina (Spiegelman et al., 1989) acetil-CoA Tejido adiposo carboxilasa (Pape y Kim, 1989) glicerofosfato deshidrogenasa (Dani et al., 1989) adipocito P2 (Hunt et al., 1986)
Mama Protema acida de Whey (WAP) (Andres et al. PNAS 84:1299-13031987
Sangre (p -globina)
Se entendera adicionalmente que ciertos promotores, mientras no tiene la actividad restringida a un unico tipo de tejido, puede no obstante presentar selectividad en que pueden ser activos en un grupo de tejidos, y menos eficaces o silentes en otro grupo. Dichos promotores se denominan tambien “espedficos de tejido”, y se contemplan para su uso con la divulgacion. Por ejemplo, los promotores que son activos en una variedad de neuronas del sistema nervioso central (SNC) pueden ser terapeuticamente utiles en la proteccion contra el dano debido a ictus, que puede tener efecto en cualquiera de diferentes regiones del cerebro. En consecuencia, los elementos reguladores espedficos de tejido utilizados en la divulgacion tienen aplicabilidad para la regulacion de las protemas heterologas, as ^como aplicabilidad como una secuencia de polinucleotido dirigida en los presentes vectores retrovmcos.
En otro aspecto mas, la divulgacion proporciona plasmidos que comprenden una construccion derivada de un retrovirus recombinante. El plasmido puede introducirse directamente en una celula diana o un cultivo celular tal como de NIH 3T3 u otras celulas de cultivo celular. Las celulas resultantes liberan el vector retrovmco en el medio de cultivo.
La divulgacion proporciona una construccion de polinucleotido que comprende de 5' a 3': una region promotora o reguladora util para iniciar la transcripcion; una senal psi empaquetada; una secuencia de acido nucleico que codifica gag, una secuencia de acido nucleico que codifica pol; y una secuencia de acido nucleico que codifica env; un sitio interno de entrada en el ribosoma; un polinucleotido heterologo que codifica un marcador, polipeptido terapeutico o diagnostico; y una secuencia de acido nucleico LTR. Como se describe en otra parte del presente documento y a continuacion los distintos segmentos de la construccion de polinucleotido de la divulgacion (por ejemplo, un polinucleotido retrovmco recombinante competente en replicacion) estan modificados dependiendo en parte de la celula huesped deseada, el tiempo de expresion o la cantidad, y el polinucleotido heterologo. Una construccion retrovmca competente en replicacion de la divulgacion se puede dividir en varios dominios que se pueden modificar individualmente por los expertos en la tecnica.
Por ejemplo, el promotor puede comprender un promotor CMV que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: l l9 , 20 o 22 del nucleotido 1 a aproximadamente el nucleotido 582 y puede incluir una modificacion en una o mas (por ejemplo, 2-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-100 o mas bases de acido nucleico) a condicion de que el promotor modificado sea capaz de dirigir e iniciar la transcripcion. En un aspecto de la divulgacion, la region promotora o reguladora comprende un dominio CMV-R-U5 de polinucleotido. El dominio CMV-R-U5 comprende el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano de la region R-U5 de MLV. En un aspecto de la divulgacion, el dominio CMV-R-U5 del polinucleotido comprende una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 19, 20 o 22 desde aproximadamente el nucleotido 1 a aproximadamente el nucleotido 1202 o las secuencias que son al menos un 95% identicas a una secuencia que se expone en las SEQ ID NO: 19, 20 o 22 donde el polinucleotido promueve la transcripcion de una molecula de acido nucleico unida operativamente al mismo. El dominio gag del polinucleotido puede derivarse de cualquier numero de retrovirus pero normalmente se derivaran de oncorretrovirus y mas particularmente de oncorretrovirus de mairnfero. En un aspecto de la divulgacion el dominio gag comprende una secuencia de aproximadamente el nucleotido numero 1203 a aproximadamente 2819 o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 99,8 % (redondeando a la decima mas proxima) de identidad con la misma. El dominio pol del polinucleotido se puede derivar de cualquier numero de retrovirus, pero normalmente se derivara de un oncorretrovirus y mas particularmente de un oncorretrovirus de mamffero. En un aspecto de la divulgacion el dominio pol comprende una secuencia de aproximadamente el nucleotido numero 2820 a aproximadamente el nucleotido 6358 o una secuencia que tenga al menos un 95%, 98%, 99% o 99,8% (redondeando a la decima mas proxima) de identidad con la misma. El dominio env del polinucleotido puede derivarse de cualquier numero de retrovirus pero se derivaran normalmente de un oncorretrovirus o retrovirus gamma y mas particularmente de un oncorretrovirus de mamffero o un retrovirus gamma. En algunos aspectos de la divulgacion el dominio codificante de env comprende un dominio env anfotropico. En un aspecto de la divulgacion el dominio env comprende una secuencia desde aproximadamente el nucleotido numero 6359 a aproximadamente el nucleotido 8323 o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 99,8 % (redondeando a la decima mas proxima) de identidad con la misma. El dominio IRES comprende una secuencia desde aproximadamente el nucleotido numero 8327a aproximadamente el nucleotido 8876 o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, o 99 % (redondeado a la decima mas proxima) de identidad con la misma a condicion de que el dominio permita la entrada de un ribosoma. El dominio heterologo puede comprender una citosina desaminasa de la divulgacion. En un aspecto de la divulgacion, el polinucleotido de la CD comprende una secuencia con el codon humano optimizado. En otro aspecto mas de la divulgacion, el polinucleotido de CD codifica un polipeptido mutante que tiene una citosina desaminasa, donde las mutaciones confieren una estabilizacion termica aumentada que aumenta la temperatura de fusion (Tm) unos 10 °C permitiendo sostener la actividad cinetica sobre un intervalo de temperatura mas amplio y un aumento de los niveles acumulados de protema. En un aspecto de la divulgacion, la citosina desaminasa comprende una secuencia que se exponen en la SEQ ID NO: 19 o 22 desde aproximadamente el nucleotido numero 8877 a aproximadamente 9353. El dominio heterologo puede estar seguido por un dominio rico en polipurina. La LTR 3' puede derivarse de cualquier numero de retrovirus, normalmente un oncorretrovirus y preferentemente un oncorretrovirus de mamffero. En un aspecto de la divulgacion, la LTR 3' comprenden el dominio U3-R-U5. En otro aspecto mas de la divulgacion la LTR comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19 o 22 desde aproximadamente el nucleotido 9405 a aproximadamente 9998 o una secuencia que es al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 99,5 % (redondeando a la decima mas proxima) identica a la misma.
La divulgacion tambien proporciona un vector retrovmco recombinante que comprende de 5' a 3' CMV-R-U5, una fusion del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano con la region R-U5 de MLV; un PBS, sitio de union al cebador para la transcriptasa inversa; un sitio de corte y empalme 5'; una senal de empaquetamiento y ; un gag, ORF para el antfgeno espedfico de MLV; un pol, ORF para polimerasa poliproteica de MLV; un sitio de corte y empalme 3', un env 4070, o Rf para la protema de envoltura de la cepa 4070A del MLV; un IRES, sitio interno de entrada al ribosoma del virus de encefalomiocarditis; una citosina desaminasa modificada (termoestabilizada y optimizado el codon),; un PPT; tracto polipurina; y un U3-R-U5, repeticion terminal larga de MLV. Esta estructura se representa adicionalmente en la Figura 3.
La divulgacion tambien proporciona un vector retrovrnco que comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19, 20 o 22.
Los vectores retrovmcos se pueden utilizar para tratar un amplio intervalo de enfermedades y trastornos incluyendo varias enfermedades y trastornos proliferativos celulares (vease, por ejemplo, las Pat. de EE. UU. N.° 4.405.712 y 4.650.764; Friedmann, 1989, Science, 244:1275-1281; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932, R. Crystal, 1995, Science 270:404-410; vease tambien, The Development of Human Gene Therapy, Theodore Friedmann, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999. ISBN 0-87969-528-5.
La divulgacion tambien proporciona una terapia genetica para el tratamiento de trastornos proliferativos celulares. Dicha terapia conseguira su efecto terapeutico mediante la introduccion de un polinucleotido terapeutico apropiado (por ejemplo, ribozimas antisentido, ribozimas, genes suicidas, ARNip), en celulas del sujeto que tiene un trastorno proliferativo. El suministro de construcciones de polinucleotido se puede conseguir utilizando el vector retrovrnco recombinante de la divulgacion, particularmente si se basan en MLV, que sera capaz de infectar celulas en division. Ademas, los metodos terapeuticos de la invencion (por ejemplo, la terapia genetica o metodos de suministro genetico) como se describe en el presente documento se puede llevar a cabo in vivo o ex vivo. Puede ser preferible retirar la mayona de un tumor antes de la terapia genetica, por ejemplo, quirurgicamente o por radiacion. En algunos aspectos, la terapia retrovmca puede estar precedida o seguida por cirugfa, quimioterapia o radioterapia.
Por lo tanto, la divulgacion proporciona un retrovirus recombinante capaz de infectar una celula que no esta en division, una celula en division o una celula neoplasica, en el que el retrovirus recombinante comprende un GAG vmco; un POL vmco; un ENV vmco; un acido nucleico heterologo unido operativamente a un IRES; y secuencias de acido nucleico cis-actuantes necesarias para el empaquetamiento, la transcripcion inversa y la interaccion. El retrovirus recombinante puede ser un lentivirus, tal como VIH, o puede ser un oncovirus. Como se ha descrito anteriormente para el metodo de produccion de un retrovirus recombinante, el retrovirus recombinante de la divulgacion puede adicionalmente incluir al menos una de entre las protemas VPR, VIF, NEF, VPX, TAT, REV, y VPU. Aunque sin querer estar ligado por alguna teona en particular, se crefa que uno o mas de estos genes /productos proteicos son importantes para aumentar el tftulo vmco del retrovirus recombinante producido (por ejemplo, NEF) o puede ser necesario para la infeccion y empaquetamiento del virion.
La divulgacion tambien proporciona un metodo de transferencia de acido nucleico a una celula diana para proporcionar la expresion de un acido nucleico en particular (por ejemplo, una secuencia heterologa). Por lo tanto, en otro aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para la introduccion y expresion de un acido nucleico en una celula diana que comprende infectar la celula diana con el virus recombinante de la divulgacion y expresar el acido nucleico heterologo en la celula diana. Como se ha mencionado anteriormente, la celula diana puede ser cualquier tipo de celula incluyendo en division, no en division, neoplasica, inmortalizada, modificada y otros tipos celulares reconocidos por los expertos en la tecnica, a condicion de que sean capaces de la infeccion por un retrovirus.
Puede ser deseable modular la expresion de un gen en una celula mediante la introduccion de una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, la secuencia de acido nucleico heterologa) mediante el metodo de la divulgacion, donde la secuencia de acido nucleico da lugar, por ejemplo, a una molecula antisentido o ribozima. El termino “modular” se refiere la supresion de la expresion de un gen cuando esta sobre-expresado, o el aumento de la expresion cuando esta bajo-expresado. Cuando se asocia un trastorno proliferativo con la expresion de un gen, se pueden utilizar secuencias de acido nucleico que interfieren con la expresion del gen a nivel de la traduccion. Esta estrategia utiliza, por ejemplo, un acido nucleico antisentido, ribozimas, o agentes triples para bloquear la transcripcion o traduccion de un ARNm espedfico, sea enmascarando el ARNm con un acido nucleico antisentido o agente triple o escindiendolo con una ribozima.
Puede ser deseable transferir un acido nucleico que codifica un modificador de la respuesta biologica (por ejemplo, una citocina) en una celula de un sujeto. En esta categona estan incluidos los agentes inmunopotenciadores incluyendo los acidos nucleicos que codifican varias de las citocinas clasificadas como “interleucinas”. Estas incluyen, por ejemplo, las interleucinas de 1 a 15, asf como otros modificadores de la respuesta y factores descritos en otra parte del presente documento. Tambien se incluyen en esa categona, aunque notrabajando necesariamente de acuerdo con los mismos mecanismo, los interferones, y en particular el interferon gamma, el factor de necrosis tumoral (TNF) y el facto estimulante de colonias de granulocitos macrofagos (GM-CSF). Otros polipeptidos incluyen, por ejemplo, factores angiogenicos y factores anti-angiogenicos. Puede ser deseable suministrar dichos acidos nucleicos a las celulas de la medula osea o los macrofagos para tratar deficiencias enzimaticas o defectos inmunitarios. Tambien se pueden introducir acidos nucleicos que codifican factores de crecimiento, peptidos toxicos, ligandos, receptores. U otras protemas fisiologicamente importantes en las celulas diana espedficas.
La divulgacion se puede utilizar para suministrar polinucleotidos heterologos que promueven y efectuan el direccionamiento de farmacos espedfico. Por ejemplo, el HER2 (vease, por ejemplo, la SEQ ID NO: 23 y 24), un miembro de la familia de receptores EGF, es la diana para la union del farmaco trastuzumab (Herceptin™, Genentech). El trastuzumab es un mediador de la citotoxicidad celar dependiente de anticuerpo (ADCC). La actividad se dirige preferentemente a las celulas que expresan HER2 con niveles de sobre-expresion de 2+ o 3+ mediante inmunohistoqmmica mas que celulas que expresan 1+ o no expresan (Herceptin prescribing information, Crommelin 2002). El aumento de la expresion de HER2 por la introduccion de un vector que expresa HER2 que expresa solo los dominios extracelular y transmembrana) en tumores con HER2 bajo puede facilitar el desencadenamiento de ADCC optimo y superar rapidamente el desarrollo de resistencia a HER2 que se observa en el uso clmico.
La sustitucion de yCD2 (que comprende la SEQ ID NO: 19 desde aproximadamente 8877 a 9353) para el dominio intracelular de HER2 permite la expresion en superficie de HER2 y la localizacion en el citosol de yCD2. El dominio extracelular (ECD) y dominio transmembrana (TM) de HER2 (aproximadamente a 2026 desde aproximadamente la posicion 175 a 2200 de la SEQ ID NO: 23) puede amplificarse por PCR (Yamamoto et al., Nature 319:230-234, 1986; Chen et al., Canc. Res., 58:1965-1971, 1998) o sintetizarse qmmicamente (BioBasic Inc., Markham, Ontario, Canada) e insertarse entre el IRES y el gen yCD2 en el vector pAC3-YCD2 SEQ ID NO: 19 (por ejemplo, entre aproximadamente el nucleotido 8876 y 8877 de la SEQ ID NO: 18). De manera alternativa el gen de yCD se puede escindir y sustituirse con un polinucleotido que codifica un polipeptido HER2 o un fragmento del mismo. Un HER2 truncado adicionalmente con solo el dominio IV de union a la Herceptina de los dominios ECD y TM (aproximadamente a 290 pb de la posicion 1910 a 2200) se puede amplificar o sintetizar qmmicamente y utilizarlo como anteriormente (Landgraf 2007; Garrett et al., J. of Immunol., 178:7120-7131, 2007). Una modificacion adicional de esta forma truncada con el peptido de senal nativo (aproximadamente a 96 pb de la posicion 175-237) fusionada con el dominio IV de la TM puede sintetizarse qmmicamente y utilizarse como anteriormente. Los virus resultantes se pueden utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular en un sujeto en combinacion con trastuzumab o trastuzumab y 5-FU.
De manera alternativa, el HER2 y las modificaciones descritas anteriormente se pueden expresar en un vector separado que contenga un gen ENV diferentes u otra protema de superficie apropiada. Este vector puede ser competente en replicacion (Logg et al. J.Mol Biol. 369:12142007) o un vector retrovmco de “primera generacion” no replicante que codifique la envoltura y el gen de interes (Emi et al. J.Virol 65:1202 1991). En este ultimo caso la infeccion vmca preexistente proporcionara gag y pol complementarios para permitir la diseminacion infecciosa del vector “no replicante” desde cualquier celula infectada previamente. ENV y glicoprotemas alternativas incluyen ENV y glicoprotemas xenotropicas y politropicas capaces de infectar celulas humanas, por ejemplo, las secuencias ENV de la cepa NZB de MLV y las glicoprotemas de MCF, VSV, GALV y otros virus (Palu 2000, Baum et al., Mol. Therapy, 13(6):1050-1063, 2006). Por ejemplo, un polinucleotido puede comprender una secuencia en la que los genes de GAG, POL y yCD2 de la SEQ ID NO: 19 se hayan eliminado, el ENV se corresponde con un dominio ENV xenotropco de NZB MLV o VSV-g, y el IRES o un promotor tal como de RSV esta unido operativamente directamente a HER2, HER2 ECDTM, HER2 ECDIVTM, o HER2 SECDIVTM.
La infeccion mixta de celulas por un virus VSVG pseudotipado y un retrovirus anfotropico da como resultado la produccion de una progenie de viriones que albergan el genoma de un virus encapsidado por las protemas de la envoltura del otro. Lo mismo pasa para otras envolturas que seudotipan partmulas retrovmcas. Por ejemplo, la infeccion derivada anteriormente da como resultado la produccion de una progenie de viriones capaz de codificar YCD2 y HER2 (o una variante) en celulas infectadas. Los virus resultantes se pueden utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular en un sujeto en combinacion con trastuzumab o trastuzumab y 5-FU.
Recientemente, un retrovirus gamma XMRV, se ha asociado con el cancer de prostata en seres humanos mostrando el virus una fuerte preferencia para la replicacion en el tejido prostatico (R.Schlaberg et al. PNAS106: 16351-16356 2009). El virus parece ser muy similar al MLV demasiado xenotropico. En un aspecto de la presente divulgacion, los vectores retrovmcos no replicantes se proporcionan teniendo dos genes terapeuticos (citosina desaminasa, timidina cinasa, otros genes activantes de profarmacos, interferones, IL-2, IL-12, otras citocinas, otros anti-oncogenes p53, miARN anticancer o similares) y un gen de envoltura que es capaz de complementarse con las funciones del gag y gag pol de XMRV tal como una envoltura anfotropica, una envoltura de GALV, una envoltura proteica de VSVg, u otras envolturas conocidas por los expertos en la tecnica. El polinucleotido del vector no replicante se suministra en el cancer de prostata de un paciente o animal como una molecula de ADN o ARN utilizando uno de: sistemas de suministro ffsico o no vmco; un sistema de suministro vmco heterologo tal como un vector adenovmco, o como una partmula retrovmca fabricada. Una vez que se suministra el vector no replicante se diseminara por complementacion mediante XMRV y la infeccion a las celulas vecinas tendra lugar hasta que se alcance el lfmite de la infeccion por XMR, cuando la complementacion con el XMRV no este disponible. El gen terapeutico puede entonces tener este efecto (por ejemplo, despues de administrarse un profarmaco) solo en el area infectada por el XMRV. El mismo efecto de rescate se puede conseguir utilizando un vector retrovmco replicante de la presente divulgacion. Esta estrategia (vector no replicante complementario con un gen terapeutico) se puede utilizar con cualquier enfermedad retrovmca (infeccion por VIH, infeccion por HTLV1, otros retrovirus asociados al cancer), o con cualquier enfermedad vmca o asociada con virus (infeccion por HPV, y expresion de E6 y E7 de HPV en canceres del cuello uterino, linfomas o carcinomas asociados con EBV, etc.).
Otro aspecto del desarrollo de resistencia al trastuzumab se refiere a la interferencia con la senalizacion intracelular necesaria para la actividad del trastuzumab. Las celulas resistentes muestran perdida de PTEN y una expresion mas baja de p27kip1 [Fujita, Brit J. Cancer, 94:247, 2006; Lu et al., Journal of the National Cancer Institute, 93(24): 1852­ 1857, 2001; Kute et al., Cytometry Part A 57A:86-93, 2004). Por ejemplo, se puede generar de manera recombinante o sintetizar qmmicamente un polinucleotido que codifica PTEN (SEQ Id NO: 25) (BioBasic Inc., Markham, Canada) e insertarse operativamente directamente despues del polinucleotido de yCD2 en el vector pAC3-YCD2 de SEQ ID NO: 19 o 22, o con una secuencia enlazadora como se ha descrito anteriormente o como una sustitucion de yCD2. En un ejemplo adicional, el polinucleotido que codifica PTEN se puede sintetizar como anteriormente e insertarse entre las secuencias del IRES y yCD2 o con un enlazador como se ha descrito anteriormente.
De manera alternativa, se puede expresar el PTEN en un vector diferente que contienen un gen ENV diferente u otra protema de superficie apropiada. Este vector puede ser competente en replicacion (Logg et al. J.Mol Biol. 369:1214 2007) o un vector retrovrnco de “primera generacion” no replicante que codifica la envoltura y el gen de interes (Emi et al., J.Virol 65:1202 1991). En este ultimo caso la infeccion vmca preexistente proporcionara el gag y pol complementarios para permitir la diseminacion infecciosa del vector “no replicante” a partir de cualquier celula infectada previamente. Las glicoprotemas y ENV alternativas incluyen ENV y glicoprotemas xenotropicas y politropicas capaces de infectar celulas humanas, por ejemplo, secuencias de ENV de la cepa NZB del MLV y glicoprotemas de MCF, VSV, GALV y otros virus (Palu, Rev Med Virol. 2000, Baum, Mol. Ther. 13(6):1050-1063, 2006). Por ejemplo, un polinucleotido puede comprender una secuencia en la que los genes GAG y Pol y el yCD2 de la SEQ ID NO: 19 se han eliminado, el ENV correspondiente a un dominio ENV xenotropico de NZB MLV o VSV-g, y el IRES o un promotor tal como de RSV estan unidos operativamente directamente al PTEN.
La infeccion mixta de celulas por el virus VSVG pseudotipado y un retrovirus anfotropico da como resultado la produccion de una progenie de viriones que tiene el genoma de un virus encapsidado por protemas de la envoltura del otro [Emi, 1991]. Lo mismo pasa con otras envolturas que pseudotipan partmulas retrovmcas. Por ejemplo, la infeccion por retrovirus derivada como anteriormente da como resultado la produccion de una progenie de viriones capaz de codificar yCD2 y PTEN (o una variante) o solo el PTEN en las celulas infectadas. Los virus resultantes se pueden utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular en un sujeto en combinacion con trastuzumab o trastuzumab y 5-FC.
De manera similar, se puede sintetizar qmmicamente un polinucleotido que codifica p27Kipl (SEQ ID NO: 27 y 28) (BioBasic Inc., Markham, Canada) e insertarse operativamente directamente despues del gen yCD2 en el vector pAC3-YCD2 SEQ ID NO: 19 o con una secuencia enlazadora. En un ejemplo adicional, el polinucleotido que codifica el p27Kipl se puede sintetizar como anteriormente e insertarse entre las secuencias del IRES y el yCD2 o con un enlazador como se ha descrito anteriormente o en lugar del gen yCD2.
De manera alternativa, se puede expresar el p27kipI en un vector diferente que contienen un gen ENV diferente u otra protema de superficie apropiada. Este vector puede ser competente en replicacion (CR. Logg et al. J. Mol Biol.
369:12142007) o un vector retrovrnco de “primera generacion” no replicante que codifica la envoltura y el gen de interes (Emi et al., J. Virol 65:1202 1991). En este ultimo caso la infeccion vmca preexistente proporcionara el gag y pol complementarios para permitir la diseminacion infecciosa del vector “no replicante” a partir de cualquier celula infectada previamente. Las glicoprotemas y ENV alternativas incluyen ENV y glicoprotemas xenotropicas y politropicas capaces de infectar celulas humanas, por ejemplo, secuencias de ENV de la cepa NZB del MLV y glicoprotemas de MCF, VSV, GALV y otros virus (Palu 2000, Baum 2006, supra). Por ejemplo, un polinucleotido puede comprender una secuencia en la que los genes GAG y Pol y el yCD2 de la SEQ ID NO: 19 se han eliminado, el ENV correspondiente a un dominio ENV xenotropico de nZb m Lv o VSV-g, y el IRES o un promotor tal como de RSV estan unidos operativamente directamente al p27kipI.
La infeccion mixta de celulas por el virus VSVG pseudotipado y un retrovirus anfotropico da como resultado la produccion de una progenie de viriones que tiene el genoma de un virus encapsidado por protemas de la envoltura del otro [Emi, 1991]. Lo mismo pasa con otras envolturas que pseudotipan partmulas retrovmcas. Por ejemplo, la infeccion por retrovirus derivada como anteriormente a partir de ambas SEQ ID NO: 19 y 22 da como resultado la produccion de una progenie de viriones capaz de codificar yCD2 y p27kipI (o una variante) en las celulas infectadas. Los virus resultantes se pueden utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular en un sujeto en combinacion con trastuzumab o trastuzumab y 5-FC.
En otro ejemplo, el CD20 es la diana de union del farmaco rituximab (Rituxan™, Genentech). El rituximab es un mediador de la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y ADCC. Las celulas con una intensidad media de fluorescencia mayor por citometna de flujo presentan un aumento de sensibilidad al rituximab (van Meerten et al., Clin Cancer Res 2006; 12(13):4027-4035, 2006). El aumento de la expresion de CD20 por la introduccion de un vector que expresa CD20 en las celulas B con CD20 bajo puede facilitar que se desencadene la ADCC optimamente.
Por ejemplo, se puede sintetizar qmmicamente un polinucleotido que codifica CD20 (SEQ ID NO: 29 y 30) (BioBasic Inc., Markham, Canada) e insertarse operativamente directamente despues del polinucleotido de yCD2 en el vector pAC3-YCD2(-2) de SEQ ID NO: 19 o 22, con una secuencia enlazadora como se ha descrito anteriormente o como una sustitucion del gen yCD2. En un ejemplo adicional, el polinucleotido que codifica CD20 se puede sintetizar como anteriormente e insertarse entre las secuencias del IRES y yCD2 o con un enlazador como se ha descrito anteriormente. Como alternativa adicional la secuencia de CD20 se puede insertar en el vector pAC3-YCD2 despues de la escision del gen CD por digestion con Psi 1 y Not1.
En un ejemplo adicional mas, se puede sintetizar qmmicamente un polinucleotido que codifica el CD20 (SEQ ID NO:29 y 30) (BioBasic Inc., Markham, Canada) e insertarse en un vector que comprende un gen ENV no afotropico u otra protema de superficie apropiada (Tedder et al., PNAS, 85:208-212, 1988). Las glicoprotemas y ENV alternativas incluyen ENV y glicoprotemas xenotropicas y politropicas capaces de infectar celulas humanas, por ejemplo, secuencias de ENV de la cepa NZB del MLV y glicoprotemas de MCF, VSV, GALV y otros virus [Palu 2000, Baum 2006]. Por ejemplo, un polinucleotido puede comprender una secuencia en la que los genes GAG y POL y el YCD2 de la SEQ ID NO: 19 se han eliminado, el ENV correspondiente a un dominio e Nv xenotropico de NZB MLV o VSV-g, y el IRES o un promotor tal como de RSV estan unidos operativamente directamente al CD20.
La infeccion mixta de celulas por el virus VSVG pseudotipado y un retrovirus anfotropico da como resultado la produccion de una progenie de viriones que tiene el genoma de un virus encapsidado por protemas de la envoltura del otro [Emi, 1991]. Lo mismo pasa con otras envolturas que pseudotipan partmulas retrovmcas. Por ejemplo, la infeccion por retrovirus derivada como anteriormente a partir de ambas SEQ ID NO: 19 y 22 da como resultado la produccion de una progenie de viriones capaz de codificar yCD2 y CD20 (o una variante) en las celulas infectadas. Los virus resultantes se pueden utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular en un sujeto en combinacion con trastuzumab o trastuzumab y 5-FC. De manera similar, la infeccion de un tumor con un vector que codifica solo el marcador CD20 puede hacer el tumor tratable con el uso de Rituxan.
Los niveles de las enzimas y cofactores implicados en el anabolismo de pirimidinas pueden limitarse. La expresion de OPRT, timidina cinasa (Tk ), uridina monofosfato cinasa, nucleosido pirimidina fosforilasa es baja en las celulas cancerosas resistentes a 5-FU en comparacion con las lmeas sensibles (Wang et al., Cancer Res., 64:8167-8176, 2004). Los analisis de grandes poblaciones muestran una correlacion de los niveles enzimaticos con el resultado de la enfermedad (Fukui et al., Int'l. J. OF Mol. Med., 22:709-716, 2008). La co-expresion de CD y otras enzimas del anabolismo de pirimidinas (PAE) pueden aprovecharse para aumentar la actividad y por lo tanto el mdice terapeutico de los farmacos fluoropirimidimcos.
Para aumentar adicionalmente la estabilidad genetica (vease, por ejemplo, la Figura 5) de vectores que contienen YCD2/PAE el gen que codifica la enzima puede sintetizarse qmmicamente con mutaciones aleatorias a lo largo de la secuencia. Estas mutaciones pueden ser esencialmente aleatorias o pueden consistir en mutaciones solo en la posicion oscilante para cada aminoacido. La biblioteca de las secuencias mutadas se inserta corriente abajo o en lugar del gen yCD2 como se habfa descrito anteriormente para la SEQ ID NO: 11 y 13 para crear una biblioteca de plasmidos, que entonces se puede utilizar para generar una biblioteca de partmulas infecciosas por transfeccion transitoria en celulas 293T o equivalentes. Las celulas sensibles se pueden infectar con retrovirus que codifican el polipeptido de fusion y se somete a seleccion con qmmicos apropiados.
El barajado de ADN o “cna molecular” permite que la informacion genetica se entremezcle, dando lugar a recombinantes con las propiedades deseadas. Se han mejorado diferentes enzimas y protemas utilizando barajado de ADN (Stemmer 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91(22): 10747-51; Stemmer 1994 Nature 370 (6488):389-91). La recombinacion genetica es una fuerza principal que dirige la evolucion de muchos virus. La recombinacion en retrovirus entre dos genomas retrovmcos co-empaquetados se puede producir a tasas de hasta el 40 % por ciclo de replicacion. Las altas tasas de recombinacion en cada ciclo de replicacion hacen posible que la informacion genetica se entremezcle rapidamente, dando lugar a recombinantes con nuevos patrones de mutaciones y fenotipos en un periodo de tiempo corto. Por ejemplo, la cna molecular de retrovirus que contienen una biblioteca de secuencias de envoltura ecotropicas recombinantes de seis virus de leucemia murina daba como resultado un clon vmico con un nuevo tropismo. Utilizando el mismo metodo, se seleccionaron varios clones vmcos con una estabilidad y rendimientos de procesamiento mejorados (Soong et al., 2000 Nat Genet 25(4):436-9; Powell et al., 2000 Nat Biotechnol 18(12):1279-82).
La secuencia de polinucleotido incorporado en la presente divulgacion a veces es inestable dando lugar a la eliminacion de la secuencia de polinucleotido del genoma vmico con el tiempo. La base de esto no se entiende bien, pero es claramente dependiente de la secuencia. La cna molecular utilizando la presente divulgacion para seleccionar clones vmcos recombinantes que han adquirido recombinaciones optimas en la secuencia de polinucleotido heterologa se emplea para seleccionar clones vmicos que tienen una mayor estabilidad de vector. Por ejemplo, la secuencia codificante de HSV-TK (SEQ ID NO: 37) no es tan estable como se desea en algunas situaciones. La cna molecular de vectores retrovmicos recombinantes engloba un agrupamiento de secuencias codificantes degeneradas de HSV-TK se lleva a cabo para seleccionar vectores recombinantes que tienen una mayor estabilidad de vector. Se sintetizo qmmicamente la timidina cinasa (TK) del herpes mutagenizada aleatoriamente (Bio Basic Inc, Markham, Canada). La secuencia sintetica se inserta aa 3' de la secuencia yCD2 en la SEQ ID NO: 19, o por sf misma en el armazon del vector pAC3-YCD2 despues de la escision del gen CD2. La mezcla de vector retrovmco se empaqueta como se ha descrito previamente. Las celulas LMTK de fibroblastos de raton o las 143Tk humanas se infectan con el vector y se seleccionan en cuanto a la actividad TK en medio HAT (Hiller et al., Mol. Cell Biol. 8(8):3298-3302, 1988). El pasaje en serie de los sobrenadantes de celulas resistentes al medio reciente HAT, de nuevo con celulas LMTK/143Tk seleccionadas, da como resultado la seleccion de vectores estables que expresan TK. Las celulas resistentes TK+ se pueden aislar y rescatarse las secuencias de TK mediante tecnicas basadas en PCR convencional para el analisis de mutacion (Cowell et al., CDNA Library Protocols, publicado por Humana Press, 1996). De esta manera, se seleccionan las secuencias tanto por expresion de la protema funcional como de la estabilidad genomica de la construccion del vector retrovmco. Se pueden emplear estrategias similares para UPRT (SEQ ID NO: 11, 13), OPRT (SEQ ID NO: 15, 17) (Olah et al., Cancer Res.
40:2869-2875, 1980; y Suttle, Somatic Cell & Mol. Genet., 15(5):435-443, 1989) y otros genes de interes. Ademas, la estrategia de pasajes en serie se puede utilizar para no indicadores geneticos y el ADN genomico despues del pasaje en serie se explora en cuanto a inserciones de longitud completa por PCR a traves del gen de la insercion IRES (vease la Fig. 5). Las inserciones de longitud completa pueden purificarse y clonarse de nuevo en el vector vmco y entonces se vuelven a ensayar. Se pueden llevar a cabo varios ciclos de este procedimiento para seleccionar el gen mas estable. Esta estrategia tambien se puede utilizar para el pasaje en animales con o sin tumores, e incluso en tejidos del paciente.
De manera alternativa, OPRT, UPRT, TK u otro PAE que se puede expresar en un vector diferente que contienen un gen ENV diferentes u otra glicoprotema de superficie apropiada. Este vector puede ser competente en replicacion (Logg et al. J.Mol Biol. 369:12142007) o un vector retrovmco de “primera generacion” no replicante que codifica la envoltura y el gen de interes (Emi et al. J.Virol 65:1202 1991). En este ultimo caso la infeccion vmca preexistente proporcionara gag y pol complementarios que permiten la diseminacion infecciosa del vector “no replicante” desde cualquier celula infectada previamente. La e Nv y glicoprotemas incluyen ENV y glicoprotemas xenotropicas y politropicas capaces de infectar celulas humanas, por ejemplo, las secuencias ENV de la cepa NZB de MLV y las glicoprotemas de MCF, VSV, GALV y otros virus [Palu 2000, Baum 2006, supra], Por ejemplo, un polinucleotido puede comprender una secuencia en la que los genes GAG y POL se han eliminado, el ENV se corresponde con un dominio ENV xenotropico de NZB MLV o VSV-g, y el IRES o un promotor tal como de RSV esta unido operativamente directamente a OPRT, UPRT u otro gen PAE.
La infeccion mixta de celulas por el virus VSV-g pseudotipado y un retrovirus anfotropico da como resultado la produccion de una progenie de viriones que tiene el genoma de un virus encapsidado por protemas de la envoltura del otro (Emi et al., J. Virol. 65:1202, 1991). Lo mismo pasa con otras envolturas que pseudotipan partmulas retrovmcas. Por ejemplo, la infeccion por retrovirus derivada como anteriormente a partir de ambas SEQ ID NO: 19 y 22 da como resultado la produccion de una progenie de viriones capaz de codificar yCD2 y OPRT en las celulas infectadas. Los virus resultantes se pueden utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular en un sujeto en combinacion con 5-FC.
El retrovirus recombinante de la divulgacion se puede utilizar para el tratamiento de un trastorno neuronal, por ejemplo, puede contener opcionalmente un gen exogeno, por ejemplo, un gen que codifica un receptor o un gen que codifica un ligando. Dichos receptores incluyen receptores que responden a la dopamina, GABA, adrenalina, noradrenalina, serotonina, glutamato, acetilcolina y otros neuropeptidos, como se ha descrito anteriormente. Ejemplos de ligandos que pueden proporcionar un efecto terapeutico en un trastorno neuronal incluyen dopamina, adrenalina, noradrenalina, acido gamma-aminobutmco y serotonina. La difusion y captacion de un ligando necesario despues de la secuencia por una celula donante infectada sena beneficioso en un trastorno en el que la celula neural del sujeto es deficiente en la produccion de dicho producto genetico. Una celula geneticamente modificada para secretar un factor neurotrofico tal como el factor de crecimiento de nervios, (NGF), puede utilizarse para evitar la degeneracion de neuronas colinergicas que pueden de otra manera morir sin tratamiento.
De manera alternativa, las celulas se injertan en un sujeto con un trastorno de los ganglios basales, tal como la enfermedad de Parkinson, se pueden modificar para que contengan un gen exogeno que codifique L-DOPA, el precursor de dopamina. La enfermedad de Parkinson se caracteriza por una perdida de neuronas dopaminergicas en la sustancia negra del cerebro medio, que tiene los ganglios basales como su organo diana principal.
Otros trastornos neuronales que ese pueden tratar de manera similar por el metodo de la divulgacion incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, un dano neuronal debido a ictus y dano en la medula espinal. La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la degeneracion de las neuronas colinergicas del cerebro anterior basal. Los neurotransmisores para estas neuronas son acetilcolina, que es necesario para su supervivencia. El injerto de celula colinergicas infectadas con un retrovirus recombinante de la divulgacion que contienen un gen exogeno par un factor que promovena la supervivencia de esas neuronas puede conseguirse por el metodo de la divulgacion, como se ha descrito. Despues de un ictus, existe una perdida selectiva de celular en el CA1 del hipocampo, asf como la perdida cortical celular que puede subyacer en la perdida de funcion cognitiva y memoria en estos pacientes. Una vez que se identifican, las moleculas responsables de la muerte celular de CA1 se puede inhibir por los metodos de la presente divulgacion. Por ejemplo, secuencias antisentido, o se puede transferir un gen que codifica un antagonista a una celula neuronal y se implanta en la region del hipocampo del cerebro.
Para las enfermedades debidas a deficiencia de un producto proteico, la transferencia genetica podna introducir un gen normal en los tejidos afectados para una terapia de remplazo, asf como para crear modelos animales para la enfermedad utilizando mutaciones antisentido. Por ejemplo, puede ser deseable insertar un Factor IX que codifica un acido nucleico en un retrovirus para la infeccion de una celula muscular o hepatica.
La divulgacion tambien proporciona terapia genetica para el tratamiento de trastornos proliferativos celulares o inmunologicos. Dicha terapia conseguina su efecto terapeutico por la introduccion de un polinucleotido codificante antisentido o dominante negativo en las celulas que tienen el trastorno proliferativo, donde el polinucleotido se une y evita la traduccion o expresion de un gen asociado con un trastorno proliferativo celular. El suministro de acidos nucleicos utiles para el tratamiento o modulacion de un trastorno proliferativo (por ejemplo, polinucleotidos antisentido) se puede conseguir utilizando un vector retrovmco recombinante de la divulgacion. En otro aspecto de la divulgacion, un trastorno proliferativo celular se trata introduciendo un polinucleotido CD de la divulgacion, expresando el polinucleotido para producir un polipeptido que comprende una actividad citosina desaminasa y poniendo en contacto la celula con 5-fluorocitosina en una cantidad y durante un periodo de tiempo para producir una cantidad citotoxica de 5-FU.
Existen en el mercado actualmente varios agentes quimioterapicos que tienen grados variables de exito desde la remision completa a la remision temporal y prolongacion de la vida con recurrencias esperadas. Algunos agentes terapeuticos del mercado se dirigen a las propiedades angiogenicas vasculares del tumor. La composicion se dirige a la angiogenesis de los tumores buscando reducir el suministro de sangre y nutrientes al tumor o cancer y de esta manera reducir el tumor y prolongar la vida del sujeto. El VEGF es un factor angiogenico conocido por tener un papel en el crecimiento tumoral. Por lo tanto, se han desarrollado antagonistas del VEGF como agentes anticancer.
El VEGF humano media en la neoangiogenesis en el sistema vascular normal y maligno; se sobre-expresa en la mayona de las enfermedades malignas y sus altos niveles se correlacionan con un mayor riesgo de metastasis y peor pronostico muchas veces. Cuando el VEGF interactua con su receptor en modelos in vitro de angiogenesis, proliferacion de celulas endoteliales y formacion de nuevos vasos sangumeos. En los modelos animales, el VEGF ha demostrado que induce la migracion/proliferacion celular-endotelial vascular, mantiene la supervivencia de vasos sangumeos recien formados, y aumenta la permeabilidad vascular.
Un agente antagonista es el que se dirige o regula negativamente la senalizacion de la ruta de VEGF. Ejemplo incluyen los inhibidores del VETf (por ejemplo agentes que inhiben directamente el VEGF (por ejemplo VEGF-A, B, C, o D), tal como por union con el VEGf (por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF tales como el bevacizumab (AVASTIN®) o ranibizumab (LUCENTIS®), u otros inhibidores tales como pegaptanib, NEOVASTAT®, AE-941, VEGF Trap, y PI-88)), moduladores de la expresion de VEGF (por ejemplo, INGN-241, oral tetratiomolibdato, 2-metoxiestradiol, dispersion de 2-metoxiestradiol nanocristalino, bevasiranib sodico, PTC-299, Veglin), inhibidores de un receptor de VEGF (por ejemplo, el receptor III de VEGF o KDR (Filt4), por ejemplo anticuerpo anti-KDR, anticuerpo VEGFR2 tal como CDp-791, IMC-1l21B, bloqueadores del v Eg f R2 tales como CT-322), moduladores de la expresion de VEGFR (por ejemplo, modulador de la expresion de VEGFR1 Sinfa-027) o inhibidores de la senalizacion del receptor de VEGF corriente abajo. En algunos aspectos, se describe en el presente documento, que el agente antagonista del VEGF es bevacizumab, pegaptanib, ranibizumab, sorafenib, sunitinib, AE-941, VEGF Trap, pazopanib, vandetanib, vatalanib, cediranib, fenretinida, escualamina, INGN-241, oral tetratiomolibdato, tetratiomolibdato, Panzem NCD, 2-methoxyestradiol, AEE-788, AG-013958, bevasiranib sodico, AMG-706, axitinib, BIBF-1120, CDP-791, CP-547632, PI-88, SU-14813, SU-6668, XL-647, XL-999, IMC-1121B, ABT-869, BAY-57­ 9352, BAY-73-4506, BMS-582664, CEP-7055, CHIR-265, CT-322, CX-3542, E-7080, ENMD-1198, OSI-930, PTC-299, Sirna-027, TKI-258, Veglin, XL-184, o ZK-304709.
El Bevacizumab (AVASTATIN®) (rhuMAb-VEGF) (anticuerpo monoclonal anti-VEGF) es un anticuerpo monoclonal recombinante quimerico humano/murino dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)). Se prepara modificando restos de union al VEGF de un anticuerpo monoclonal anti-VEGF murino en las regiones marco conservadas de una inmunoglobulina G1 humana (IgG1) (Prod Info Avastin, 2004). Solamente el 7% de la secuencia de aminoacidos se deriva del anticuerpo murino, con un 93% de la IgG1. El bevacizumab se une y neutraliza toda forma de VEGF humano mediante el reconocimiento de los sitios de union de los dos tipos de receptor de VEGF humano (flt-1 y flk-1). En modelos animales, el anticuerpo ha demostrado que estabiliza los tumores establecidos o suprime el crecimiento tumoral inhibiendo la angiogenesis inducida por el VEGF.
La farmacocinetica del bevacizumab es lineal despues de dosis de 0,3 mg/kg o mayores (Anon, 2002). Despues de 990 minutos de las infusiones intravenosas de 0,3, 1, 3 y 10 mg/kg en pacientes con cancer avanzado (n = 25) los picos de concentraciones en el suero de bevacizumab variaban de 5 a 9 mcg/ml, 21 a 39 mcg/ml, 52 a 92 mcg/ml y 186 a 294 mcg/ml, respectivamente, se observaba una ligera acumulacion con dosis repetidas (semanalmente), pero no era significativa y la farmacocinetica se mantema lineal. Los niveles del estado establecido de bevacizumab se obteman en 100 dfas despues de 1 a 20 mg/kg semanalmente, cada 2 semanas o cada 3 semanas.
La dosis de bevacizumab recomendada es de 5 miligramos/kilogramo infundida por via intravenosa durante 30 minutos cada dos semanas hasta que disminuya la progresion de la enfermedad. El bevacizumab debena seguir con quimioterapia. La eficacia del bevacizumab como agente unico no se ha establecido. El bevacizumab (que se puede coadministrar con gemcitabina y docetaxel, o en una semana antes o despues de la quimioterapia), se administra por via intravenosa, a aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, preferentemente aproximadamente a 5 mg/kg.
Los metodos y composiciones de la divulgacion son utiles en terapias de combinacion incluyendo las terapias con bevacizumab. Como se ha descrito en el presente documento, el retrovirus competente en replicacion (RCR) de la divulgacion comprende un gen terapeutico (por ejemplo, citotoxico) util en el tratamiento de trastornos proliferativos celular. Una ventaja del RCR de la divulgacion incluye su capacidad para infectar celulas en replicacion, celulas cancerosas. Cuando el transgen del vector comprende un gen citotoxico (por ejemplo, un gen que codifica un polipeptido que convierte un agente no citotoxico en un agente citotoxico) proporciona la capacidad para destruir celulas cancerosas.
La divulgacion proporciona metodos para el tratamiento de trastornos proliferativos celulares tales como el cancer y neoplasias que comprende la administracion de un vector de RCR de la divulgacion, seguido por un tratamiento con un agente quimioterapico o anticancer. En un aspecto, el vector RCR se administra a un sujeto durante un periodo de tiempo antes de la administracion del agente quimioterapico o anticancer que permita al RCR infectar y replicarse. El sujeto se trata entonces con un agente quimioterapico o agente anticancer durante un periodo de tiempo y dosificacion para la proliferacion o destruir las celulas cancerosas. En un aspecto si el tratamiento con el agente quimioterapico o anticancer reducir, pero no destruye el cancer/tumor (por ejemplo, una remision parcial o remision temporal), el sujeto se tiene que tratar entonces con un agente terapeutico no toxico (por ejemplo, 5-FC) que se convierte en un agente terapeutico toxico en las celulas que expresan un gen citotoxico (por ejemplo, citosina desaminasa) del RCR. Utilizando dichos metodos los vectores RCXR de la divulgacion se diseminan durante un proceso de replicacion de las celulas tumorales, dichas celulas se pueden destruir entonces con un agente anticancer o quimioterapico y adicionalmente se puede producir la destruccion utilizando el procedimiento de tratamiento con RCR descrito en el presente documento.
En otro aspecto de la divulgacion mas, el gen heterologo puede comprender una secuencia codiciante para un antfgeno diana (por ejemplo, un antfgeno del cancer). En este aspecto, las celulas que comprenden un trastorno proliferativo se infectan con un RCR que comprende un polinucleotido heterologo que codifica el antfgeno diana para proporcionar la expresion del antfgeno diana (por ejemplo, la sobre-expresion de un antfgeno del cancer). Entonces se administra un agente anticancer que comprende un resto equivalente de direccionamiento que interactua espedficamente con el antfgeno diana al sujeto. El resto equivalente de direccionamiento puede estar unido operativamente a un agente citotoxico o puede ser un agente anticancer por sf mismo. Por lo tanto, una celula cancerosa infectada con el RCR que comprende en secuencias que codifican el antfgeno direccionado aumenta la expresion de la diana en la celula cancerosa dando como resultado un aumento de la eficacia/eficiencia del direccionamiento citotoxico.
Se ha demostrado que el bloqueo de las interacciones entre las celulas del sistema inmunitario tiene efectos inmunologicos significativos, sean de activacion o supresion (Waldmann Annu Rev Med. 57:652006). Por ejemplo, el bloqueo de la interaccion de CTLA-4 (CD152) y B7.1 (CD80) que modulan la activacion de las celulas T se ha demostrado que causa estimulacion inmunitaria, presumiblemente bloqueando esta interaccion supresora (Peggs et al. Curr. Opin. Immunol. 18:206, 2006). Este bloqueo se puede conseguir potencialmente con anticuerpos contra CTLA-4 o por B7.1 soluble. La administracion sistemica de estos tipos de moleculas puede tener efectos globales no deseables que pueden como mmimo dar lugar a efectos secundarios perjudiciales e incluso la muerte en el caso de un agonista C28 (Suntharalingam et al. NEJM 35510182006). Pfizer ha desarrollado uno de dichos anticuerpos de bloqueo anti-CTLA-4 (CP-675,206) como reactivo anticancer, pero recientemente se ha detenido su desarrollo debido a los efectos secundarios significativos. El suministro local de moleculas de bloqueo que se liberan en el entorno local, desde el tumor despues de la infeccion con un vector competente en replicacion que codifica dichas moleculas que se liberan en el espacio extracelular, proporciona la modulacion inmunitaria localmente y evita estos efectos secundarios graves. Las moleculas de bloqueo son anticuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, versiones solubles del ligando natural u otros peptidos que se unen a dichos receptores.
En otro aspecto mas, un RCR de la divulgacion puede comprender una secuencia codificante que comprende un dominio de union (por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un dominio de anticuerpo o un ligando receptor) que interactua espedficamente con un antfgeno o ligando equivalente. El RCR comprende la secuencia codificante para el dominio de union que se puede entonces utilizar para infectar las celulas de un sujeto que comprende un trastorno proliferativo celular tal como una celula cancerosa o una celula neoplasica. La celula infectada entonces expresara el dominio de union o anticuerpo. Se puede administrar entonces un antfgeno o equivalente unido operativamente a un agente citotoxico o que es propiamente citotoxico al sujeto. El equivalente citotoxico entonces destruira selectivamente las celulas infectadas que expresan el dominio de union. De manera alternativa el propio dominio de union puede ser un agente anticancer.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “anticuerpo” se refiere a una protema que incluye al menos un dominio variable de inmunoglobulina o una secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una region variable de cadena pesada (H) (abreviada en el presente documento como VH) y una region variable de cadena ligera (L) (abreviada en el presente documento como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena ligara (L). El termino “anticuerpo” engloba fragmentos de union al antigeno de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, F(ab')2, un fragmento Fd, fragmentos Fv, y fragmentos dAb) as^ como anticuerpos completos.
Las regiones VH y VL puede subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinates de complementariedad” (CDR), intercaladas en regiones que estan mas conservadas, denominadas “regiones marco conservadas” (FR). La extension de la region marco conservada y CDR se ha definido con precision (vease, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). Las definiciones de Kabat se utilizan en el presente documento. Cada VH y VL esta compuesta normalmente por tres CDR y cuatro FR, dispuestas de sede el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, F3, CDR3, FR4.
Un “dominio de inmunoglobulina se refiere a un dominio del dominio constante o variable de moleculas de inmunoglobulina. Los dominios de inmunoglobulina contienen normalmente dos laminas beta formados de aproximadamente siete cadenas beta, y un enlace disulfuro conservado (vease, por ejemplo, A. F. Williams y A. N. Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6:381-405). Las estructuras canonicas de bucles hipervariables de una region variable de inmunoglobulina se pueden deducir a partir de su secuencia, como se describe en Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798); y Tomlinson et al. (1995) EMBO J.
14(18):4628-38.
Como se utiliza en el presente documento, una “secuencia de dominio variable de inmunoglobulina” se refiere a una secuencia de aminoacidos que puede formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, la secuencia puede incluirtodo o parte de la secuencia de aminoacidos de un dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la secuencia puede omitir uno, dos o mas aminoacidos del extremo N o C, aminoacidos internos, puede incluir una o mas inserciones o aminoacidos terminales adicionales, o puede incluir otras alteraciones. En un aspecto de la divulgacion, un polipeptido que incluye una secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina puede asociarse con otra secuencia de dominio variable de inmunoglobulina para formar una estructura de union (o “sitio de union al antfgeno), por ejemplo, una estructura que interactua con Tiel, por ejemplo, se una o inhibe Tiel.
La cadena VH o VL del anticuerpo pueden incluir adicionalmente todo o parte de la region constante de cadena pesada o ligera, para formar de esta manera una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, respectivamente. En un aspecto de la divulgacion, el anticuerpo es un tetramero de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulinas, donde las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina estan interconectadas por, por ejemplo, enlaces disulfuro. La region constante de cadena pesada incluye tres dominios CH1, CH2 y CH3. La region constante de cadena ligera incluye un dominio CL. La region variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de union que interactua con un antfgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos median normalmente en la union del anticuerpo a tejidos o factores del huesped, incluyendo distintas celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema de complemento clasico. El termino “anticuerpo” incluyen inmunoglobulinas intactas de tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (asf como subtipos de los mismos): Las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas pueden ser de los tipos kappa o lambda. En un aspecto de la divulgacion, el anticuerpo esta glicosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para la citotoxicidad dependiente de anticuerpo y/o citotoxicidad mediada por complemento.
La expresion “anticuerpo monoespedfico” se refiere a un anticuerpo que presenta una unica especificidad y afinidad de union por una diana en particular, por ejemplo, un epttopo. Esta expresion incluye un “anticuerpo monoclonal” que se refiere a un anticuerpo que se produce como una especie molecular unica, por ejemplo, de una poblacion homogenea de celulas aisladas. Una “composicion de anticuerpos monoclonales” se refiere a una preparacion de anticuerpos o fragmentos de los mismos en una composicion que incluye una unica especie molecular de anticuerpo. En un aspecto de la divulgacion, un anticuerpo monoclonal se produce en una celula de mairnfero. Se pueden combinar una o mas especies de anticuerpo monoclonal.
Una o mas regiones de un anticuerpo puede ser humana o practicamente humana. Por ejemplo, una o mas regiones variables pueden ser humanas o practicamente humanas. Por ejemplo, una o mas de las CDR pueden ser humanas, por ejemplo, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDr2, y LC CDR3. Cada una de las CDR de cadena ligera pueden ser humana. HCCDR3 puede ser humana. Una o mas de las regiones marco conservadas pueden ser humanas, por ejemplo, FR1, FR2, f R3, y FR4 de la HC o LC. En un aspecto de la divulgacion, todas las regiones marco conservadas son humanas, por ejemplo, derivadas de una celula somatica humana, por ejemplo, una celula hematopoyetica que produce inmunoglobulinas o una celula no hematopoyetica. En un aspecto de la divulgacion, las secuencias humanas son secuencias de la lmea germinal, por ejemplo, codificadas por un acido nucleico de la lmea germinal. Uno o mas regiones constantes pueden ser humanas o practicamente humanas. En un aspecto de la divulgacion, al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, o 98 % de las regiones marco conservadas (por ejemplo, FR1, FR2, y FR3, colectivamente, o FR1, FR2, FR3, y FR4, colectivamente) o el anticuerpo interno puede ser humano o practicamente humano. Por ejemplo, FR1, FR2, y FR3, colectivamente pueden ser al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98, o 99 % identicas a una secuencia humana codificada por un segmento V de la lmea germinal humana de un locus que codifica una secuencia de cadena ligera o pesada.
Todo o parte de un anticuerpo puede estar codificado por un gen de inmunoglobulina o un segmento del mismo. Los genes de inmunoglobulina humana ejemplar incluyen los genes de region constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon y mu, asf como la minada de genes de regiones variables de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 Kd o 214 aminoacidos) se codifican por un gen de region variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoacidos) y un gen de la region constante kappa o lambda en el extremo COOH-. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 kd o 446 aminoacidos) se codifican de manera similar por un gen de la region variable (de aproximadamente 115 aminoacidos) y uno de los otros genes de la region constante mencionados anteriormente, por ejemplo, gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoacidos) Una cadena ligera se refiere a cualquier polipeptido que incluye un dominio variable de cadena ligera. Una cadena pesada se refiere a cualquier polipeptido que incluye un dominio variable de cadena pesada.
La expOresion “fragmento de union al antfgeno” de un anticuerpo de longitud completa (o simplemente, “parte de anticuerpo”, o “fragmento”), como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpos de longitud completa que mantiene la capacidad para unirse espedficamente a una diana de interes. Ejemplos de fragmentos de union englobados en el termino “fragmentos de union al antfgeno” de una anticuerpo del longitud completa incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en la VL, VH, CL y dominios CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region de la bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una region determinante de complementariedad (CDR) aislada que mantiene la funcionalidad. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y VH, se codifican por genes diferentes, se pueden unir, utilizando metodos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que hace posible que sean capaces de producirse como una unica cadena proteica en la cual las regiones VL y VH se emparejan para formar moleculas monovalentes conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv). Vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener utilizando cualquier tecnica apropiada incluyendo las tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica. La expresion “anticuerpo monoespedfico” se refiere a un anticuerpo que presentan una unica especificidad y afinidad de union por una diana en particular, por ejemplo, un epttopo. Esa expresion incluye un “anticuerpo monoclonal” o una “composicion de anticuerpo monoclonal”, que se utiliza en el presente documento para referirse a una preparacion de anticuerpos o fragmentos de los mismos de una composicion molecular unica. Como se utiliza en el presente documento “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que estan codificados por los genes de la region constante de cadena pesada.
La divulgacion proporciona un metodo de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno proliferativo celular. El sujeto puede ser cualquier mamffero, y preferentemente es un ser humano. El sujeto se pone en contacto con un vector retrovmco recombinante competente en replicacion de la divulgacion. La puesta en contacto puede ser in vivo o ex vivo. Los metodos de administracion del vector retrovmco de la divulgacion se conocen en la tecnica e incluyen, por ejemplo, la administracion sistemica, administracion topica, administracion intraperitoneal, administracion intramuscular, intracraneal, cerebroespinal, asf como la administracion directamente en el sitio del tumor o trastorno proliferativo celular. Se conocen en la tecnica otras vfas de administracion.
Por lo tanto, la divulgacion incluye distintas composiciones farmaceuticas utiles para tratar un trastorno proliferativo celular. Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la divulgacion se preparan uniendo un vector retrovmco que contienen una secuencia de polinucleotido heterologo util en el tratamiento o modulacion de un trastorno proliferativo celular de acuerdo con la divulgacion en una forma adecuada para la administracion a un sujeto utilizando vehmulos, excipientes y aditivos o auxiliares. Los vetuculos o auxiliares que se utilizan frecuentemente incluyen, carbonato magnesico, dioxido de titanio, lactosa, manitol y otros azucares, talco, protema de leche, gelatina, almidon, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales y vegetales, polietilenglicoles y disolventes tales como agua esteril, alcoholes, glicerol, y alcoholes politudricos. Los vetuculos intravenosos incluyen abastecedores de fluidos y de nutrientes. Los conservantes incluyen antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. Otros vehmulos farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas, excipientes no toxicos incluyendo sales, conservantes, tampones y similares, como se describe, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed. Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975) y The National Formulary XIV., 14a ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975).
El pH y concentracion exacta de los distintos componentes de la composicion farmaceutica se ajustan de acuerdo con la experiencia de rutina en la tecnica. Vease Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7a ed.).
Por ejemplo, y no a modo de limitacion, un vector retrovmco util en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular incluira una protema ENV anfotropica, protemas GAG y POL, una secuencia promotora en la region U3 del genoma retrovmco, y todas las secuencias cis-actuante necesarias para la replicacion, empaquetamiento e integracion del genoma retrovmco en la celula diana.
Los siguientes Ejemplos tienen la intencion de ilustrar, pero no limitan la divulgacion.
Ejemplos
Ejemplo 1. Modificacion del armazon del vector de pACE-GFPemd en pAC3-GFPemd e insercion de secuencias del gen de citosina desaminasa en lugar de GFP
El armazon previo del plasmido Pace-GFPemd (documento US6899871, Wang et al. Hum Gene Ther 14:1172003) se modifico de tres maneras como se muestra en la Figura 3E. Las modificaciones se hicieron por mutagenesis dirigida de oligonucleotido mediado por PCR (Logg et al., J. Mol Biol 369: 1214, 2007; vease tambien "Molecular Biology and Biotechnology" Eds. J M. Walker, R.Rapley, Royal Society of Chemistry, London RU, 2000). Se hicieron las siguientes modificaciones. 1) La secuencia de acido nucleico en la region p15 en el extremo 3' del gen env anfotropico se derivaba originalmente de la envoltura ecotropica - esta secuencia se sustituyo por la secuencia correspondiente de la envoltura 4070 A anfotropica; los aminoacidos de la envoltura son identicos en las dos construcciones. 2) la secuencia IRES del extremo 3' se modifico para permitir una insercion mas facil de transgenes de eleccion con la insercion de un sitio Pstl1 y pequenas repeticiones imperfectas en el extremo del sitio del transgen IRES se retiro. 3) la secuencia vmca residual corriente abajo de la LTR 3' se retiro. El plasmido resultante pACE-emdGFP (tambien conocido como pACE-GFP, pACE-eGFP y T5.0006) se utilizo como una base para los vectores que codifican la citosina desaminasa y variantes. Se utilizaron inicialmente dos metodos de insercion de los casetes de la secuencia codificante. El primer metodo resultaba en la secuencia 5'TTATAAT3', y el segundo en la secuencia 5'TTATAA3' inmediatamente corriente arriba del codon de inicio ATG. El segundo metodo era mas simple, ya que implica cortes simples con las enzimas Pstl1 y Not1 en el vector y los genes de la citosina desaminasa sintetica, seguida por empalme. Los vectores con inserciones de citosina desaminasa se hicieron de ambas maneras con las secuencias codificantes CDopt (CD1) y el CDopt+ept (CD2) (vease la Figura 2) y se hicieron y se hicieron las preparaciones de virus infecciosos portransfeccion transitoria de celulas 293T como se describe en el Ejemplo 3. Las celulas U87 se infectaron entonces en el cultivo, con una MOI de 0',1 y las celulas se cultivaron hasta el 100 % de infectadas. Los extractos celulares de las celulas 100 % infectadas se ensayaron en cuanto a la actividad de citosina desaminasa como se describe en el Ejemplo 6 y se descubrio que la actividad espedfica de la enzima era equivalente para las construcciones con la secuencia corriente arriba, que de otra manera eran identicas. Por lo tanto, en la tabla de la Figura 2, pACE-eGFP (T5.0006) y pACE-YCD (T5.0007) tienen la primera secuencia corriente arriba, mientras que todas las demas construcciones que se ensayaron adicionalmente teman la segunda. Posteriormente los vectores con diferentes inserciones geneticas se habfan construido rutinariamente con cortes directos Pstl 1 y Not1.
Vease la Figura 3A posteriormente para un diagrama de la construccion del vector para el retrovirus competente en replicacion transfectado inicial. CMV es el promotor temprano inmediato de CMV humano, U3, R y U5 son las regiones correspondientes de la repeticion terminal larga (LTR). Gag, pol y env son las regiones vmcas que codifican las protemas. La Figura 3B y 3D muestran la estructura del plasmido y una secuencia de la divulgacion.
El vector de la divulgacion proporciona varias diferencias en comparacion con el vector de Tai et al., Mol. Ther.
12:842, 2005. El vector de Tai et al., se ha alterado para eliminar aproximadamente 70 pb de la secuencia corriente arriba de la secuencia MLV de la LTR 3'. La secuencia de ADN corriente arriba del sitio Clal en la envoltura se cambio por una secuencia de envoltura anfotropica. Este cambio no cambia la secuencia de aminoacidos de la envoltura. Ademas, las pequenas repeticiones en cada lado del casete IRES-cd se han eliminado para evitar la inestabilidad debida a recombinacion homologa. Estos cambios tambien proporcionaban inesperadamente una estabilidad aumentada del vector durante la replicacion y el pasaje en celulas huesped (Figura 5).
Se reconoce que despues de la transcripcion inversa y el primer evento de integracion en las celulas tratadas, el provirus ADN y cualquier progenie de retrovirus posterior tiene una estructura de la LTR convencional de MLV en cada extremo. Se ha demostrado que esta configuracion es estable despues de multiples ciclos de infeccion (Vease la Figura 5 posteriormente).
Ejemplo 2 Aumentos geneticos del gen de citosina desaminasa en una levadura de tipo silvestre
Se hicieron dos conjuntos de cambios: (1) tres mutaciones posicionales que cambian tres aminoacidos (A23L, I140L y V108I) para aumentar la estabilidad termica de la citosina desaminasa proteica de levadura y (2) modificaciones adicionales en la secuencia genetica para aumentar el uso de las secuencias humanas de uso del codon para mejorar la eficacia de traduccion proteica en las celulas humanas sin cambios adicionales de la secuencia de aminoacidos.
La secuencia disenada para CD inclrna el CD optimizado, CD-UPRT (+/- enlazador). La secuencia codificante de citosina desaminasa final puede comprender en el extremo 5' un sitio PSI1 (de longitud completa) y un sitio Not1 en el extremo 3' mas una cola poliA para la estrategia basada en el casete PSI1/Not1. Las secuencias de los casetes se ordenaron y se proporcionaron por un proveedor comercial (BioBasic Inc., Markham, Ontario, Canada).
La siguiente secuencia que comprende la citosina desaminasa de levadura se utilizo para la clonacion, optimization y mutation (los acidos nucleicos encuadrados comprenden los sitios de restriction Psi1 y Not1 utilizados posteriormente en los metodos para la clonacion:
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La siguiente Tabla resume los genes y los vectores plasmidos que se produjeron y sus nombres.
Tabla: Construcciones de vector sus nombres
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El vector retrovrnco competente en replication descrito por Kasahara et al. pACE-CD (Patente de EE. UU. N.° 6.899.871) se utilizo como base para modificaciones adicionales. Se modifico un vector (pAC3-yCD) para que expresara un gen de citosina desaminasa de levadura como se ha descrito en el presente documento y se utilizo en las construcciones. Vease la Figura 3A posteriormente para un diagrama de la construction del vector para el retrovirus competente en replicacion transfectado inicial. CMV es el promotor temprano inmediato de CMV humano, U3, R y U5 son las regiones correspondientes de la repetition terminal larga vrnca. Gag, pol y env son las regiones codificantes de las protemas vrncas. La Fig. 3B y 3D muestran la estructura del plasmido y una secuencia de la divulgacion.
Despues de que se sintetizaran los genes en el proveedor (Bio Basic Inc., Markham, Ontario, Canada) se insertaron en el sitio Psi1-Not1 del armazon del vector pAC3 (Figura 3). El armazon del plasmido se genero normalmente cortando el plasmido pAC3-eGFP con Psi1 y Not1 y la purification del fragmento grande (aproximadamente 11 kb) que codifica el armazon retrovrnco y el plasma.
A. Gen CD con el codon humanizado optimizado (CDopt, tambien denominado CD1, T5.0001) Una comparacion de la citosina desaminasa con codon humano optimizado de Conrad et al., y el documento PCT WO 99/60008 indica 91 codones optimizados totales en ambos, 36 codones identicos, 47 codones tema cambios en el tercer par de bases (todos codifican el mismo aminoacido) y 9 codones eran diferentes (sin embargo, codificaban el mismo aminoacido). De los 9 codones que eran diferentes:
AGC (Ser) a TCC (Ser)
CGT (Arg) a AGG (Arg)
CCA (Pro) a CCT (Pro)
Todos teman un contenido en GC equivalente y codifican el mismo aminoacido. Se optimizo el codon de la secuencia genetica nativa de levadura anterior por separado para dar el siguiente gen CD (CD1) y se llamo T5.0001 cuando se inserto en el vector plasmfdico pAC3 que codifica el retrovirus competente en replicacion (RCR) con IRES.
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B. gen CD termoestabilizado. Se hicieron modificaciones adicionales para aumentar la estabilidad de la citosina desaminasa. Se hicieron aumentos geneticos del gen de desamina citosina de levadura de tipo silvestre para incluir tres mutaciones posicionales que cambian tres aminoacidos (A23L, I140L y V108I) para aumentar la estabilidad termica de la citosina desaminasa proteica de levadura.
Se utilizaron los siguientes pares de cebadores en la generacion del gen para el polipeptido de citosina desaminasa de la divulgacion.
Cebadores de mutagenesis dirigida al sitio: Cebadores en sentido 5'-tcgaggatatcggcgagtgaaacccgttattctttttggc-3' (SEQ ID NO:33) Cebadores antisentido: 5'-gccaaaaagaataacgggtttcactcgccgatatcctcga-3' (SEQ ID NO: 34) Cebador en sentido:
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Cebador antisentido:
Figure imgf000030_0003
Para aumentar la estabilidad de la CD proteica de levadura nativa, se realizaron tres sustituciones de aminoacidos en la protema. Estas sustituciones eran solas o en combinacion con optimizacion del codon humano.
Las tres sustituciones de aminoacidos son: A23L, V108I, I140L. Una secuencia codificante de estas sustituciones se muestra posteriormente.
Figure imgf000031_0001
El polipeptido codificado comprende la siguiente secuencia (los aminoacidos sustituidos estan subrayados):
Figure imgf000031_0002
El diseno de la construccion final que integra las tres sustituciones de aminoacidos A23L/V108I/I140L que utiliza los codones preferidos y utiliza el uso de codon humano preferido para la secuencia completa (este gen se llamo CDopt+3pt [tambien llamado CD2] (SEQ ID NO: 37):
Figure imgf000031_0003
y T5.0002 cuando se inserta en el vector plasmfdico pAC3 que codifica el RCR con IRES. Los codones subrayados senalan los codones preferidos para las sustituciones de aminoacidos.
El alineamiento de secuencia de traduccion proteica indica los cambios preferidos de codon y las sustituciones de aminoacido resultan en la estructura proteica deseada:
Diseno de secuencia CD optimizada (preferencia de codon humano 3 sustituciones de aminoacidos)
Figure imgf000031_0004
C. Construccion del gen de fusion CD-UPRT (CDopt+3pt-UPRT, [tambien llamado CDopt-UPRT y CD2-UPRT], T5.0003 en el plasmido pAC3 del vector RCR). Tambien se desarrollo una construccion de fusion que comprende un polipeptido CD como se ha descrito anteriormente unido a un polipeptido UPRT para generar una secuencia CD optimizado UPRT utilizando el Esquema I como se expone en la Figura 10A. Se utilizaron los siguientes cebadores para eliminar la parada-inicio entre el CD y UPRT.
Secuencias de cebador:
Figure imgf000031_0005
Figure imgf000032_0002
El polinucleotido de fusion resultante comprende 1296 pb y la secuencia expuesta inmediatamente a continuacion:
Figure imgf000032_0001
D. Construccion de un gen de fusion CD-enlazador-UPRT (CDopt+3pt-enlazador-UPRT [tambien llamado CDoptenlazador-UPRTI Se desarrollo tambien una construccion de fusion clonando un dominio de enlazador (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4 entre y en fase con el polipeptido CD y el polipeptido UPRT para generar una secuencia CD optimizadoenlazador-UPRT utilizando el Esquema II como se representa en la Figura 10B. Se utilizaron los siguientes cebadores para insertar el enlazador.
Figure imgf000032_0003
Figure imgf000033_0002
La construccion resultante tiene un tamano de: 1356 pb y la secuencia inmediatamente a continuacion:
Figure imgf000033_0001
E. Construccion del gen de fusion CD-OPRT (CDopt+3pt-OPRT Ttambien llamado CDopt-OPRT y CD2-OPRT1, T5.0004 cuando se inserta en el plasmido pAC3 del vector RCR). Tambien se desarrollo una construccion de fusion que comprende un polipeptido CD como se ha descrito anteriormente a un polipeptido OPRT para generar una CD optimizado-OPRTasa (dominio humano de CD humanizado+ mutacion 3pt OPRTasa funcional) utilizando el Esquema III como se muestra en la Figura 10C. La construccion resultante comprende un tamano de 1269 pb y la secuencia inmediatamente abajo:
Figure imgf000034_0001
F. Construccion del gen de fusion CD-enlazador-OPRT (CDopt+3pt-enlazador-OPRT, [tambien llamado CDoptenlazador-OPRT], T5.0005 en el plasmido pAC3 del vector RCR). Tambien se desarrollo una construccion clonando un dominio de enlazador ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4) entre y en fase con el polipeptido CD y el polipeptido OPRT para generar una secuencia CD optimizado-enlazador-OPRT utilizando el Esquema IV como se muestra en la Figura 10D.
La construccion resultante comprende un tamano de 1329 pb y la secuencia inmediatamente a continuation:
Figure imgf000034_0002
La Figura 4 demuestra que se observaban niveles mas altos del codon optimizado humano con las tres mutaciones para una mayor estabilidad en comparacion con una protelna yCD detipo silvestre en celulas T-87 infectadas.
Ejemplo 3. Produccion de vector por transfeccion transitoria
El vector se puede producir de varias maneras, pero la primera etapa es introducir el vector ADN en celulas para permitir la produccion de partlculas infecciosas, que se pueden recolectar del sobrenadante celular. Una vez que se han generado las partlculas infecciosas se pueden implementar otros metodos de produccion por los expertos en la tecnica. Las parriculas de vector se generaron por transfeccion transitoria de celulas 293T (Pear et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:8392-83961993).
Las celulas 293T se descongelaron y se pusieron en un medio de cultivo, entonces se pasaron dos veces en matraces T-75 que conteman 15 ml de medio DMEM que se preparo mezclando medio DMEM alto en glucosa (Hyclone n° 30081, 500 ml) con FBS (Hyclone n° SH30070, 50 ml), L-glutamina (Cellgro n° 25-005-Cl, 5 ml), NEAA (Hyclone n° SH30238, 5 ml), y penicilina-estrep. (Cellgro n° 30-002-Cl, 5 ml). Los matraces se incubaron a 37 °C y un 5 % de CO2. Despues del 3° pasaje se sembraron las celulas en 6 T-25, que contema cada uno 5 ml de medio, a una densidad celular de 1,8 x 106 celulas/T-25 (o 7,2 x 104 celulas/cm2). Un dfa despues de la siembra en los T-25, las celulas se transfectaron con el plasmido T5.0002 que expresaba el vector vftico utilizando el kit de transfeccion con fosfato calcico de Promega (Cat n° E1200). Dieciocho horas despues de la transfeccion, los medios de un conjunto de matraces (de 3 matraces cada uno) se remplazaron como medio nuevo que contema 10 mM de NaB. Los medios en el 2° conjunto de matraces no se remplazaban, sirviendo como control (cero NaB). Ocho horas despues del tratamiento con NaB, los medios de todos los matraces se remplazaron con el medio nuevo que no contema NaB. Se permitio que continuara la expresion para ambos conjuntos de matraces desde el dfa siguiente (de 22 horas de duracion). Los sobrenadantes de ambos conjuntos de matraces se recolectaron y ensayaron en cuanto a sus tftulos por qPCR expresado en Unidades de Transduccion (UT)/m (vease el Ejemplo 4).
Los resultados de tftulos se muestran en la siguiente tabla.
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Las preparaciones de vector posteriores se produjeron de esta manera, sin butirato sodico. Se han utilizado otros vectores plasmidos (Tabla 2) de la misma manera para generar las preparaciones de vector con tftulos entre 1E5 UT/ml y 1E7 UT/ml. Dicho material se puede purificar y concentrar adicionalmente, si se desea, como se describe posteriormente, vease tambien el documento US 5792643; T. Rodriguez et al. J Gene Med 9:2332007; Solicitud de EE. UU. 61218063.
En ciertos aspectos de la divulgacion, la dosificacion se calculo por gramos de peso cerebral. En dichos aspectos, la dosificacion de un vector retrovrnco competente en replicacion de la divulgacion util en los metodos para el tratamiento puede variar de 104 a 106 UT por gramo de peso cerebral.
Ejemplo 4. Ensayo de titulacion por PCR cuantitativa
La concentracion de vector funcional, o tftulo, se determina por un metodo basado en una PCR cuantitativa (qPCR). En este metodo, el vector se titula infectando una lrnea celula huesped que se pueda transducir (por ejemplo, celulas PC-3 de carcinoma prostatico humano, ATCC Cat n° CRL-1435) con un volumen convencional de vector y midiendo al cantidad resultante de provirus presente en las celulas huesped despues de la transduccion. Las celulas y el vector se incuban en condiciones de cultivo convencionales (37 °C, un 5 % de CO2) durante 24 h para permitir la infeccion completa antes de la adicion del anti-retrovmco AZT para parar la replicacion del vector. A continuacion, las celulas se recolectan de la placa de cultivo y se purifica el ADN genomico (ADNg) utilizando un kit de purificacion de ADNg Purelink de Invitrogen y se eluye de la columna de purificacion con agua esteril libre de RNasa/DNasa. Se mide la relacion de absorbancia A260/A280 en un espectrofotometro para determinar la concentracion y pureza relativa de la muestra. Las concentraciones de ADNg se normalizan con agua libre de RNasa/DNasa a la concentracion mas baja determinada de cualquiera de los conjuntos de preparaciones de ADNg tal como el ADN de entrada para la qPCR que es constante para todas las muestras analizadas. La pureza del ADN genomico se evalua adicionalmente por electroforesis de una aftcuota de cada muestra en un gel de agarosa al 0,8 % tenido con bromuro de etidio. Si la muestra pasa un intervalo de absorbancia A260/A280 de 1,8-2,0 y muestra una unica banda de ADNg, entonces la muestra esta preparada para el analisis por qPCR del numero de copias del vector. Utilizando los cebadores que interrogan la region LTR del provirus (ADN del vector transcrito inverso y ADN del vector que se integra en el ADNg del huesped), se lleva a cabo la qPCR para estimar el numero total de eventos de transduccion que se producen cuando se utilizo un volumen conocido de vector para transducir un numero conocido de celulas. El numero de eventos de transduccion por reaccion se calcula a partir de una curva de referencia que utiliza un plasmido que alberga una diana con un numero de copias conocido se diluye en serie desde 107 a 10 copias y se midio en identicas condiciones de qPCR que las muestras. Sabiendo como se utilizaron muchos equivalentes genomicos para cada reaccion qPCR (a partir de la concentracion determinada previamente) y como se produdan muchos eventos por reaccion, los inventores determinaron el numero total de eventos de transduccion que se produdan basandose en el numero total de celulas que estaban presentes en el momento de la transduccion. Este valor es el tftulo del vector despues de la dilucion en el medio que contema las celulas durante la transduccion inicial. Para calcular el valor de tftulo corregido, la dilucion se corrige multiplicandolo por el volumen de cultivo y el volumen del tftulo dividido por el volumen de tftulo. Estos experimentos se llevaron a cabo en cultivos replicados y se analizaron por qPCR utilizando mediciones por triplicado para cada condicion para determinar un tftulo medio y con su desviacion ftpica asociada y el coeficiente de varianza.
Ejemplo 5. Ensayo del vector
Con el fin de que sean eficaces, las construcciones de vector y sus partmulas infecciosas derivadas tienen que: 1) tener un buen tftulo de virus por transfeccion transitoria (vease los ejemplos 3 y 4); 2) ser estable en multiples pasajes; 3) destruir eficazmente celulas en presencia de 5-FC; y 4) expresar actividad enzimatica al infectar celulas diana. El Ejemplo 3 muestra que se pueden obtener tftulos utiles de los vectores.
Estabilidad genetica de los vectores. Para demostrar la estabilidad, se llevo a cabo el siguiente experimento. Se infectaron inicialmente aproximadamente 106 celula U-87 intactas con el vector vftico a una MOI de 0,01 y se cultivaron hasta que se infecto completamente para completar un unico ciclo de infeccion. El sobrenadante se volvio a pasar entonces en celulas no infectadas y se repitio el ciclo. En este experimento, se completaron doce ciclos en ensayos por duplicado (la Figura 5 muestra uno de cada uno de los ensayos por duplicado los otros duplicados dieron resultados similares). La estabilidad genomica de la secuencia de yCD2 y otros transgenes se evaluaron por amplificacion por PCR del provirus integrado a partir de las celulas infectadas utilizando cebadores espedficos de MLV flaqueando el sitio de insercion del transgen. La aparicion de cualquier banda menor que el amplicon de longitud completa sena un indicador de inestabilidad del vector. La Figura 5 demuestra que un vector de la divulgacion (T5.0007 - que comprende el vector modificado y un polinucleotido heterologo CD) mantiene la estabilidad durante mas pasajes que pACE-CD. Ademas, el T5.0003 es de alguna manera menos estable, mientras que T5.0004 y T5 parecen aproximadamente tan estables como pACE-CD. El pACE-CD se ha utilizado en estudios de tumores en raton y muestra buenos efectos antitumorales en modelos de raton. Sin embargo, un genoma vftico mas estable sera mucho mas potente y duradero en el tratamiento de animales y seres humanos, especialmente si son necesarios multiples ciclos de 5-FC. Tanto T5.0001 y T5.0002 son marcadamente mas estables que el T5.0007, demostrando que los cambios silentes en una secuencia codificante de una protema o pequenos cambios que dan como resultado mutaciones puntuales pueden dar lugar a propiedades inesperadamente superiores con genomas de vector mas estables.
Experimentos de destruccion celular. El ensayo de proliferacion en solucion acuosa uno CellTiter 96 (MTS) es un metodo colorimetrico para la determinacion del numero de celulas viables en ensayos de proliferacion. Los inventores han utilizado este ensayo para determinar la cinetica de crecimiento celular, asf como para determinar la respuesta a la dosis de distintas lmeas celulares a la 5-Fluorocitosina (5-FC) y 5-Fluorouracilo (5-FU).
Las celulas infectadas 100% con el vector se sembraron a 1000 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos. Se controlaron durante un periodo de ocho dfas despues del tratamiento con distintas concentraciones de 5-FC (5-FU para los controles). Se evaluo un analisis de su crecimiento celular cada dos dfas utilizando la solucion acuosa uno CellTiter 96 de Promega (MTS). En resumen, 20 pl de MTS se mezclo con 100 pl de medio (como se recomienda por el fabricante) y se anade a las muestras en la placa de 96 pocillos. Las muestras se incubaron durante 60 minutos en una incubadora a 37 °C/un 5 % de CO2. A continuacion, se tomaron las lecturas de la absorbancia en una lector de placas a una longitud de onda de 490 nm. Las placas entonces se desecharon.
La Figura 6A muestra los resultados de un experimento que demuestra que la citosina desaminasa en las celulas que expresan la protema yCD2 es al menos tan activo como la de las celulas que expresan la protema yCD de tipo silvestre, llevando a cabo titulaciones de 5-FC en celulas U-87 infectadas con AC3-yCD2 (vector) o AC3-yCd (vector). En resumen, las celulas U-87 5 dfas despues de la infeccion a una multiplicidad de infeccion de 0,1 (es decir, infectadas al 100 %) con el vector AC3-yCD (CD de tipo silvestre) o el vector AC3-yCD2 (termoestabilizado y con el codon optimizado) se sometieron a cantidades crecientes de 5-FC o 0,1 mM de 5-FU como control positivo durante 8 dfas. El dfa 8, los cultivos celulares se evaluaron en cuanto a la viabilidad utilizando un ensayo MTS (ensayo de proliferacion en solucion acuosa CellTiter 96 de Promega). Los datos muestran la destruccion comparada entre los vectores retrovfticos con dosis crecientes de tratamiento con 5-FC.
En experimentos de cultivo celular in vitro similares con celulas RG2 (ATCC Cat n° CRL-2433), la lmea celular RG2 se transdujo con 5 vectores diferentes (pACE-CD, T5.0001, T5.0002, T5.0004, y T5.0007). Posteriormente se sometio a concentraciones crecientes de 5-FC (5-FU para los controles) durante 8 dfas y se controla como se describio anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 2. Las concentraciones de 0,01 mM fueron suficientes para inducir la destruccion completa con todos los vectores ensayados con la excepcion de la citosina desaminasa de levadura de tipo silvestre (pACE-YCD). Era menos sensible y necesitaba 1.0 mM de 5-FC para la destruccion completa.
Ensayo de expresion CD. Se transdujeron celulas U87 a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 0,1, se cultivaron durante 5 dfas para permitir la diseminacion vftica y las celulas desde el dfa 5 despues de la transduccion se recolectaron. Las celulas se recolectaron entonces por centrifugacion a 800 x g durante 5 min. El sobrenadante se aspiro del aglomerado celular y se lavo con 5 ml de solucion salina tampon fosfato (PBS) y se centrifugo de nuevo a 800 x g durante 5 min. El aglomerado celular resultante se llevo hasta 1,5 ml con PBS, se resuspendio con un pasaje a traves de una punta de pipeta y se coloco en un frigonfico a -20 °C. Las celulas se lisaron por el metodo de congelacion/descongelacion. Las celulas suspendidas previamente se dejaron descongelar a temperatura ambiente, se pasaron a traves de una punta de pipeta, se mezclaron con un coctel inhibidor de proteasa y de nuevo se congelaron a -20 °C. Antes del ensayo enzimatico, la muestra se descongelo de nuevo a temperatura ambiente y se paso a traves de una punta de pipeta. La suspension se centrifugo entonces a 14.000 rpm en una centnfuga de mesa durante 5 min. El sobrenadante se decanto del aglomerado y se coloco en un tubo de Eppendorf nuevo y se coloco en hielo.
Se evaluo la actividad de la enzima yCD utilizando un ensayo HPLC. El ensayo HPLC se llevo a cabo en una unidad Shimadzu LC20AT conectada en serie con un detector Photoarray y un autoinyector. La fase solida era una columna de HPLC Hypersil BDS C18 con un tamano de esfera de 5 pm y dimensiones de columna de 4,0 x 250 mm. La fase movil era 50 mM de fosfato amonico, pH 2,1, que contema un 0,01 % de perclorato de tert-butilamonio y un 5 % de metanol; el sistema se equilibro a 22 °C. Todos los reactivos teman una calidad ACS y los disolventes eran de calidad HPLC. Se hizo una mezcla de reaccion consistente en 800 pl con una concentracion final de 0,125 mg/ml de 5FC (1 mM) en PBS y se colocaron en un vial automuestreo de 1,5 ml. La reaccion se inicio entonces anadiendo 200 ul de cada lisado celular. Los viales de reaccion/automuestreo se colocaron en el automuestreador y se inyectaron 5 ul de la mezcla de reaccion. Se tomaron puntos temporales periodicamente recuperando una aftcuota de 5 ul de cada vial de reaccion y se analizaron en la columna de HPLC. Se calcularon las tasas de conversion de 5 FC en 5FU comparando las areas del pico con una curva de referencia con cantidades conocidas de 5FU generada anteriormente. La tasa de conversion de FC en FU se derivo representando la cantidad de 5 FU (en nmol) generada frente a su intervalo de tiempo correspondiente. La concentracion proteica para la muestra celular se derivo y se calculo la actividad espedfica de las muestras de lisado celular dividiendo la tasa de conversion (nmol/min9 por la cantidad de protema utilizada en el ensayo en mg. La Figura 6B muestra la actividad espedfica de distintas vectores despues de 5 dfas de la transduccion con una MOI de 0,1. Los datos demuestran que pACE-YCD (T5.0000) < pAC3-YCD1(T5.0001) <pAC3-CD2 (T5.0002) en terminos de actividad espedfica de citosina desaminasa en las celulas del cultivo celular.
Ejemplo 6 Purificacion y concentracion del vector
Un vector de la divulgacion se fabrico por transfeccion transitoria en celulas 293T (Ejemplo 3), seguido por recoleccion del sobrenadante celular, se filtro, se trato con benzonasa, se diafiltro/concentro y se dializo. Se puede incluir una etapa adicional en una columna de cromatograffa, conocida por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, el documento US5792643; T. Rodriguez et al. J Gene Med 9:2332007; Solicitud de EE. UU. 61218063). El material clmico se libera basandose en ensayos convencionales tales como de esterilidad, micoplasmas y endotoxinas, mas potencia espedfica del producto, fuerza y ensayo de identidad. El tftulo se determina en Unidades de transduccion (UT) por PCR de cuantificacion de ADN del vector vftico integrado en las celulas diana (Ejemplo 4). El producto final se dirige para tener un tftulo de hasta 109 UT/ml formulado en solucion de sacarosa con tampon Tris isotonico, como un inyectable esteril.
En general, para determinar con precision y exactamente la fuerza de los lotes de vectores, se ha desarrollado un ensayo de tftulo basado en PCR (descrito en terminos generales en el Ejemplo 4). Los detalles del procedimiento de ensayo consisten en las siguientes etapas:
Transduccion: Las transducciones se llevaron a cabo en un formato de placas de 12 pocillos utilizando una lrnea celular PC-3 estable derivada de adenocarcinoma de prostata humano. Para cada muestra de ensayo se utilizaron tres diluciones de preparacion de vector sin titular para transducir las celulas PC-3 en pocillos por triplicado. La replicacion vftica se detuvo a las 24 horas despues de la transduccion con azidotimidina (AZT). Las celulas se mantuvieron unas 24-64 horas adicionales antes de la recoleccion y purificacion del ADN genomico.
Preparacion de ADN genomico. Se utilizo el minikit de ADN DNeasy de Qiagen para preparar el ADN genomico a partir de celular transducidas recolectadas segun el protocolo del fabricante. Las concentraciones de ADN y la calidad se evaluaron por medicion de absorbancia directa utilizando espectrometna UV/vis para determinar la A260 y la relacion A260/A280.
PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizo un instrumento PCR en tiempo real BioRad CFX96 o equivalente para llevar a cabo la PCR cuantitativa. Se mide el numero de copias del pro-vector en cada muestra de ensayo utilizando oligonucleotidos cebadores de ADN espedficos en conjuncion con una sonda Taqman disenada para amplificar el paquete U3/Psi integrado o pro-retrovmco frente al promotor plasirftdico CMV/Psi. El tftulo del vector se expreso en relacion a una curva de numero de copias de referencia. Para generar la curva de referencia de numero de copias, se vertio el ADN genomico de las celulas PC-3 con un unico plasmido que conteman la secuencia U3/Psi proretrovmca. Los tftulos del vector de ensayo se obtuvieron calculando el numero de genomas transducidos en multiples diluciones utilizando multiples reacciones por dilucion.
Para cada evaluacion de tftulo, se llevo a cabo por triplicado un control sin armazon (pocillos que conteman todos los componentes excepto el ADN plasirftdico o genomico) y un control negativo (todos los componentes incluyendo el ADN genomico equivalente de celulas PC-3 no transducidas). Los valores del tftulo se expresaron en unidades de transduccion por mililitro (UT/ml).
La potencia del vector de la divulgacion depende de la replicacion del vector y la actividad de la citosina desaminasa (CD) resultante en las celulas diana. Por lo tanto, el ensayo de potencia mide el aumento de actividad CD a lo largo del tiempo segun se disemina la infeccion del vector en una lmea celular previamente no infectada en un cultivo tisular. El ensayo mide la actividad enzimatica de la protema yCD2 transferida en celulas transducidas durante los estadios temprano, medio y tardfo de la infeccion controlando la conversion de 5-fluorocitosina (5-FC) en 5-fluorouracilo (5-FU), utilizando una separacion por HPLC de fase inversa con deteccion por UV. El aumento de actividad de CD a lo largo del curso de la infeccion es una puncion del porcentaje de celulas infectadas a lo largo del tiempo es indicativo de la capacidad del vector TOCA 511 para replicarse. La actividad de CD basada en la tasa de conversion de 5-FC a 5-FU se mide para cada momento en unidades de CD por mg de protema (la actividad espedfica, AE). El aumento de AE entonces se representa a lo largo del tiempo, y se refleja tanto el aumento de porcentaje de celulas transducidas como un resultado de la replicacion vmica en el cultivo, y la transferencia resultante de la actividad de CD. Los datos acumulados de los multiples ensayos y los lotes de vector se han utilizado para determinar una especificacion apropiada para este aumento en la EA de CD, para la liberacion de producto. El ensayo tema puntos temporales de 1, 3 y 5 dfas despues de la infeccion inicial a una MOI de aproximadamente 0,1 y un control no infectado.
La actividad de CD de las celulas infectadas en estadio tardm (punto temporal de 5 dfas) se comparo entre los lotes para evaluar el uso de esta actividad segun un ensayo de identidad. En ensayo incluye las siguientes etapas:
Transducciones. Las transducciones se llevaron a cabo en un formato multipocillo en celulas U87. Para cada transduccion, se utilizaron tres diluciones adecuadas y cada una se llevo a cabo por triplicado. Las celulas se recolectaron a los 0, 1, 3 y 5 dfas despues de la transduccion.
Realizacion de la reaccion de CD. Las celulas se lisaron y se determino la concentracion total de protema utilizando el ensayo de protema BCA utilizando el BSA como referencia. Para el ensayo de la enzima yCD2, se anadio una cantidad apropiada del lisado celular a un tampon que contema 5-FC de manera que la tasa de formacion de 5-FU se mantiene lineal durante 1-2 horas a 37 °C. El volumen final de la mezcla de reaccion es de100 pl. Despues de 2 h, la reaccion enzimatica se termina por adicion de acido cloroacetico, en resumen, se remueve y prepara para los analisis de HPLCA posteriores. Los lisados celulares de celulas no transducidas se utilizan como control negativo mientras que se utiliza un ensayo similar utilizando muestras de celulas infectadas al 100 % como control positivo.
Analisis de HPLC. La mezcla de reaccion terminada se centrifuga a 12.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente en una microcentnfuga. El sobrenadante se decanta del aglomerado y se pasa a traves de un filtro de 0,2 pm para retirar adicionalmente las partmulas antes de la inyeccion en una columna de HPLC de fase inversa previamente equilibrada con una fase movil de base acuosa que contiene tampon fosfato a un pH alrededor de 4,0. Los cromatogramas se siguen a 260 nm y 280 nm para controlar tanto el consumo del sustrato como la formacion de producto. Las concentraciones de sustrato o producto se determinan utilizando la graficacion y capacidades del analisis en GraphPad comparandolas con las curvas de referencia generadas previamente calculadas a partir de concentraciones de sustrato o producto conocidas. Las cantidades de 5-FU generadas en 1-2 h se utilizan para determinar las unidades CD de actividad (1 unidad de actividad CD se define como la formacion de un nmol de 5-FU por min) y se calcula la actividad espedfica dividiendo este numero por la cantidad de protema (del lisado celular) utilizado en el ensayo.
Ejemplo de referencia 7 Construccion y uso de un vector que codifica un anticuerpo de cadena sencilla contra CTLA-4 (CD 152)
Los anticuerpos de cadena sencilla se derivan de secuencias de anticuerpo completos conocidas que tiene un efecto deseado. Dichas secuencias estan disponibles (por ejemplo, documentos WO2006048749, US2006165706, US7034121, numeros de registro en el GenBank DJ437648, CS441506, CS441500, CS441494, CS441488). Dichas secuencias de genes de anticuerpo convencionales se convierten en secuencias de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) por metodo que se utilizan comunmente conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Gilliland et al. "Rapid and reliable cloning of antibody variable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments." Tissue Antigens 47, 1-20, 1996). Los anticuerpos de cadena contra CTLA-4 en fago tambien estan disponibles explorando bibliotecas de fagos-scFv directamente y se pueden utilizar directamente para la insercion en los vectores retrovmcos replicantes de la presente divulgacion (Pistillo et al. Tissue Antigens 55:229 2000). Independientemente de como se derive la secuencia los scFvtienen normalmente aproximadamente de 700­ 900 pb de longitud y se sintetizan por un proveedor comercial (BioBasic) con un sitio Psi1 en el extremo 5' y compatible con el sitio Not1 en el extremo 3', como se ha descrito previamente. Esta secuencia se inserta entonces en el armazon del retrovmco replicante de pAC3-YCD2 y los sitios Psi1-Not1 despues de retirar la secuencia yCD2. El vector se produce y se titula como se ha descrito, y se purifica adicionalmente si es necesario como se ha descrito anteriormente. El CTLA-4 humano y de raton son muy homologos en secuencia y el retrovirus replicante de la divulgacion se ensayo primero en modelos de raton inmunocompetentes singenicos adecuados tales como el modelo CT26/Balb/c y los modelos s91 de melanoma de raton, bien conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Hodge et al J. Immunol. 174:59942005). Se mide el resultado en cuanto a uno o mas de: modulacion del crecimiento tumoral; falta de toxicidad; generacion de respuestas antitumorales; contraccion de lesiones remotas indicando inmunidad sistemica. Las dosis estan en el intervalo de 103 a 107 UT en ratones. En pacientes el vector ese administra por inyeccion intralesional en el tumor, o por administracion en la circulacion que lleva el virus al tumor. Las dosis estan en el intervalo de 105 a 1011 UT.
Ejemplo de referencia 8. Estudios de eficacia anti-melanoma con un vector que expresa un anticuerpo de cadena sencilla anti-CD152 en un modelo de melanoma en raton
Objetivo
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un nuevo vector retrovmco competente en replicacion basado en MLV que tiene un anticuerpo de cadena sencilla dirigido contra el antigeno 4 de linfocitos T citotoxicos (CTLA-4) al que tambien se hace referencia como agrupamiento de diferenciacion 152 (CD152) secuencia (pAC3-aCD152) sobre el crecimiento, cuando se suministra por inyeccion via intratumoral (IT) en ratones DBA/2 que albergan un melanoma subcutaneo (Cloudman S91).
Ratones
Se adquirieron ratones DBA/2 hembras (edad ~ 8 semanas) en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los ratones se aclimataron durante 7 dfas despues de llegar antes de iniciar los estudios.
Celulas
Las celulas Cloudman S91 (ATCC, Manassas VA) son de un melanoma que aparece espontaneamente derivado de ratones DBA/2. Las celulas se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco con un 10 % de suero fetal bovino, piruvato sodico, y Glutamax (Hyclone, Logan UT, e Invitrogen, San Diego CA). Las celulas se resuspendieron en PBS (Hyclone, Logan UT) para la implantacion. Las celulas S91 (1E6 en 100 jl) se inyectaron en el flanco derecho de ratones DBA/2.
Vector
Las preparaciones de vector se hicieron por transfeccion transitoria (o a partir de una lmea celular productora en celulas HT1080, vease la solicitud de EE. UU.) con tttulos de aproximadamente 7E6 UT/ml. Para los estudios iniciales el vector no estaba purificado o concentrado adicionalmente. Para continuar con los experimentos para determinar las curvas de respuesta de dosis completa, se preparo un material purificado con alto tftulo con un tftulo esperado de alrededor de 10E8/ml. El vector se administra IT en un volumen de 50-100 j l e IV en 100 j l de dosis total/raton de aproximadamente 7E5 UT/raton. El vector que expresaba aCD152 se identifica con Toca aCD152. Implantacion del tumor e inyeccion del vector
Se implanto a cinco grupos de hembras DBA/2 (55 ratones, 9-10 semanas de edad) por via subcutanea con celulas de melanoma S91 (Dfa 0) y entonces se dosificaron (dfa 4-7 dependiendo de la tasa de crecimiento del tumor S91 aproximadamente 50-100 mm3) con un vehfculo (Grupos 1), con vector de control [AC3-GFP(V), (Grupo 2), inyeccion intratumoral (IT) con el vector Toca aCD152 (Grupos 3), o inyeccion por via intravenosa del vector Toca aCD152 (Grupo 4). Los ratones del grupo 5 no teman tumor implantado y se inyectaron por via intravenosa con Toca aCD152 solo.
Analisis de datos
Los analisis de crecimiento tumoral se llevaron a cabo hasta 2000 mm3 o a los 60 dfas basandose en el que llegara primero. 10 ratones de cada grupo se representaron en cuanto al tamano del tumor respecto al tiempo. Se determinara la significacion estadfstica utilizando el analisis de varianza (ANOVA). Los valores de P de < 0,05 se consideran estadfsticamente significativos en todos los analisis que se llevaron a cabo con el software estadfstico Prism 5 (software GraphPad) o equivalente. Se tomaron tambien observaciones en vivo para evaluar cualquier evento adverso la expresion de aCD152 durante el tratamiento.
Resultados
El suministro de aCD152 mediante el MLV replicante IT presenta un retraso estadfsticamente significativo del crecimiento en comparacion con los controles. El suministro de aCD152 mediante MLV por via intravenosa presenta un retraso estadfsticamente significativo en comparacion con los controles anula la carga de melanoma del modelo de raton DBA/2-Cloudman S91.
Se llevaron a cabo estudios adicionales en animales de la siguiente manera:
Ejemplo 9. El vector vrnco ACE- /CD2 es terapeutico en un xenoinjerto humano (U87) intracraneal en ratones desnudos
Se establecio un modelo de xenoinjerto intracraneal utilizando la lmea celular U87 de glioma humano para ensayar la diseminacion del vector RCR y su biodistribucion, asf como la eficacia terapeutica de la terapia genetica suicida con citosina desaminasa mediada por el vector RCR en un raton huesped desnudo.
A continuacion de la aclimatacion, se asignaron aleatoriamente los ratones a uno de los 8 grupos de tratamiento (vease la descripcion de los grupos posteriormente). Siete grupos se sometieron a la administracion intracraneal en el cuerpo estriado derecho de 1 x l05 celulas U87 administradas/raton el D^ a 0. A los ratones del grupo 8 no se les implanto tumor. El dfa 5, se inyecto a los ratones solo con la formulacion tampon, o con un vector RCR a 9 x 105/5 ul, 9 x 104/5 ul, o 9 x 103/ul. Los ratones que no recibieron vector, o el vector a 9 x 105/5 ul o 9 x 103/5 ul se distribuyeron aleatoriamente para que recibieran 5-FC 8500 mg/kg/dfa, administrado como una unica inyeccion IP, empezando el Dfa 19, o sin 5-FC. Los ratones que recibieron el vector con la dosis media recibieron todos 5-FC (es decir, no habfa un grupo de control separado para esta dosis). La administracion de 5-FC se continuo diariamente durante 7 dfas consecutivos seguido por 15 dfas sin tratamiento. Los ciclos de farmaco mas el descanso se repitieron hasta 5 ciclos. 10 ratones de cada grupo excepto del grupo 8 se asignaron aleatoriamente a la categona de ensayo de supervivencia. El resto de los ratones se sacrificaron de acuerdo con una programacion predeterminada.
Asignacion de grupos y niveles de dosis
Figure imgf000040_0001
La dosificacion intravenosa se hizo mediante inyeccion en la vena caudal. La dosificacion intraperitoneal se hizo mediante inyeccion en el abdomen teniendo cuidado de evitar la vejiga. Para la inyeccion intracraneal, los ratones se anestesiaron con isofluorano y se posicionaron en un dispositivo estereotaxico con barras de orejas romas. La piel se afeita y se utiliza betadine para tratar el cuero cabelludo para preparar el sitio quirurgico. El animal se coloca en una manta electrica y se utiliza un bistun en condiciones esteriles para hacer una incision en la lmea media a lo largo de la piel. La retraccion de la piel y la reflexion de la fascia en el sitio de incision permite la visualizacion del craneo. Se inserta una canula grna con una proyeccion de 3 mm, provista de una tapa con una proyeccion de 3,5 mm, a traves de un agujero pequeno perforado en el craneo y se fija con cemento dental y tres pequenos tornillos al craneo. Despues de endurecerse el cemento, la piel se cierra con suturas. Las coordenadas estereotaxicas proyectadas son AP= 0,5-1,0 mm, ML = 1,8- 2,0 mm, DV = 3,0 mm. Las coordenadas estereotaxicas exactas para la cohorte de animales recibidos se determinaron en un experimento piloto (2-3 animales) inyectando un colorante y determinando su localizacion. Los animales se controlan durante la recuperacion de la anestesia. Se administran por via subcutanea analgesicos, buprenorfina, antes del final del procedimiento y luego la buprenorfina se administrara aproximadamente cada 12 h hasta 3 dfas. Los animales se controlaron a diario. Las celulas o el vector se infundieron por via intracraneal a traves de la canula de inyeccion con una proyeccion de 3,5 mm insertada a traves de la canula grna. La velocidad se controlo con una bomba de jeringa ajustada a una jeringa de Hamilton y un tubo flexible. Para la inyeccion celular se suministro un microlitro de celulas a un caudal de 0,2 microlitros por minuto (5 minutos en total). Para la inyeccion del vector, se suministraron 5 microlitros de vector a un caudal de 0,33 microlitros por minuto (15 minutos en total.
El vector se suministro y se calculo como unidades transformantes (UT) por gramo de peso de cerebro a los ratones. Utilizando dicho calculo se puede calcular la extrapolacion de dosis para otros mairnferos incluyendo los seres humanos. La Figura 8 muestra el efecto de la dosis de vector en este modelo de raton.
Ejemplo 10. El AC3-/CD2 (V) es terapeutico en un modelo de raton singenico de cancer cerebral
Se llevaron a cabo experimentos adicionales para demostrar los metodos y composiciones de la divulgacion en un modelo animal singenico.
Se establecio un modelo de implante intracraneal utilizando la lmea celular CT26 de cancer colorrectal en ratones BALB/c singenicos para ensayar la diseminacion y biodistribucion del vector RCR asf como la eficacia terapeutica de la terapia genetica suicida con citosina desaminasa mediada por el vector RCR y su impacto inmunologico.
Este estudio inclma 129 animales, 0 machos, 119 hembras y 10 animales de contingencia (10 hembras). Despues de la aclimatacion, los ratones se asignaron aleatoriamente a uno de los 8 grupos de tratamiento (vease la descripcion de grupos posteriormente). Siete grupos se sometieron a la administracion intracraneal en el cuerpo estriado derecho de 1 x 104 celulas CT26 administradas/raton el Dfa 0. A un grupo de ratones no se les implanto el tumor. El Dfa 4 se inyecto a los ratones formulacion tampon solo, o el vector a 9 x 105/ul, 9 x 104/ul, o 9 x 103/ul. Los ratones que no recibieron vector, o el vector a 9 x 105/ul o 9 x 103/ul se distribuyeron aleatoriamente para recibir 5-FC (500 mg/kg/BID), administrada por inyeccion IP, comenzando el Dfa 13, o no 5-FC. Los ratones que recibieron en vector a dosis media recibfan 5-FC (es decir, no hay un grupo de control separado para esta dosis). La administracion de 5-FC continuo a diario durante 7 dfas consecutivos seguido por 10 dfas sin tratamiento. Los ciclos de farmaco mas el descanso se repitieron hasta 4 ciclos. Se asignaron aleatoriamente 10 ratones de cada grupo excepto del grupo 8 a la categona de analisis de supervivencia. El resto de los ratones se sacrificaron de acuerdo a una programacion predeterminada.
Se co-alojaron ratones intactos centinelas con los animales programados para el sacrificio y se hizo lo mismo en los mismos puntos temporales para evaluar la transmision del vector mediante diseminacion.
A i n i n r niv l i
Figure imgf000041_0001
La dosificacion intravenosa se hizo mediante inyeccion en la vena caudal. La dosificacion intraperitoneal se hizo mediante inyeccion en el abdomen teniendo cuidado de evitar la vejiga. Para la administracion intracraneal, se utilizaron ratones con una canula grna con una proyeccion de 3,2 mm implantada en el cuerpo estriado derecho y provista con una tapa con una proyeccion de 3,7 mm. Las coordenadas estereotaxicas proyectadas eran AP= 0,51,0 mm, ML = 1,8-2,0 mm, DV = 3,2 mm (segun Bregma). Las celulas o el vector se infundieron porvfa intracraneal mediante la canula de inyeccion con una proteccion de 3,7 mm insertada a traves de la canula gma. Se controlo la velocidad con una bomba de jeringa ajustada con una jeringa de Hamilton y tubos flexibles.
Para la inyeccion celular, se suministro 1 microlitro de celulas a un caudal de 0,2 microlitros por minuto (5 minutos en total). Para la inyeccion del vector, se suministraron 5 microlitros de vector a una caudal de 0,33 microlitros por minuto (15 minutos en total).
El vector se suministro y se calculo en unidades de trasformacion (UT) por gramo de peso cerebral a los ratones. Utilizando dicho calculo, se puede calcular la extrapolacion de dosis a otros mairnferos incluyendo seres humanos. La Figura 9 muestra el efecto de la dosis de vector en este modelo de raton cuando se suministra el vector por via intracraneal.
Ejemplo 11. Construccion y ensayo de vectores RCR que expresan miR-128-1 y miR-128-2
A. Construccion de un vector retrov^rico recombinante competente en replicacion que contienen una secuencia de polinucleotido heterologa del pri-miARN-128-1 humano
El vector retrovmco competente en replicacion, pAC3-miR-128-1 que expresa miR-128-1 se derivo del armazon de pAC3-YCD2 descrito en uno de los aspectos. El armazon pAC3 en el vector pAC3-miR-128-1 se aislo por digestion mediante endonucleasas del ADN plasmfdico pAC3-YCD2 con Mlul y Notl para retirar la secuencia de polinucleotido IRES-yCD2. La secuencia de polinucleotido ADN de pri-miR-128-1 se obtuvo a partir del producto del vector de expresion pEP-mir-128-1 (Cell BioLabs, Inc.) (SEQ ID NO: 31). La secuencia de ADN de pri-miR-128-1 se sintetizo con un sitio de enzima de restriccion Mlul en el extremo 5' y el sitio de la enzima de restriccion Noto en el extremo 3' de un fragmento de ADN de cadena doble para la insercion posterior del sitio correspondiente en el ADN plasmfdico pAC3-YCD2 digerido con Mlul y Notl descrito anteriormente. La construccion resultante pAC3-miR-128-1, codifica 3 genes: el gag, el pol y el env, y la secuencia codificante pri-miR-128-1 (Figura 11).
Se produjo una reserva de vector por transfeccion transitoria del ADN plasmfdico que codifica el vector en celulas 293T utilizando el metodo de fosfato de calcio. Dieciocho horas despues de la transfeccion, se remplazo el cultivo con medio nuevo. Veinticuatro horas despues del remplazo de medio, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en alfcuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros de las reservas de vector recolectadas para infectar celulas de cancer de prostata humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir la replicacion vmca adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, se extrajo el ADN de las celulas PC3 infectadas para el ensayo de titulacion. El tttulo de las reservas de vector se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
B. Construccion de un vector retrov^rico recombinante competente en replicacion que contema una secuencia de polinucleotido heterologa del pri-miARN-128-2 humano
El vector retrovmco competente en replicacion, pAC3-miR-128-2 que expresa miR-128-2 se derivo del armazon de pAC3-YCD2 descrito en uno de los aspectos de la divulgacion. El armazon pAC3 en el vector pAC3-miR-128-1 se aislo por digestion mediante endonucleasas del ADN plasmfdico pAC3-YCD2 con Mlul y Notl para retirar la secuencia de polinucleotido IRES-yCD2. La secuencia de polinucleotido ADN de pri-miR-128-2 se obtuvo a partir del analisis de secuencia del vector de expresion Lenti-miR-128-2 que expresan el pri-miR-128-2 (System Biosciences) (SEQ lD NO: 32). La secuencia de ADN de pri-miR-128-2 se sintetizo con un sitio de enzima de restriccion Mlul en el extremo 5' y el sitio de la enzima de restriccion Noto en el extremo 3' de un fragmento de ADN de cadena doble para la insercion posterior del sitio correspondiente en el ADN plasmfdico pAC3-YCD2 digerido con Mlul y Notl descrito anteriormente. La construccion resultante pAC3-miR-128-1, codifica 3 genes: el gag, el pol y el env, y la secuencia codificante pri-miR-128-2 (Figura 1).
Se produjo una reserva de vector por transfeccion transitoria del ADN plasmfdico que codifica el vector en celulas 293T utilizando el metodo de fosfato de calcio. Dieciocho horas despues de la transfeccion, se remplazo el cultivo con medio nuevo. Veinticuatro horas despues del remplazo de medio, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en alfcuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros de las reservas de vector recolectadas para infectar celulas de cancer de prostata humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir la replicacion vmca adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, se extrajo el ADN de las celulas PC3 infectadas para el ensayo de titulacion. El tttulo de las reservas de vector se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
C. Construccion de un vector retrov^rico recombinante competente en replicacion que contienen secuencias de polinucleotido heterologas de promotor H1 humano y pre-miARN-128 humano
El vector retrovftico competente en replicacion, pAC3-miR-128-2 que expresa miR-128-2 se derivo del armazon de pAC3-YCD2 descrito en uno de los aspectos. El armazon pAC3 en el vector pAC3-miR-128-1 se aislo por digestion mediante endonucleasas del ADN plasirftdico pAC3-YCD2 con MIuI y Notl para retirar la secuencia de polinucleotido IRES-yCD2 La secuencia del polinucleotido ADN del promotor H1 humano se obtuvo a partir de la informacion de producto del vector de expresion pSilencer 3.1 H1 hygro (Ambion), y la secuencia de polinucleotido ADN del premiR-128-1 estructurado con una horquilla corta se obtuvo del http://www.mirbase.org/. La secuencia de ADN de premiR-128-1 unida al promotor H1 humano (SEQ ID NO: 33) se sintetizo con un sitio de enzima de restriccion Mlul en el extremo 5' y el sitio de la enzima de restriccion Notl en el extremo 3' de un fragmento de ADN de cadena doble para la insercion posterior del sitio correspondiente en el ADN plasirftdico pAC3-YCD2 digerido con Mlul y Notl descrito anteriormente. La construccion resultante pAC3-H1-shRNAmiR128, codifica 3 genes: el gag, el pol y el env, y la secuencia pre-miR-128-1 estructurada con una horquilla corta no codificante (Figura 11).
Se produjo una reserva de vector por transfeccion transitoria del ADN plasirftdico que codifica el vector en celulas 293T utilizando el metodo de fosfato de calcio. Dieciocho horas despues de la transfeccion, se remplazo el cultivo con medio nuevo. Veinticuatro horas despues del remplazo de medio, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en aftcuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros de las reservas de vector recolectadas para infectar celulas de cancer de prostata humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir la replicacion vftica adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, se extrajo el ADN de las celulas PC3 infectadas para el ensayo de titulacion. El tftulo de las reservas de vector se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
D. Analisis de cinetica de replicacion del vector retrovkico recombinante competente en replicacion mediante ensayo de qPCR
Actualmente, existen al menos dos formas comunes para obtener la cinetica de replicacion de un vector retrovmco recombinante competente en replicacion: (1) analisis de la expresion de GFP con vectores que expresan la protema GFP mediante analisis citometricos, y (2) ensayo de transcriptasa inversa midiendo la actividad de transcriptasa inversa del vector de reserva recolectado del medio de cultivo de celulas transducidas. Los tftulos evaluados por el analisis de ADN de celulas transducidas proporcionan la estimacion mas fiable de los tftulos funcionales en comparacion con los tftulos obtenidos por ARN y expresion del transgen en el que los tftulos se sobre-estimaban y se subestimaban, respectivamente, (Sastry et al., 2002 Gene Therapy 9, 1155-1162). La cinetica de replicacion de la diseminacion vftica se correlaciona con el porcentaje de una poblacion que se ha transducido en la que un ADN provftico del genoma vftico se puede detectar por qPCR con cebadores espedficos de la secuencia vftica que se esta ensayando en cultivo. El presente ensayo necesita una entrada iguala de ADN genomico de todos los puntos temporales con el mismo vector ensayado y entre distintos vectores si se esta ensayando una comparacion de cineticas de replicacion. El grafico de cinetica de replicacion se genero representando los valores de C(t) invertidos frente a los puntos temporales. La Figura 12A y la Figura 12B muestran comparaciones de cineticas de replicacion de distintos vectores retrovfticos recombinantes competentes en replicacion. El ensayo es sensible para revelar la pequena diferencia de cineticas de replicacion entre distintos vectores.
E. Ensayo de cineticas de replicacion de vectores retrovkicos recombinantes competentes en replicacion que conten^an miR-128 en cultivo
Con el fin de confirmar que la incorporacion de pri-miR-128-1, pri-miR-128-2 y la secuencia de H1-pre-miR-128-1, respectivamente, en la presente divulgacion se replica normalmente, se utilizo un volumen calculado de cada reserva de vector recolectada por la transfeccion transitoria mencionada anteriormente para infectar celulas de fibrosarcoma humano, HT1080, recien preparadas y celulas de glioma humano, U87-MG, respectivamente, a una MOI de 0,1. Se hicieron pasajes de las celulas transducidas los dfas 3, 6 y 9 despues de la infeccion. En cada punto temporal, s recolecto una parte de celulas por extraccion de ADN por qPCR. Se hicieron diluciones del ADN genomico para generar aftcuotas del ADN genomico con la misma concentracion para la entrada de iguales cantidades genomicas en la qPCR. Se generaron las cineticas de replicacion para cada vector representando los valores de C(t) invertidos frente a los puntos temporales. La Figura 12A y 12B muestran todos los vectores ensayados replicados con cineticas similares en comparacion con el virus MLV de control.
E. Ensayo de la expresion del miR-128 maduro de celulas transducidas con el vector retrov^rico recombinante competente en replicacion que contiene miR-128
Con el fin de confirmar la expresion de miR-128 de las celulas transducidas con vectores retrovfticos recombinantes competentes en replicacion, se expandieron las celulas del dfa 9 despues de la infeccion que habfan alcanzado la maxima infectividad (Figura 12A y Figura 12B) y se recolectaron para extraer el ARN total para la deteccion de la expresion del miARN maduro. Los resultados del ensayo de microARN Taqman demostraba una sobre-expresion de miR-128 maduro a partir de ambas celulas HT1080 y UT87 transducidas con los vectores pAC3-miR-128-1, pAC3 miR-128-2, y pAC3-H1-shRNAmiR128, respectivamente, en comparacion con las celulas no transducidas (Figura 13). En ambas lmeas celulares, las celulas transducidas con el vector pAC3-miR-128-1 y pAC3-H1-shRNAmiR128 expresaban un nivel mas alto de miR-128 maduro que las celulas transducidas con el vector pAC3-miR-128-2. F. Ensayo de la expresion de Bmi-1 a partir de celulas transducidas con vectores retrov^ricos recombinantes competentes en replicacion que contienen miR-128 para demostrar la implicacion con la diana de miR-12
Se ha observado que la expresion de Bmi-1 esta regulada positivamente en una variedad de canceres humanos incluyendo el glioblastoma, y se ha demostrado que es la diana del miR-128. Para confirmar la implicacion de la diana con el miR-128, se detecto la expresion de Bmi-1 de las celulas transducidas con los vectores pAC3-miR-128-1, pAC3-miR-128-2, y pAC3-H1-shRNAmiR128, respectivamente mediante qRT-PCR. La Figura 14 muestra que las celulas U87-MG transducidas con los vectores pAC3-miR-128-1, pAC3-miR-128-2, y pAC3-H1-shRNAmiR128, respectivamente, expresaban un nivel menor de Bmi-1 que las celulas no transducidas, mientras que en las celulas HT1080 no se observaba una diferencia significativa entre las celulas transducidas y no transducidas. Los datos soportan el concepto de que el miR-128 tiene un papel funcional importante en el sistema nervioso central.
Ejemplo de referencia 12. Construccion y ensayo del vector retrovirico recombinante competente en replicacion que contiene secuencias de polinucleotido heterologas de IRES, yCD2, promotor H1 humano y pre-miR-128-1 humano
A. Construccion
El vector retrovmco competente en replicacion, pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 se deriva del armazon de pAC3-YCD2 descrito en uno de los aspectos de las divulgaciones. El armazon pAC3-YCD2 en el vector pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 se aislo por digestion mediante endonucleasas del ADN plasmfdico pAC3-YCD2 con Notl. La secuencia del polinucleotido ADN del promotor H1 humano se obtuvo a partir de la informacion de producto del vector de expresion pSilencer 3.1 H1 hygro (Ambion), y la secuencia de polinucleotido ADN del pre-miR-128-1 estructurado con una horquilla corta se obtuvo del http://www.mirbase.org/. La secuencia de ADN de pre-miR-128-1 unida al promotor H1 humano (SEQ ID NO: 34) se sintetizo con un sitio de enzima de restriccion Notl en ambos extremos del fragmento de ADN de cadena doble para la insercion posterior del sitio correspondiente en el ADN plasmfdico pAC3-YCD2 digerido con Notl descrito anteriormente. La construccion resultante, pAC3-H1-shRNAmiR128, codifica 4 genes: el gag, el pol, el env, y el yCD2 , y la secuencia pre-miR-128-1 estructurada con una horquilla corta no codificante (Figura 11).
Se produjo una reserva de vector por transfeccion transitoria del ADN plasmfdico que codifica el vector en celulas 293T utilizando el metodo de fosfato de calcio. Dieciocho horas despues de la transfeccion, se remplazo el cultivo con medio nuevo. Veinticuatro horas despues del remplazo de medio, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en alfcuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros de las reservas de vector recolectadas para infectar celulas de cancer de prostata humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir la replicacion vmca adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, se extrajo el ADN de las celulas PC3 infectadas para el ensayo de titulacion. El tftulo de las reservas de vector se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
B. Ensayo de cineticas de replicacion vectores retrov^ricos recombinantes competentes en replicacion pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 en cultivo
Con el fin de confirmar que la incorporacion de H1-pre-miR-128-1 en la presente divulgacion se replica normalmente, se utiliza un volumen calculado de cada reserva de vector recolectada a partir de la transfeccion transitoria mencionada anteriormente para infectar celulas de fibrosarcoma humano recientes, HT1080 y celulas de glioma humano, U87-MG, respectivamente, a una MOI de 0,1. Se hacen pasajes en las celulas transducidas el dfa 3, 5 y 9 despues de la infeccion. En cada punto temporal, se recolecto una porcion de celulas para la extraccion de ADN genomico para la qPCR. Las diluciones de ADN se hacen para generar alfcuotas de a Dn genomico con la misma concentracion para una cantidad de entrada genomica igual en la qPCR. Las cineticas de cada vector se generaron representando los valores de C(t) invertidos frente a los puntos temporales. El resultado muestra que el vector se replica con cineticas comparables al virus MLV de control.
C. Ensayo de la expresion del miR-128 maduro a partir de celulas transducidas con el vector retrov^rico recombinante competente en replicacion pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128
Para confirmar la expresion de miR-128 a partir de las celulas transducidas con el vector retrovmco recombinante competente en replicacion pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128, las celulas del dfa 9 despues de la infeccion, en las que se habfa alcanzado la maxima infectividad, se expandieron y recolectaron para extraer el ARN total para la deteccion de la expresion del miARN maduro. El resultado de los ensayos de microARN Taqman muestra una sobre-expresion de miR-128 maduro de ambas celulas HT1080 y U87-MG transducidas con el pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 en comparacion con las celulas transducidas.
D. Ensayo de la expresion de Bmi-1 a partir de celulas transducidas con el vector retrov^rico recombinante competente en replicacion pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 para demostrar la implicacion con la diana de miR-128 Se ha observado que la expresion de Bmi-1 esta regulada positivamente en una variedad de canceres humanos incluyendo el glioblastoma, y se ha demostrado que es la diana del miR-128. Para confirmar la implicacion de la diana con el miR-128, se detecto la expresion de Bmi-1 de las celulas transducidas con el vector pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 mediante qRT-PCR. El resultado muestra que las celulas U87-MG transducidas con el vector pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 expresaban un nivel menor de Bmi-1 que las celulas no transducidas, mientras que en las celulas HT1080 no se observaba una diferencia significativa entre las celulas transducidas y no transducidas. Los datos soportan el concepto de que el miR-128 tiene un papel funcional importante en el sistema nervioso central. E. Ensayo de la expresion de yCD2 a partir de celulas transducidas con pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 mediante trasferencia inmunitaria
Para confirmar la expresion de yCD2 a partir de celulas transducidas con el vector retrovmco recombinante competente en replicacion pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128, las celulas del dfa 9 despues de la infeccion, en el que se alcanzaba la maxima infectividad se expandieron y cultivaron para extraer la protema total para la deteccion de la expresion de yCD2. El resultado de la transferencia inmunitaria muestra una expresion normal de yCD2 de ambas celulas HT1080 y U87-MG transducidas con el pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 en comparacion con las celulas transducidas con el pAC3-YCD2.
Ejemplo de referencia 13: Ensayo de la estabilidad de vector de vectores retrovmicos recombinantes que contienen miR-128 en cultivo
Se ensayaron multiples ciclos de infeccion en serie de vectores retroviricos recombinantes que conteman miR-128 (pAC3-miR-128-1, pAC3-miR-128-2, y pAC3-H1-shRNAmiR128 y pAC3-YCD2-H1-shRNAmiR128) para evaluar la estabilidad de los vectores. Se infectaron inicialmente las celulas HT1080 y U87-MG con los vectores a una MOI baja y se permitio que se diseminaran en el cultivo. Se recolectaron reservas de vector en cada ciclo de infeccion, si filtraron diluidos hasta celulas infectadas recientes. Al final de cada ciclo de infeccion, se recolectaron las celulas y se extrajo el ADN genomico para evaluar la estabilidad del transgen mediante PCR convencional utilizando cebadores que se unen a 3' del gen env y 3' de la region no traducida del vector corriente arriba de la LTR 3'. El resultado demuestra que todos los vectores ensayados se mantienen estables durante al menos mas de 8-20 ciclos.
Ejemplo de referencia 14: Estudios de eficacia antitumoral con un vector que expresa un miARN en un modelo de xenoinjerto de raton/humano
Objetivo
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un nuevo vector retrovmco competente en replicacion basado en MLV que tiene la secuencia de miR-128 (AC3-miR128-1(V); AC3-miR128-2(V); AC3-miR128-3(V)) sobre la supervivencia, cuando se suministra por inyeccion via intracraneal (IC) en ratones desnudos que albergan un xenoinjerto de glioma humano con tres niveles de dosis de Toca 511.
Ratones
Se adquirieron ratones atfmicos nude-Foxn1Aun (desnudos) hembras (edad ~ 8 semanas) en Harlan (Indianapolis, IN). Los ratones se aclimataron durante 7 dfas despues de llegar. Los ratones se sometieron a la colocacion quirurgica de una canula grna permanente con una proyeccion de 3,0 mm implantada en el cuerpo estriado derecho, y provisto con un tapon que contema una proyeccion de 3,5 mm. Las coordenadas estereotaxicas eran AP = 0,5 mm, ML = -1,8 mm (de Bregma).
Celulas
Las celulas U87-MG (ATCC, Manassas VA) se derivan de un glioma maligno de una mujer de raza blanca de 44 anos de edad. Las celulas se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco con un 10% de suero fetal bovino, piruvato sodico, y Glutamax (Hyclone, Logan UT, e Invitrogen, San Diego CA). Las celulas se resuspendieron en PBS (Hyclone, Logan UT) para la implantacion. Las celulas U87-MG (1E5 en 1 pl) se infundieron a 0,2 pl por minuto (5 minutos, seguido por un descanso de 5 minutos) IC mediante una canula de inyeccion con una proteccion de 3,5 mm insertada a traves de la canula grna.
Las preparaciones de vector se hicieron por transfeccion transitoria (o a partir de una lmea celular productora a la que se hace referencia como provisional) y todas con tttulos de aproximadamente 5E6 UT/ml. Para los estudios iniciales el vector no estaba purificado o concentrado adicionalmente. Para continuar con los experimentos para determinar las curvas de respuesta de dosis completa, se preparo un material purificado con alto tftulo con un tftulo de alrededor de 10E8/ml. El vector se administra IC en un volumen de 5 ul o menos para una dosis total mmima/raton de aproximadamente 2,5E4 UT/raton.
Implantacion del tumor e inyeccion del vector
Se implanto a seis grupos de ratones hembras Foxn1Aun desnudos (65 ratones, 9-10 semanas de edad) p o ^ a IC con celulas tumorales U87 ^ a 0) y entonces se dosificaron (dfa 4-7 dependiendo de la tasa de crecimiento de las celulas U87) con un velmculo (Grupos 1), con vector de control (AC3-Gf P(V), (Grupo2), o IC con (AC3-miR128-1(V); AC3-miR128-2(V); AC3-miRl28-3(v) (Grupos 3-5). Los ratones del grupo 6 no teman tumor implantado ni vector. Analisis de datos
Los analisis de supervivencia se llevaron a cabo en 10 ratones de cada grupo 1-6 y se representaron en un grafico de Kaplan Meyer. Las curvas de supervivencia se comparan por el ensayo de intervalo logantmico. Los valores de P de < 0,05 se consideran estadfsticamente significativos en todos los analisis que se llevaron a cabo con el software estadfstico Prism 5 (software GraphPad) o equivalente.
Los resultados del tratamiento con los vectores presentan una ventaja de supervivencia estadfsticamente significativa en este modelo de xenoinjerto de glioma humano en comparacion con el tratamiento con el vector de control o el velmculo solo.
Ejemplo de referencia 15: Estudios de eficacia antitumoral con el vector que expresa yCD2 y miARN en un modelo de xenoinjerto de raton/humano
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un nuevo vector retrovmco competente en replicacion basado en MLV que expresa yCD2 y miR-128 denominado AC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 (V) sobre la supervivencia, cuando se suministra por inyeccion via intracraneal (IC) en ratones desnudos que albergan un xenoinjerto de glioma humano enriquecido tipo “celula madre”, con tres niveles de dosis.
Se adquirieron ratones artmicos nude-Foxn1Aun (desnudos) hembras (edad ~ 8 semanas) en Harlan (Indianapolis, IN). Los ratones se aclimataron durante 7 dfas despues de llegar. Los ratones se sometieron a la colocacion quirurgica de una canula grna permanente con una proyeccion de 3,0 mm implantada en el cuerpo estriado derecho, y provisto con un tapon que contema una proyeccion de 3,5 mm. Las coordenadas estereotaxicas eran AP = 0,5 mm, ML = -1,8 mm (de Bregma).
Pasajes tempranos de glioma humano primario (Dr. Carol Kruse, Burnham Biomedical Res Inst, San Diego, CA) se cultivaron en medio libre de suero con un suplemento de EGF, bFGF y B27. Las celulas se resuspendieron en PBS (Hyclone, Logan UT) para la implantacion. Se infundieron aproximadamente 1000 celulas en 1 pl a 0,2 pl por minuto (5 minutos, seguido por un descanso de 5 minutos) IC mediante una canula de inyeccion con una proteccion de 3,5 mm insertada a traves de la canula grna.
Las preparaciones de vector se hicieron por transfeccion transitoria (o a partir de una lmea celular productora a la que se hace referencia como provisional) y todas con tttulos de aproximadamente 5E6 UT/ml. Para los estudios iniciales el vector no estaba purificado o concentrado adicionalmente. Para continuar con los experimentos para determinar las curvas de respuesta de dosis completa, se preparo un material purificado con alto tftulo con un tftulo de alrededor de 10E8/ml. El vector se administra IC en un volumen de 5 ul o menos para una dosis total mmima/raton de aproximadamente 2,5E4 UT/raton.
Implantacion del tumor e inyeccion del vector
Se implanto a seis grupos de ratones hembras Foxn1Aun desnudos (66 ratones, 9-10 semanas de edad) por via IC con celulas “tipo madre” (Dfa 0) y entonces se dosificaron IC los dfas 7-14 despues de la implantacion tumoral dependiendo de la tasa de crecimiento de las celulas con los Grupos 1: velmculo; Grupo 2: vector control AC3-GFP(V); Grupo 3: TOCA511; Grupo 4: AC3-H1-shRNAmiR128 (V); Grupo 5: AC3-YCD2-H1-shRNAmiR128 (V); y Grupo 6: los ratones del grupo 6 no teman tumor implantado ni vector.
Analisis de datos
Los analisis de supervivencia hasta el dfa 60 se llevaron a cabo en 10 ratones de cada grupo 1-5 y se representaron en un grafico de Kaplan Meyer. Las curvas de supervivencia se comparan por el ensayo de intervalo logantmico. Los valores de P de < 0,05 se consideraban estadfsticamente significativos en todos los analisis, que se llevaron a cabo con el software estadfstico Prism 5 (software GraphPad) o equivalente.
Resultados
Los resultados del tratamiento con los vectores presentan una ventaja de supervivencia estadfsticamente significativa en este modelo de xenoinjerto de glioma humano en comparacion con el tratamiento con el vector de control o el velmculo solo.
A. Construccion de un vector retrov^rico competente en replicacion que expresa GFP y que contiene una unica copia de la secuencia diana 142-3p
El vector retrovmco competente en replicacion, pAC3-emd-142-3pT, que codifica GFP se derivaba del armazon del pAC3-emd descrito anteriormente (patente existente actual). El armazon pAC3-emd del vector pAC3-emd-142-3pT se aislo por digestion con endonucleasas del ADN plasirndico pAC3-emd con Notl. La secuencia diana perfectamente complementaria de miR142-3pT se obtuvo de la bibliograffa publicada (Brown et al., 2006 Nature Medicine 12:5585-591). La secuencia diana del miR142-3pT (SEQ ID NO: 35) se sintetizo con un sitio de enzima de restriccion Notl presente en cada extremo del fragmento de ADN de doble cadena para la insercion posterior en el sitio correspondiente del ADN plasirndico pAC3-emd. La orientacion de la insercion 142-3p se confirmo por analisis de secuenciacion. La construccion resultante, pAC3-emd-142-3pT, codifica 4 genes: el gag, el pol, el envy el emd, y la secuencia no codificante 142-3pT (Figura 15).
Se produjo una reserva de vector por transfeccion transitoria del ADN plasirndico que codifica el vector en celulas 293T utilizando el metodo de fosfato de calcio. Dieciocho horas despues de la transfeccion, se remplazo el cultivo con medio nuevo. Veinticuatro horas despues del remplazo de medio, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en almuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros de las reservas de vector recolectadas para infectar celulas de cancer de prostata humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir la replicacion vmca adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, se extrajo el ADN de las celulas PC3 infectadas para el ensayo de titulacion. El tttulo de las reservas de vector se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
B. Construccion del vector retrovmco competente en replicacion que expresa yCD2 y que contiene una unica copia de la secuencia diana 142-3p
El vector retrovmco competente en replicacion, pAC3-YCD2-142-3pT, que codifica el gen yCD2 se derivaba del armazon de pAC3- yCD2 descrito anteriormente (patente existente actual). El armazon pAC3- yCD2 del vector pAC3-YCD2-142-3pT, se aislo por digestion por endonucleasas del ADN plasirndico pAC3- yCD2 con Notl. La secuencia diana perfectamente complementaria de miR142-3pT se obtuvo de la bibliograffa publicada (Brown et al., 2006 Nature Medicine 12:5585-591). La secuencia diana del miR142-3p (SEQ ID NO: 35) se sintetizo con el sitio de la enzima de restriccion Notl presente en cada extremo del fragmento de ADN de doble cadena para la insercion posterior en el sitio correspondiente del ADN plasirndico pAC3- yCD2. La construccion resultante pAC3-YCD2-142-3pT, codifica 4 genes: el gag, el pol, el env, y el yCD2, y la secuencia no codificante 142-3pT (Figura 16).
Se produjo una reserva de vector por transfeccion transitoria del ADN plasirndico que codifica el vector en celulas 293T utilizando el metodo de fosfato de calcio. Dieciocho horas despues de la transfeccion, se remplazo el cultivo con medio nuevo. Veinticuatro horas despues del remplazo de medio, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en almuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros de las reservas de vector recolectadas para infectar celulas de cancer de prostata humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir la replicacion vmca adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, se extrajo el ADN de las celulas PC3 infectadas para el ensayo de titulacion. El tttulo de las reservas de vector se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
C. Construccion de un vector retrovmco competente en replicacion que expresa GFP y contiene 4 copias de la secuencia diana 142-3p
El vector retrovmco competente en replicacion, pAC3-emd-142-3pT4X, que codifica GFP se derivaba del armazon del pAC3-emd descrito anteriormente (patente existente actual). El armazon pAC3-emd del vector pAC3-emd-142-3pT4X se aislo por digestion con endonucleasas del ADN plasirndico pAC3-emd con Notl. La secuencia diana perfectamente complementaria con cuatro repeticiones en tandem de miR142-3pT4X se obtuvo de la bibliograffa publicada (Brown et al., 2006 Nature Medicine 12:5585-591). La secuencia diana del miR142-3pT4X (SEQ lD NO: 36) se sintetizo con un sitio de enzima de restriccion Notl presente en cada extremo del fragmento de ADN de doble cadena para la insercion posterior en el sitio correspondiente del ADN plasirndico pAC3-emd. La orientacion de la insercion 142-3p se confirmo por analisis de secuenciacion. La construccion resultante, pAC3-emd-142-3pT4X, codifica 4 genes: el gag, el pol, el env y el emd, y la secuencia no codificante 142-3pT4X (Figura 15).
Se produjo una reserva de vector por transfeccion transitoria del ADN plasirndico que codifica el vector en celulas 293T utilizando el metodo de fosfato de calcio. Dieciocho horas despues de la transfeccion, se remplazo el cultivo con medio nuevo. Veinticuatro horas despues del remplazo de medio, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en almuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros de las reservas de vector recolectadas para infectar celulas de cancer de prostata humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir la replicacion vmca adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, se extrajo el ADN de las celulas PC3 infectadas para el ensayo de titulacion. El tftulo de las reservas de vector se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
D. Construccion del vector retrov^rico competente en replicacion que expresa yCD2 y contiene 4 copias de la secuencia diana 142-3p
El vector retrovftico competente en replicacion, pAC3- YCD2-142-3pT4X, que codifica GFP se derivaba del armazon del pAC3-emd descrito anteriormente (patente existente actual). El armazon pAC3-emd del vector pAC3- yCD2-142-3pT4X se aislo por digestion con endonucleasas del ADN plasirftdico pAC3- yCD2 con Notl. La secuencia diana perfectamente complementaria con cuatro repeticiones en tandem de miR142-3pT4X se obtuvo de la bibliograffa publicada (Brown et al., 2006 Nature Medicine 12:5585-591). La secuencia diana del miR142-3pT4X (SEQ ID NO: 36) se sintetizo con un sitio de enzima de restriccion Notl presente en cada extremo del fragmento de ADN de doble cadena para la insercion posterior en el sitio correspondiente del ADN plasirftdico pAC3- yCD2. La orientacion de la insercion 142-3pT4X se confirmo por analisis de secuenciacion. La construccion resultante, pAC3-emd-142-3pT4X, codifica 4 genes: el gag, el pol, el env y el emd, y la secuencia no codificante 142-3pT4X (Figura 16).
Se produjo una reserva de vector por transfeccion transitoria del ADN plasirftdico que codifica el vector en celulas 293T utilizando el metodo de fosfato de calcio. Dieciocho horas despues de la transfeccion, se remplazo el cultivo con medio nuevo. Veinticuatro horas despues del remplazo de medio, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en aftcuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros de las reservas de vector recolectadas para infectar celulas de cancer de prostata humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir la replicacion vftica adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, se extrajo el ADN de las celulas PC3 infectadas para el ensayo de titulacion. El tftulo de las reservas de vector se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
Ejemplo 17. Graficacion de las cineticas de replicacion de vector retrovmco recombinante por ensayo qPCR Actualmente, existen al menos dos formas comunes para obtener la cinetica de replicacion de un vector retrovmco recombinante competente en replicacion: (1) analisis de la expresion de GFP con vectores que expresan la protema GFP mediante analisis citometricos, y (2) ensayo de transcriptasa inversa midiendo la actividad de transcriptasa inversa del vector de reserva recolectado del medio de cultivo de celulas transducidas. Los tftulos evaluados por el analisis de ADN de celulas transducidas proporcionan la estimacion mas fiable de los tftulos funcionales en comparacion con los tftulos obtenidos por ARN y expresion del transgen en el que los tftulos se sobre-estimaban y se subestimaban, respectivamente, (Sastry et al., 2002 Gene Therapy 9, 1155-1162). La cinetica de replicacion de la diseminacion vftica se correlaciona con el porcentaje de una poblacion que se ha transducido en la que un ADN provftico del genoma vftico se puede detectar por qPCR con cebadores espedficos de la secuencia vftica que se esta ensayando en cultivo. El presente ensayo necesita una entrada iguala de ADN genomico de todos los puntos temporales con el mismo vector ensayado y entre distintos vectores si se esta ensayando una comparacion de cineticas de replicacion. El grafico de cinetica de replicacion se genero representando los valores de C(t) invertidos frente a los puntos temporales. La Figura 17A y la Figura 17B muestran comparaciones de cineticas de replicacion de distintos vectores retrovfticos recombinantes competentes en replicacion. El ensayo es sensible para revelar la pequena diferencia de cineticas de replicacion entre distintos vectores.
Ejemplo de referencia 18. Ensayo de cineticas de replicacion
Vectores retrovmcos recombinantes que contienen 142-3pT en lneas celulares humanas no hematopoyeticas Con el fin de confirmar que la incorporacion de la secuencia 142-3pT en la presente divulgacion se replica de manera similar a sus vectores parentales, se utiliza un volumen calculado de cada reserva de vector recolectada a partir de la transfeccion transitoria mencionada anteriormente para infectar celulas de fibrosarcoma humano recientes, HT1080 y celulas de glioma humano, U87-MG, respectivamente, a una MOI de 0,1. Se hacen pasajes en las celulas transducidas el dfa 3, 5 y 9 despues de la infeccion. En cada punto temporal, se recolecto una porcion de celulas para la extraccion de ADN genomico para la qPCR. Las diluciones de ADN se hacen para generar aftcuotas de ADN genomico con la misma concentracion para una cantidad de entrada genomica igual en la qPCR.
Las cineticas de cada vector se generaron representando los valores de C(t) invertidos frente a los puntos temporales. La Figura 17A y 18A muestran que todos los vectores ensayados se replican con cineticas similares en comparacion con sus vectores parentales (pAC3-emd y pAC3-YCD2). Las cineticas de replicacion de los vectores que expresan la protema GFP (pAC3-emd, pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X) tambien se evaluaron por analisis de citometna de flujo. La Figura 3B y 4B muestran que los vectores pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X se replicaban con una cinetica similar que su vector parental, pAC3-emd.
A. Ensayo de cineticas de replicacion de vectores retrovrncos recombinantes que contienen 142-3pT en celulas hematopoyeticas humanas y de raton
La expresion del miR-142-3p maduro se confirmo primero en una lmea celular EL4 de linfocitos T, una lmea celular SUP-T1 de linfocitos T humanos y una lmea celular U937 monodtica humana mediante un ensayo de microARN Taqman utilizando el conjunto de cebadores espedficos para el miR-142-3p humano y de raton ya que las secuencias del miR-152-3p maduras de las dos especies son identicas. Las cineticas de replicacion del vector retrovmco recombinante que expresa la GFP (pAC3-emd) se ensayo en las tres lmeas celulares con una infeccion inicial a una MOI de 2. La Figura 19 muestra que el vector pAC3-emd se replicaba eficazmente en linfocitos T y monocitos humanos (SUP-T1 y U937) segun la diseminacion vmca alcanzaba un 65% y 95% de la poblacion celular, respectivamente, el dfa 28 despues de la infeccion. La diseminacion del vector en celulas EL4 permaneda en menos del 5 % durante el marco de tiempo ensayado.
Ejemplo de referencia 18A: Ensayo de la diseminacion del vector de vectores retrovrncos recombinantes que contienen 142-3pT en celulas hematopoyeticas humanas y de raton
Se ensayo el efecto funcional de miR-142-3p en la supresion de la expresion de GFP en el vector retrovmco recombinante que expresa GFP por analisis de citometna de flujo. Se utilizo el volumen calculado de reserva de vector de pAC3-emd, pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X recolectados a partir de la transfeccion transitoria mencionada anteriormente para infectar las celulas EL4, SUP-T1 y U937 a una MOI de 2. Una porcion de las celulas se recolecto el dfa 6, 12 y 18 despues de la infeccion para el analisis de expresion de GFP por analisis de citometna de flujo La Figura 20A muestra que la expresion de GFP estaba suprimida a nivel de fondo en celulas El4 transducidas con el vector pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X en comparacion con su vector parental pAC3-emd. La supresion de GFP se mantema persistente en el intervalo de tiempo ensayado. La Figura 20B y Figura 20C muestra la sorprendente supresion de la expresion de GFP en celulas SUP-T1 y U937 transducidas con el vector pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X, respectivamente, en comparacion con su vector parental pAC3-emd. Los resultados confirman que la expresion de miR-142-3p en celulas hematopoyeticas humanas y de raton suprime eficazmente la expresion de GFP en celulas transducidas con vectores retrovmcas recombinantes que contienen la secuencia 142-3pT. En las celulas U937, el resultado sugiere que el vector que contiene 4 copias de 142-3pT (pAC3-emd-142-3pT4X) puede ser mas eficaz en la supresion de la expresion de GFP que el vector que contiene una unica copia de 142-3pT (pAC3-emd-142-3pT).
Ejemplo de referencia 19: Ensayo del ARN genomico vmco
No esta claro si el efecto funcional del pAC3-emd-142-3pT en la supresion de la expresion de GFP mencionada anteriormente es debido a supresion directa de la expresion de GFP a nivel traduccional o debido a degradacion del genoma vmco a nivel postranscripcional. Una porcion de celulas al final del punto temporal experimental se recolecto para la extraccion de ARN total utilizando un metodo de biologfa molecular convencional. Se llevo a cabo una qRT-PCR utilizando cebadores (por ejemplo, el conjunto de cebadores pol y el conjunto de cebador env2) espedfico del ADNc derivado del ARNd vmco transcrito inversamente para evaluar la carga vmca de las celulas transducidas. Los resultados muestran que la carga vmca de las celulas transducidas con pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X, respectivamente es significativamente menor que las celulas transducidas con el vector pAC3-emd. El resultado apoya el concepto de que el miR-142-3p en las celulas hematopoyeticas humanas y de raton degrada eficazmente el genoma de ARN vmco a nivel post transcripcional, y por lo tanto, restringe la diseminacion del vector en celulas hematopoyeticas humanas y de raton.
Ejemplo de referencia 20: Ensayo del ADN provirico integrado mediante qPCR
No esta claro si el efecto funcional del pAC3-142-3pT en la supresion de la expresion de GFP mencionada anteriormente es debido a supresion directa de la expresion de GFP a nivel traduccional o debido a degradacion del genoma vmco y por lo tanto la integracion del ADN provirico. Una porcion de celulas al final del punto temporal experimental se recolecto para la extraccion de ARN total utilizando un metodo de biologfa molecular convencional. Se llevo a cabo una qPCR utilizando cebadores espedficos del ADN provirico integrado para evaluar el numero de copias de ADN provirico integrado por celula. El resultado muestra que el numero de copias por celula de las celulas transducidas con pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X, respectivamente es significativamente menorque las celulas transducidas con el vector pAC3-emd. El resultado apoya el concepto de que el miR-142-3p en las celulas hematopoyeticas humanas y de raton degrada eficazmente el genoma de ARN vmco a nivel post transcripcional, y por lo tanto, restringe la diseminacion del vector en celulas hematopoyeticas humanas y de raton.
Ejemplo de referencia 21: Ensayo de la estabilidad del vector de vectores retroviricos recombinantes que contienen 142-3pT en cultivo
Se ensayaron ciclos de infeccion multiple en serie de vectores vmcos recombinantes que conteman 142-3pT para evaluar la estabilidad de los vectores. Las celulas HT1080 y U87-MG se infectaron inicialmente con vectores a una MOI baja y se permitio que se diseminaran en cultivo. Se recolectaron vectores de reserva en cada ciclo de infeccion, se filtraron y diluyeron para infectar celulas recientes. Al final de cada ciclo de infeccion, las celulas se recolectaron y se extrajo el ADN genomico para la evaluacion de la estabilidad del transgen por PCR convencional utilizando cebadores que se unen al 20 del gen env y 3' de la region no traducida en el vector corriente abajo de la secuencia de polinucleotido heterologa unida al IRES. El resultado muestra que los vectores que contienen la copia unica de 142-3pT (pAC3-emd-142-3pT y pAC3- YCD2-142-3pT) se mantienen estables al menos durante 10-20 ciclos, mientras que los vectores que contienen 4 repeticiones en tandem de 142-3pT (pAC3-emd-142-3pT4X y pAC3- YCD2-142-3pT4X) muestra una eliminacion de la secuencia 142-3pT en los ciclos tempranos de infeccion. Ejemplo de referencia 22: Ensayo de la diseminacion del vector controlada de vectores retroviricos recombinantes que contienen 142-3pT in vivo
Este experimento se llevo a cabo con el mismo diseno del Ejemplo 27 posterior. El efecto funcional de miR-142-3p en la restriccion de la diseminacion del vector mediante celulas hematopoyeticas se ensayo in vivo mediante la inyeccion intravenosa de vectores retrovmcos recombinantes (pAC3-emd, pAC3-emd-142-3pT y pAC3-emd-142-3pT4X) en ratones Balb/C de 8 sem de edad con xenoinjertos de U87 implantados. Para cada vector, hay tres grupos de ratones que cada uno representa un punto temporal (por ejemplo, 30 dfas, 60 dfas y 90 dfas despues de la administracion del vector vmco). Una dosis de 1E4 a 1E7 UT de cada vector de reserva se administra por inyeccion intravenosa a todos los animales. Los animales de cada punto temporal se sacrificaron y se recolectaron el bazo, ganglios linfaticos y medula osea y el tumor. La expresion de GFP de la subpoblacion de celulas (por ejemplo, CD4+, CD8+, y etc.) se recolecto y analizo por analisis de citometna de flujo. En un experimento duplicado, los animales de cada punto temporal se sacrificaron y los tejidos (por ejemplo, Idgado, rinon, bazo, tumor, etc.) se recolectaron para la extraccion de ADN genomico. Se llevo a cabo la qPCR para evaluar la presencia de ADN provmco integrado en los tejidos recolectados. El resultado muestra que la diseminacion del vector de los vectores que conteman la 142-3pT estaba significativamente reducida en tejidos hematopoyeticos demostrando la reduccion de la replicacion del vector en estos tejidos. Al mismo tiempo la senal de GF y PCR se sigue observando en el tumor, demostrando que las secuencias miR diana tienen una diseminacion deprimida en los tejidos linfoides, pero aun mantiene la diseminacion en el tejido tumoral.
Ejemplo 23. Extension de la supervivencia en un paciente canino con glioma maligno recurrente espontaneo y tratado con el vector T5.0002 mas 5-FC
Un Boxer macho de 35 kg, que presentaba un oligodendroglioma anaplasico recurrente 3 meses despues de la reseccion quirurgica completa, se trato con virus T5.0002, purificado y formulado (vease, el documento US 5792643; T. Rodriguez et al. J Gene Med 9:2332007; Solicitud de EE. UU. 61218063) en Tris/NaCl isotonico pH 7,2 se hadan isotonicos con manitol y sacarosa, 1 mg/ml de HSA, 0,1 mg/ml de ascorbato) en combinacion con 5-FC. El tumor media aproximadamente 13 cm3, y produda compresion del ventnculo mayor lateral y cambiaba significativamente la lmea media (vease la Figura 21). Debido al gran tamano del tumor, se infundio Toca 411 a traves de 2 cateteres separados (400 pl y 480 pl), utilizando un Suministro de Conveccion Aumentada (CED). La dosis total de Toca 511 administrada era aproximadamente de 4,1 x 106 UT/g de cerebro. Se anadio ProHance® (gadoteridol) al Toca 511 antes de la inyeccion para permitir la visualizacion del suministro por MRI. El volumen de distribucion del vector se estimaba que era aproximadamente del 10-12 % del volumen tumoral.
Las Figuras 21A y 21B son fotograffas de las imagenes del MRI obtenidas del perro paciente durante la infusion intratumoral CED de Toca 511 y gadolinio. Notese que el gran tumor del lado izquierdo de la imagen comprende ambos lados del cerebro y cambia las estructuras de la lmea media a la derecha. Las areas blancas son la infusion de gadolinio-Toca 511. La Figura 21B muestra la colocacion de los dos cateteres en el tumor.
Se permitio que Toca 511 se diseminara durante 8 dfas. El perro se trato con 5-FC a una dosis dividida de 130 mg/kg/dfa, por boca, tres veces al dfa concomida durante 5 dfas. La dosis se aumento a 160 mg/kg/dfa durante 2 dfas mas (7 dfas de 5-FC en total). Un seguimiento con MRI no demostraba cambios en el tamano del tumor y algunos cambios posibles en el area interna del tumor. Despues de 21 dfas de diseminacion vmca, se inicio un segundo ciclo de 5-FC a la dosis mas alta de 160 mg/kgMa (dividido en tres veces al dfa, con comida). El farmaco se paro despues del quinto dfa de dosificacion debido al desarrollo de sarpullido.
La MRI llevada a cabo a las 2 semanas despues del primer curso de 5-FC y dos semanas despues del segundo curso de 5-FC (7 semanas despues de que el tratamiento comience) como se muestra que el tumor se aplanaba, mientras que la tasa de crecimiento tumoral declinaba. El paciente se volvio mas alerta y activo, y se mantuvo clmicamente estable, 13 semanas despues de la inyeccion del vector. En el momento de la escritura el perro segrna vivo. El periodo de vida estimado del peroro era no mas de 3-4 semanas en el momento de la inyeccion inicial del vector. La eficacia de la combinacion de Toca 511/5-FC en este perro paciente se muestra por la supervivencia de 3 o 4 veces mas que lo estimado originalmente por su veterinario encargado.
Ejemplo de referencia 24: Construccion de vectores con interferon gamma
A. Construccion y ensayo de un vector retrov^rico competente en replicacion que codifica el gen del IFN-gamma humano
El vector retrovmco competente en replicacion, pAC3-hIFNg, que codifica el gen del IFN-gamma humano, se derivo del armazon pAC3- yCD2 descrito anteriormente. El armazon de pAC3 en el vector pAC3-hIFNg se aislo por digestion con endonucleasa del ADN plasirndico pAC3- yCD2 con Psil y Notl. La secuencia de ADNc del gen del IFN-gamma humano se identifico y se confirmo entre tres secuencias obtenidas de los diferentes numeros de registro (AM903379, BC070256, y NM000619). El alineamiento de secuencia presentaba una secuencia identica entre las tres. La fase de lectura abierta del IFN-gamma humano (SEQ ID NO: 38) se sintetizo con el sitio de enzimas de restriccion PsiI y NotI presentes en cada extremo del fragmento de ADN para la insercion posterior en el sitio correspondiente del armazon pAC3. La construccion resultante, pAC3-hIFNg, codifica 4 genes: el gag, el pol, el env, y el IFN-gamma humano (Figura 22).
El vector de reserva se produjo por transfeccion transitoria del ADN plasirndico que codifica el vector en celulas HT1080 utilizando el reactivo de transfeccion FUGENE HD. Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, se recolecto el sobrenadante que contema el vector y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en almuotas a -80 °C para su uso posterior. El volumen espedfico del vector de reserva sin diluir se utilizo para infectar un HT1080 con un 75 % de confluencia. El dfa 4 y el dfa 5 despues de la infeccion, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en almuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros del vector de reserva recolectado para infectar celulas de cancer prostatico humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir una replicacion vmca adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, el ADN genomico de las celulas PC3 infectadas se extrajo para el ensayo de titulacion. El tttulo de los vectores de reserva se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
La expresion del IFN-gamma humano se ensayo primero a nivel de ARN. Se extrajo el ARN total a partir de las celulas HT1080 transducidas a los 5 dfas despues de la infeccion en la segunda infeccion utilizando el metodo convencional de extraccion de ARN. Se llevo a cabo la RT-PCR para detectar la expresion de IFN-g humano. SE utilizaron cincuenta nanogramos de ARN total en la reaccion RT para generar el ADNc. Un decimo del volumen de la reaccion RT se utilizo posteriormente para la PCR utilizando un conjunto de cebadores de PCR espedfico para el IFN humano. El resultado del RT-PCR demostraba que el IFN-gamma humano se expresa en las celulas HT1080 infectadas con el vector pAC3-hIFNg.
La expresion del IFN proteico humano secretado se ensayo mediante ELISA convencional. El vector de reserva recolectado el dfa 4 y dfa 5 despues de la infeccion se diluyo en serie en el ensayo ELISA con el fin de obtener un intervalo lineal entre la concentracion proteica y el factor de dilucion. El resultado demostraba que el IFN proteico humano se secreta en una concentracion mas alta por las celulas HT1080 al dfa 5 despues de la infeccion que por las celulas el dfa 4 despues de la infeccion (Fig. 24). Las celulas el d 5 despues de la infeccion secretaban aproximadamente 325-355 pg/ml de IFN-gamma proteico humano.
B. Construccion y ensayo de un vector retrovmco competente en replicacion que codifica el gen IFN-gamma de raton
El vector retrovmco competente en replicacion, pAC3-mIFNg, que codifica el gen del IFN-gamma de raton, se derivo del armazon pAC3- yCD2 descrito anteriormente. El armazon de pAC3 en el vector pAC3-mIFNg se aislo por digestion con endonucleasa del ADN plasirndico pAC3- yCD2 con PsiI y NotI. La secuencia de ADNc del gen del IFN-gamma de raton se identifico y se confirmo entre tres secuencias obtenidas de los diferentes numeros de registro (BC119063, BC119065 y NM008337). El alineamiento de secuencia presentaba una secuencia identica entre las tres. La fase de lectura abierta del IFN-gamma de raton (SEQ ID NO: 38) se sintetizo con el sitio de enzimas de restriccion PsiI y NotI presentes en cada extremo del fragmento de ADN para la insercion posterior en el sitio correspondiente del armazon pAC3. La construccion resultante, pAC3-mIFNg, codifica 4 genes: el gag, el pol, el env, y el IFN-gamma de raton (Figura 22).
El vector de reserva se produjo por transfeccion transitoria del ADN plasirndico que codifica el vector en celulas HT1080 utilizando el reactivo de transfeccion FUGENE HD. Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, se recolecto el sobrenadante que contema el vector y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en almuotas a -80 °C para su uso posterior. El volumen espedfico del vector de reserva sin diluir se utilizo para infectar un HT1080 con un 75 % de confluencia. El dfa 4 y el dfa 5 despues de la infeccion, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en almuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros del vector de reserva recolectado para infectar celulas de cancer prostatico humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir una replicacion vmca adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, el ADN genomico de las celulas PC3 infectadas se extrajo para el ensayo de titulacion. El tttulo de los vectores de reserva se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
La expresion del IFN-gamma de raton se ensayo primero a nivel de ARN. Se extrajo el ARN total a partir de las celulas HT1080 transducidas a los 5 dfas despues de la infeccion en la segunda infeccion utilizando el metodo convencional de extraccion de ARN. Se llevo a cabo la RT-PCR para detectar la expresion de IFN-g de raton. SE utilizaron cincuenta nanogramos de ARN total en la reaccion RT para generar el ADNc. Un decimo del volumen de la reaccion RT se utilizo posteriormente para la PCR utilizando un conjunto de cebadores de PCR espedfico para el IFN de raton (Fig. 23). El resultado del RT-PCR demostraba que el IFN-gamma de raton se expresa en las celulas HT1080 infectadas con el vector pAC3-mIFNg.
La expresion del IFN-gamma proteico humano secretado se ensayo mediante ELISA convencional. El vector de reserva recolectado el dfa 4 y dfa 5 despues de la infeccion se diluyo en serie en el ensayo ELISA con el fin de obtener un intervalo lineal entre la concentracion proteica y el factor de dilucion. El resultado demostraba que el IFN proteico se secreta en una concentracion mas alta por las celulas HT1080 al dfa 5 despues de la infeccion que por las celulas el dfa 4 despues de la infeccion (Fig. 25). Las celulas el d 5 despues de la infeccion secretaban aproximadamente 33-42 ng/ml de IFN-gamma proteico de raton.
Ejemplo de referencia 25: Estudios de eficacia antitumoral con un vector de expresion de interferon gamma en un modelo de tumor subcutaneo de raton
Objetivo
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un nuevo vector retrovmco competente en replicacion basado en MLV que alberga la secuencia de interferon gamma murino (pAC3-mIFNg) sobre el crecimiento tumoral, cuando se suministra mediante inyeccion intratumoral (IT) en ratones BALB/c que albergan un carcinoma de colon subcutaneo (CT26.WT).
Ratones
Los ratones BALB/c hembras (de ~ 8 semanas de edad) se adquirieron en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los ratones se aclimataron durante 7 dfas despues de la llegada antes de iniciar los estudios.
Celulas
Las celulas CT26.WT (ATCC, Manassas VA) son una lmea celular de carcinoma de colon indiferenciado inducidas por N-nitroso-N-metiluretano-(NNMU). Las celulas se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco con un 10% de suero bovino fetal, piruvato sodico, y Glutamax (Hyclone, Logan UT, e Invitrogen, San Diego CA). Las celulas se resuspendieron en PBS (Hyclone, Logan UT) para la implantacion. Las celulas CT26.WT (2E5 en 100 pl) se inyectaron en el flanco derecho de los ratones BALB/C.
Vector
Las preparaciones del vector se hicieron portransfeccion transitoria (o de una lmea celular productora despues de la infeccion de una segunda lmea celular con el virus infeccioso de la transfeccion inicial; Solic. de EE.UU. 61218063) con tftulos de aproximadamente 3E6 UT/ml. Para los estudios iniciales el vector no se purifica o concentra adicionalmente. Para los siguientes experimentos para determinar las curvas de respuesta de dosis completa, se prepara un material purificado con alto tftulo con un tftulo esperado alrededor de 10E8 /ml. Para conseguir un material con alto tftulo, se escogio la lmea celular CF2 canina para la produccion ya que el interferon gamma es poco reactivo entre especies y el uso de lmeas celulares xenogenicas evitara la accion inhibidora del interferon gamma en las celulas productoras. El vector se purifica y se concentra como se describe en la memoria descriptiva. El vector se administra IT en un volumen de 100 pl y la dosis total/raton de aproximadamente 3E3, 3E4 y 3E5 UT/raton. Se identifico el vector que expresaba el interferon gamma como Toca 621.
Implantacion del tumor e inyeccion del vector
Se les implanto a nueve grupos de hembras BALB/c (99 ratones, 9-10 semanas de edad) por via subcutanea con celulas tumorales CT26.WT (Dfa 0) y entonces se dosificaron (dfa 4-7 dependiendo de la tasa de crecimiento del tumor CT26; aproximadamente 50-100 mm3) con vehmulo (Grupo 1), con vector de control (AC3-GFP (V), (Grupo 2), inyeccion IT del vector Toca 621 (Grupos 3-5), o inyeccion intravenosa del vector Toca 621 (Grupos 6-8). Los ratones del grupo 9 no teman implantado tumor y se les inyecto solo el vector por via intravenosa.
Analisis de datos
Los analisis de crecimiento tumoral se llevaron a cabo hasta 2000 mm3 o a los 60 dfas basandose en el que llegara primero. 10 ratones de cada grupo se representaron en cuanto al tamano del tumor respecto al tiempo. Se determinara la significacion estadfstica utilizando el analisis de varianza (ANOVA). Los valores de P de < 0,05 se consideran estadfsticamente significativos en todos los analisis que se llevaron a cabo con el software estadfstico Prism 5 (software GraphPad) o equivalente. Se tomaron tambien observaciones en vivo para evaluar cualquier evento adverso con la administracion de Toca 621.
Resultados
Los resultados de medicion del tamano tumoral a lo largo del tiempo muestran una diferencia estad^sticamente significativa en el crecimiento de tumores tratados con el vector que expresa el IFN gamma sobre los tumores en animales que recibfan el vector de control o vehmulo.
Ejemplo de referencia 26: Estudios de eficacia antitumoral con un vector que expresa el interferon gamma en un modelo de tumor subcutaneo en el raton.
Objetivo
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un nuevo vector retrovmco competente en replicacion basado en MLV que alberga la secuencia de interferon gamma murino (pAC3-mIFNg) sobre el crecimiento tumoral, cuando se suministra mediante inyeccion intratumoral (IT) en ratones BALB/c que albergan un carcinoma de colon subcutaneo (CT26.WT).
Ratones
Los ratones BALB/c hembras (de ~ 8 semanas de edad) se adquirieron en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los ratones se aclimataron durante 7 dfas despues de la llegada antes de iniciar los estudios.
Celulas
Las celulas CT26.WT (ATCC, Manassas VA) son una lmea celular de carcinoma de colon indiferenciado inducidas por N-nitroso-N-metiluretano-(NNMU). Las celulas se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco con un 10% de suero bovino fetal, piruvato sodico, y Glutamax (Hyclone, Logan UT, e Invitrogen, San Diego CA). Las celulas se resuspendieron en PBS (Hyclone, Logan UT) para la implantacion. Las celulas CT26.WT (2E5 en 100 pl) se inyectaron en el flanco derecho de los ratones BALB/C.
Vector
Las preparaciones del vector se hicieron portransfeccion transitoria (o de una lmea celular productora despues de la infeccion de una segunda lmea celular con el virus infeccioso de la transfeccion inicial; Solic. De EE.UU. 61218063) con tttulos de aproximadamente 3E6 UT/ml. Para los estudios iniciales el vector no se purifica o concentra adicionalmente. Para los siguientes experimentos para determinar las curvas de respuesta de dosis completa, se prepara un material purificado con alto tttulo con un tttulo esperado alrededor de 10E8 /ml. Para conseguir un material con alto tftulo, se escogio la lmea celular CF2 canina para la produccion ya que el interferon gamma es poco reactivo entre especies y el uso de lmeas celulares xenogenicas evitara la accion inhibidora del interferon gamma en las celulas productoras. El vector se purifica y se concentra como se describe en la memoria descriptiva. El vector se administra IT en un volumen de 100 pl y la dosis total/raton de aproximadamente 3E3, 3E4 y 3E5 UT/raton. Se identifico el vector que expresaba el interferon gamma como Toca 621.
Implantacion del tumor e inyeccion del vector
Se les implanto a nueve grupos de hembras BALB/c (99 ratones, 9-10 semanas de edad) por via subcutanea con elulas tumorales CT26.WT (Dfa 0) y entonces se dosificaron (dfa 4-7 dependiendo de la tasa de crecimiento del tumor CT26; aproximadamente 50-100 mm3) con vehmulo (Grupo 1), con vector de control (AC3-GFP (V), (Grupo 2), inyeccion IT del vector Toca 621 (Grupos 3-5), o inyeccion intravenosa del vector Toca 621 (Grupos 6-8). Los ratones del grupo 9 no teman implantado tumor y se les inyecto solo el vector por via intravenosa.
Analisis de datos
Los analisis de crecimiento tumoral se llevaron a cabo hasta 2000 mm3 o a los 60 dfas basandose en el que llegara primero. 10 ratones de cada grupo se representaron en cuanto al tamano del tumor respecto al tiempo. Se determinara la significacion estadfstica utilizando el analisis de varianza (ANOVA). Los valores de P de < 0,05 se consideran estadfsticamente significativos en todos los analisis que se llevaron a cabo con el software estadfstico Prism 5 (software GraphPad) o equivalente. Se tomaron tambien observaciones en vivo para evaluar cualquier evento adverso con la administracion de Toca 621.
Resultados
Los resultados de medicion del tamano tumoral a lo largo del tiempo muestran una diferencia estad^sticamente significativa en el crecimiento de tumores tratados con el vector que expresa el IFN gamma sobre los tumores en animales que recibfan el vector de control o vehmulo.
Ejemplo de referencia 27. Suministro genetico intravenoso utilizando un vector vmco replicante Objetivo
El objetivo de este estudio era evaluar la eficacia del suministro intravenoso de un nuevo vector retrovmco competente en replicacion basado en MLV que tiene el marcador de protema fluorescente verde (AC3-GFP(V)) a gliomas U87 implantados en los cereros de ratones desnudos.
Ratones
Se adquirieron ratones atfmicos nude-Foxn1Aun (desnudos) hembras (edad ~ 8 semanas) en Harlan (Indianapolis, IN). Los ratones se aclimataron durante 7 dfas despues de llegar. Los ratones se sometieron a la colocacion quirurgica de una canula grna permanente con una proyeccion de 3,0 mm implantada en el cuerpo estriado derecho, y provisto con un tapon que contema una proyeccion de 3,5 mm. Las coordenadas estereotaxicas eran AP = 0,5 mm, ML = -1,8 mm (de Bregma).
Celulas
Las celulas U87-MG (ATCC, Manassas VA) se derivan de un glioma maligno de una mujer de raza blanca de 44 anos de edad. Las celulas se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco con un 10% de suero fetal bovino, piruvato sodico, y Glutamax (Hyclone, Logan UT, e Invitrogen, San Diego CA). Las celulas se resuspendieron en PBS (Hyclone, Logan UT) para la implantacion. Las celulas U87-MG (1E5 en 1 j l) se infundieron a 0,2 j l por minuto (5 minutos, seguido por un descanso de 5 minutos) IC mediante una canula de inyeccion con una proteccion de 3,5 mm insertada a traves de la canula grna.
Las preparaciones de vector se hicieron por transfeccion transitoria y todas teman tttulos de aproximadamente 2,8E7 UT/ml. El vector se administro por via intratumoral (IT) en un volumen de 5 ul o menos para una dosis total mmima/raton de aproximadamente 1,4E45 UT/raton. Se hicieron inyecciones intravenosas mediante la vena caudal con 2,8E6/100 ul.
Implantacion del tumor e inyeccion del vector
Se implanto a cinco grupos de ratones hembras FoxnlAun desnudos (16 ratones, 9-10 semanas de edad) por via IC con celulas tumorales U87 (Dfa 0) y entonces se dosificaron IT o IV (dfa 4-7 dependiendo de la tasa de crecimiento de las celulas U87) con un vehmulo IV (Grupo 1), con vector IV (Grupo2), IT con el alterador de la barrera hematoencefalica Vardenafil y vector (Grupo 3), IT con Vardenafil y vector (Grupo 4), o IT con vector (Grupo 5). 14 dfas despues de la inyeccion con el vector los ratones se sacrificaron y los tumores se aislaron y analizaron en cuanto a la expresion de GFP.
Analisis de datos
Se analizaron las celulas U87 aisladas de los tumores alterados de los ratones por citometna de flujo en cuanto al porcentaje de GFP positiva de los grupos 2-5 (Figura 26). El analisis de histograma tambien se hizo para los grupos 1,3, y 5 para medir la distribucion de la senal de GFP en las celulas U76 aisladas (Figura 27).
Resultados
El suministro intravenoso de GFP era igualmente eficaz como inyeccion intratumoral de las celulas de glioma U87 implantadas intracranealmente en ratones desnudos.
Ejemplo de referencia 28. Construccion de un vector retrovmco competente en replicacion que codifica el gen de IL-2 humano
El vector retrovmco competente en replicacion, pAC3-hIL2, que codifica el gen de la IL-2 human, se deriva del armazon del vector pAC3- yCD2. El armazon pAC3 del ADC plasirndico que codifica bel vector pAC3-hIL2 se aislo por digestion mediante endonucleasas del ADN plasirndico pAC3- yCD2 con PsiI y NotI. La secuencia de ADNc del gen del IFN-y humano se identifico y se confirmo utilizando secuencias obtenidas de los diferentes numeros de registro (BC066255 y BC066257). El alineamiento de secuencias de los dos revelaba una secuencia identica. La fase de lectura abierta del IFN-y humano (SEQ ID NO: 40) se sintetizo con los sitios de enzimas de restriccion PsiI y NotI en cada extremo del fragmento de ADN para la insercion posterior en el sitio correspondiente del armazon de pAC3. La construccion resultante, pAC-hIL2, codifica 4 genes: el gag, el pol, el env, y la IL-2 humana (Figura 28). Se produjo una reserva de vector por transfeccion transitoria del ADN plasirftdico que codifica el vector en celulas 293T utilizando el metodo de fosfato de calcio. Dieciocho horas despues de la transfeccion, se remplazo el cultivo con medio nuevo. Veinticuatro horas despues del remplazo de medio, el sobrenadante que contema el vector se recolecto y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm y se utilizo inmediatamente o se almaceno en aftcuotas a -80 °C para su uso posterior. Se utilizaron veinte microlitros de las reservas de vector recolectadas para infectar celulas de cancer de prostata humano, PC3. Veinticuatro horas despues de la infeccion, se anadio AZT a las celulas para inhibir la replicacion vftica adicional. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, se extrajo el ADN de las celulas PC3 infectadas para el ensayo de titulacion. El tftulo de las reservas de vector se determino por qPCR con una inclusion de referencias de numero de copias conocido.
La expresion de IL-2 humana se ensayo primer a nivel de ARN. SE extrajo el ARN total de celulas CF2TH y HT1080 a los 5 dfas despues de la infeccion utilizando un metodo convencional de extraccion de ARN. SE llevo a cabo la RT-PCR para detectar la expresion de IL-2 humana. Se utilizaron cincuenta nanogramos de ARN total en la reaccion RT para generar el ADNc. Un decimo del volumen de la reaccion de RT se utilizo posteriormente para la PCR utilizando un conjunto de cebadores de PCR espedficos para la IL-2 humana. Los resultados de la RT-PCR muestran que la lL-2 humana se expresa en las celulas HT1080 transducidas con el vector pAC3-hIL2.
La expresion de la IL-2 proteica human secretada se ensayo por ELISA convencional. La reserva de vector recolectada desde el dfa 5 despues de la infeccion se diluyo en serie en el ensayo ELISA con el fin de obtener un intervalo lineal entre la concentracion proteica y el factor de dilucion. El resultado demostraba que la IL-2 proteica humana se secreta a mayor concentracion en las celulas CF2TH que en las HT1080 a los 5 dfas despues de la infeccion.
Ejemplo de referencia 29. Estudios de eficacia antitumoral con un vector que expresa interleucina 2 en un modelo de tumor subcutaneo en ratones
Objetivo
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un nuevo vector retrovmco competente en replicacion basado en MLV que alberga la secuencia de la hormona leucocitotropica interleucina 2 (pAC3-mIL2) sobre el crecimiento tumoral, cuando se suministra mediante inyeccion intratumoral (IT) en ratones BALB/c que albergan un carcinoma de colon subcutaneo (CT26.WT).
Ratones
Los ratones BALB/c hembras (de ~ 8 semanas de edad) se adquirieron en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los ratones se aclimataron durante 7 dfas despues de la llegada antes de iniciar los estudios.
Celulas
Las celulas CT26.WT (ATCC, Manassas VA) son una lmea celular de carcinoma de colon indiferenciado inducidas por N-nitroso-N-metiluretano-(NNMU). Las celulas se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco con un 10% de suero bovino fetal, piruvato sodico, y Glutamax (Hyclone, Logan UT, e Invitrogen, San Diego CA). Las celulas se resuspendieron en PBS (Hyclone, Logan UT) para la implantacion. Las celulas CT26.WT (2E5 en 100 pl) se inyectaron en el flanco derecho de los ratones BALB/C.
Vector
Las preparaciones del vector se hicieron por transfeccion transitoria (o de una lmea celular productora; a la que se hace referencia como provisional) con tftulos de aproximadamente 3E6 UT/ml. Para los estudios iniciales el vector no se purifica o concentra adicionalmente. Para los siguientes experimentos para determinar las curvas de respuesta de dosis completa, se prepara un material purificado con alto tftulo con un tftulo esperado alrededor de 10E8 /ml. El vector se administra IT en un volumen de 100 pl y la dosis total/raton de aproximadamente 6E5 UT/raton. Se identifico el vector que expresaba el interferon gamma como Toca IL2.
Implantacion del tumor e inyeccion del vector
Se les implanto a cinco grupos de hembras BALB/c (55 ratones, 9-10 semanas de edad) por via subcutanea con celulas tumorales CT26.WT (Dfa 0) y entonces se dosificaron (dfa 4-7 dependiendo de la tasa de crecimiento del tumor CT26; aproximadamente 50-100 mm3) con vehmulo (Grupo 1), con vector de control (AC3-GFP (V), (Grupo 2), inyeccion IT del vector Toca IL2 (Grupo 3), o inyeccion intravenosa del vector Toca IL2 (Grupo 4). Los ratones del grupo 5 no teman implantado tumor y se les inyecto solo el vector por via intravenosa.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un retrovirus recombinante competente en replicacion que comprende:
una protema GAG retrovmca;
una protema POL retrovmca;
una envoltura retrovmca; y
un polinucleotido retrovmco que comprende una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 19 o 22
2. Un retrovirus como se define en la reivindicacion 1, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno proliferativo en combinacion con 5-fluorocitosina, en condiciones de manera que se exprese el polinucleotido retrovmco.
3. El retrovirus para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, donde el polinucleotido retrovmco esta integrado en una celula del sujeto,
y/o donde un vector retrovmco comprende el polinucleotido,
y/o donde el trastorno proliferativo celular es un glioblastoma multiforme,
y/o donde el trastorno proliferativo celular se selecciona de entre cancer de pulmon, cancer de colon-recto, cancer de mama, cancer de prostata, cancer del tracto urinario, cancer uterino, cancer cerebral, cancer de cabeza y cuello, cancer pancratico, melanoma, cancer de estomago o cancer ovarico.
4. Un retrovirus como se define en la reivindicacion 1 para su uso en un sujeto que tiene un trastorno proliferativo celular en combinacion con un agente anticancer o un agente quimioterapico, en condiciones de manera que el retrovirus infecte las celulas con el trastorno.
5. El retrovirus para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, donde el agente anticancer se selecciona de entre bevacizumab, pegaptanib, ranibizumab, sorafenib, sunitinib, AE-941, VEGF Trap, pazopanib, vandetanib, vatalanib, cediranib, fenretinida, escualamina, INGN-241, tetratiomolibdato oral, tetratiomolibdato, Panzem NCD, 2-metoxiestradiol, AEE-788, AG-013958, bevasiranib sodico, AMG-706, axitinib, BIBF-1120, CDP-791, CP-547632, PI-88, SU-14813, SU-6668, XL-647, XL-999, IMC-1121B, ABT-869, BAY-57-9352, BAY-73-4506, BMS-582664, CEP-7055, CHIR-265, CT-322, CX-3542, E-7080, ENMD-1198, OSI-930, PTC-299, Sirna-027, TKI-258, Veglin, XL-184, o ZK-304709.
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