CN103068835A - 重组rna 病毒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述了修饰RNA病毒基因区段和编码修饰RNA病毒基因区段的核酸。本文还描述了包含修饰RNA病毒基因区段的重组RNA病毒和这类重组RNA病毒在疾病预防和治疗中的用途。

Description

重组RNA 病毒及其用途
本申请要求2010年6月6日提交的美国临时申请号61/351,908的优先权，其通过引用以其整体结合到本文中。
在陆军研究办公室(Army Research Office)授予编号W911NF-07-R-0001-05的政府支持下完成本发明。政府在本发明中享有一定权利。
1.引言
本文描述了修饰RNA病毒基因区段和编码修饰RNA病毒基因区段的核酸。本文还描述了包含修饰RNA病毒基因区段的重组RNA病毒和这类重组RNA病毒在疾病预防和治疗中的用途。本文进一步描述了RNA病毒用于递送干扰疾病相关基因表达的RNA分子的用途。
2.背景
能够产生擅于调节信使RNA(例如miRNA)的RNA序列的病毒，在对抗疾病和病症时以及在加大宿主对用于疫苗接种的病毒的反应时，可能代表了有价值的资源。实际上，有效和无毒递送miRNA的问题是一个重大挑战，并成为RNA干扰(RNAi)技术与其治疗应用之间最重要的障碍(参见例如Mittal(2004)Nat Rev Genet5(5):355-365；以及Grimm(2009)AdvancedDrug Delivery Reviews61:672-703)。虽然基于慢病毒和基于脂质的递送模型显示某种体内成功，但是胞内miRNA的基因组整合和/或产生不足限制于它们的应用(参见例如Mittal(2004)Nat Rev Genet5(5):355-365)。相比之下，发现未整合的病毒载体诱导超生理和持续水平的小RNA，通过宿主小RNA细胞机器的饱和而产生毒性(参见例如Grimm等(2006)Nature441(7092):537-541)。因此，存在对基于病毒的RNA递送系统的需要，所述系统包含具有诱导短暂的高水平RNA序列的能力的病毒，可加以利用以治疗疾病(参见例如Zeng等(2002)Mol Cell9(6):1327-1333)。
3.概述
本申请部分基于这样的发现，即可对RNA病毒进行改造以产生参与转录后基因沉默(PTGS)的异源RNA序列(例如微小RNA、小干扰RNA、反义RNA、小发夹RNA)。在某些方面，这些重组RNA病毒不进行基因组整合，并且能够在对象中正常复制，因此代表了将参与转录后基因加工的异源RNA序列递送给对象用于例如预防或治疗疾病和用于提高宿主对疫苗接种的免疫应答的优质病毒。
一方面，本文提供嵌合病毒基因组区段，其中嵌合病毒基因组区段来源于RNA病毒，且其中嵌合病毒基因组区段包含异源RNA，其中异源RNA在细胞中转录，产生干扰靶基因在细胞中表达的效应子RNA。在一个实施方案中，RNA病毒是节段单链负义RNA病毒或节段双链RNA病毒。在另一个实施方案中，效应子RNA是miRNA、mirtron、shRNA、siRNA、piRNA、svRNA或反义RNA。在某些实施方案中，从中得到嵌合病毒基因组区段的病毒是正黏病毒、本雅病毒或沙粒病毒。
在一个具体的实施方案中，嵌合病毒基因区段包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成正黏病毒基因可读框的部分的第一核苷酸序列；(c)剪接供体位点；(d)异源RNA序列；(e)剪接受体位点；和(f)构成正黏病毒基因可读框的部分的第二核苷酸序列；和(g)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。
在另一个具体的实施方案中，嵌合病毒基因区段包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成第一正黏病毒基因和第二流感病毒基因的可读框的部分的第一核苷酸序列；(c)剪接供体位点；(d)构成第一正黏病毒基因可读框的部分的第二核苷酸序列；(e)异源RNA序列；(e)剪接受体位点；(f)构成第二正黏病毒基因可读框的部分的第三核苷酸序列；和(g)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。在一个具体的实施方案中，第一正黏病毒基因是流感病毒NS1基因，第二正黏病毒基因是流感病毒NS2基因。在另一个具体的实施方案中，第一正黏病毒基因是流感病毒M1基因，第二正黏病毒基因是流感病毒M2基因。
另一方面，本文提供嵌合病毒基因组，其中嵌合病毒基因组来源于RNA病毒，且其中嵌合病毒基因组包含异源RNA，其中异源RNA在细胞中转录，产生干扰靶基因在细胞中表达的效应子RNA。在一个实施方案中，RNA病毒是非节段单链负义RNA病毒。在另一个实施方案中，RNA病毒是非节段单链正义RNA病毒。在另一个实施方案中，效应子RNA是miRNA、mirtron、shRNA、siRNA、piRNA、svRNA或反义RNA。在某些实施方案中，从其中得到嵌合病毒基因组的病毒是弹状病毒、副粘病毒、线状病毒、丁型肝炎病毒、波纳病毒、细小核糖核酸病毒、披膜病毒、黄病毒、冠状病毒、呼肠病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多蜱热病毒。
本文还提供重组RNA病毒，其包含本文提供的嵌合病毒基因组区段和嵌合病毒基因组。在具体的实施方案中，使重组RNA病毒减毒。
本文还提供编码本文提供的嵌合病毒基因组区段和嵌合病毒基因组的核酸。在具体的实施方案中，核酸是DNA。
本文还提供制备本文所述重组RNA病毒的方法，其中所述方法包括将本文所述核酸导入表达用于产生重组RNA病毒的所有其它组分的细胞中；从细胞上清液上纯化出重组RNA病毒。
本文还提供包含本文所述嵌合病毒基因组区段或本文所述嵌合病毒基因组或本文所述重组RNA病毒的底物，例如卵或细胞。
本文还提供包含本文所述重组RNA病毒的药物组合物和免疫原性组合物。
本文还提供治疗和/或预防对象的疾病的方法，所述方法包括将本文所述重组RNA病毒给予对象，其中由重组RNA病毒产生的效应子RNA干扰在疾病中过量表达或异位表达的基因的表达。
本文还提供包括本文所述重组RNA病毒、本文所述嵌合病毒基因组区段和/或本文所述嵌合病毒基因组的一种或多种的试剂盒。
3.13.1术语
本文所用术语“约”或“大约”当与数值连用时是指所引用的数值或是指所引用数值的1、5或10%以内的任何数值。
本文所用术语“疾病”和“病症”可互换使用，是指对象的病况。可按照本文所述方法治疗的示例性疾病/病症包括癌症、病毒感染、细菌感染和遗传紊乱。
在将某疗法给予对象的情况下，本文所用术语“有效量”是指具有预防作用和/或治疗作用的该疗法的量。在某些实施方案中，在将疗法给予对象或对象群的情况下，“有效量”是指足以实现疗法的1、2、3、4种或更多种以下作用的量：(i)减轻或改善对象或对象群的疾病的严重程度或其相关症状；(ii)缩短对象或对象群的疾病或其相关症状的持续时间；(iii)防止对象或对象群的疾病或其相关症状的进程；(iv)引起对象或对象群的疾病或其相关症状消退；(v)防止对象或对象群的疾病或其相关症状发生或发作；(vi)防止对象或对象群的疾病或其相关症状复发；(vii)防止或减慢疾病从一对象或对象群传播给另一对象或对象群；(viii)减少与对象或对象群的疾病相关的器官衰竭；(ix)降低对象或对象群的住院发生率；(x)缩短对象或对象群的出院期长度；(xi)延长对象或对象群的生存期；(xii)消除对象或对象群的疾病；(xiii)提高或改善对象或对象群中另一疗法的预防或治疗作用；(xiv)防止病毒或细菌从对象的一种细胞、组织、器官传播到对象的另一种细胞、组织、器官；和/或(xv)减少对象或对象群的疾病症状的数目。
本文所用术语“重组RNA病毒”是指包含异源RNA的本文所述病毒。重组RNA病毒不包括反转录病毒。
本文所用术语“靶基因”是指对象或植物中由重组RNA病毒产生的效应子RNA所针对的基因。在一些实施方案中，靶基因是与疾病有关的基因，即靶基因的表达涉及疾病的发病机制。在一些实施方案中，靶基因是病原体的基因，例如靶基因是病原体复制或存活所必需的基因。
在一些实施方案中，本文所用术语“野生型”在病毒的情况下，是指流行的、自然传播并发生典型疾病爆发的病毒的类型。在其它实施方案中，在病毒的情况下，术语“野生型”是指亲代病毒。
本文所用术语“异源RNA”是指已导入RNA病毒基因组且不是野生型RNA病毒基因组的组成部位的RNA序列。异源RNA的转录和任选所得转录物的加工产生效应子RNA。
本文所用术语“效应子RNA”，是指产生自异源RNA的转录(任选加工)且干扰基因表达的RNA分子。
本文所用术语“转录后基因沉默”简写为PTGS，是指与基因对应的DNA序列转录后基因的修饰。
本文所用术语“使……杂交”、“杂交”是指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，本文所用术语“使……杂交”、“杂交”是指彼此至少60%(例如70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或99.5%)互补的两个或更多个核酸序列的结合。在某些实施方案中，杂交在高严格条件的控制下。在某些实施方案中，杂交在中等(即中间)严格条件控制下。在某些实施方案中，杂交在低严格条件控制下。在一些实施方案中，2个核酸杂交彼此杂交，即使它们不完全互补，例如它们在低至中等严格条件下杂交。本领域技术人员应了解的是，低、中和高严格条件取决于均相互发生作用的多种因素，并且还依赖于所涉及的核酸的具体性质。在某些实施方案中，核酸只在高严格条件下与其互补序列杂交。例如，高严格条件通常可包括核酸的解链温度5℃以内的温度、低盐浓度(例如小于250mM)和高助溶剂浓度(例如1-20%的助溶剂，例如DMSO)。另一方面，低严格条件可包括低于核酸解链温度超过10℃的温度、高盐浓度(例如大于1000mM)和缺乏助溶剂。核酸杂交技术和条件是本领域已知的，描述于例如Sambrook等,MolecularCloning A Laboratory Manual，第二版,Cold Spring Lab.Press,1989年12月；美国专利号4,563,419和4,851,330及Dunn等,1978,Cell 12:23-26以及许多其它出版物。对杂交反应的各种修改是本领域已知的。
在将两种或更多种疗法给予对象的情况下，本文所用术语“组合”是指应用不止一种疗法(例如不止一种预防剂和/或治疗剂)。术语“组合”的使用不限制其中给予对象的疗法的顺序。例如，可在将第二疗法给予对象之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、同时或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)给予第一疗法(例如第一预防剂或治疗剂)。
本文所用术语“病毒感染”意指细胞或对象中病毒的侵入、繁殖和/或存在。在一个实施方案中，病毒感染是“主动”感染，即其中病毒在细胞或对象中复制的感染。这类感染的特征在于病毒从最初感染病毒的细胞、组织和/或器官传播到其它细胞、组织和/或器官。感染还可以是潜伏感染，即其中病毒不复制的感染。
本文所用术语“细菌感染”意指细胞或对象中细菌的侵入、繁殖和/或存在。
本文所用术语“病原体感染”意指细胞或对象中病原体的侵入、繁殖和/或存在。
本文所用术语“流感病毒疾病”是指因细胞或对象中流感病毒(例如甲型流感病毒或乙型流感病毒)的存在或者流感病毒侵入细胞或对象中而产生的病理状态。在具体的实施方案中，该术语是指由流感病毒引起的呼吸道疾病。
本文所用术语“病毒疾病”是指因细胞或对象中病毒的存在或者病毒侵入细胞或对象中而产生的病理状态。
本文所用数学术语“log”是指log10。
本文所用表述“感染复数”或“MOI”是每个被感染细胞的感染性病毒颗粒的平均数。通过将所加入的感染性病毒颗粒数(ml所加x PFU/ml)除以所加入的细胞数(ml所加x细胞/ml)来求出MOI。
本文所用术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核酸、核糖核苷酸和核糖核酸及其寡聚体和多聚体形式及其类似物，并包括单链或双链形式。核酸包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物。核酸类似物包括以下核酸类似物：含有非天然存在的碱基、与其它核苷酸形成天然存在的磷酸二酯键以外的键的核苷酸或含有通过磷酸二酯键以外的键连接的碱基。因此，核酸类似物包括例如而不限于锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、糖核酸(glycolnucleic acid、GNA)、苏糖核酸(TNA)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硼酸磷酸酯(boranophosphate)、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸等。在某些实施方案中，本文所用术语“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。
在将疗法给予对象以预防疾病的情况下，本文所用术语“预防”和“防止”是指因给予疗法或疗法的组合引起的一种或两种下列作用：(i)抑制疾病或其症状发生或发作；和(ii)抑制疾病或其相关症状复发。
当在从天然来源(例如细胞)获得的蛋白质或核酸的情况下使用时，本文所用术语“纯化的”和“分离的”是指这样的多肽，其基本上不含来自天然来源的污染物质(例如来自环境的土壤颗粒、物质、化学物质)和/或天然来源的细胞物质，例如但不限于细胞碎片、细胞壁物质、膜、细胞器、细胞中存在的大量核酸、糖、蛋白质和/或脂质。因此，被分离的蛋白质或核酸包括具有细胞物质和/或污染物质小于约30%、20%、10%、5%、2%或1%(占干重)的蛋白质或核酸的制备物。当在是化学合成的蛋白质或核酸的情况下使用时，本文所用术语“纯化的”和“分离的”是指这样的蛋白质或核酸，其基本上不含参与多肽合成的化学前体或其它化学物质。
本文所用术语“病毒复制”是指导致病毒繁殖的病毒生活周期的一个或多个或全部阶段。病毒生活周期的阶段包括但不限于病毒附着在宿主细胞表面上、穿透或进入宿主细胞(例如通过受体介导的胞吞或膜融合)、脱壳(藉此脱去病毒衣壳并被病毒酶或宿主酶降解从而释放病毒基因组核酸的过程)、基因组复制、病毒信使RNA(mRNA)合成、病毒蛋白合成、以及用于基因组复制的病毒核糖核蛋白复合体的装配、病毒颗粒的装配、病毒蛋白的翻译后修饰、通过溶解或芽殖从宿主细胞中释放并获得含有嵌入病毒糖蛋白的磷脂包膜。在一些实施方案中，术语“病毒复制”是指病毒基因组的复制。在其它实施方案中，术语“病毒复制”是指病毒蛋白的合成。
本文所用术语“对象”或“患者”可互换使用，是指动物(例如禽、爬行动物和哺乳动物)。在一个具体的实施方案中，对象是禽(例如鸡或鸭)。在另一个实施方案中，对象是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如猴、黑猩猩和人)。在某些实施方案中，对象是非人动物。在一些实施方案中，对象是农场动物(例如牛、猪、马、绵羊、山羊等)或宠物(例如狗、猫等)。在另一个实施方案中，对象是人。在另一个实施方案中，对象是婴幼儿。在另一个实施方案中，对象是儿童。在另一个实施方案中，对象是成人。在另一个实施方案中，对象是老年人。在另一个实施方案中，对象是早产婴儿。
本文所用术语“早产婴儿”是指孕龄少于37周出生的婴儿。
本文所用术语“婴幼儿”是指新生至1岁的人。
本文所用术语“幼童”是指1岁-3岁大的人。
本文所用术语“儿童”是指1岁-18岁大的人。
本文所用术语“成人”是指18岁以上的人。
本文所用术语“老年人”是指65岁以上的人。
本文所用术语“疗法”可指可用于预防或治疗疾病或其相关症状的任何方案、方法、化合物、组合物、制剂和/或药剂。在某些实施方案中，术语“疗法”是指可用于治疗或预防本领域技术人员已知的疾病或其相关症状的生物疗法、支持疗法和/或其它疗法。在一些实施方案中，疗法不会导致疾病治愈。
在将疗法给予对象或对象群的情况下，本文所用术语“治疗”和“医治”是指治疗疾病以获得疗法或疗法组合的有益或治疗作用。在具体的实施方案中，这类术语是指因给予疗法或疗法组合而产生的1、2、3、4、5或更多种下列作用：(i)减轻或改善对象或对象群的疾病或其相关症状的严重程度；(ii)缩短对象或对象群的疾病或其相关症状的持续时间；(iii)防止对象或对象群的疾病或其相关症状的进程；(iv)对象或对象群的疾病或其相关症状消退；(v)防止对象或对象群的疾病或其相关症状的发生或发作；(vi)防止对象或对象群的疾病或其相关症状复发；(vii)防止或减少疾病从一对象或对象群传播给另一对象或对象群；(viii)减少与对象或对象群的疾病有关的器官衰竭；(ix)降低对象或对象群的住院发生率；(x)缩短对象或对象群的出院期长度；(xi)延长对象或对象群的生存期；(xii)消除对象或对象群的疾病；(xiii)提高或改善对象或对象群中另一疗法的预防或治疗作用；(xiv)防止病原体从对象的一种细胞、组织、器官传播到对象的另一种细胞、组织、器官；和/或(xv)减少对象或对象群的疾病的症状的数目。
本文所用术语“对象群”是指已向其给予疗法的一组至少5个的对象。在某些实施方案中，对象群为至少10个对象、至少25个对象、至少50个对象、至少100、至少500、至少1000个或介于10-25个对象、25-50个对象、50-100个对象、100-500个对象或500-1000个对象。
4.附图简述
图1：改造的裂解NS1/NEP病毒不影响病毒复制。(A)上：与改造的裂解NS1/NEP构建体相比原始NS vRNA区段的简图。中：来自改造的裂解vRNA的NS1和NEP mRNA及编码用于递送外源miRNA的剪切RFP构建体的质粒的简图。下：合成的(scbl)、pri-miR-124或pri-miR-124(R)插入序列的简图。星号表示插入序列连接的位置。(B)scbl、miR-124和miR-124(R)的基于质粒和基于病毒(MOI2)的miR-124表达的小的RNA印迹(Small northern blot)。miR-93和U6的水平用作加载对照。(C)MDCK细胞中模拟物(mock)或scbl、miR-124或野生型A/PR/8/34流感(wt)病毒感染的蛋白质印迹分析(MOI2)。印迹表示病毒核蛋白(NP)、非结构蛋白1(NS1)、核输出蛋白(NEP/NS2)和肌动蛋白。(D)MDCK细胞中进行的来自(C)的病毒的多周期生长曲线。误差棒表示一式三份样品的标准差。
图2：miR-124的改造病毒合成。(A)感染后规定小时内病毒miR-124的小的RNA印迹(MOI1)。miR-93和U6的水平用作加载对照。(B)用小核仁RNA-202(snoRNA-202)标准化的病毒miR-124水平的qRT-PCR分析。(C)用微管蛋白标准化的病毒PB2水平的qRT-PCR分析。误差棒表示标准差。(D)野生型和Dcr1-/-成纤维细胞中病毒miR-124水平的RNA印迹。(E)(D)中产生的样品的qRT-PCR。
图3：病毒基因组miRNA发夹不是Drosha的底物。(A)产生区段8的miR-124的简图。RNA种类包括vRNA、cRNA和mRNA。描述了用于后续实验的引物和参考号。用于反转录(RT)的引物如下：RT1表示寡聚dT，RT2对NS cRNA的非编码区有特异性。(B)NEP/NS2mRNA和NS1mRNA/3’NS cRNA的RT-PCR产物。RT1和RT2表示用于反转录反应的引物。RNA来源于模拟物感染的成纤维细胞(-)或用野生型流感A/PR/8/34处理的细胞(+)。(C)来自模拟物处理的成纤维细胞或用scbl或产生miR-124的甲型流感病毒感染的细胞的qPCR。数值表示与微管蛋白相比的5’NS cRNA水平。(D)同(C)，使用3’cRNA特异性引物。(E)同(D)，使用对pri-miR-124插入序列有特异性的引物。(F)病毒感染的5’RACE分析。对指定的凝胶切段进行纯化和测序，参照(A)中编号的简图，表中标明代表性结果。
图4：病毒基因组RNA不被miRNA靶定。(A)编码非靶定合成插入序列(scbl)或导向NS vRNA(vRNAt)或NS1mRNA(mRNAt)的miR-142靶位点的重组区段8的简图。(B)在用miR-142表达载体转染的细胞中探测miR-142表达的小的RNA印迹。(C)MDCK细胞、稳定表达miR-142、模拟物处理的或用scbl、vRNAt或mRNAt病毒(MOI0.1)感染的MDCK细胞的蛋白质印迹。描述了NS1、NP和肌动蛋白的免疫印迹。
图5：改造的流感病毒产生功能性miR-124。(A)用miR-124靶定的GFP构建体的转染的成纤维细胞，用合成的(scbl)或产miR-124的(miR-124)甲型流感病毒感染，并与未处理细胞进行比较。采用FACS分析测定GFP表达(感染后36小时)。(B)在48小时血清饥饿后或用合成的(scbl)或产miR-124的病毒感染(MOI1)后24小时之后，固定CAD细胞。细胞用β-微管蛋白染色后，通过共焦显微术成像。使用Hoechst染料来观测核。
图6：NS1UTR不产生miR-124。(A)表达在3’UTR具有mir-124发夹的NS1的质粒的简图。(B)模拟物、scbl和UTR转染细胞的蛋白质印迹分析。成转染后24小时收获纤维细胞。印迹表示NS1蛋白和肌动蛋白。(C)来自(B)加全长NS1/NEP124的样品的miR-124水平的qRT-PCR分析，用snoRNA-202标准化。
图7：(A)表示miR-124基因座的亚基因组插入点的重组新培斯病毒(Sindbis-124)的示意图。(B)CAD细胞的共焦显微照片。左图：模拟物感染的CAD细胞。右图：感染后36小时Sindbis-124感染的CAD细胞。(C)用Sindbis-124或编码合成的(scbl)RNA基因座的新培斯病毒感染的人293成纤维细胞的RNA印迹。产miR-124质粒的转染用作阳性对照。
图8：来自重组正黏病毒的异源RNA产生的图示。缩写词如下：vRNA为病毒基因组RNA；mRNA是转录的信使RNA；UN表示一段尿苷残基；AN表示一段腺嘌呤残基。A)转录和剪接时产生异源RNA的重组正黏病毒基因组区段(vRNA(修饰的))。B)转录时产生异源RNA的重组正黏病毒基因组区段(vRNA(修饰的))与核酶活动。
图9：来自重组非节段RNA病毒的异源RNA产生的图示。缩写词如下：5’C表示5’端帽；ns表示非结构蛋白；P123表示多蛋白质123；NCR表示非编码区；CP、E3、E2、6K和E1为结构蛋白；N、P、M、G和L为病毒基因；AN表示一段腺嘌呤残基。A)来自重组披膜病毒(Togaviridae)的异源RNA的产生。B)来自重组弹状病毒(Rhabdoviridae)的异源RNA的产生。
图10：示例性的异源RNA。(A)NFKBIA基因RNA靶。(B)流感病毒核蛋白基因RNA靶。(C)EGFR基因RNA靶。(D)KRAS基因RNA靶。(E)ELANE基因RNA靶。(F)弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)hepA基因RNA靶。(G)SARS冠状病毒核蛋白基因RNA靶。
图11：示例性的异源RNA。(A)流感病毒核蛋白基因RNA靶，作为典型套索的效应子RNA。(B)流感病毒核蛋白基因RNA靶，作为过客链递送套索(passenger strand delivery lariat)的效应子RNA。(C)流感病毒核蛋白基因RNA靶，作为核海绵(nuclear sponge)的效应子RNA。(D)流感病毒核蛋白基因RNA靶，核酶释放的效应子RNA。(E)单链负义RNA病毒的示例性基因组。(F)单链正义RNA病毒的示例性基因组。
图12：来自重组双链RNA病毒的异源RNA产生的图示。缩写词如下：L、M和S是病毒基因；IRES表示内部核糖体进入位点。呼肠病毒(科：呼肠病毒科(Reoviridae))用作从中可产生异源RNA的示例性双链RNA病毒。
图13：用模拟物对照、Sindbis-124或编码合成的(scbl)RNA基因座的新培斯病毒感染的核输出蛋白-5阳性293成纤维细胞、核输出蛋白-5阴性293成纤维细胞、切酶阳性永生化鼠成纤维细胞和切酶阴性永生化鼠成纤维细胞的RNA印迹。缩写词如下：m表示模拟物感染；s表示Sindbis(scbl)感染；124表示Sindbis(mir-124)感染。泳道1-3：切酶阳性细胞。泳道4-6：切酶阴性细胞。泳道7-9：核输出蛋白-5阳性细胞。泳道10-12：核输出蛋白-5阴性细胞。
图14：某些病毒科的分类及其结构特征。图14是以下文献的改进图：Flint等,Principles of Virology:Molecular Biology,Pathogenesis and Control ofAnimal Virus.第2版,ASM Press,2003。显示了本文所包括的病毒亚型。
图15：微小RNA前体的图示。描述了RNA链的5’端和3’端。标为1-5的各个部分为：1：miRNA框(miRNA frame)；2：过客链(有义链或miRNA星体(miRNA star))；3：中部miRNA框(环)；4：成熟miRNA(反义链或引导链)；5：3’miRNA框。平等线表示杂交d RNA链。
图16：(A)来源于野生型(WT)、切酶-(Dcr1-/-)、DGCR8-(Dgcr8-/-)或IFN-I(Ifnar1-/-)-缺陷型小鼠的鼠胚胎成纤维细胞用模拟物处理或用野生型新培斯病毒(SV)或表达miR-124的新培斯病毒(SV124)感染24小时(MOI2)。最上3个组图表示探测miR-124、miR-93和U6的RNA印迹。最下2个组图表示新培斯病毒核心蛋白和肌动蛋白的蛋白质印迹。(B)用miR-124靶定的GFP质粒(GFP_miR-124t)转染的人成纤维细胞再用产miR-124的质粒(p124)转染或用SV或SV124感染24小时(MOI2)。最上3个组图表示绿色荧光蛋白(GFP)、新培斯病毒核心蛋白和肌动蛋白的蛋白质印迹。最下3个组图表示探测miR-124、miR-93和U6的RNA印迹。
图17：(A)市售的针对人STAT1产生的短干扰RNA(siRNA)的描述。(B)如何可调节miR-124发夹以产生相同的siRNA的描述。(C)模拟转染的细胞(-)或用STAT1siRNA或STAT1amiRNA转染的细胞的RNA印迹法分析。探测STAT1siRNA和U6的RNA印迹。(D)在I型干扰素(IFN-I)不存在或存在时，表达amiRNA的细胞或表达野生型miRNA-124的质粒的蛋白质印迹。探测STAT1和β-肌动蛋白的蛋白质印迹。
图18：胞质介导的miRNA生物发生。(A)用WT或表达miR-124的SV、水泡性口炎病毒(VSV)或甲型流感病毒(IAV)感染的鼠胚胎成纤维细胞的RNA印迹。针对miR-124(上)、miR-93(中)和U6(下)探测RNA。(B)表达以下的人成纤维细胞：绿色荧光蛋白(GFP)、依赖RNA聚合酶II的miR-124质粒(p124)或在T7聚合酶的转录控制下的miR-124(T7miR-124)。在有或没有新培斯病毒感染的情况下，用T7_124转染的细胞再用载体(-)或T7聚合酶(T7Pol)转染。转染后6小时以MOI1进行病毒感染。按照(A)中所述分析样品。
图19：表达miR-124的RNA病毒构建体的模型。(A)在NS1和NS2之间插入IAV的miR-124(上)、插入SV(中)和在G和L之间插入VSV(中)及由胞质T7聚合酶驱动的miR-124(下)的示意图。(B)来自图18A中产生的样品的病毒转录物(SV nsp1、VSV G和IAV PB2)的qRT-PCR。(C)BHK细胞用WT或表达miR-124的SV、VSV和IAV感染，并且将miR-124表达与质粒来源的miR-124(p124)进行比较。针对miR-124(上)和miR-93(下)通过小的RNA印迹分析探测RNA样品。
图20：RNA病毒衍生的体内miRNA的产生。(A)IFNαR-/-小鼠用表达miR-124的SV、VSV或IAV感染。对于VSV，在感染(p.i.)后第1天从肺中提取RNA，对于SV和IAV在p.i.第2天提取，且小RNA RNA印迹探测miR-124(上)、miR-93(中)和U6(下)。
图21：胞质来源的miRNA导致星体链(star strand)的蓄积。(A)在模拟感染的和SV124、VSV124和IAV124感染的鼠胚胎成纤维细胞中对miR-124和miR-124星体链丰度的深度测序分析。各组图的Y轴表示细胞总miRNA的百分比。(B)miR-124(右上侧)和miR-124*(左上侧)的深度测序结果。得自脑、SV124、VSV124和IAV124的具体读数描述为总pri-miR-124-2读数的百分比。读数小于0.1%不列出(-)。下：在负责发夹形成影响下具有结合相互作用的miR-124-2序列。
图22：来自经改造的质型病毒的miR-124星体链的蓄积。鼠胚胎成纤维细胞用SV124、VSV124和IAV124(分别以MOI1、1.3)感染，感染后16小时，针对miR-124(A，上)、miR-124星体(B，上)和miR-93(A、B，下)通过小的RNA印迹探测RNA。
图23：(A)293细胞用加Flag标签的Ago2转染或GFP构建体用表达miR-124的病毒感染或用p124作为阳性对照转染。针对miR-124(上)、miR-124和miR-93(中)和U6(下)，通过小的RNA印迹分析探测来自免疫沉淀的Ago2和GFP以及10%作为加载对照的输入蛋白(input protein)的RNA。(B)BHK细胞用含有renilla和编码3’UTR中的scp1的萤光素酶的构建体转染，所述3’UTR含有内源miR-124靶位点。转染后4小时，分别以MOI1.1和3用WT或miR-124经改造的SV、VSV和IAV感染细胞，感染后12小时测定萤光素酶活性水平。使萤光素酶活性电子归一化至非靶定renilla，测量下降为较之于WT病毒感染的降低。萤光素酶减少的p值如下：p124p=0.0000047、SV124p=0.0022、VSV124p=0.00023和IAV p=0.0849。(C)BHK细胞用3’UTR中含有miR-124的串联完整靶位点的GFP(GFP_124t-3’UTR)转染以及或用表达miR-124的质粒(p124)共转染，或者转染后2小时分别用MOI1、3、5的miR-124经改造的SV、VSV和IAV感染。感染后12小时分离蛋白质，并通过蛋白质印迹分析探测GFP(上)；SV核心、VSV G和IAV NEP病毒蛋白(中间3组图)；及B-肌动蛋白(下)。
图24：针对Flag、GFP、SV壳体、VSV G、IAV NP和作为加载对照的肌动蛋白的表达，通过蛋白质印迹分析对图23A产生的蛋白质样品进行分析。
图25：(A)在血清存在或不存在时，将鼠胚胎成纤维细胞培养24小时，然后用MOI1的SV或MOI5的SV124感染。感染后16小时，提取RNA，且小的RNA印迹探测miR-122(上)、miR-93(中)和U6(下)。(B)293细胞用MOI1的SV或SV124感染16小时。从模拟物和感染细胞以及作为阳性对照的huh7肝细胞中提取RNA。小的RNA印迹探测miR-124(上)、miR-93(中)和U6(下)。
图26：(A)将鼠胚胎成纤维细胞与10uM CFSE一起孵育，并在有(右，模拟物)或没有(左，血清饥饿))10%血清的情况下培养，在血清饥饿后24和48小时，将细胞固定，并通过FACS分析。(B)来自图25A中产生的样品的病毒转录物的qRT-PCR。
图27：胞质miRNA生物发生缺陷型细胞中的SV124复制。(A)来自图28A中产生的WT和Dicer1-/-样品中的病毒转录物的qRT-PCR。(B)来自图28B中产生的WT和Tarbp-/-样品中的病毒转录物的qRT-PCR。(C)来自图28C中产生的WT和PACT-/-样品中的病毒转录物的qRT-PCR。(D)来自图28D中产生的WT Ago2-/-样品中的病毒转录物的qRT-PCR。
图28：(A)来源于模拟物处理的或用SV或SV124感染(MOI=1)24小时的WT(WT MEF)或切酶缺陷型(Dicer1-/-)小鼠的鼠胚胎成纤维细胞。提取RNA用于小RNA RNA印迹法，并探测miR-124(上)、miR-93(中)和U6(下)。(B)WT(WT MEF)或Tarbp2缺陷型(Tarbp2-/-)鼠胚胎成纤维细胞经模拟物处理，或用SV或SV124感染(MOI=1)24小时，同(A)一样对样品进行分析。(C)WT(WT MEF)或PACT缺陷型(PACT-/-)细胞用SV或SV124感染(MOI=1)24小时，同(A)一样对样品进行分析。(D)WT(WT MEF)或Ago2缺陷型(Ago2-/-)鼠胚胎成纤维细胞经模拟物处理，或用SV或SV124感染(MOI=1)24小时，同(A)一样对样品进行分析。
图29：(A)Dgcr8fl/fl鼠胚胎干细胞用MOI300的表达GFP或GFP_Cre的重组腺病毒(分别为AdV_GFP和AdV_Cre)感染。AdV感染后5天，细胞经模拟物处理或用SV或SV124感染(MOI=1)24小时，随后通过探测miR-124(上)、miR-93(中)和U6(下)的小RNA RNA印迹法进行分析。(B)Rnasenfl/fl鼠胚胎成纤维细胞用AdV_GFP或AdV_Cre(MOI=500)感染5天。然后细胞经模拟物处理或用SV或SV124(MOI=1)感染24小时。通过针对miR-124(上)、miR-93(中)和U6(下)探测的小RNA RNA印迹对RNA进行分析。(C)鼠胚胎成纤维细胞经模拟物处理或用SV或SV124(MOI=1)感染0、2、4、8、12或24小时。Rnasenfl/fl成纤维细胞还用AdV_GFP和AdV_Cre(MOI=500)感染5天，随后用MOI3的SV124感染。感染后24小时通过探测miR-124(上)、miR-93(中)和U6(下)的小RNA RNA印迹对RNA进行分析。(D)通过光密度测定法对来自(C)的pri-miR-124和成熟miR124条带进行分析。虚线表示成熟miR-124的检测限。
图30：核微处理器缺陷型细胞(nuclear microprocessor-deficient cell)中的SV124复制。(A)来自图29A中产生的DGCR8fl/fl样品的病毒转录物的qRT-PCR。(B)来自图29B中产生的Rnasenfl/fl样品的病毒转录物的qRT-PCR。
图31：IAV来源的miR-124的体内动力学。Balb/C野生型小鼠鼻内用1x104噬斑形成单位的对照甲型流感病毒(IAV CTRL)或表达miR-124的IAV(IAV124)感染，感染后1、3或5天收获整个肺。针对病毒来源的miR-124和miR-93表达通过小的RNA印迹对总RNA进行分析。
图32：VSV来源的miR-124的全身递送。Balb/C野生型小鼠鼻内用1x104噬斑形成单位的对照水泡性口炎病毒(VSV CTRL)或表达miR-124的VSV感染。在感染后2天通过小的RNA印迹，分析心脏、脾脏和肝脏的总RNA。RNA印迹表示病毒来源的miR-124和内源miR-93。
图33：(A)在野生型鼠成纤维细胞(WT)或缺乏切酶(Dcr1-/-)或功能性IFN-I受体(Ifnar1-/-)的成纤维细胞中进行的SV和SV124的多周期生长曲线。细胞以MOI0.1感染，在规定的时间点上统计噬斑。感染后48小时，WT、Dcr1-/-和Ifnar1-/-中SV和SV124复制水平之间的差异的p值分别为0.008、0.164和0.015。(B)人成纤维细胞经模拟物处理或用载体或产miR-124的质粒(p124)转染。转染后24小时，细胞用SV或SV124(MOI2)感染，且感染后24小时时收获。上2个组图表示新培斯病毒核心蛋白和肌动蛋白的蛋白质印迹。下3个组图表示探测miR-124、miR-93和U6的RNA印迹。(C)SV124基因组(上)或SV124负链基因组的miR-124寻靶的示意图。
5.发明详述
本文描述了用于将效应子RNA递送给患者的方法和组合物。具体地讲，本文描述了用于递送在患者中干扰特定靶基因的表达的效应子RNA的方法和组合物。靶基因可以是病原体基因或促疾病基因(例如癌基因)。在下文第5.7节中给出了靶基因和通过靶向这类基因可以治疗的疾病。这类效应子RNA可以是miRNA、mirtron、shRNA、siRNA、piRNA、svRNA和反义RNA。
一方面，本文描述了用于将效应子RNA递送给对象/患者的重组RNA病毒。这类重组RNA病毒包含异源RNA，所述异源RNA在宿主细胞中转录，任选加工产生效应子RNA，效应子RNA进而可干扰靶基因的表达。本文所述重组RNA病毒可来源于RNA病毒。可用于本文所述方法和组合物的RNA病毒是节段单链负义RNA病毒(例如正黏病毒)、非节段单链负义RNA病毒(单负股病毒目(Mononegavirales))、非节段单链正义RNA病毒(例如冠状病毒)、双义RNA病毒(例如本雅病毒和沙粒病毒)和双链RNA病毒(例如呼肠病毒)。
在某些实施方案中，重组RNA病毒来源于具有不是反转录病毒的RNA基因组的RNA病毒。在某些实施方案中，重组RNA病毒来源于节段单链负义RNA病毒、非节段单链负义RNA病毒、非节段单链正义RNA病毒或双链RNA病毒(例如呼肠病毒)。
另一方面，本文描述了编码包括下述异源RNA的病毒基因组或病毒基因组区段的核酸，特别是DNA分子。
另一方面，可对用于将效应子RNA递送给本文所述对象/患者的重组RNA病毒进行改造以包括miRNA应答元件(MRE)和效应子RNA(参见例如Perez等，2009，Nature Biotechnology27:572-576和WO2010101663)。MRE整合到病毒载体中可提供多个目的。首先，将对由病毒表达的效应子RNA起反应的MRE掺入本文所述重组病毒可起调节病毒本身的作用(即自我调节目的)。这可通过将对由病毒表达的效应子RNA起反应的MRE插入病毒基因组来实现，使得在MRE与之缔合的miRNA的存在下(例如由于通过病毒产生的效应子RNA所致)，使病毒减毒。组织特异性miRNA表达已有描述(参见例如Landgraf等，2007，Cell129(7):1401-1414)。因此，可通过将MRE掺入本文所述重组病毒而提供的第二个目的是调节病毒靶向某些组织的能力。这可通过将对对象的内源miRNA起反应的MRE插入病毒基因组来实现，其中所述对象的内源miRNA是组织特异性的。因此，病毒只可在对象的某些组织中繁殖，即不表达对MRE有特异性的miRNA的组织。因此当环境需要或许可时，MRE的这种掺入可通过例如使病毒减毒，在对象中起调节病毒载体作用，以及起调节病毒的组织特异性miRNA表达的作用。此外，可对具有已知向性的病毒进行改造，以具有由病毒产生的效应子RNA的组织特异性表达的基于MRE调节，使得提高病毒的现有向性。也就是说，组织寻靶提高的病毒可通过选择导致组织特异性寻靶的MRE来产生，其中靶定的组织已经是病毒对其具有天然向性的组织。
5.1节段单链负义重组RNA病毒
5.1.1嵌合病毒基因组区段
在某些实施方案中，在节段单链负义RNA病毒(例如正黏病毒)的病毒基因组区段中包括异源RNA。包含异源RNA的这类病毒基因组区段(其中重组RNA病毒来源于节段单链负义RNA病毒)在本节中称为嵌合病毒基因组区段。本文还描述了编码嵌合病毒基因组区段的核酸，例如DNA分子。
一方面，利用剪接以从由嵌合病毒基因组区段转录的病毒转录物中释放出异源RNA。在更具体的实施方案中，在天然进行剪接的病毒区段中包括异源RNA，例如流感病毒的M1/M2区段或流感病毒的NS1/NEP区段。在某些实施方案中，在病毒区段第一可读框的终止密码子后(例如如果使用流感病毒的话，如果使用NS1/NEP区段，则在NS1的终止密码子后，或如果使用M1/M2区段，则在M1的终止密码子后)，内源剪接受体位点被破坏并再造，在新的剪接受体位点后，从起始剪接受体位点到新剪接受体位点的序列进行复制，如图8A如示，从而产生基因间区(intergenic region)和位于剪接受体位点5’的第二可读框(同时保持第一可读框)。可将异源RNA克隆至该基因间区。虽不受理论束缚，但是在嵌合病毒基因组区段转录和剪接时，形成包括异源RNA的套索。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组区段的DNA分子。
在某些具体的实施方案中，在不引起该位置处的氨基酸取代的情况下，破坏内源剪接受体位点。在某些具体的实施方案中，内源剪接受体位点的破坏引起该位置处的保守氨基酸取代。在某些实施方案中，在不产生移码的情况下，使剪接受体位点的核苷酸缺失。
因此，在某些实施方案中，本文提供嵌合病毒基因组区段，其包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)包括剪接供体位点的正黏病毒基因的第一可读框；(c)具有异源RNA序列的基因间区；(d)剪接受体位点；(e)正黏病毒基因的第二可读框；和(f)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组区段的DNA分子。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的所有非编码区来源于同一毒株和/或同一物种和/或相同的RNA病毒类型。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的非编码区来源于与编码区相同的毒株和/或相同的物种和/或相同的RNA病毒类型。在一个具体的实施方案中，分离编码嵌合病毒基因组区段的嵌合病毒基因组区段或DNA分子。
流感病毒基因区段包装信号是已知的。此外，用于鉴定正黏病毒基因区段包装信号的技术是众所周知的。示例性的包装测定法(packaging assay)包括公开于Liang等，2005，J Virol79:10348-10355包装测定法和公开于Muramoto等，2006，J Virol80:2318-2325的包装测定法。描述于Liang等和Muramoto等的包装测定法的说明通过引用结合到本文中。可对Liang和Muramoto的方案的几个参数进行修改；例如可使用不同的宿主细胞，并且可使用不同的报道基因。
另一方面，可将剪接受体位点和剪接供体位点引入病毒基因组区段的可读框(ORF)。剪接受体和剪接供体位点的产生允许引入基因间区，且当剪除基因间区时，但形成套索。在某些具体的实施方案中，对分别类似于剪接受体位点或剪接供体位点的ORF中的序列分别进行修饰成为剪接受体位点或剪接供体位点，使得在分别形成剪接受体位点或剪接供体位点的序列中的取代产生较少的氨基酸改变。在某些实施方案中，通过引入剪接受体位点和剪接供体位点产生的任何氨基酸取代是保守氨基酸取代。在某些实施方案中，将剪接受体位点和剪接供体位点引入对基因的功能或其基因产物的功能是非必需的基因的部分。在某些实施方案中，剪接受体位点和剪接供体位点的引入使病毒减毒。
在某些实施方案中，本文提供嵌合病毒基因组区段，其包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成正黏病毒基因可读框的部分的第一核苷酸序列；(c)剪接供体位点；(d)异源RNA序列；(e)剪接受体位点；(f)构成正黏病毒基因可读框的部分的第二核苷酸序列；和(g)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组区段的DNA分子。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的所有非编码区来源于同一毒株和/或同一物种和/或相同的RNA病毒类型。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的非编码区来源于与编码区相同的毒株和/或相同的物种和/或相同的RNA病毒类型。在一个具体的实施方案中，分离编码嵌合病毒基因组区段的嵌合病毒基因组区段或DNA分子。
另一方面，在天然不进行剪接的嵌合病毒基因组区段例如流感病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP和NA区段中包括异源RNA。可将剪接供体位点和剪接受体位点引入嵌合病毒基因组区段的非翻译区。可将异源RNA引入剪接供体位点和剪接受体位点之间，使得在转录和剪接时，异源RNA从病毒mRNA中释放出来。
因此，在某些实施方案中，本文提供嵌合病毒基因组区段，其包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)正黏病毒基因的可读框；(c)剪接供体位点；(d)异源RNA序列；(e)剪接受体位点；和(f)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组区段的DNA分子。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的所有非编码区来源于同一毒株和/或同一物种和/或相同的RNA病毒类型。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的非编码区来源于与编码区相同的毒株和/或相同的物种和/或相同的RNA病毒类型。在一个具体的实施方案中，分离编码嵌合病毒基因组区段的嵌合病毒基因组区段或DNA分子。
在某些实施方案中，本文还提供嵌合病毒基因组区段，其包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)剪接供体位点；(c)异源RNA序列；(d)剪接受体位点；(e)正黏病毒基因的可读框；和(f)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组区段的DNA分子。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的所有非编码区来源于同一毒株和/或同一物种和/或相同的RNA病毒类型。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的非编码区来源于与编码区相同的毒株和/或相同的物种和/或相同的RNA病毒类型。在一个具体的实施方案中，分离编码嵌合病毒基因组区段的嵌合病毒基因组区段或DNA分子。
在其它方面，可使用核酶，以从由嵌合病毒基因组区段转录的病毒转录物中释放异源RNA。在这些方面，异源RNA的两侧可以是2个核酶识别基序和2个自切割核酶，使得通过2个侧翼核酶切下异源RNA。异源RNA可位于自嵌合病毒基因组区段转录的病毒转录物的5’或3’非翻译区。如果异源RNA位于病毒mRNA可读框的3’，则将10个以上尿嘧啶碱基的序列段(stretch)引入mRNA的可读框的3’。可以使用的自切割RNA包括但不限于锤头RNA、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白(CPEB3)核酶、核糖核酸酶P(RNaseP)和β-珠蛋白共转录切割(CotC)核酶。
在某些实施方案中，剪接与核酶组合。因此，嵌合病毒基因组区段可包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成正黏病毒基因的可读框的第一核苷酸序列；(c)大于10个尿嘧啶碱基的序列段；(d)剪接供体位点；(e)异源RNA序列；(e)核酶识别基序；(f)自催化RNA(例如丁型肝炎核酶(Hepatitis delta ribozyme))；(g)剪接受体位点；和(h)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。虽不受理论束缚，但是在转录和剪接时，所得到的包含核酶和异源RNA的套索被切割，以从套索中释放异源RNA(参见图8B)。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组区段的DNA分子。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的所有非编码区来源于同一毒株和/或同一物种和/或相同的RNA病毒类型。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的非编码区来源于与编码区相同的毒株和/或相同的物种和/或相同的RNA病毒类型。
在某些实施方案中，本文提供嵌合病毒基因组区段，其包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成正黏病毒基因可读框的部分的第一核苷酸序列；(c)核酶识别基序；(d)异源RNA序列；(e)自催化RNA(例如丁型肝炎核酶)；(f)构成正黏病毒基因可读框的部分的第二核苷酸序列；和(g)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组区段的DNA分子。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的所有非编码区来源于同一毒株和/或同一物种和/或相同的RNA病毒类型。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的非编码区来源于与编码区相同的毒株和/或相同的物种和/或相同的RNA病毒类型。在一个具体的实施方案中，分离编码嵌合病毒基因组区段的嵌合病毒基因组区段或DNA分子。
在某些实施方案中，异源RNA位于嵌合病毒基因组区段的5’非翻译区，并通过核酶释放(例如图8B)。因此，嵌合病毒基因组区段可包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成正黏病毒基因的可读框的第一核苷酸序列；(c)大于10个尿嘧啶碱基的序列段；(d)核酶识别基序；(e)异源RNA序列；(f)自催化RNA(例如丁型肝炎核酶)；和(g)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组区段的DNA分子。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的所有非编码区来源于同一毒株和/或同一物种和/或相同的RNA病毒类型。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的非编码区来源于与编码区相同的毒株和/或相同的物种和/或相同的RNA病毒类型。
在某些实施方案中，异源RNA位于嵌合病毒基因组区段的5’非翻译区，并通过核酶释放。因此，嵌合病毒基因组区段可包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)自催化RNA(例如丁型肝炎核酶)；(c)异源RNA序列；(d)核酶识别基序；(e)正黏病毒基因的可读框；和(g)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组区段的DNA分子。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的所有非编码区来源于同一毒株和/或同一物种和/或相同的RNA病毒类型。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的非编码区来源于与编码区相同的毒株和/或相同的物种和/或相同的RNA病毒类型。
在某些实施方案中，克隆核酶及其靶序列，使得只在病毒mRNA中有活性，但在vRNA中无活性。同样，引入剪接受体和供体位点，使得它们在mRNA中有活性，但在vRNA中无活性。
在某些实施方案中，节段单链负义RNA病毒在宿主细胞核中复制并转录，例如流感病毒。
在某些其它实施方案中，节段单链负义RNA病毒在宿主细胞的胞质中复制和转录，例如本雅病毒。在具体的实施方案中，如果重组RNA病毒是质型病毒，则构建病毒，使得异源RNA通过核酶活性而非通过剪接释放。
在某些实施方案中，异源RNA的病毒基因组区段自身不是Drosha核糖核酸酶或Dicer核糖核酸酶的底物。相反，剪接和/或核酶产物是Drosha核糖核酸酶或Dicer核糖核酸酶的底物。
在某些方面，构建嵌合病毒基因组区段，其包含(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)异源RNA序列；和(c)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。在某些具体的实施方案中，嵌合病毒基因组区段不含可读框。在更具体的实施方案中，引入剪接位点以从转录物中释放异源RNA。在其它更具体的实施方案中，将核酶识别序列和切割核酶识别序列的核酶引入异源RNA的3’或5’以从转录物中释放异源RNA。在其它更具体的实施方案中，将核酶识别序列和切割核酶识别序列的核酶引入异源RNA的3’或5’以从转录物中释放异源RNA。在其它实施方案中，将剪接位点和核酶组合，以从转录物中释放异源RNA。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组区段的DNA分子。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的所有非编码区来源于同一毒株和/或同一物种和/或相同的RNA病毒类型。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段的非编码区来源于与编码区相同的毒株和/或相同的物种和/或相同的RNA病毒类型。在一个具体的实施方案中，分离编码嵌合病毒基因组区段的嵌合病毒基因组区段或DNA分子。
5.1.2病毒
可进行改造以含有并表达嵌合病毒基因组区段的节段负义单链RNA病毒的非限制性实例包括：正黏病毒(例如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、托高土病毒(thogoto virus)和传染性鲑鱼贫血病(infectioussalmon anemia)病毒)、本雅病毒(例如布尼奥罗病毒、汉坦病毒、Dugbe病毒、山谷热病毒和番茄斑萎病毒)和沙粒病毒(例如拉沙病毒、胡宁病毒、马休波病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)。病毒可以是正黏病毒、本雅病毒和沙粒病毒的任何类型、种类和/或毒株。在某些具体的实施方案中，病毒是流感病毒。流感病毒的任何类型、种类和/或毒株可与本文所述方法和组合物一起使用。具体地讲，流感病毒的任何类型、亚型、种类和/或毒株可用产生来用于递送效应子RNA的重组RNA病毒。
在一个具体的实施方案中，经改造以含有并表达嵌合病毒基因组区段的病毒是甲型流感病毒。甲型流感病毒的非限制性实例包括亚型H10N4、亚型H10N5、亚型H10N7、亚型H10N8、亚型H10N9、亚型H11N1、亚型H11N13、亚型H11N2、亚型H11N4、亚型H11N6、亚型H11N8、亚型H11N9、亚型H12N1、亚型H12N4、亚型H12N5、亚型H12N8、亚型H13N2、亚型H13N3、亚型H13N6、亚型H13N7、亚型H14N5、亚型H14N6、亚型H15N8、亚型H15N9、亚型H16N3、亚型H1N1、亚型H1N2、亚型H1N3、亚型H1N6、亚型H1N9、亚型H2N1、亚型H2N2、亚型H2N3、亚型H2N5、亚型H2N7、亚型H2N8、亚型H2N9、亚型H3N1、亚型H3N2、亚型H3N3、亚型H3N4、亚型H3N5、亚型H3N6、亚型H3N8、亚型H3N9、亚型H4N1、亚型H4N2、亚型H4N3、亚型H4N4、亚型H4N5、亚型H4N6、亚型H4N8、亚型H4N9、亚型H5N1、亚型H5N2、亚型H5N3、亚型H5N4、亚型H5N6、亚型H5N7、亚型H5N8、亚型H5N9、亚型H6N1、亚型H6N2、亚型H6N3、亚型H6N4、亚型H6N5、亚型H6N6、亚型H6N7、亚型H6N8、亚型H6N9、亚型H7N1、亚型H7N2、亚型H7N3、亚型H7N4、亚型H7N5、亚型H7N7、亚型H7N8、亚型H7N9、亚型H8N4、亚型H8N5、亚型H9N1、亚型H9N2、亚型H9N3、亚型H9N5、亚型H9N6、亚型H9N7、亚型H9N8和亚型H9N9。
甲型流感病毒毒株的具体实例包括但不限于：A/sw/爱荷华/15/30(H1N1)；A/WSN/33(H1N1)；A/eq/布拉格/1/56(H7N7)；A/PR/8/34；A/野鸭/波茨坦/178-4/83(H2N2)；A/银鸥/DE/712/88(H16N3)；A/sw/香港/168/1993(H1N1)；A/野鸭/亚伯达/211/98(H1N1)；A/滨鸟/特拉华/168/06(H16N3)；A/sw/荷兰/25/80(H1N1)；A/sw/德国/2/81(H1N1)；A/sw/汉诺威/1/81(H1N1)；A/sw/波茨坦/1/81(H1N1)；A/sw/波茨坦/15/81(H1N1)；A/sw/波茨坦/268/81(H1N1)；A/sw/菲尼斯泰尔/2899/82(H1N1)；A/sw/波茨坦/35/82(H3N2)；A/sw/Cote d’Armor/3633/84(H3N2)；A/sw/根特/1/84(H3N2)；A/sw/荷兰/12/85(H1N1)；A/sw/Karrenzien/2/87(H3N2)；A/sw/什未林/103/89(H1N1)；A/火鸡/德国/3/91(H1N1)；A/sw/德国/8533/91(H1N1)；A/sw/比利时/220/92(H3N2)；A/sw/根特/V230/92(H1N1)；A/sw/莱比锡/145/92(H3N2)；A/sw/Re220/92hp(H3N2)；A/sw/巴库/909/93(H3N2)；A/sw/什列斯威－好斯敦/1/93(H1N1)；A/sw/苏格兰/419440/94(H1N2)；A/sw/巴库/5/95(H1N1)；A/sw/Best/5C/96(H1N1)；A/sw/英格兰/17394/96(H1N2)；A/sw/耶拿/5/96(H3N2)；A/sw/Oedenrode/7C/96(H3N2)；A/sw/Lohne/1/97(H3N2)；A/sw/Cote d’Armor/790/97(H1N2)；A/sw/巴库/1362/98(H3N2)；A/sw/意大利/1521/98(H1N2)；A/sw/意大利/1553-2/98(H3N2)；A/sw/意大利/1566/98(H1N1)；A/sw/意大利/1589/98(H1N1)；A/sw/巴库/8602/99(H3N2)；A/sw/Cotes d'Armor/604/99(H1N2)；A/sw/Coted’Armor/1482/99(H1N1)；A/sw/根特/7625/99(H1N2)；A/香港/1774/99(H3N2)；A/sw/香港/5190/99(H3N2)；A/sw/香港/5200/99(H3N2)；A/sw/香港/5212/99(H3N2)；A/sw/伊尔-维兰/1455/99(H1N1)；A/sw/意大利/1654-1/99(H1N2)；A/sw/意大利/2034/99(H1N1)；A/sw/意大利/2064/99(H1N2)；A/sw/柏林/1578/00(H3N2)；A/sw/巴库/1832/00(H1N2)；A/sw/巴库/1833/00(H1N2)；A/sw/Cote d’Armor/800/00(H1N2)；A/sw/香港/7982/00(H3N2)；A/sw/意大利/1081/00(H1N2)；A/sw/Belzig/2/01(H1N1)；A/sw/Belzig/54/01(H3N2)；A/sw/香港/9296/01(H3N2)；A/sw/香港/9745/01(H3N2)；A/sw/西班牙/33601/01(H3N2)；A/sw/香港/1144/02(H3N2)；A/sw/香港/1197/02(H3N2)；A/sw/西班牙/39139/02(H3N2)；A/sw/西班牙/42386/02(H3N2)；A/瑞士/8808/2002(H1N1)；A/sw/巴库/1769/03(H3N2)；A/sw/Bissendorf/IDT1864/03(H3N2)；A/sw/Ehren/IDT2570/03(H1N2)；A/sw/Gescher/IDT2702/03(H1N2)；A/sw/Haselünne/2617/03hp(H1N1)；A/sw//IDT2530/03(H1N2)；A/sw/IVD/IDT2674/03(H1N2)；A/sw/Nordkirchen/IDT1993/03(H3N2)；A/sw/Nordwalde/IDT2197/03(H1N2)；A/sw/Norden/IDT2308/03(H1N2)；A/sw/西班牙/50047/03(H1N1)；A/sw/西班牙/51915/03(H1N1)；A/sw/Vechta/2623/03(H1N1)；A/sw/Visbek/IDT2869/03(H1N2)；A/sw/Waltersdorf/IDT2527/03(H1N2)；A/sw/Damme/IDT2890/04(H3N2)；A/sw/Geldern/IDT2888/04(H1N1)；A/sw/Granstedt/IDT3475/04(H1N2)；A/sw/Greven/IDT2889/04(H1N1)；A/sw/Gudensberg/IDT2930/04(H1N2)；A/sw/Gudensberg/IDT2931/04(H1N2)；A/sw/Lohne/IDT3357/04(H3N2)；A/sw/Nortrup/IDT3685/04(H1N2)；A/sw/Seesen/IDT3055/04(H3N2)；A/sw/西班牙/53207/04(H1N1)；A/sw/西班牙/54008/04(H3N2)；A/sw/Stolzenau/IDT3296/04(H1N2)；A/sw/Wedel/IDT2965/04(H1N1)；A/sw/Bad Griesbach/IDT4191/05(H3N2)；A/sw/Cloppenburg/IDT4777/05(H1N2)；A/sw/
Figure BDA00002819658700212
/IDT3780/05(H1N2)；A/sw/
Figure BDA00002819658700213
/IDT4735/05(H1N2)；A/sw/Egglham/IDT5250/05(H3N2)；A/sw/Harkenblek/IDT4097/05(H3N2)；A/sw/Hertzen/IDT4317/05(H3N2)；A/sw/Krogel/IDT4192/05(H1N1)；A/sw/Laer/IDT3893/05(H1N1)；A/sw/Laer/IDT4126/05(H3N2)；A/sw/Merzen/IDT4114/05(H3N2)；A/sw/Muesleringen-S./IDT4263/05(H3N2)；A/sw/Osterhofen/IDT4004/05(H3N2)；A/sw/Sprenge/IDT3805/05(H1N2)；A/sw/Stadtlohn/IDT3853/05(H1N2)；A/sw/Voglarn/IDT4096/05(H1N1)；A/sw/Wohlerst/IDT4093/05(H1N1)；A/sw/Bad Griesbach/IDT5604/06(H1N1)；A/sw/Herzlake/IDT5335/06(H3N2)；A/sw/Herzlake/IDT5336/06(H3N2)；A/sw/Herzlake/IDT5337/06(H3N2)和A/野猪/德国/R169/2006(H3N2)。
在一个具体的实施方案中，经改造以含有并表达嵌合病毒基因组区段的病毒是乙型流感病毒。乙型流感病毒的具体实例包括毒株爱知/5/88、毒株秋田/27/2001、毒株秋田/5/2001、毒株阿拉斯加/16/2000、毒株阿拉斯加/1777/2005、毒株阿根廷/69/2001、毒株亚利桑那/146/2005、毒株亚利桑那/148/2005、毒株曼谷/163/90、毒株曼谷/34/99、毒株曼谷/460/03、毒株曼谷/54/99、毒株巴塞罗那/215/03、毒株北京/15/84、毒株北京/184/93、毒株北京/243/97、毒株北京/43/75、毒株北京/5/76、毒株北京/76/98、毒株比利时/WV106/2002、毒株比利时/WV107/2002、毒株比利时/WV109/2002、毒株比利时/WV114/2002、毒株比利时/WV122/2002、毒株波恩/43、毒株巴西/952/2001、毒株布加勒斯特/795/03、毒株布宜诺斯艾利斯/161/00)、毒株布宜诺斯艾利斯/9/95、毒株布宜诺斯艾利斯/SW16/97、毒株布宜诺斯艾利斯/VL518/99、毒株加拿大/464/2001、毒株加拿大/464/2002、毒株查科/366/00、毒株查科/R113/00、毒株济州/303/03、毒株千叶/447/98、毒株重庆/3/2000、毒株临床分离株SA1泰国/2002、毒株临床分离株SA10泰国/2002、毒株临床分离株SA100菲律宾/2002、毒株临床分离株SA101菲律宾/2002、毒株临床分离株SA110菲律宾/2002)、毒株临床分离株SA112菲律宾/2002、毒株临床分离株SA113菲律宾/2002、毒株临床分离株SA114菲律宾/2002、毒株临床分离株SA2泰国/2002、毒株临床分离株SA20泰国/2002、毒株临床分离株SA38菲律宾/2002、毒株临床分离株SA39泰国/2002、毒株临床分离株SA99菲律宾/2002、毒株CNIC/27/2001、毒株科罗拉多/2597/2004、毒株科尔多瓦/VA418/99、毒株捷克斯洛伐克/16/89、毒株捷克斯洛伐克/69/90、毒株大邱/10/97、毒株大邱/45/97、毒株大邱/47/97、毒株大邱/9/97、毒株B/Du/4/78、毒株B/德班/39/98、毒株德班/43/98、毒株德班/44/98、毒株B/德班/52/98、毒株德班/55/98、毒株德班/56/98、毒株英格兰/1716/2005、毒株英格兰/2054/2005)、毒株英格兰/23/04、毒株芬兰/154/2002、毒株芬兰/159/2002、毒株芬兰/160/2002、毒株芬兰/161/2002、毒株芬兰/162/03、毒株芬兰/162/2002、毒株芬兰/162/91、毒株芬兰/164/2003、毒株芬兰/172/91、毒株芬兰/173/2003、毒株芬兰/176/2003、毒株芬兰/184/91、毒株芬兰/188/2003、毒株芬兰/190/2003、毒株芬兰/220/2003、毒株芬兰/WV5/2002、毒株福建/36/82、毒株日内瓦/5079/03、毒株热那亚/11/02、毒株热那亚/2/02、毒株热那亚/21/02、毒株Genova/54/02、毒株Genova/55/02、毒株广东/05/94、毒株广东/08/93、毒株广东/5/94、毒株广东/55/89、毒株广东/8/93、毒株广州/7/97、毒株广州/86/92、毒株广州/87/92、毒株京畿道/592/2005、毒株汉诺威/2/90、毒株哈尔滨/07/94、毒株夏威夷/10/2001、毒株夏威夷/1990/2004、毒株夏威夷/38/2001、毒株夏威夷/9/2001、毒株河北/19/94、毒株河北/3/94)、毒株河南/22/97、毒株广岛/23/2001、毒株香港/110/99、毒株香港/1115/2002、毒株香港/112/2001、毒株香港/123/2001、毒株香港/1351/2002、毒株香港/1434/2002、毒株香港/147/99、毒株香港/156/99、毒株香港/157/99、毒株香港/22/2001、毒株香港/22/89、毒株香港/336/2001、毒株香港/666/2001、毒株香港/9/89、毒株休斯顿/1/91、毒株休斯顿/1/96、毒株休斯顿/2/96、毒株湖南/4/72、毒株茨城/2/85、毒株仁川(ncheon)/297/2005、毒株印度/3/89、毒株印度/77276/2001、毒株以色列/95/03、毒株以色列/WV187/2002、毒株日本/1224/2005、毒株江苏/10/03、毒株约翰内斯堡/1/99、毒株约翰内斯堡/96/01、毒株卡多马/1076/99、毒株卡多马/122/99、毒株鹿儿岛/15/94、毒株堪萨斯/22992/99、毒株哈尔科夫/224/91、毒株神户/1/2002、毒株高知/193/99、毒株拉齐奥/1/02、毒株Lee/40、毒株列宁格勒/129/91、毒株里斯本/2/90)、毒株洛杉矶/1/02、毒株卢萨卡/270/99、毒株里昂/1271/96、毒株马来西亚/83077/2001、毒株马普托/1/99、毒株马德普拉塔/595/99、毒株马里兰/1/01、毒株孟斐斯/1/01、毒株孟斐斯/12/97-MA、毒株密歇根/22572/99、毒株三重/1/93、毒株米兰/1/01、毒株明斯克/318/90、毒株莫斯科/3/03、毒株名古屋/20/99、毒株南昌/1/00、毒株纳什维尔/107/93、毒株纳什维尔/45/91、毒株内布拉斯加/2/01、毒株荷兰/801/90、毒株荷兰/429/98、毒株纽约/1/2002、毒株NIB/48/90、毒株宁夏/45/83、毒株挪威/1/84、毒株阿曼/16299/2001、毒株大阪/1059/97、毒株大阪/983/97-V2、毒株奥斯陆/1329/2002、毒株奥斯陆/1846/2002、毒株巴拿马/45/90、毒株巴黎/329/90、毒株帕尔马/23/02、毒株珀斯/211/2001、毒株秘鲁/1364/2004、毒株菲律宾/5072/2001、毒株釜山/270/99、毒株魁北克/173/98、毒株魁北克/465/98、毒株魁北克/7/01、毒株罗马/1/03、毒株萨嘎/S172/99、毒株首尔/13/95、毒株首尔/37/91、毒株山东/7/97、毒株上海/361/2002)、毒株滋贺/T30/98、毒株四川/379/99、毒株新加坡/222/79、毒株西班牙/WV27/2002、毒株斯德哥尔摩/10/90、毒株瑞士/5441/90、毒株台湾/0409/00、毒株台湾/0722/02、毒株台湾/97271/2001、毒株德黑兰/80/02、毒株东京/6/98、毒株的里雅斯特/28/02、毒株乌兰乌德/4/02、毒株英国/34304/99、毒株USSR/100/83、毒株维多利亚/103/89、毒株越南/1/99、毒株武汉/356/2000、毒株WV194/2002、毒株Xuanwu/23/82、毒株山形/1311/2003、毒株山形/K500/2001、毒株阿拉斯加/12/96、毒株GA/86、毒株NAGASAKI/1/87、毒株东京/942/96和毒株罗切斯特/02/2001。
在一个具体的实施方案中，经改造以含有并表达嵌合病毒基因组区段的病毒是丙型流感病毒。丙型流感病毒的具体实例包括毒株爱知/1/81、毒株安娜堡/1/50、毒株青森/74、毒株加利福尼亚/78、毒株英格兰/83、毒株希腊/79、毒株广岛/246/2000、毒株广岛/252/2000、毒株兵库/1/83、毒株约翰内斯堡/66、毒株神奈川/1/76、毒株Kyoto/1/79、毒株密西西比/80、毒株宮城/1/97、毒株宮城/5/2000、毒株宮城/9/96、毒株奈良/2/85、毒株新泽西/76、毒株猪/北京/115/81、毒株埼玉/3/2000)、毒株静冈/79、毒株山形/2/98、毒株山形/6/2000、毒株山形/9/96、毒株柏林/1/85、毒株英格兰/892/8、毒株北美五大湖/1167/54、毒株JJ/50、毒株猪/北京/10/81、毒株猪/北京/439/82)、毒株TAYLOR/1233/47和毒株C/山形/10/81。
在一个具体的实施方案中，本文所述的非节段负义单链RNA病毒包含第5节中描述的miRNA应答元件(MRE)(参见例如Perez等，2009，NatureBiotechnology27:572-576；和WO2010101663)。在一个具体的实施方案中，本文所述的包含miRNA应答元件(MRE)的非节段负义单链RNA病毒是流感病毒。
5.1.3重组RNA病毒的产生
可采用本领域技术人员已知的任何技术，包括下文第6节中描述的技术，对本文所述的包含第5.1节中描述的嵌合病毒基因组区段的重组RNA病毒进行改造。可采用反求遗传学和无辅助质粒拯救等技术来产生具有第5.1节中描述的具有嵌合病毒基因组区段的重组RNA病毒。反求遗传学技术包括含有负链病毒RNA的非编码区的合成重组病毒RNA的制备，所述非编码区对通过病毒聚合酶进行识别和产生成熟病毒粒所需包装信号是必需的。重组RNA自重组DNA模板合成，且体外用纯化的病毒聚合酶复合体重建以形成可用来转染细胞的重组核糖核蛋白(RNP)。如果在合成RNA体外或体内转录期间存在病毒聚合酶蛋白，则可实现更有效的转染。可拯救合成重组RNP成为感染性病毒颗粒。前述技术描述于1992年11月24日授予专利权的美国专利号5,166,057；1998年12月29日授予专利权的美国专利号5,854,037；1996年2月20日公布的欧洲专利出版物EP0702085A1；美国专利申请顺序号09/152,845；1997年4月3日公布的国际专利出版物PCT WO97/12032；1996年11月7日公布的WO96/34625；欧洲专利出版物EP A780475；1999年1月21日公布的WO99/02657；1998年11月26日公布的WO98/53078；1998年1月22日公布的WO98/02530；1999年4月1日公布的WO99/15672；1998年4月2日公布的WO98/13501；1997年2月20日公布的WO97/06270；以及1997年6月25日公布的EPO780475A1，其每一份都通过引用以其整体结合到本文中。在具体的实施方案中，将重组RNA病毒分离/纯化。
还可利用无辅助质粒技术对第5.1节中描述的包含嵌合病毒基因组区段的重组RNA病毒进行改造。例如，使用PCR，用包括独特限制位点的引物，使病毒区段的全长cDNA扩增，所述限制位点允许将PCR产物插入质粒载体(参见例如Flandorfer等，2003,J.Virol.77:9116-9123；以及Nakaya等，2001,J.Virol.75:11868-11873；其二者通过引用以其整体结合到本文中)。设计使PCR产物位于截短的人RNA聚合酶I启动子和丁型肝炎病毒核酶序列之间的质粒载体，使得从聚合酶I启动子产生准确的负(vRNA有义)转录物。将包含各个病毒区段或最小病毒区段的单独的质粒载体以及包含病毒复制所需的必需病毒蛋白的表达载体转染至细胞，导致重组病毒颗粒的产生。有关无辅助质粒技术的详细描述参见例如国际公布号WO01/04333；美国专利号6,649,372；Fodor等，1999,J.Virol.73:9679-9682；Hoffmann等，2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6108-6113；以及Neumann等，1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:9345-9350，所述文献通过引用以其整体结合到本文中。
在某些实施方案中，在细胞中拯救重组RNA病毒，所述细胞经改造以表达拯救病毒所必需的病毒蛋白。在某些实施方案中，使用双向转录系统拯救重组RNA病毒(参见例如Hoffmann等2002，PNA99:11411-11416)。在某些实施方案中，使用Vero细胞或MDCK用于拯救。
具有包含第5.1节中描述的嵌合病毒基因组区段的基因组的重组RNA病毒可在任何基质中繁殖，所述基质可供重组RNA病毒生长至允许重组RNA病毒分离的效价。例如，重组RNA病毒可在易受重组RNA病毒感染的细胞(例如禽细胞、鸡细胞(例如原代鸡胚细胞或鸡肾细胞)、Vero细胞、MDCK细胞、人呼吸上皮细胞(例如A549细胞)、牛肾细胞、水貂肾细胞等)、含胚卵或动物(例如禽)中生长。重组RNA病毒可从细胞培养物中回收，并且通常可通过众所周知的澄清方法，例如梯度离心和柱层析法，从细胞组分中分离，而且可按需要，采用本领域技术人员熟知的方法例如噬斑测定法进一步纯化。
在某些实施方案中，使含有并表达嵌合病毒基因组区段的重组RNA病毒减毒。在某些实施方案中，可使用减毒RNA病毒对含有并表达嵌合病毒基因组区段的重组RNA病毒进行改造。在某些实施方案中，异源RNA的引入使RNA病毒减毒。在某些实施方案中，异源RNA靶向重组RNA病毒的基因，从而使重组RNA病毒减毒。在某些实施方案中，减毒病毒为冷适应减毒株、天然存在的或经遗传工程改造的减毒病毒株，其携带病毒基因的缺失、截短或修饰，例如在流感的情况下为：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NEP或PBI-F2。这类减毒病毒经改造以包括异源RNA而产生重组RNA病毒。在某些实施方案中，病毒经改造以包括异源RNA而产生重组RNA病毒，然后对其进一步进行遗传工程改造使病毒减毒。
在某些实施方案中，重组RNA病毒经改造，使得可随意终止病毒繁殖。例如，重组RNA病毒是已知对抗病毒药敏感的病毒株。如果在患者中不再需要病毒进一步繁殖，则可给予抗病毒药以终止病毒的繁殖。在某些实施方案中，病毒携带防止病毒经历一个以上的完整生活周期的自杀基因，从而防止患者被病毒进一步感染。
在某些实施方案中，重组RNA病毒经改造，使得病毒只可在对象中经历少数复制。在更具体的实施方案中，重组RNA病毒的基因组在对象中复制1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在其它更具体的实施方案中，重组RNA病毒在对象中经历1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个复制循环。
在一些实施方案中，减毒可部分产生于重组RNA病毒有效复制所必需的基因的突变。此外，减毒可部分产生于其它病毒基因中一个或多个突变的组合。在某些实施方案中，重组RNA病毒是具有描述于例如以下授权专利的NS1基因截短或缺失的流感病毒：2002年10月22日授予专利权的美国专利号6,468,544、2005年3月15日授予专利权的美国专利号6,866,853、2003年12月30日授予专利权的美国专利号6,669,943和2009年9月15日授予专利权的美国专利号7,588,768。也可对来自天然变体的重组RNA病毒进行改造，例如甲型流感的A/火鸡/Ore/71天然变体，或是乙型流感的天然变体的B/201以及B/AWBY-234。
在某些具体的实施方案中，重组RNA病毒来源于流感病毒，减毒通过干扰流感病毒的svRNA来实现(参见Perez等，“Influenza A virus-generatedsmall RNAs regulate the switch from transcription to replication(甲型流感病毒产生的小RNA调节从转录到复制的转换),”PNA，2010年6月1日在线表现)。
在某些实施方案中，使用通常不感染既定对象的重组RNA病毒。因此，在一个具体的实施方案中，既定对象是人，而重组RNA病毒来源于通常不感染人的RNA病毒。
在某些实施方案中，携带异源RNA的节段负义单链RNA病毒的复制率是在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的至多5%、至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多75%、至多80%、至多90%。在某些实施方案中，携带异源RNA的节段负义单链RNA病毒的复制率是在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些实施方案中，携带异源RNA的节段负义单链RNA病毒的复制率介于在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的5%和20%之间、介于10%和40%之间、介于25%和50%之间、介于40%和75%之间、介于50%和80%之间或介于75%和90%之间。
5.1.4基因组区段的再接
在某些实施方案中，嵌合病毒基因组区段与一个或多个其它病毒基因组区段“再接”以防止重配介导的携带异源RNA的区段丢失(参见Gao和Palese2009，PNA106:15891-15896；以及国际申请公布号WO11/014645)。各个流感病毒RNA区段的特定包装信号位于5'和3'非编码区以及RNA区段ORF的末端区。通过将第一病毒基因组区段的包装序列置于第二病毒基因组区段的ORF上，并使第二区段ORF中的原始包装区突变，产生具有第一区段的包装特征的嵌合第二区段。通过相同策略，可对第一区段进行改造以获得第二区段的包装特征。这类再接病毒可具有全部基因组区段的包装信号，但是它没有独立重配第一和第二区段的能力。在一个具体的实施方案中，将NS和HA区段再接。
在某些实施方案中，将携带异源RNA的基因组区段与编码负责或主要负责病毒向性的蛋白质的基因组区段再接。在某些其它实施方案中，将携带异源RNA的基因组区段与编码重组RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶的基因组区段再接。
例如，如果异源RNA是例如svRNA模拟物或抗svRNA，则可使基因组区段再接以防止丧失携带异源RNA的区段的表达。
5.1.5向性
在某些实施方案中，重组RNA病毒来源于其中的RNA病毒的天然向性或改进向性被用来将效应子RNA靶向所需细胞类型、组织、器官或机体部位。因此，如果需要在例如肺组织中影响靶基因的表达，则使用只感染肺组织的重组RNA病毒。负责病毒向性的病毒基因组区段可与携带异源RNA的嵌合病毒基因组区段不同或相同。
在某些实施方案中，负责重组RNA病毒向性的病毒基因用来自具有不同向性的第二病毒的基因置换，使得重组RNA病毒获得第二病毒的向性。例如，流感HA和/或NA可用VSV的G基因(编码HA和NA包装序列的任一种)置换，得到其进入将不限于任何细胞的病毒(参见Watanabe等，J.Virol.77(19)：10575.)。在另一个具体的实施方案中，HA和NA的编码区可分别与gp41和gp120交换，以获得其向性模拟HIV向性的重组RNA病毒。在又一个实施方案中，HA和/或NA可用HCV的gpE1置换，以获得模拟HCV的向性的重组RNA病毒。
在某些实施方案中，重组RNA病毒包含2007年6月6日公布的WO2007/064802中描述的病毒基因组区段。
5.2非节段负义单链重组RNA病毒
5.2.1嵌合病毒基因组
在某些实施方案中，重组RNA病毒来源于非节段负义单链RNA病毒。将异源RNA引入非节段负链RNA病毒的基因组中。所得基因组在本节中称为嵌合病毒基因组。在某些实施方案中，转录的异源RNA经加工，得到效应子RNA。在某些实施方案中，异源RNA是效应子RNA。
可通过用异源RNA完全置换病毒编码区，或通过部分置换所述异源RNA，或通过将异源核苷酸序列加入病毒基因组的非编码区，来实现将异源RNA插入非节段负义单链RNA病毒基因组。所得基因组称为嵌合病毒基因组。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组的核酸，例如DNA分子。
在某些实施方案中，对非节段负义单链RNA病毒的病毒生活周期不是必需的基因用异源RNA完全或部分置换。
可将异源RNA加入或插入病毒基因组非编码区的不同位置。在某些实施方案中，将异源RNA插入病毒基因组的两个基因之间(即插入基因间区)、3’前导序列或5’尾随序列。在一个实施方案中，非节段负义单链RNA病毒是副流感病毒，且将异源RNA插入待转录的第一与第二、第二与第三、第三与第四、第四与第五或第五与第六病毒基因之间。
在某些实施方案中，异源RNA的两侧是相同非节段负义单链RNA病毒基因的3’端的基因起点和5’端的基因终点。例如，如果非节段负义单链RNA病毒是呼吸道合胞病毒，则可以使用来自N、P、M、SH、G、F、M2或L基因的基因起点和基因终点或其组合。用于操作非节段负义单链RNA病毒的说明性方法描述于例如Haller等2003，J Gen Vir84:2153-2162(参见图1)。
在某些实施方案中，使用具有转录梯度的非节段负义单链RNA病毒，其中位于3’端的基因以比位于5’端的基因高的水平转录。虽不受理论束缚，但是由于横跨病毒基因组时出现转录梯度所致，与更接近5’端的插入相比，插入更接近3’端的异源RNA可导致异源RNA更强的表达。在一个具体的实施方案中，如果需要异源RNA强表达，则使异源RNA更接近病毒基因组3’端存在。
在某些实施方案中，遵从6倍原则的非节段负义单链RNA病毒(即对于有效繁殖的病毒，病毒基因组核苷酸的数目是6的倍数)用来对含有并表达异源RNA的重组RNA病毒进行改造。如果使用遵从6倍原则的病毒，则异源RNA可具有这样的长度，即重组非节段负义单链RNA病毒的重组基因组仍然遵从6倍原则。在其它实施方案中，异源RNA可具有这样的长度，即来源于非节段负义单链RNA病毒的重组RNA病毒的重组基因组不遵从6倍原则，并且使病毒减毒。
在某些实施方案中，嵌合病毒基因组包含：(a)存在于基因组3’非编码区的聚合酶起始位点；(b)病毒复制所需的任何数目的病毒基因；(c)异源RNA序列；和(d)存在于基因组5’非编码区的任何聚合酶复制位点。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组包含：(a)存在于基因组3’非编码区的聚合酶起始位点；(b)病毒复制所需的任何数目的病毒基因；(c)两侧是核酶识别序列和一个或多个核酶的异源RNA序列，使得从病毒转录物上切割异源RNA序列；和(d)存在于基因组5’非编码区的任何聚合酶复制位点。在某些实施方案中，嵌合病毒基因组包含：(a)存在于基因组3’非编码区的聚合酶起始位点；(b)病毒复制所需的任何数目的病毒基因；(c)核酶识别序列；(d)异源RNA序列；和(e)切割核酶识别序列的核酶是(c)。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组的核酸，例如DNA分子。在一个具体的实施方案中，分离嵌合病毒基因组或编码嵌合病毒基因组的DNA分子。
在某些实施方案中，嵌合弹状病毒(或副粘病毒(paramyxoviridae))基因组包含：(a)存在于基因组3’非编码区的聚合酶起始位点；(b)病毒复制所需的任何数目的病毒基因；(c)其5’和3’序列遵循聚合酶起始或终止的要求的异源RNA序列；(d)病毒复制所需要的任何其余的病毒基因；和(e)存在于基因组5’非编码区的聚合酶复制位点。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组的核酸，例如DNA分子。
5.2.2病毒
可进行改造以含有并表达异源RNA的非节段负义单链RNA病毒的非限制性实例包括：弹状病毒(例如水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒和狂犬病相关病毒)、副粘病毒(例如新城疫病毒(NDV)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒例如仙台病毒和肺病毒例如呼吸道合胞病毒(RSV)和偏肺病毒(metapneumovirus))、线状病毒(例如依波拉病毒和马尔堡病毒)、丁型肝炎病毒和波纳病毒。在一个具体的实施方案中，非节段负义单链RNA病毒是3型嵌合牛/人副流感病毒(参见例如Tang等2005，Vaccine23:1657-1667)。在另一个具体的实施方案中，非节段负义单链RNA病毒是NDV的速发型、中发型或缓发型毒株。NDV毒株的具体实例包括但不限于73-T毒株、NDVHUJ毒株、Ulster毒株、MTH-68毒株、Italien毒株、Hickman毒株、PV701毒株、Hitchner B1毒株、La Sota毒株(参见例如Genbank编号AY845400)、YG97毒株、MET95毒株、Roakin毒株和F48E9毒株。
5.2.3重组病毒的产生
可采用技术人员已知的任何方法来拯救携带异源RNA的病毒。可采用反求遗传学来拯救病毒。可采用无辅助病毒拯救。参见例如2004年7月22日公布的美国专利申请公布号20040142003。在具体的实施方案中，对重组病毒进行分离/纯化。
在某些实施方案中，对重组RNA病毒进行修饰，使得病毒在患者中减毒。在具体的实施方案中，副流感病毒用来产生重组RNA病毒，并使一个或多个病毒基因突变以使病毒减毒，即N、P、M、F、HN或L基因。
在某些实施方案中，在细胞中拯救重组RNA病毒，所述细胞经改造以表达拯救病毒所必需的病毒蛋白。在某些实施方案中，Vero细胞或MDCK用于拯救。在某些实施方案中，卵用于病毒生长。
在某些实施方案中，使用通常不感染既定对象的重组RNA病毒。例如使牛副流感病毒(例如3型牛副流感病毒)在人对象中减毒。因此，在一个具体的实施方案中，重组RNA病毒来源于牛副流感病毒，其中既定对象是人。
在某些实施方案中，重组RNA病毒经改造，使得可随意终止病毒繁殖。例如，重组RNA病毒是已知对抗病毒药敏感的病毒株。如果在患者中不再需要病毒进一步繁殖，则可以给予抗病毒药以终止病毒繁殖。在某些实施方案中，病毒携带防止病毒经历一个以上完整生活周期的自杀基因，从而防止患者被病毒进一步感染。
在某些实施方案中，重组RNA病毒经改造，使得病毒只可在对象中经历少数复制。在更具体的实施方案中，重组RNA病毒的基因组在对象中复制1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在其它更具体的实施方案中，重组RNA病毒在对象中经历1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个复制循环。
在一些实施方案中，减毒可部分产生于重组RNA病毒有效复制所必需的基因的突变。此外，减毒可部分产生于其它病毒基因中一个或多个突变的组合。
在某些实施方案中，携带异源RNA的非节段负义单链RNA病毒的复制率是在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的至多5%、至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多75%、至多80%、至多90%。在某些实施方案中，携带异源RNA的非节段负义单链RNA病毒的复制率是在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些实施方案中，携带异源RNA的非节段负义单链RNA病毒的复制率介于在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的5%和20%之间、介于10%和40%之间、介于25%和50%之间、介于40%和75%之间、介于50%和80%之间或介于75%和90%之间。
5.2.4向性
在某些实施方案中，重组RNA病毒来源于其中的RNA病毒的天然向性或改进向性用来将效应子RNA靶向所需细胞类型、组织、器官或机体部位。因此，如果需要在例如肺组织中影响靶基因的表达，则使用只感染肺组织的重组RNA病毒。
在某些实施方案中，负责重组RNA病毒向性的病毒基因用来自具有不同向性的第二病毒的基因置换，使得重组RNA病毒获得第二病毒的向性。例如，重组RNA病毒不来源于VSV，但是重组RNA病毒的糖蛋白用VSV的G基因(编码HA和NA包装序列的任一种)置换，得到其进入将不限于任何细胞的病毒。在另一个具体的实施方案中，重组RNA病毒的糖蛋白的编码区可分别与gp41和gp120交换，以获得其向性模拟HIV向性的重组RNA病毒。在又一个实施方案中，重组RNA病毒的糖蛋白可用HCV的gpE1置换，以获得模拟HCV的向性的重组RNA病毒。
在某些具体的实施方案中，重组RNA病毒的糖蛋白用波尔纳病病毒的糖蛋白置换以靶向神经组织(Bajramovic2003，J Virol77:12222-12231)。
5.3非节段正链RNA病毒
5.3.1嵌合病毒基因组
在某些实施方案中，非节段正链RNA病毒可用来改造含有并表达异源RNA的重组RNA病毒。所得重组RNA病毒具有含有并表达异源RNA的嵌合病毒基因组。在某些实施方案中，转染的异源RNA经加工，得到效应子RNA。在某些实施方案中，异源RNA是效应子RNA。
在某些方面，将异源RNA引入非节段正链RNA病毒基因组的3’非翻译区以对嵌合病毒基因组进行改造。本文还描述了编码嵌合病毒基因组的核酸，例如DNA分子。
在某些方面，异源RNA的两侧是核酶识别序列及其相应的核酶，使得异源RNA通过自切割核酶从病毒基因组中释放。在更具体的实施方案中，核酶只在负义链中有活性，所述负义链在宿主细胞的病毒生活周期内产生。在甚至更具体的实施方案中，核酶并非100%有效，使得病毒负义链基因组的一部分保持完整。
在某些实施方案中，将异源RNA引入非节段正链RNA病毒基因组的转录部分的3’区。在更具体的实施方案中，异源RNA的两侧是核酶识别序列及其相应的核酶，使得异源RNA通过自切割核酶从病毒基因组中释放。在更具体的实施方案中，核酶只在负义链中有活性，所述负义链在宿主细胞的病毒生活周期内产生。在甚至更具体的实施方案中，核酶并非100%有效，使得病毒负义链基因组的一部分保持完整。
在某些实施方案中，利用亚基因组RNA的产生以从病毒基因组中释放异源RNA。将用于亚基因组RNA转录的内部转录起始位点(即亚基因组启动子)再加上异源RNA引入非节段正链RNA病毒基因组的5’末端非翻译区。在某些实施方案中，将亚基因组mRNA启动子序列引入病毒基因组的非必需区。在某些实施方案中，人工掺入的亚基因组mRNA启动子是最近3’端定位的亚基因组启动子。在某些实施方案中，无翻译区位于人工掺入的亚基因组mRNA启动子的3’端。
虽不受理论束缚，但是冠状病毒和动脉炎病毒亚基因组RNA转录物也含有通用5’前导序列，其来源于基因组5’端(Pasternak2006，J Gen Virol87:1403-1421)。5’前导序列和位于基因组3’端的亚基因组RNA转录物之间的装配，被认为通过共转录融合而发生(Pasternak2006，J Gen Virol87:1403-1421)。在某些实施方案中，将异源RNA的5’部分引入5’前导序列，且将异源RNA的3’部分引入亚基因组RNA的5’部分或具有人工引入的亚基因组启动子的人工亚基因组RNA5’部分。在亚基因组RNA转录时，将5’前导序列和3’亚基因组RNA连接，异源RNA便结合在一起。
在某些实施方案中，嵌合病毒基因组包含：(a)存在于基因组5’非编码区的聚合酶起始位点；(b)非结构病毒蛋白的可读框；(c)亚基因组RNA合成的内部识别序列；(d)结构病毒蛋白的可读框；(e)异源RNA序列；(f)聚A尾。在某些更具体的实施方案中，嵌合病毒基因组包含：(a)存在于基因组5’非编码区的聚合酶起始位点；(b)非结构病毒蛋白的可读框；(c)亚基因组RNA合成的内部识别序列；(d)结构病毒蛋白的可读框；(e)核酶识别序列；(f)异源RNA序列；(g)自切割核酶及其核酶识别序列(参见区段(e))；和(h)聚A尾。在其它更具体的实施方案中，嵌合病毒基因组包含：(a)存在于基因组5’非编码区的聚合酶起始位点；(b)非结构病毒蛋白的可读框；(c)亚基因组RNA合成的内部识别序列；(d)结构病毒蛋白的可读框；(e)自切割核酶及其核酶识别序列；(f)异源RNA序列；(g)自切割核酶及其核酶识别序列；和(h)聚A尾。本文还描述了编码这类嵌合病毒基因组的核酸，例如DNA分子。在一个具体的实施方案中，分离嵌合病毒基因组或编码嵌合病毒基因组的DNA分子。
在某些实施方案中，嵌合披膜病毒基因组包含：(a)存在于基因组5’非编码区的聚合酶起始位点；(b)非结构病毒蛋白的可读框；(c)亚基因组RNA合成的内部识别序列；(d)结构病毒蛋白的可读框；(d)亚基因组RNA合成的第二内部识别序列；(e)其5’和3’序列符合聚合酶起始或终止要求的异源RNA序列；(f)存在于包括3’保守序列元件(CSE)和聚A尾的基因组3’非编码区的聚合酶复制位点。本文还描述了编码这类嵌合披膜病毒基因组的核酸，例如DNA分子。在一个具体的实施方案中，分离嵌合病毒基因组或编码嵌合病毒基因组的DNA分子。
在某些方面，将异源RNA掺入编码非结构蛋白的基因组的部分。参见例如Liang和Li2005,Gene Therapy and Molecular Biology9:317-323。在更具体的实施方案中，将异源RNA掺入嵌合病毒基因组，使得异源RNA位于编码非结构蛋白的转录物的3’端。在某些具体的实施方案中，使用核酶以从转录物中释放异源RNA。本文还描述了编码这类嵌合披膜病毒基因组的核酸，例如DNA分子。
5.3.2病毒
在某些实施方案中，本文所述重组RNA病毒来源于下列RNA病毒之一：细小核糖核酸病毒、披膜病毒(例如新培斯病毒)、黄病毒和冠状病毒。病毒可以是细小核糖核酸病毒、披膜病毒(例如新培斯病毒)、黄病毒和冠状病毒的任何类型、种类和/或毒株。
例如，如果嵌合病毒基因组来源于新培斯病毒基因组，则可以使用Levis等人1990，J Virol64:1726-1733鉴定的亚基因组启动子(另参见Hahn等1992，PNA89:2679-2683)。
5.3.3重组病毒的产生
可采用技术人员已知的任何方法来拯救携带异源RNA的病毒。虽不受理论束缚，但是非节段正链RNA病毒的基因组RNA自身是感染性的。因此，无辅助病毒拯救可通过例如将编码嵌合病毒基因组的cDNA导入宿主细胞来实现。在更具体的实施方案中，编码嵌合病毒基因组的cDNA自质粒转录。在具体的实施方案中，对重组RNA病毒进行重组/纯化。
在某些具体的实施方案中，不引起细胞病变的新培斯病毒用来改造重组RNA病毒(Agapov等1998，PNA95:12989-12994)。在具体的实施方案中，嵌合病毒基因组来源于nsP2基因中具有突变的新培斯病毒。在更具体的实施方案中，嵌合病毒基因组来源于具有突变的新培斯病毒，所述突变导致nsP2蛋白726位处的氨基酸取代。在甚至更具体的实施方案中，嵌合病毒基因组来源于具有突变的新培斯病毒，所述突变导致nsP2蛋白的726位处P至L的氨基酸取代(Agapov等1998，PNA95:12989-12994)。
在某些实施方案中，对重组RNA病毒进行修饰，使得使病毒在既定对象(例如人患者)中减毒。在具体的实施方案中，使非结构基因或结构基因突变以实现减毒。在某些实施方案中，使非编码序列，例如RNA依赖性RNA聚合酶的5’前导序列或启动子突变以实现减毒。
在某些实施方案中，使用通常不感染既定对象的重组RNA病毒。因此，在一个具体的实施方案中，重组RNA病毒来源于非人RNA病毒，其中既定对象是人。
在某些实施方案中，重组RNA病毒经改造，使得可随意终止病毒繁殖。例如，重组RNA病毒是已知对抗病毒药敏感的病毒株。如果在患者中不再需要病毒进一步繁殖，则可以给予抗病毒药以终止病毒繁殖。在某些实施方案中，病毒携带防止病毒经历一次以上完整生活周期的自杀基因，从而防止患者被病毒进一步感染。
在某些实施方案中，重组RNA病毒经改造，使得病毒只可在对象中经历少数复制。在更具体的实施方案中，重组RNA病毒的基因组在对象中复制1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在其它更具体的实施方案中，重组RNA病毒在对象中经历1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个复制循环。
在一些实施方案中，减毒可部分产生于重组RNA病毒有效复制所必需的基因的突变。此外，减毒可部分产生于其它病毒基因中一个或多个突变的组合。
在某些实施方案中，携带异源RNA的非节段正义单链RNA病毒的复制率是在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的至多5%、至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多75%、至多80%、至多90%。在某些实施方案中，携带异源RNA的非节段正义单链RNA病毒的复制率是在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些实施方案中，携带异源RNA的非节段正义单链RNA病毒的复制率介于在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的5%和20%之间、介于10%和40%之间、介于25%和50%之间、介于40%和75%之间、介于50%和80%之间或介于75%和90%之间。
5.3.4向性
在某些实施方案中，重组RNA病毒来源于其中的RNA病毒的天然向性或改进向性用来将效应子RNA靶向所需细胞类型、组织、器官或机体部位。因此，如果需要在例如肺组织中影响靶基因的表达，则使用只感染肺组织的重组RNA病毒。
在某些实施方案中，负责重组RNA病毒向性的病毒基因用来自具有不同向性的第二病毒的基因置换，使得重组RNA病毒获得第二病毒的向性。在具体的实施方案中，第二病毒与重组RNA病毒具有相同类型。例如，重组RNA病毒的糖蛋白可用VSV的G基因置换，得到其进入将不限于任何细胞的病毒。在另一个具体的实施方案中，重组RNA病毒的糖蛋白的编码区可分别与gp41和gp120交换，以获得其向性模拟HIV向性的重组RNA病毒。在又一个实施方案中，重组RNA病毒的糖蛋白可用HCV的gpE1置换，以获得模拟HCV的向性的重组RNA病毒。
在某些具体的实施方案中，重组RNA病毒的糖蛋白用波尔纳病病毒的糖蛋白置换以靶向神经组织(Bajramovic2003，J Virol77:12222-12231)。
在某些实施方案中，重组RNA病毒表达与表皮生长因子(EGF)受体寻靶部分融合的基于可溶性受体(soR)表达构建体，以使重组RNA病毒靶向肿瘤细胞(Verheije等2009，J Virol83:7507-7516)。在一个具体的实施方案中，重组RNA病毒来源于冠状病毒，并表达与表皮生长因子(EGF)受体寻靶部分融合的基于可溶性受体(soR)表达构建体，以使重组RNA病毒靶向肿瘤细胞(Verheije等2009，J Virol83:7507-7516)。
5.4双链RNA病毒
5.4.1嵌合病毒基因组区段
在某些实施方案中，双链RNA病毒可用来产生含有并表达异源RNA的重组RNA病毒。将异源RNA引入病毒基因组区段；所得嵌合病毒基因组区段含有并表达异源RNA。在某些实施方案中，异源RNA经转录和加工，得到效应子RNA。在其它实施方案中，一旦转染，异源RNA便是效应子RNA。
编码重组RNA病毒的核酸的说明性实施方案见图12。例如，呼肠病毒(Reovius)的基于质粒的拯救可用来引入额外的非编码dsRNA区段。例如，编码侧翼是产生特定3端的HDV核酶的L1、L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2、S3和S4的T7聚合酶依赖性质粒的转染，在T7聚合酶存在下产生复制型病毒(Kobayashi等2007,Cell Host Microbe1：147-157)。由于病毒逸出特别包装这10个区段，因此异源RNA的引入需要两个区段融合，其中第二区段受内部核糖体进入位点(IRES)控制。IRES的存在将允许在同一区段上编码的第二3’产物翻译。这因此允许原始RNA区段编码两侧是有效包装和呼肠病毒聚合酶识别所需的必需5’和3’序列的异源RNA。在一个实施方案中，分别编码σ1和σ2的S3和S4作为短RNA区段，可融合在一起作为单一区段，σ2藉此自IRES翻译(参见图12)。因此原始S4RNA可用来递送同样在病毒复制期间包装的异源RNA。
在某些实施方案中，嵌合病毒基因组包含：(a)双链RNA依赖性RNA聚合酶的转录起始位点；(b)核酶切割位点；(c)异源RNA；和(d)切割部分(b)的核酶切割位点的核酶。在某些实施方案中，将一个病毒基因组区段的一个可读框引入第二病毒基因组区段，使得一个病毒基因组区段含有2个可读框。因此，包括嵌合病毒基因组区段的病毒基因组区段的总数与野生型病毒中的相同。本文还描述了编码这类嵌合披膜病毒基因组的核酸，例如DNA分子。在一个具体的实施方案中，分离编码嵌合病毒基因组区段的嵌合病毒基因组区段或DNA分子。
在某些实施方案中，嵌合病毒基因组包含：(a)双链RNA依赖性RNA聚合酶的转录起始位点；(b)可读框；(c)核酶切割位点；(d)异源RNA；和(e)切割部分(b)的核酶切割位点的核酶。在某些实施方案中，将一个病毒基因组区段的一个可读框引入第二病毒基因组区段，使得一个病毒基因组区段含有2个可读框。本文还描述了编码这类嵌合披膜病毒基因组的核酸，例如DNA分子。在一个具体的实施方案中，分离编码嵌合病毒基因组区段的嵌合病毒基因组区段或DNA分子。
5.4.2病毒
在某些实施方案中，重组RNA病毒来源于呼肠病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多蜱热病毒。病毒可以是呼肠病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多蜱热病毒的任何类型、种类和/或毒株。
5.4.3重组RNA病毒的产生
可采用技术人员已知的任何方法来拯救携带异源RNA的病毒。在具体的实施方案中，对重组RNA病毒进行重组/纯化。
在某些实施方案中，对重组RNA病毒进行修饰，使得使病毒在既定对象(例如人患者)中减毒。在具体的实施方案中，如果重组RNA病毒来源于呼肠病毒，则对L1、L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2或S3进行突变以实现减毒。
在某些实施方案中，使用通常不感染既定对象的重组RNA病毒。因此，在一个具体的实施方案中，重组RNA病毒来源于非人RNA病毒，其中既定对象是人。
在某些实施方案中，重组RNA病毒经改造，使得可随意终止病毒繁殖。例如，重组RNA病毒是已知对抗病毒药敏感的病毒株。如果在患者中不再需要病毒进一步繁殖，则可以给予抗病毒药以终止病毒繁殖。在某些实施方案中，病毒携带防止病毒经历一次以上完整生活周期的自杀基因，从而防止患者被病毒进一步感染。
在某些实施方案中，重组RNA病毒经改造，使得病毒只可在对象中经历少数复制。在更具体的实施方案中，重组RNA病毒的基因组在对象中复制1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在其它更具体的实施方案中，重组RNA病毒在对象中经历1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个复制循环。
在一些实施方案中，减毒可部分产生于重组RNA病毒有效复制所必需的基因的突变。此外，减毒可部分产生于其它病毒基因中一个或多个突变的组合。
在某些实施方案中，携带异源RNA的双链RNA病毒的复制率是在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的至多5%、至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多75%、至多80%、至多90%。在某些实施方案中，携带异源RNA的双链RNA病毒的复制率是在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些实施方案中，携带异源RNA的双链RNA病毒的复制率介于在相同条件下重组病毒来源于其中的野生型病毒的复制率的5%和20%之间、介于10%和40%之间、介于25%和50%之间、介于40%和75%之间、介于50%和80%之间或介于75%和90%之间。
在某些实施方案中，病毒的减毒可被以下方面介导：区段截短，或其中拯救在缺乏一个或多个必需非结构基因的情况下进行的干扰缺损(DI)颗粒的产生。这将产生无法复制的病毒样颗粒，除非在转录中供给缺失的基因产物。
5.4.4向性
在某些实施方案中，重组RNA病毒来源于其中的RNA病毒的天然向性或改进向性用来将效应子RNA靶向所需细胞类型、组织、器官或机体部位。因此，如果需要在例如肺组织中影响靶基因的表达，则使用只感染肺组织的重组RNA病毒。
在某些实施方案中，负责重组RNA病毒向性的病毒基因用来自具有不同向性的第二病毒的基因置换，使得重组RNA病毒获得第二病毒的向性。在具体的实施方案中，第二病毒与重组RNA病毒具有相同类型。例如，重组RNA病毒的糖蛋白可用VSV的G基因置换，得到其进入将不限于任何细胞的病毒。在另一个具体的实施方案中，重组RNA病毒的糖蛋白的编码区可分别与gp41和gp120交换，以获得其向性模拟HIV向性的重组RNA病毒。在又一个实施方案中，重组RNA病毒的糖蛋白可用HCV的gpE1置换以获得模拟HCV的向性的重组RNA病毒。
在某些具体的实施方案中，重组RNA病毒的糖蛋白用波尔纳病病毒的糖蛋白置换以靶向神经组织(Bajramovic2003，J Virol77:12222-12231)。
在某些实施方案中，重组RNA病毒表达与表皮生长因子(EGF)受体寻靶部分融合的基于可溶性受体(soR)表达构建体，以使重组RNA病毒靶向肿瘤细胞(Verheije等2009，J Virol83:7507-7516)。
5.5异源RNA
5.5.1微小RNA
在某些实施方案中，异源RNA编码包含微小RNA前体的初级转录物。微小RNA(miRNA)是短的非编码RNA，通过影响mRNA的稳定性和翻译而在多细胞生物中参与基因表达的转录后调节。miRNA通过RNA聚合酶II转录，作为可以是编码或非编码蛋白质的加帽聚腺苷酸化初级转录物(pri-miRNA)的部分。初级转录物被Drosha核糖核酸酶III切割，产生约70个核苷酸的茎环前体miRNA(前体miRNA)，其通过蛋白质核输出蛋白5(Exp5)从核输出至胞质，在胞质中被胞质Dicer核糖核酸酶进一步切割，产生成熟miRNA和反义miRNA星体(miRNA*)或过客链产物。将成熟miRNA掺入RNA诱导沉默复合体(RISC)，其通过与miRNA的不完全碱基配对而识别靶mRNA，且最常导致靶mRNA的翻译受抑或不稳定。
微小RNA前体可包含5’至3’方向的下列元件：
5’miRNA框–过客链(有义链或miRNA星体)–中部miRNA框–成熟miRNA(反义链或引导链)–3’miRNA框
或
5’miRNA框–成熟miRNA(反义链或引导链)–中部miRNA框–过客链(有义链或miRNA星)–3’miRNA框
在某些实施方案中，miRNA构架仿照人前体miRNA的构架设计，与人miRNA前体的miRNA构架有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性。在某些更具体的实施方案中，miRNA构架与人微小RNA-30a的前体(SEQ ID NO:1)(参见例如Zeng等2002,Molecular Cell9:1327-1333)、或人微小RNA mir-585的前体(SEQ IDNO:2)、或人微小RNA mir-55的前体、或人微小RNA mir-142的前体(SEQID NO:4)有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性。
在某些实施方案中，miRNA构架仿照典型内含子miRNA设计(Kim等，2009,Nature Reviews Molecular Cell Biology10：126-139)。在某些实施方案中，miRNA构架仿照非典型内含子小RNA(mirtron)设计(Kim等2009,Nature Reviews Molecular Cell Biology10：126-139)。
在某些实施方案中，相对于人工前体miRNA仿其设计的人前体miRNA，人工前体miRNA的预测结构是保守的；人工前体miRNA邻近的5’和3’序列与人工miRNA仿其设计的人miRNA的初级转录物的5’和3’侧翼序列相同；前体miRNA茎环结构的茎中的凸起与人工miRNA仿其设计的人前体miRNA的处于相同位置，且具有相同的长度。
在某些实施方案中，miRNA构架是人工构架。可产生人工构架，使得miRNA前体自身对折起来，从而形成茎环，其中环位于中央miRNA框。在某些实施方案中，环是10个核苷酸或更长，且茎比成熟miRNA的长。在某些实施方案中，前体RNA具有2个核苷酸3’突出端。
在某些实施方案中，5’miRNA框长为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在某些实施方案中，5’miRNA框长度介于1-10、5-15、10-20、15-25、20-30、25-35或30-40个核苷酸之间。在某些实施方案中，茎环结构中，5’miRNA框中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸与3’miRNA框的核苷酸互补。在某些实施方案中，茎环结构中，5’miRNA框的介于1-10、5-15、10-20、15-25、20-30、25-35或30-40个之间的核苷酸与3’miRNA框的核苷酸互补。在某些实施方案中，互补核苷酸位于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的1、2、3、4或5个聚簇中。
在某些实施方案中，3’miRNA框长为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在某些实施方案中，3’miRNA框的长度介于1-10、5-15、10-20、15-25、20-30、25-35或30-40个核苷酸之间。在某些实施方案中，在茎环结构中，3’miRNA框中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸与5’miRNA框中的核苷酸互补。在某些实施方案中，在茎环结构中，3’miRNA框中介于1-10、5-15、10-20、15-25、20-30、25-35或30-40个之间的核苷酸与5’miRNA框中的核苷酸互补。在某些实施方案中，互补核苷酸是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的1、2、3、4或5个聚簇。
在某些实施方案中，5’miRNA框有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或至少90%与3’miRNA框互补。在某些实施方案中，5’miRNA框有10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%或80%-90%与3’miRNA框互补。
在某些实施方案中，中央miRNA框长为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在某些实施方案中，中央miRNA框的长度介于1-10、5-15、10-20、15-25、20-30、25-35或30-40个核苷酸之间。在某些实施方案中，在环结构中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸与中央miRNA框中的核苷酸互补。在某些实施方案中，在环结构中，介于1-10、5-15、10-20、15-25、20-30、25-35或30-40个之间的核苷酸与中央miRNA框中的核苷酸互补。在某些实施方案中，互补核苷酸是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的1、2、3、4或5个聚簇。
在某些实施方案中，成熟miRNA是人miRNA。在某些实施方案中，成熟miRNA是人工成熟miRNA。成熟miRNA的长可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在某些更具体的实施方案中，成熟miRNA的长为20、21、22、23或24个核苷酸。成熟miRNA序列的选择描述于“成熟miRNA的序列”部分。
在某些实施方案中，miRNA前体是人miRNA前体。
在某些实施方案中，过客链长为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸。在某些实施方案中，过客链与成熟miRNA有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%互补。在某些实施方案中，互补核苷酸位于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个连续核苷酸的1、2、3、4或5个聚簇中。在某些实施方案中，过客链是成熟miRNA长度的80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%、106%、107%、108%、109%、110%、111%、112%、113%、114%、115%、116%、117%、118%、119%或120%。
在某些实施方案中，过客链和成熟miRNA之间的杂交包含1、2、3、4或5凸起，即非互补核苷酸的区域。凸起的长可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
可在体外测定法中测试人工前体用作内切核糖核酸酶切酶的底物的能力(参见第5.9.3.3节)。在某些实施方案中，内切核糖核酸酶切酶加工人工前体的效率是加工野生型底物(即人工miRNA前体仿其设计的野生型miRNA前体)效率的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或至少90%、95%、98%、99%或100%。虽不受理论束缚，但是切酶酶促反应的产物是21-24个核苷酸双链RNA，具有2个碱基3’突出端及5’磷酸基和3’羟基。此外，虽不受理论限制，但将切酶酶促反应的产物掺入RNA诱导沉默复合体(RISC)，且通过Argonaute2(AGO2)切割并除去过客链。
在某些实施方案中，初级转录物是前体miRNA。可通过使用例如合适的剪接位点或通过掺入RNA酶，来产生精确的3’端和5’端。
在某些实施方案中，初级转录物包含被额外RNA序列围住的前体miRNA。在某些实施方案中，额外RNA序列由模板异源RNA的侧翼序列转录。在某些实施方案中，在转录后加入额外RNA序列。在某些实施方案中，初级转录物是加帽的和聚腺苷酸化的。虽不受理论束缚，但是初级转录物通过Drosha核糖核酸酶III加工以产生miRNA前体。在某些实施方案中，初级转录物的环为10个核苷酸或更长；和/或初级转录物的茎比成熟miRNA的长；和/或初级转录物的茎比前体miRNA的茎长；和/或初级转录物在前体miRNA的每侧具有至少40个核苷酸的额外序列；和/或位于前体RNA侧翼的额外RNA序列的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或至少90%或100%为单链RNA。在一个更具体的实施方案中，额外RNA序列的至少3个核苷酸是单链。在某些实施方案中，初级转录物的长介于50和100、75和150、100和200、150和250、200和300、250和350、300和500、400和600、500和700、600和800、700和900、800和1,000个核苷酸之间。
可在体外测定法中测试人工前体用作Drosha核糖核酸酶的底物的能力(参见第5.9.3.1节)。在某些实施方案中，Drosha核糖核酸酶加工人工前体的效率是加工野生型底物效率的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或至少90%或100%。在某些实施方案中，人工前体用作微处理器复合体(microprocessor complex)的底物，所述微处理器复合体由蛋白质Drosha和GiGeorge综合征临界区基因8(GiGeorge syndrom critical regiongene8，DGCR8)组成(参见第5.9.3.2节)。在某些实施方案中，微处理器复合体加工人工前体的效率是加工野生型底物效率的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或至少90%或100%。
在某些实施方案中，初级转录物的长度介于0.5和1.5、1和2、1.5和2.5、2和3、2.5和3.5、3和4、3.5和4.5、4和5、4.5和5.5、5和6、5.5和6.5、6和7、6.5和7.5、7和8、7.5和8.5、8和9、8.5和9.5、9和10、9.5和10.5、10和15、12.5和17.5、15和20、17.5和22.5、20和25、22.5和27.5、25和30千核苷酸。在某些实施方案中，初级转录物含有列举如下的成熟miRNA和过客链的串联重复序列(过客链和成熟miRNA后的数字表示重复序列数，n可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更大)：
5’miRNA框–过客链-1–…–过客链-n–中央miRNA框–成熟miRNA-n–…–成熟miRNA-1–3’miRNA框
或
5’miRNA框–成熟miRNA-1–…–成熟miRNA-n–中央miRNA框–过客链-n–…–过客链-1–3’miRNA框
在某些实施方案中，针对Drosha核糖核酸酶III的切割，在体外测定法中对来自异源RNA的初级转录物进行测试(参见例如Zeng和Cullen，2005，J Biol Chem280:27595-27603和第5.9.3.1节)。
在某些实施方案中，异源RNA的两侧是剪接供体和剪接受体位点。在转录时，形成包括异源RNA的套索。虽不受理论束缚，但是套索脱支并折叠形成前体miRNA。在某些其它实施方案中，异源RNA的两侧是核酶及其核酶切割位点。在转录时，核酶切割从转录物上切割异源RNA。在某些其它实施方案中，异源RNA的两侧是2个核酶及其核酶切割位点。在转录时，核酶从转录物上切割异源RNA。
在某些实施方案中，一旦转录的异源RNA被Drosha加工，则Drosha产物具有长为14个核苷酸的双链茎，并且具有1-8个3’突出端。虽不受理论束缚，但是这类Drosha产物可通过核输出蛋白5从核中转运到胞质中。
虽不受理论束缚，但是在切酶切割后，过客链与成熟miRNA的相对热力学稳定性决定了哪条链掺入RISC。此外，虽不受理论限制，但是切酶产物链5’端的相对热力学不稳定性促进其载入RISC中。Schwarz等2003，Cell 115:199-208。
在某些实施方案中，一条链5’端的热力学稳定性相对于另一条降低，有利于促进该链载入RISC中。热力学稳定性可通过改变茎末端之一而改变。例如，GC配对在欲成为miRNA的链的3’端处增加(即GC配对在欲成为过客链的链5’端处增加)。虽不受理论束缚，但是在其5’端具有较少GC配对的链更可能载入RISC中。此外，虽不受理论束缚，但是由于茎取决于5’端，因此改变人工微小RNA3’端的一个或两个碱基不可能不利地影响靶向RISC。在某些实施方案中，热力学稳定性逆转，使得过客链掺入RISC中。
在某些实施方案中，如果重组RNA病毒来源于在胞质中复制的病毒，则在转录时，异源RNA成为切酶的底物。在某些实施方案中，如果重组RNA病毒来源于在核中复制的病毒，则在转录时，异源RNA成为Drosha的底物。
5.5.1.1成熟miRNA的序列
在某些实施方案中，成熟miRNA是人miRNA。在其它实施方案中，成熟miRNA是人工miRNA(amiRNA)，其序列来源于所需靶标的序列。所需靶标的序列可以是患者基因组、病原体基因组的基因和/或重组RNA病毒本身的基因(参见第5.7节)。在某些实施方案中，成熟miRNA是具有多个靶标的amiRNA，例如，miRNA可以靶向某一基因的多个变异或特定病原体的多个变异，例如，特定病毒的不同分离株/毒株(参见例如Israsena等，2009,Antiviral Research84:76-83)。用于预测miRNA靶的软件工具可用来验证人工miRNA靶向所需靶标的序列(Bartel 2009,Cell 136:215-233)。
在某些实施方案中，成熟miRNA长为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在某些实施方案中，成熟miRNA的长度介于10-20、15-25、20-30或25-35核苷酸之间。在更具体的实施方案中，成熟miRNA长为20、21、22、23或24个核苷酸。
在某些实施方案中，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%的成熟miRNA的核苷酸与靶序列互补，因此允许在互补核苷酸形成Watson-Crick配对。在某些实施方案中，成熟miRNA5’端的核苷酸2-7(“种子”)与靶标互补，因此允许成熟miRNA与其在成熟miRNA核苷酸2-7之间的靶标形成完全碱基配对。
在某些实施方案中，将成熟miRNA的核苷酸序列与整个转录物组进行比较以避免脱靶效应。在一个具体的实施方案中，与成熟miRNA的互补序列是人转录物组中的独特序列。在具体的实施方案中，互补序列对于病原体基因是独特的，并且不存在于对象的转录物组中。
在某些实施方案中，miRNA的靶序列位于靶基因的3’非翻译区(UTR)。
5.5.2siRNA
在某些实施方案中，异源RNA产生siRNA。在某些实施方案中，siRNA是长度介于19-25个核苷酸之间的双链RNA。异源RNA的转录导致包含与目标靶基因互补的部分的双链RNA分子。虽不受理论束缚，但是双链RNA被切酶复合物加工成siRNA。
虽不受理论束缚，但是siRNA对各个靶标的功效通常取决于不同的因素，例如热力学稳定性、结构特征、靶mRNA可及性和其它位置特异性决定因素。参见López-Fraga等2009，Biodrugs23:305-332。在某些实施方案中，与本发明的方法和组合物一起使用的siRNA的长度应介于19和25个核苷酸之间，应具有30个对称的二核苷酸突出端、低的鸟嘌呤-胞嘧啶含量(介于30%和52%之间)和位于某些位置的特定核苷酸。例如，提高siRNA功效的特征是有义链1位的腺嘌呤或尿嘧啶、3位的腺苷、7和11位的尿嘧啶、13位的鸟嘌呤、10位(这是用于RISC介导的切割的位点)的尿嘧啶或腺嘌呤、21位的鸟嘌呤的存在和/或19位缺乏鸟嘌呤或胞嘧啶(参见Dykxhoorn和Lieberman2006，Annu Rev Biomed Eng8:377-402)。
一般而言，序列头6-7个碱基对中腺苷和尿嘧啶的富集，因此氢键结合弱，允许RISC容易地解开双链的双链体，并加载指导链。siRNA双链体在其30末端(即有义链的15-19位)还应是热力学上柔性的。这与其沉默功效相关联，使得在该区中至少一个腺苷-尿嘧啶对的存在可降低内部稳定性，并提高沉默功效。相比之下，内部重复序列或回文序列降低siRNA的沉默潜力。
另一个在设计siRNA序列时需要考虑的因素是靶序列的性质。在某些情况下，可能优选的是包括用于siRNA设计的所有剪接变体和同种型，而在其它情况下，应特别排除剪接变体和同种型。同样，应注意靶基因序列编码区内的序列的选择，因为基因沉默是唯一的胞质加工。
基于计算机的算法可辅助任何给定基因的最优siRNA序列的设计，并且应考虑有助于RNA双链体稳定性的性质，例如热力学值、序列不对称性和多态性。
虽不受理论束缚，但是siRNA的产生不仅仅依赖于切酶活性，而且还依赖于Drosha。因此，异源RNA的初级转录物是切酶的底物(参见第5.9.3.3节)。
在具体的实施方案中，使用质型病毒产生用于递送siRNA的重组RNA病毒。
在某些实施方案中，异源RNA编码长发夹结构。在某些其它实施方案中，将两个单独的异源RNA引入重组RNA病毒，其一起提供形成dsRNA的有义-反义对。
在某些实施方案中，重组RNA病毒是双链RNA病毒，且异源RNA的两侧是启动子，启动子以相反方向转录RNA形成趋同转录物(convergenttranscript)。
5.5.3shRNA
在某些实施方案中，异源RNA编码短发夹RNA(shRNA)。在某些实施方案中，异源RNA的初级转录物折叠成具有以下性质的发夹环：3'UU-突出端、茎长介于25-29个核苷酸之间且环大小介于4-23个核苷酸之间。在某些实施方案中，在结合靶mRNA的茎的部分(反义链)与mRNA之间的互补性为100%。
虽不受理论束缚，但是异源RNA的初级转录物是核输出蛋白5的底物(参见第5.9.3.4节)。在某些实施方案中，如果重组RNA病毒是质型病毒，则异源RNA的初级转录物是切酶的底物(参见第5.9.3.3节)。
5.5.4RNA海绵(RNA sponge)
在某些实施方案中，异源RNA是所需靶基因的互补RNA的串联重复序列。在某些实施方案中，异源RNA含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个重复序列。在某些实施方案中，异源RNA含有1-10、5-15、10-20、15-25、20-30、25-35或30-40个重复序列。在某些实施方案中，每个重复序列的核苷酸长度介于10-20、15-25、20-30、25-35、30-40、35-45或40-50个之间。在某些实施方案中，重复序列间的区段长为0-10、5-15、10-20、15-25、20-30、25-35、30-40、35-45或40-50个核苷酸。
5.5.5反义RNA
在某些实施方案中，异源RNA经转录，产生与靶基因的mRNA互补的反义RNA。
5.5.6svRNA
在某些实施方案中，异源RNA经转录，得到svRNA。在具体的实施方案中，异源RNA经转录以模拟svRNA，例如流感病毒的svRNA(参见例如Perez等，“Influenza A virus-generated small RNAs regulate the switch fromtranscription to replication(甲型流感病毒产生的小RNA调节从转录到复制的转换),”PNAS，2010年6月1日在线发表)。
在某些实施方案中，小病毒RNA(svRNA)是正黏病毒(例如流感病毒)的svRNA。虽不受理论束缚，但是由流感病毒表达的svRNA通过例如调节病毒基因组从转录到复制的转换而参与调节病毒复制。虽不受任何理论的束缚，但调节这种小病毒RNA的表达或活性的化合物可调节病毒基因组的转录和复制之间的转换，因此，可调节病毒颗粒的产生。一方面，可使用调节正黏病毒基因组的转录和复制间的转换的化合物。在其它方面，调节正黏病毒基因组的转录和复制之间的转换的化合物可与来源于正黏病毒的重组RNA病毒一起使用。在某些方面，调节正黏病毒基因组的转录和复制之间的转换的化合物可用来选择性地调节一种或多种正黏病毒基因组区段或mRNA转录物的产生，进而可选择性地调节一种或多种正黏病毒蛋白或异源RNA的产生。
在具体的实施方案中，svRNA是与病毒基因组RNA的5’端(vRNA)相同且与病毒RNA基因组的3’端(cRNA)互补的单链RNA。在一个实施方案中，通过RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)切割，从正黏病毒基因组RNA的5’端(或者本文亦称为“vRNA”)产生svRNA。在一个实施方案中，通过RdRp机器，从正黏病毒基因组cRNA的3’端产生svRNA。在一个实施方案中，svRNA与vRNA的3’端相互作用。在另一个实施方案中，svRNA与cRNA的3’端相互作用。在一些实施方案中，svRNA与正黏病毒vRNA和cRNA两者的3’端相互作用。svRNA描述于2010年4月23日提交的美国临时专利申请号61/327,384。
5.6组合物
可将本文提供的重组RNA病毒掺入组合物中。在一个具体的实施方案中，组合物是药物组合物，包括免疫原性组合物(例如疫苗制剂)。本文提供的药物组合物可呈允许将组合物给予对象的任何形式。在一个具体的实施方案中，药物组合物适于兽用和/或人用给药。组合物可用于预防或治疗疾病的方法。
在一个实施方案中，药物组合物包含与药学上可接受的载体混合的重组RNA病毒。在一些实施方案中，除重组RNA病毒以外，药物组合物可包含一种或多种其它疗法。
本文所用术语“药学上可接受的”意指已经联邦政府或州政府管理机构批准，或列于美国药典或其它公认药典以用于动物，更特别用于人。术语“载体”是指与药物组合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液还可用作液体载体，特别用于注射用溶液剂。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。合适的药用载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。制剂应适于给药方式。
在一个具体的实施方案中，将药物组合物配制成适于给予对象的预定途径。例如，可将药物组合物配制成适用于胃肠外、口服、真皮内、透皮、结肠直肠、腹膜内或直肠给予。在一个具体的实施方案中，可将药物组合物配制成用于静脉内、口服、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌内、表皮、真皮内、透皮或经肺给予。
在某些实施方案中，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙二醇(PEGylation)、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、聚丙交酯、聚(丙交酯-乙交酯共聚物)、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸等生物可降解聚合物可用作载体。在一些实施方案中，重组RNA病毒与增加保护重组RNA病毒免于从体内快速清除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。用于制备这类制剂的方法对本领域技术人员而言将是显而易见的。脂质体或微团也可用作药学上可接受的载体。这些可按照本领域技术人员已知方法，例如如美国专利号4,522,811中所述来制备。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种佐剂。
在具体的实施方案中，本文所述药物组合物是单价制剂。在其它实施方案中，本文所述药物组合物是多价制剂。在一个实例中，多价制剂包含一种或多种重组RNA病毒。
在某些实施方案中，本文所述药物组合物还包含防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞。在一个具体的实施方案中，本文所述药物组合物包含0.001%-0.01%硫柳汞。在其它实施方案中，本文所述药物组合物不含防腐剂。在一个具体的实施方案中，在本文所述药物组合物制备期间使用硫柳汞，在产生药物组合物后通过纯化步骤除去硫柳汞，即药物组合物含有痕量的硫柳汞(在纯化后<0.3μg汞/剂；这类药物组合物视为无硫柳汞的产品)。
在某些实施方案中，本文所述药物组合物还包含鸡蛋蛋白质(例如卵清蛋白或其它鸡蛋蛋白质)。对于1ml药物组合物，本文所述药物组合物中鸡蛋蛋白质的量的范围可为约0.0005-约1.2μg鸡蛋蛋白质。在其它实施方案中，本文所述药物组合物不含鸡蛋蛋白质。
在某些实施方案中，本文所述药物组合物还包含一种或多种抗微生物剂(例如抗生素)，包括但不限于庆大霉素、新霉素、多黏菌素(例如多黏菌素B)和卡那霉素、链霉素。在其它实施方案中，本文所述药物组合物不含任何抗生素。
在某些实施方案中，本文所述药物组合物还包含明胶。在其它实施方案中，本文所述药物组合物不含明胶。
在某些实施方案中，本文所述药物组合物还包含一种或多种缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂和蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲剂。在其它实施方案中，本文所述药物组合物不含缓冲剂。
在某些实施方案中，本文所述药物组合物还包含一种或多种盐，例如氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸一钠和铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)或这类铝盐的混合物)。在其它实施方案中，本文所述药物组合物不含盐。
在具体的实施方案中，本文所述药物组合物不含一种或多种通常存在于疫苗制剂(例如流感病毒疫苗制剂)的添加剂。这类疫苗已有描述(参见例如以国际公布号WO 09/001217公布的国际申请号PCT/IB2008/002238，其通过引用以其整体结合到本文中)。
可将本文所述药物组合物与给药说明书一起装入容器、药包(pack)或分配器中。
在用前可保存本文所述药物组合物，例如，药物组合物可冷冻保存(例如在约-20°C或约-70°C下)；保存在冷藏条件(例如约4°C)下；或在室温下保存(对于在无冷藏条件的情况下，保存包含流感疫苗的组合物的方法参见以国际公布号WO 07/110776公布的国际申请号PCT/IB2007/001149，其通过引用以其整体结合到本文中)。
在一个具体的实施方案中，本文提供包含活的重组RNA病毒的组合物，其中病毒是流感病毒。在一些实施方案中，包含活的重组RNA病毒(其中病毒是流感病毒)的组合物是免疫原性组合物(例如疫苗)。在另一个具体的实施方案中，本文提供包含活的重组RNA病毒的组合物，其中病毒是新培斯病毒。
在某些实施方案中，包含活的重组RNA病毒的组合物包含向性发生改变的病毒，即重组RNA病毒的向性不同于病毒的天然向性(例如野生型病毒的向性)。
在某些实施方案中，包含活的重组RNA病毒的组合物包含在组合物所给予的对象中是减毒的病毒。这类减毒重组RNA病毒可以是天然减毒的(即病毒在对象中天然不引起疾病)，或者可进行改造以减毒(即病毒经遗传变化，使得它在对象中不引起疾病)。
5.6.1佐剂
在某些实施方案中，本文所述组合物(特别是免疫原性组合物)包含佐剂，或与佐剂组合给予。用于与本文所述组合物组合给予的佐剂可在给予所述组合物之前、同时或之后给予。在一些实施方案中，术语“佐剂”是指这样的化合物，当本文所述组合物联合给予或作为所述组合物的部分给予时增加、提高和/或加强本文所述组合物的免疫应答。佐剂可通过若干机制，包括例如淋巴细胞募集、刺激B和/或T细胞和刺激巨噬细胞，来加强免疫应答。
佐剂的具体实例包括但不限于铝盐(明矾)(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3脱-O-酰化单磷酰脂质A(MPL)(参见GB2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨醇酯80(Tween80；ICL Americas，Inc.)、咪唑并吡啶化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064857，以国际公布号WO2007/109812公布)、咪唑并喹喔啉化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064858，以国际公布号WO2007/109813公布)和皂苷类例如QS21(参见Kensil等，载于VaccineDesign:The Subunit and Adjuvant Approach(编辑Powell和Newman，Plenum Press，NY，1995)；美国专利号5,057,540)。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其它佐剂是任选与免疫刺激剂例如单磷酰脂质A组合水包油乳剂(例如角鲨烯或花生油)(参见Stoute等,N.Engl.J.Med.336，86-91(1997))。另一种佐剂是CpG(Bioworld Today，1998年11月15日)。这类佐剂可与或不与免疫刺激剂(例如MPL或3-DMP、QS21)、聚合氨基酸或单体氨基酸(例如聚谷氨酸或聚赖氨酸)或其它免疫强化剂一起使用。
5.7重组RNA病毒的用途
5.7.1基因表达和miRNA寻靶的调节
一方面，本文所述重组RNA病毒可用来调节基因表达。虽不受理论限制，但可对本文所述重组RNA病毒进行改造以产生对靶基因有特异性的效应子RNA，使得当效应子RNA与由靶基因转录的mRNA接触时，靶基因的表达受到调节。受由本文所述重组RNA病毒表达的效应子RNA调节的靶基因可以是但不限于对象的基因、植物的基因、病原体的基因或者细胞或细胞系的基因。因此，本文描述的是用于通过给予重组RNA病毒而在对象中降低靶基因的表达的方法，所述重组RNA病毒将效应子RNA递送给对象。本发明还提供的是通过给予重组RNA病毒而在对象中降低病原体的效价的方法，所述重组RNA病毒将靶向病原体的效应子RNA递送给对象。
可采用本领域技术人员已知方法以及本文所述方法，例如用于测量RNA表达(例如mRNA表达)或蛋白质表达的技术，来评价效应子RNA调节靶基因的表达的能力(参见下文第5.9.4节)。本领域技术人员应认识到，如果与在效应子RNA不存在时RNA的表达水平和/或蛋白质表达的水平相比，在效应子RNA存在时来自靶基因的RNA表达(例如mRNA表达)的水平和/或蛋白质表达的水平降低，则靶基因受效应子RNA调节。相反地，如果在效应子RNA不存在时RNA表达的水平和/或蛋白质表达的水平与在效应子RNA存在时来自靶基因的RNA表达(例如mRNA表达)的水平和/或蛋白质表达水平相同，则靶基因不受效应子RNA调节。
在一些实施方案中，靶基因可受效应子RNA调节，使得因靶基因引起的RNA表达(例如mRNA表达)完全降低，即无通过靶基因而产生的RNA。在其它实施方案中，靶基因可受效应子RNA调节，使得由靶基因引起的RNA表达(例如mRNA表达)不完全降低，但相对于在正常条件下(即在效应子RNA不存在时)由靶基因引起的RNA表达的水平降低，例如，表达可降低达5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，或者降低达2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15-20倍、25倍、50倍或100倍或大于100倍。
在一些实施方案中，靶基因可受效应子RNA调节，使得因靶基因引起的蛋白质表达完全降低，即通过靶基因不产生蛋白质。在其它实施方案中，靶基因可受效应子RNA调节使得因靶基因引起的蛋白质表达不完全降低，而是相对于在正常条件下(即在效应子RNA不存在时)由靶基因引起的蛋白质表达的水平降低，例如表达可降低达5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，或者达2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15-20倍、25倍、50倍或100倍或大于100倍。
另一方面，本文所述重组RNA病毒可用来靶向其它miRNA。虽不受理论限制，但可对本文所述重组RNA病毒进行改造以产生对靶miRNA有特异性的效应子RNA。受由本文所述重组RNA病毒表达的效应子RNA调节的靶miRNA可以是但不限于对象的miRNA、植物的miRNA、病原体的miRNA或细胞或细胞系的miRNA。因此，本文描述的是用于通过给予重组RNA病毒调节(例如降低)对象中靶miRNA表达的方法，所述重组RNA病毒将效应子RNA递送给对象。本发明还提供的是通过给予重组RNA病毒而在对象中降低病原体的效价的方法，所述重组RNA病毒将靶向病原体的miRNA的效应子RNA递送给对象。
5.7.2疾病的预防或治疗
一方面，本文所述重组RNA病毒可用于预防或治疗对象的疾病。虽不受理论限制，但可对本文所述重组RNA病毒进行改造以产生效应子RNA，所述效应子RNA靶向由于基因过量表达或异位表达所致而涉及疾病的对象的基因。或者，可对本文所述重组RNA病毒进行改造以产生靶向病原体(例如病毒或细菌)的基因的效应子RNA分子，即效应子RNA靶向对病原体的繁殖或生存是必需的病原体的基因。此外，可对本文所述重组RNA病毒进行改造以产生靶向涉及疾病的对象的miRNA或病原体的miRNA的效应子RNA。因此，在预防或治疗本文所述疾病的方法中包括可通过给予重组RNA病毒而获得益处的任何疾病。在某些实施方案中，病原体包括但不限于细菌、病毒、酵母、真菌、古细菌、原核生物、原生动物、寄生物和藻类。
在某些实施方案中，按照本文所述方法治疗的疾病是呼吸道疾病。呼吸道疾病包括而不限于肺部、胸膜腔、支气管、气管、上呼吸道的疾病及呼吸神经和呼吸肌肉的疾病。可按照本文所述方法治疗的示例性的呼吸道疾病包括病毒感染、细菌感染、哮喘、癌症、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、肺炎、鼻炎、结核病、支气管炎、喉炎、扁桃体炎和囊性纤维化。
在某些实施方案中，按照本文所述方法治疗的疾病是癌症。可按照本文所述方法治疗的癌症的非限制性实例包括：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨与结缔组织肉瘤、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、肺癌(例如小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、喉癌和间皮瘤)和前列腺癌。
在某些实施方案中，按照本文所述方法治疗的疾病是与需要调节个体的胆固醇水平有关的疾病，例如，疾病是与高胆固醇有关的疾病。与高胆固醇有关的疾病的非限制性实例包括心脏病、中风、外周血管疾病、糖尿病和高血压。
在某些实施方案中，按照本文所述方法治疗的疾病是由病毒感染引起的疾病。引起疾病的病毒的非限制性清单包括：呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒)、人偏肺病毒(HMPV)、鼻病毒、副流感病毒、SARS冠状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(甲型、乙型、丙型)、依波拉病毒、疱疹病毒、风疹病毒、重型天花病毒和轻型天花病毒。
在某些实施方案中，按照本文所述方法治疗的疾病是由细菌感染引起的疾病。引起疾病的细菌的非限制性清单包括：肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、百日咳博特氏菌(Bordetella pertussis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、军团杆菌属(Legionella)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)和土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、沙门氏菌属(Salmonella)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、志贺氏菌属(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和苍白密螺旋体(Treponema pallidum)。
在一个具体的实施方案中，由本文所述重组RNA病毒产生的效应子RNA靶向感染对象的病原体基因，其中效应子RNA靶向对病原体的繁殖或生存是必需的病原体基因。在另一个具体的实施方案中，由本文所述重组RNA病毒产生的效应子RNA靶向感染植物的病原体基因，其中效应子RNA靶向对病原体的繁殖或生存是必需的病原体基因。
在某些实施方案中，按照本文所述方法治疗的疾病是自身免疫病。可用本文所述方法治疗的自身免疫病的实例包括但不限于艾迪生病(Addison’s disease)、贝切特病(Behcet’s disease)、慢性活动性肝炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多神经病、丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)、克罗恩病(Crohn’s disease)、格雷夫斯病(Graves’disease)、急性热病性多神经炎(Guillain-Barre)、重症肌无力、赖特病(Reiter’ssyndrome)、类风湿性关节炎、结节病、斯耶格伦综合征(
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syndrome)和系统性红斑狼疮。
可按照本文所述方法治疗的其它疾病包括而不限于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、心血管疾病、变应性疾病、糖尿病、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease)、脆性X综合征、青光眼和银屑病。
许多基因涉及人和非人对象两者中的疾病。例如，脱脂载脂蛋白E(ApoE)基因的E4等位基因(GENE ID NO：348)与阿尔茨海默病相关(参见例如Kim等，2009，Neuron63(3):287-303)。基因还涉及癌症：表皮生长因子受体(EGFR)基因和KRAS基因(GENE ID NO：3845)涉及多种癌症类型(参见例如Lynch等，2004,N.Engl.J.Med.350(21):2129-39；以及Kranenburg，2005,Biochim.Biophys.Acta1756(2):81-2)，发现垂体转化基因(PTTG；GENE ID NO：9232)在肺癌中过量表达。实际上，已表明靶向PTTG的iRNA在用肺癌肿瘤细胞转染的小鼠中是用于防止肿瘤生长的有效机制(参见Kakar和Malik，2006,Int.J.Oncology29(2):387-395)。另一种人基因ELANE(GENE ID NO：1991)涉及肺气肿和慢性阻塞性肺病。因此，按照预防或治疗本文所述疾病的方法，可通过本文所述重组RNA病毒产生的效应子RNA靶向前述基因以及涉及疾病的任何其它基因。
病原体例如病毒和细菌的某些基因对对象中的病原体的复制和/或生存是必需的，因此需要病原体的毒力。在一些实施方案中，由本文所述重组RNA病毒产生的效应子RNA在对象中靶向病原体的基因(例如病毒基因或细菌基因)，其中靶向病原体的基因导致预防或治疗对象的疾病。更准确地讲，效应子RNA可靶向对病原体复制或存活是必需的病原体基因。例如，效应子RNA可靶向细菌hepA基因，例如弗氏志贺氏菌hepA基因(例如保藏号NC_008258.1)，导致细菌减毒。再举例来说，效应子RNA可靶向病毒的核蛋白(NP)，例如SARS冠状病毒NP(例如保藏号AY291315.1)或甲型流感病毒NP(例如保藏号EF190975.1)，导致病毒减毒。在一个具体的实施方案中，重组RNA病毒提供靶向流感病毒的效应子RNA。已经证实了用于靶向病毒(例如SARS冠状病毒、依波拉病毒、H.I.V.、RSV、丙型乙肝病毒和甲型流感病毒)的miRNA的能力(参见例如Yokota等，2007,Biochem.Biophys.Res.Commun.361:294-300；Kumar等，2008,Cell134:577-586；Bitko等2005,Nature Med.11:50-55；Li等，2005,Nature Med.11:944-951；以及Tompkins等，2004,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:8682-8686)，在具体的实施方案中，可按照本文所述方法使用在这些实例中描述的这类miRNA以靶向这类病毒。
微小RNA miR-33，与SREBP基因联合，产生控制胆固醇稳态的效果(参见例如Rayner等，2010，Science328:1570-1573；以及Najafi-Shoushtari等，2010，Science328:1566-1569)。因此，按照用于预防或治疗本文所述疾病的方法，由本文所述重组RNA病毒产生的效应子RNA可以靶向miR-33以及SREBP基因，作为在需要这类调节的个体中调节胆固醇水平的方法。
已经描述了病毒产生的miRNA和某些miRNA在病毒生活周期中的作用(参见例如Cullen，2010,PLoS Pathog.6(2):e1000787)。因此，在某些实施方案中，可对由本文所述重组RNA病毒产生的效应子RNA进行改造，以在对象中靶向病毒的miRNA，使得靶向病毒的miRNA供预防或治疗与对象的病毒感染有关的疾病。
已经证实，某些miRNA在癌症发病机制中起作用(参见例如Kawasaki和Taira，2003，Nature423:838-843；He等，2005，Nature435(7043):828-833；以及Mraz等，2009,Leuk Lymphoma50(3)：506-509)。因此，在某些实施方案中，可对由本文所述重组RNA病毒产生的效应子RNA进行改造，以靶向在对象参与癌症的miRNA，使得靶向miRNA供预防或治疗对象的癌症。
在具体的实施方案中，使异源RNA转录以靶向svRNA，例如流感病毒的svRNA(参见例如Perez等，Proc Natl Acad Sci USA 107，11525-11530(2010))，以治疗或预防被表达svRNA的病毒感染。
在另一个具体的实施方案中，所靶定的病毒是本文所述重组RNA病毒，即效应子RNA靶向其载体，使得使病毒载体减毒和/或自调节病毒载体。在一个具体的实施方案中，这类自调节通过将对表达效应子RNA有反应性的MRE掺入病毒基因组来实现。这可通过将对由病毒表达的效应子RNA起反应的MRE掺入病毒基因组来实现，使得在MRE与之缔合的miRNA的存在下(例如由于通过病毒产生的效应子RNA所致)，使病毒减毒。
5.7.3诱导或提高免疫应答
一方面，本文所述重组RNA病毒可用来诱导或提高对象的免疫应答。在一个实施方案中，本文所述重组RNA病毒可用作疫苗。
当用作疫苗时，可给对象接种本文所述重组RNA病毒对抗重组RNA病毒本身和/或通过表达对另一种病毒有特异性且已知产生免疫应答的异源核酸序列对抗一种或多种其它病毒。例如，可构建减毒病毒(例如疫苗毒株)，例如流感病毒，使得它产生针对目标病毒靶(例如流感病毒或不同病毒)的人工微小RNA，同时自身经改造以为特定的目标miRNA所接受(参见例如Perez等，Nat Biotechnol 27，572-576(2009))。这类病毒可用作疫苗和病毒预防药两者(参见例如Varble等，2011，RNA Biology 8:190-194)。在一些实施方案中，本文所包括的重组RNA病毒疫苗包含效应子RNA，所述效应子RNA通过靶向已知参与宿主免疫应答的对象的基因而提高对疫苗的宿主免疫应答。在一些实施方案中，本文所包括的重组RNA病毒疫苗包含靶向病原体基因的效应子RNA。
在另一个实施方案中，本文所述重组RNA病毒可用来提高宿主对疫苗的免疫应答，例如，可将本文所述重组RNA病毒与疫苗联合给予对象。按照这类实施方案，重组RNA病毒包含效应子RNA，所述效应子RNA通过靶向参与宿主免疫应答的对象的基因而提高宿主对疫苗的免疫应答。
可与本文所述重组RNA病毒一起给予的示例性的疫苗包括而不限于：炭疽疫苗、吸附BCG疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、乙型肝炎疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、甲型肝炎病毒疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感病毒疫苗(例如
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和
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日本脑炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、MMR(麻疹、腮腺炎和风疹病毒)疫苗、轮状病毒疫苗、风疹病毒病毒疫苗、天花(牛痘)疫苗、伤寒疫苗、水痘病毒疫苗、黄热病疫苗和带状疱疹疫苗。
已知许多基因参与宿主免疫应答。可对本文所述重组RNA病毒进行改造以包含靶向这类基因的效应子RNA，使得使对象接受的另一疗法(例如疫苗)的益处增加，或者使得在对象中达到所需要的应答。例如而不限于，可对本文所述重组RNA病毒进行改造以产生靶向SOCS1基因(GENE IDNO:8651)的效应子RNA，所述SOCS1基因起负调节信号转导蛋白和转录激活物1(STAT1)的功能；产生靶向NFKBIA基因(IκBαGENE ID NO：4792)的效应子RNA，所述NFKBIA基因起负调节NFκB功能的作用；或产生靶向IRF2基因(GENE ID NO：3660)的效应子RNA，所述IRF2基因起负调节干扰素α和β的转录活性的作用。靶向这类基因的示例性结果可以是通过延长干扰素对所给予的疫苗的反应而在对象中提高对疫苗的应答、增加细胞因子表达和/或提高主要组织相容性复合体(MHC)表达。这类重组RNA病毒可单独用作疫苗(即重组RNA病毒可表示这样的疫苗，即与不含效应子RNA的疫苗相比，诱导更大的宿主免疫应答)或可在给予不同疫苗(例如流感疫苗)之前、同时或之后给予。
5.7.4联合疗法
在不同的实施方案中，本文所述重组RNA病毒可与一种或多种其它疗法组合给予对象。在一些实施方案中，包含本文所述重组RNA病毒的药物组合物可与一种或多种疗法组合给予对象。一种或多种其它疗法在治疗或预防疾病时可能是有益的，或者可以改善与疾病有关的症状或病况。在某些实施方案中，相隔小于5分钟、相隔小于30分钟、相隔1小时、相隔约1小时、相隔约1-约2小时、相隔约2小时-约3小时、相隔约3小时-约4小时、相隔约4小时-约5小时、相隔约5小时-约6小时、相隔约6小时-约7小时、相隔约7小时-约8小时、相隔约8小时-约9小时、相隔约9小时-约10小时、相隔约10小时-约11小时、相隔约11小时-约12小时、相隔约12小时-18小时、相隔18小时-24小时、相隔24小时-36小时、相隔36小时-48小时、相隔48小时-52小时、相隔52小时-60小时、相隔60小时-72小时、相隔72小时-84小时、相隔84小时-96小时、相隔或相隔96小时-120小时给予所述疗法。在具体的实施方案中，在相同的患者就诊期内给予两种或更多种疗法。
在某些实施方案中，一种或多种疗法是抗病毒药。本领域众所周知的任何抗病毒药均可与本文所述重组RNA病毒或药物组合物组合使用。抗病毒药的非限制性实例包括抑制和/或降低病毒与其受体附着、病毒内化进入细胞、病毒复制或病毒从细胞中释放的蛋白质、多肽、肽、融合蛋白、抗体、核酸分子、有机分子、无机分子和小分子。具体地讲，抗病毒药包括但不限于核苷类似物(例如齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦(gangcyclovir)、阿糖腺苷、碘苷、曲氟尿苷和利巴韦林)、膦甲酸、金刚烷胺、培拉米韦、金刚乙胺、沙奎那韦、沙茚地那韦、利托那韦、α-干扰素和其它干扰素、AZT、扎那米韦
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和奥塞米韦
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其它抗病毒药包括流感病毒疫苗，例如(GlaxoSmithKline)、
Figure BDA00002819658700554
(MedImmuneVaccines)、
Figure BDA00002819658700555
(Chiron Corporation)、
Figure BDA00002819658700556
(GlaxoSmithKline)、
Figure BDA00002819658700557
(CSL Biotherapies Inc.)、
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(Novartis)或
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(AventisPasteur)。
在具体的实施方案中，抗病毒药是对病毒抗原有特异性的免疫调节剂，例如流感病毒血凝素多肽。
在某些实施方案中，一种或多种疗法是抗细菌药。本领域技术人员已知的任何抗细菌药均可与本文所述重组RNA病毒或药物组合物组合使用。抗细菌药的非限制性实例包括阿莫西林、两性霉素B(Amphothericin-B)、氨苄西林、阿奇霉素、杆菌肽、头孢克洛、头孢氨苄、氯霉素、环丙沙星、多黏菌素、达托霉素、多西环素、红霉素、氟康唑(Fluconazol)、庆大霉素、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、甲硝唑、米诺环素、莫西沙星、莫匹罗星、新霉素、氧氟沙星、苯唑西林、青霉素、哌拉西林、利福平、大观霉素、链霉素、舒巴坦、磺胺甲噁唑、泰利霉素、替莫西林、泰乐菌素、万古霉素和伏立康唑。
在某些实施方案中，一种或多种疗法是抗癌药。本领域技术人员已知的任何抗癌药均可与本文所述重组RNA病毒或药物组合物组合使用。示例性的抗癌药包括：阿西维辛；蒽环类(anthracyclin)；安曲霉素；阿扎胞苷(Vidaza)；二膦酸盐类(例如帕米膦酸盐(Aredria)、氯膦酸钠(sodiumclondronate)(Bonefos)、唑来膦酸(Zometa)、阿伦膦酸盐(Fosamax)、依替膦酸、伊班膦酸盐(ibandornate)、cimadronate、利塞膦酸盐(risedromate)和替鲁膦酸盐(tiludromate))；卡铂；苯丁酸氮芥；顺铂；阿糖胞苷(Ara-C)；盐酸柔红霉素；地西他滨(Dacogen)；脱甲基化剂(emethylation agent)、多西他赛；多柔比星；EphA2抑制剂；依托泊苷；法扎拉滨；氟尿嘧啶；吉西他滨；组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACs)；白介素II(包括重组白介素II，即rIL2)，干扰素α；干扰素β；干扰素γ；来那度胺(Revlimid)；抗CD2抗体(例如西利珠单抗(MedImmune Inc.；国际公布号WO02/098370，其通过引用以其整体结合到本文中))；美法仑；甲氨蝶呤；丝裂霉素；奥沙利铂；紫杉醇；嘌罗霉素；利波腺苷；螺铂；替加氟；替尼泊苷；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；伏氯唑；折尼铂；净司他丁和盐酸佐柔比星。
其它癌症疗法的实例包括但不限于抗血管生成药；反义寡核苷酸；凋亡基因抑制剂；细胞凋亡调节剂；BCR/ABL拮抗剂；β内酰胺衍生物；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；谷胱甘肽抑制剂；HMG CoA还原酶抑制剂；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；亲脂性铂化合物；溶基质蛋白抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；错配双链RNA；一氧化氮抑制剂；寡核苷酸；铂化合物；蛋白质激酶C抑制剂，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；raf拮抗剂；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；翻译抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂和尿激酶受体拮抗剂。
在一些实施方案中，与本文所述重组RNA病毒或药物组合物组合使用的疗法是抗血管生成药。抗血管生成药的非限制性实例包括降低或抑制血管生成的蛋白质、多肽、肽、缀合物、抗体(例如人、人源化、嵌合、单克隆、多克隆、Fvs、ScFv、Fab片段、F(ab)2片段及其抗原结合片段)，例如与TNF-α特异性结合的抗体、核酸分子(例如反义分子或三股螺旋)、有机分子、无机分子和小分子。抗血管生成药其它的实例可参见例如美国公布号2005/0002934A1第277-282段，其通过引用以其整体予以结合。在其它实施方案中，按照本发明使用疗法不是抗血管生成药。
在一些实施方案中，与本文所述重组RNA病毒或药物组合物组合使用的疗法是抗炎药。抗炎药的非限制性实例包括非甾体抗炎药(NSAID)(例如塞来考昔(CELEBREXTM)、双氯芬酸(VOLTARENTM)、依托度酸(LODINETM)、非诺洛芬(NALFONTM)、吲哚美辛(INDOCINTM)、酮咯酸(ketoralac)(TORADOLTM)、奥沙普秦(DAYPROTM)、萘丁美酮(nabumentone)(RELAFENTM)、舒林酸(CLINORILTM)、托美丁(tolmentin)(TOLECTINTM)、罗非考昔(VIOXXTM)、奈普生(ALEVETM、NAPROSYNTM)、酮洛芬(ACTRONTM)和萘丁美酮(RELAFENTM))、甾体抗炎药(例如糖皮质激素、地塞米松(DECADRONTM)、皮质甾类(例如甲泼尼龙(MEDROLTM))、可的松、氢化可的松、泼尼松(泼尼松TM和DELTASONETM)和泼尼松龙(PRELONETM和PEDIAPREDTM))、抗胆碱能药类(例如硫酸阿托品、甲基硝酸阿托品和异丙托溴铵(ATROVENTTM))、β2-激动剂(例如abuterol(VENTOLINTM和PROVENTILTM)、比托特罗(TORNALATETM)、左沙丁胺醇(XOPONEXTM)、奥西那林(ALUPENTTM)、吡布特罗(MAXAIRTM)、特布他林(terbutlaine)(BRETHAIRETM和BRETHINETM)、沙丁胺醇(PROVENTILTM、REPETABSTM和VOLMAXTM)、福莫特罗(FORADIL AEROLIZERTM)和沙美特罗(SEREVENTTM和SEREVENT DISKUSTM))和甲基黄嘌呤(例如茶碱(UNIPHYLTM、THEO-DURTM、SLO-BIDTM和TEHO-42TM))。
在某些实施方案中，与本文所述重组RNA病毒或药物组合物组合使用的疗法是烷化剂、亚硝基脲、抗代谢药、蒽环类、拓扑异构酶II抑制剂或有丝分裂抑制剂。烷化剂包括但不限于白消安、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥(cholormbucil)、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(decarbazine)、氮芥、美法仑(mephalen)和替莫唑胺(themozolomide)。亚硝基脲包括但不限于卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)。抗代谢药包括但不限于5-氟尿嘧啶、卡培他滨、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷和氟达拉滨。蒽环类包括但不限于柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星和米托蒽醌。拓扑异构酶II抑制剂包括但不限于托泊替康、伊立替康、依托泊苷(etopiside)(VP-16)和替尼泊苷。有丝分裂抑制剂包括但不限于紫杉烷类(taxanes)(紫杉醇、多西他赛)和长春花属生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)。
在一些实施方案中，联合疗法包括给予两种或更多种不同的本文所述重组RNA病毒。
5.7.5患者群
在某些实施方案中，可将本文所述重组RNA病毒或组合物给予无病对象(
Figure BDA00002819658700581
subjec)，即未患疾病的对象。在一个实施方案中，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予有患疾病的风险的初治对象。
在某些实施方案中，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予诊断患有癌症的患者，例如患者被诊断患有白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨与结缔组织肉瘤、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、肺癌(例如小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、喉癌和间皮瘤)和/或前列腺癌。
在某些实施方案中，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予患有呼吸道疾病的患者，例如患者被诊断患有影响呼吸系统的病毒感染、影响呼吸系统的细菌感染、哮喘、癌症、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、肺炎、鼻炎、结核病、支气管炎、喉炎、扁桃体炎和/或囊性纤维化。
在某些实施方案中，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予患有自身免疫病的患者，例如患者被诊断患有艾迪生病、贝切特病、慢性活动性肝炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多神经病、丘-施综合征、克罗恩病、格雷夫斯病、急性热病性多神经炎、重症肌无力、赖特病、类风湿性关节炎、结节病、斯耶格伦综合征和/或系统性红斑狼疮。
在某些实施方案中，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予诊断患有与高胆固醇有关的疾病的患者，例如患者被诊断患有心脏病、中风、外周血管疾病、糖尿病和/或高血压。
在某些实施方案中，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予被诊断患有被病毒感染而引起的疾病的患者，例如患者被以下病毒感染：呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、或丙型流感病毒)、人偏肺病毒(HMPV)、鼻病毒、副流感病毒、SARS冠状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(甲型、乙型、丙型)、依波拉病毒、疱疹病毒、风疹病毒、重型天花病毒和/或轻型天花病毒。
在某些实施方案中，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予诊断患有被细菌感染而引起的疾病的患者，例如患者被以下细菌感染：肺炎链球菌、结核分枝杆菌、肺炎衣原体、百日咳博特氏菌、肺炎支原体、流感嗜血菌、粘膜炎莫拉氏菌、军团杆菌属、耶氏肺孢子虫、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、炭疽芽孢杆菌、和土拉热弗朗西丝氏菌、布氏疏螺旋体、沙门氏菌属、鼠疫耶尔森氏菌、志贺氏菌属、大肠杆菌、白喉棒状杆菌和/或苍白密螺旋体。
在某些实施方案中，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予被诊断患有被真菌感染而引起的疾病的患者，例如患者被以下真菌感染：芽生菌属(Blastomyces)、Paracoccidiodes、孢子丝菌属(Sporothrix)、隐球菌属(Cryptococcus)、念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、组织孢浆菌属(Histoplasma)、隐球菌属、双极菌属(Bipolaris)、支孢瓶霉属(Cladophialophora)、毛支孢属(Cladosporium)、德氏霉属(Drechslera)、外瓶霉属(Exophiala)、着色霉属(Fonsecaea)、瓶霉属(Phialophora)、丝壳霉属(Xylohypha)、Ochroconis、小鼻枝霉属(Rhinocladiella)、齿梗孢属(Scolecobasidium)和/或Wangiella。
在某些实施方案中，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予被诊断患有被酵母感染而引起的疾病的患者，例如患者被以下酵母感染：芽孢酵母属(Aciculoconidium)、Botryoascus、酒香酵母属(Brettanomyces)、布勒弹孢酵母属(Bullera)、布勒担孢酵母属(Bulleromyces)、假丝酵母属(Candida)、固囊酵母属(Citeromyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、隐球菌属、Cystofilobasidium、Debaromyces、德巴利酵母属(Debaryomyces)、德克酵母属(Dekkera)、双足囊菌属(Dipodascus)、内孢霉属(Endomyces)、拟内胞霉属(Endomycopsis)、担孢酵母属(Erythrobasidium)、Fellomyces、Filobasidium、小季酵母属(Guilliermondella)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、汉逊酵母属Hansenula)、Hasegawaea、Hyphopichia、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克勒克酵母属(Kloeckera)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Komagataella、Leucosporidium、油脂酵母属(Lipomyces)、洛德酵母属(Lodderomyces)、Malassezia-Mastigomyces、梅奇酵母属(Metschnikowia)、Mrakia、拿逊酵母属(Nadsonia)、八孢酵母属(Octosporomyces)、卵孢酵母属(Oosporidium)、管囊酵母属(Pachysolen)、Petasospora、Phaffia、毕赤酵母(Pichia)、Pseudozyma、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、类酵母属(Saccharomycodes)、复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、裂芽酵母孢子菌属(Schizoblastosporion)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、新月酵母属(Selenotila)、链担耳属(Sirobasidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、冠孢酵母属(Stephanoascus)、梗孢酵母属(Sterigmatomyces)、Syringospora、有孢圆酵母属(Torulaspora)、球拟酵母属(Torulopsis)、Tremelloid、丝孢酵母属(Trichosporon)、三角酵母属(Trigonopsis)、Udeniomyces、Waltomyces、威克酵母属(Wickerhamia)、拟威尔酵母属(Williopsis)、温酵母属(Wingea)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)、Zygofabospora、Zygolipomyces和/或接合糖酵母属(Zygosaccharomyces)。
在某些实施方案中，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予诊断患有被寄生物感染而引起的疾病的患者，例如患者被以下寄生物感染：巴贝虫属(Babesia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)、利什曼原虫属(Leishmania)、兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、疟原虫属(Plasmodium)、弓形体属(Toxoplasma)、毛滴虫属(Trichomonas)、锥虫属(Trypanosoma)、蛔虫属(Ascaris)、多节绦虫亚纲(Cestoda)、钩虫线虫属(Ancylostoma)、布鲁格丝虫属(Brugia)、片吸虫属(Fasciola)、毛线虫属(Trichinella)、裂体吸虫属(Schistosoma)、绦虫属(Taenia)、臭虫科(Cimicidae)、虱属(Pediculus)和/或疥螨属(Sarcoptes)。
在一些实施方案中，在疾病症状出现之前或在疾病症状变严重之前(例如在患者需要住院之前)，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予患有疾病(例如癌症或呼吸道疾病)的患者。在一些实施方案中，在疾病症状出现之后或在疾病症状变严重之后(例如在患者需要住院之后)，将本文所述重组RNA病毒或组合物给予患有疾病的患者。
在一些实施方案中，待给予本文所述重组RNA病毒或组合物的对象是动物。在某些实施方案中，动物是鸟。在某些实施方案中，动物是犬。在某些实施方案中，动物是猫。在某些实施方案中，动物是马。在某些实施方案中，动物是牛。在某些实施方案中，动物是哺乳动物，例如马、猪、小鼠或灵长类动物，优选为人。
在某些实施方案中，待给予本文所述重组RNA病毒或组合物的对象是成人。在某些实施方案中，待给予本文所述重组RNA病毒或组合物的对象是50岁以上的成人。在某些实施方案中，待给予本文所述重组RNA病毒或组合物的对象是老年人对象。
在某些实施方案中，待给予本文所述重组RNA病毒或组合物的对象是早产婴儿。在某些实施方案中，待给予本文所述重组RNA病毒或组合物的对象是幼童。在某些实施方案中，待给予本文所述重组RNA病毒或组合物的对象是儿童。在某些实施方案中，待给予本文所述重组RNA病毒或组合物的对象是婴幼儿。在某些实施方案中，向其给予本文所述重组RNA病毒或组合物的对象不是6个月以下的婴幼儿。在一个具体的实施方案中，待给予本文所述重组RNA病毒或组合物的对象有2个月或更小。
在一些实施方案中，不将活病毒(例如活的重组RNA病毒)给予一个或多个以下患者群可能是明智的：老年人；6个月以下的婴幼儿；怀孕个体；1岁以下的婴幼儿；2岁以下的儿童；3岁以下的儿童；4岁以下的儿童；5岁以下的儿童；20岁以下的成人；25岁以下的成人；30岁以下的成人；35岁以下的成人；40岁以下的成人；45岁以下的成人；50岁以下的成人；70岁以上的老年人；75岁以上的老年人；80岁以上的老年人；85岁以上的老年人；90岁以上的老年人；95岁以上的老年人；患有哮喘或其它反应性气道疾病史的个体；患有慢性潜在性医学病症的个体，所述病症可能使其易患严重病毒感染；有急性热病性多神经炎综合征史的个体；患有伴有发热的急性重症疾病的个体，或者患有中度或重症疾病的个体。
5.7.6植物应用
在某些方面，重组RNA病毒来源于植物RNA病毒，并含有并表达产生效应子RNA的异源RNA，所述效应子RNA靶向植物基因以调节植物的性状。在某些实施方案中，植物是小麦、烟草、茶树、咖啡、可可、玉米、大豆、甘蔗和水稻。在某些实施方案中，植物的性状对以下不利生长条件有抗性，例如干旱、洪涝、寒冷、热、低光照或光照不足、暗期延长、营养缺乏或土质贫乏包括砂土、岩石类酸性或碱性土壤。在某些实施方案中，靶向植物基因产生生长更快的植物、产生更多种子的植物、对有害生物和微生物的抗性提高的植物或用作食物的味道或粘度改进的植物。
5.8给药方式
5.8.1递送途径
可通过各种途径将本文所述重组RNA病毒或组合物递送给对象。这些包括但不限于鼻内、气管内、口服、真皮内、肌内、腹膜内、透皮、静脉内、结膜和皮下途径。在具体的实施方案中，给药途径为经鼻，例如作为鼻喷剂的部分。在某些实施方案中，配制组合物用于肌内给药。在一些实施方案中，配制组合物用于皮下给药。在某些实施方案中，配制的组合物不用于通过注射给药。在具体的实施方案中，配制组合物用于通过注射以外的途径给药。
5.8.2给药的剂量和频率
在一种或多种本文所述方法中可能是有效的重组RNA病毒或组合物的量将取决于所采用的方法，并可通过标准实验室和/或临床技术确定。
制剂中所采用的确切剂量还将取决于给药途径以及其它条件，并且应根据医师的判断和各个对象的情况来决定。例如，有效剂量还应随给药方法、靶位点、患者的生理状态(包括年龄、体重、健康状况)而变化，不论患者是人还是动物，且不论治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物(例如转基因小鼠)。对治疗剂量进行最佳滴定测量以使安全性和功效优化。
在某些实施方案中，采用体外测定法以辅助鉴定最佳剂量范围。有效剂量可由来自体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线推算。
重组RNA病毒的剂量可在10-100或更多个病毒颗粒/剂量间变化。在一些实施方案中，重组RNA病毒的合适剂量为102、5x102、103、5x103、104、5x104、105、5x105、106、5x106、107、5x107、108、5x108、1x109、5x109、1x1010、5x1010、1x1011、5x1011或1012pfu，并且以每当需要时的间隔给予对象一次、两次、三次或更多次。
在某些实施方案中，将重组RNA病毒或组合物以单剂量给予对象一次。在某些实施方案中，将重组RNA病毒或组合物以单剂量给予对象，接着1天、3天、5天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年后给予第二剂量。在一些实施方案中，重组RNA病毒或组合物的给予可重复一段特定的时段，并且给药可间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在某些实施方案中，将重组RNA病毒或组合物每年以单剂量给予对象一次、两次或3次。
5.9测定法
5.9.1测试病毒复制的测定法
可采用本领域技术人员熟知的和下文第6节中描述的方法，对本文所述重组RNA病毒有效复制的同时表达效应子RNA的能力进行评价。例如，可利用多周期生长曲线等方法来测定表达效应子RNA的重组RNA病毒的复制能力。简单地说，细胞用表达效应子RNA的重组RNA病毒感染，接着在不同的时间点取出含有病毒的上清液。然后将上清液用于噬斑测定，并统计表示重组RNA病毒存在的噬斑数目。
本文所述重组病毒的复制率可通过技术人员已知的任何标准技术测定。复制率用病毒的生长速率表示，可通过病毒效价对感染后的时间作图来确定。可通过技术人员已知的任何技术测定病毒效价。在某些实施方案中，为了测量病毒效价，将含有重组RNA病毒的悬液与易受该病毒感染的细胞一起孵育。可用于本发明方法的细胞类型包括但不限于Vero细胞、LLC-MK-2细胞、Hep-2细胞、LF1043(HEL)细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、293T细胞、QT6细胞、QT35细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)或tMK细胞。在重组RNA病毒与细胞一起孵育后，测定被感染细胞的数目。在某些具体的实施方案中，重组RNA病毒包含报道基因。因此，表达报道基因的细胞的数目代表了被感染细胞的数目。在一个具体的实施方案中，重组RNA病毒包含编码eGFP的异源核苷酸序列，采用FACS测定表达eGFP的细胞的数目，即被重组RNA病毒感染的细胞的数目。
5.9.2用于测试效应子RNA加工的测定法
5.9.2.1Drosha测定法
可采用本领域已知的任何测定法来评价Drosha加工异源RNA的能力。用于评价Drosha加工的示例性测定法描述于Zeng和Cullen，2005,J.Biol.Chem.280(30):27595-27603。在某些实施方案中，可进行酶促测定法以评价异源RNA的Drosha加工。简单地说，将纯化的Drosha与放射性标记的包含效应子的异源RNA混合，并在37℃下温育60-90分钟。然后，在终止酶促反应后，可通过RNA印迹分析，对Drosha加工异源RNA、从而导致前体效应子RNA(例如pri-miRNA)产生的能力进行评价(参见Zeng和Cullen，2005,J.Biol.Chem.280(30):27595-27603)。
5.9.2.2Drosha/DGCR8复合体测定法
可采用本领域已知的任何测定法来评价Drosha/DGCR8复合体加工异源RNA的能力。在某些实施方案中，可进行免疫沉淀测定以测试Drosha/DGCR8加工。例如，可使Drosha或DGCR8免疫沉淀，并与放射性标记的(例如用αP32UTP标记)T7-转录的前微小RNA一起温育。然后将免疫沉淀提取物与合成的RNA发夹一起在37℃下温育1小时。可通过标准凝胶电泳测量体外加工(参见例如Zeng和Cullen，2005,J.Biol.Chem.280(30):27595-27603；以及Lee等,Methods Enzymol.2007，427:89-106)。
5.9.2.3切酶测定法
可采用本领域已知的任何测定法来评价切酶加工异源RNA的能力。可采用类似于第5.10.3.1节中描述的用于评价Drosha RNA加工的测定法来评价切酶加工，例如，可进行酶促测定法以测试纯化的切酶加工异源RNA的能力。用于评价切酶加工的其它测定法描述于DiNitto等，2010,BioTechniques48(4):303-311。在某些实施方案中，可采用荧光切酶测定法(fluorgenic Dicer assay)，来评价切酶加工异源RNA的能力。简单地说，产生具有猝灭剂部分(例如Iowa Black RQ;IDT,Coralville,IA)的将用作切酶底物的荧光标记的异源RNA，当异源RNA不被切酶加工时，所述猝灭剂部分猝灭异源RNA的荧光。将荧光标记的异源RNA与浓度递增的经纯化的切酶一起在30℃下温育，随着切酶浓度增加，所测量的荧光随时间而改变。异源RNA的切酶加工导致猝灭剂部分释放和荧光强度可测量地增加(参见例如DiNitto等，2010,BioTechniques48(4):303-311)。
5.9.2.4核输出蛋白5测定法
可采用本领域已知的任何测定法来评价核输出蛋白5结合来自异源RNA的初级转录物(例如在Drosha加工后)的能力。用于评价核输出蛋白5结合的示例性方法描述于Brownawell等，2002,J.Cell Biol.156(1):53-64。简单地说，使来自异源RNA的标记的初级转录物与珠粒(例如A蛋白琼脂糖凝胶或GSH珠粒)结合，并与标记的(例如HIS-Tag)核输出蛋白5一起温育。温育后，将珠粒悬浮于Laemmli样品缓冲液中，用SDS-PAGE分离，并通过蛋白质印迹分析。由化学发光显示的核输出蛋白5和来自异源RNA的初级转录物两者的存在情况表明核输出蛋白5结合(参见Brownawell等，2002,J.Cell Biol.156(1):53-64)。
可采用本领域已知的任何测定法，来评价核输出蛋白5从核中输送来自异源RNA的初级转录物至胞质的能力(参见例如Brownawell等，2002,J.Cell Biol.156(1):53-64)。
5.9.2.5切酶/TRBP/PACT复合体测定法
可采用本领域已知的任何测定法，来评价切酶/TRBP/PACT复合体加工异源RNA的能力。在某些实施方案中，可采用第5.9.2.2节中描述的方法来评价切酶/TRBP/PACT复合体加工异源RNA的能力。
5.9.3用于测试效应子RNA表达的测定法
可采用本领域技术人员熟知的和下文第6节中描述的方法，评价本文所述重组RNA病毒表达效应子RNA的能力。用于评价效应子RNA表达的示例性方法包括RNA印迹分析(参见例如Pall和Hamilton，2008,Nat.Protoc.3(6):1077-1084)；茎环特异性定量PCR(参见例如Chen等，2005,NucleicAcids Res.33(20):e179)；以及RNase保护测定法(RPA)(参见例如Gillman等，Curr Protoc Mol Biol2001，第4.7单元)。
5.9.4用于测试对靶基因的作用的测定法
可采用本领域技术人员熟知的和下文第6节中描述的方法，评价由本文所述重组RNA病毒产生的效应子RNA调节靶基因表达的能力。在某些实施方案中，可采用检测RNA表达的测定法或采用检测蛋白质表达的测定法，来评价由本文所述重组RNA病毒产生的效应子RNA调节靶基因表达的能力。用于评价RNA表达的示例性方法包括RNA印迹分析(参见例如Pall和Hamilton，2008,Nat.Protoc.3(6):1077-1084)；茎环特异性定量PCR(参见例如Chen等，2005,Nucleic Acids Res.33(20):e179)；以及RNase保护测定法(RPA)(参见例如Gillman等，Curr Protoc Mol Biol2001，Unit4.7)。用于评价蛋白质表达的示例性方法包括蛋白质印迹和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样品，蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳(例如8%-20%SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转印到膜例如硝化纤维、PVDF或尼龙上，将膜在封闭溶液(例如含3%BSA或无脂奶的PBS)中封闭，将膜在洗涤缓冲液(例如PBS-Tween20)中洗涤，将膜与在封闭缓冲液稀释的第一抗体(目标抗体)一起温育，将膜在洗涤缓冲液中洗涤，将膜与第二抗体(其识别第一抗体，例如抗人抗体)一起温育，所述第二抗体与在封闭缓冲液中稀释的酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性同位素(例如32P或125I)标记的分子缀合，将膜在洗涤缓冲液中洗涤，并检测抗原的存在情况。本领域技术人员应了解有关可进行修改以提高受检信号和降低背景信号的实验变量。
ELISA一般包括制备抗原(例如含有目标抗原的细胞裂解物或经纯化的目标抗原的缓冲溶液)的溶液，用抗原包被96孔微量滴定板的各孔，孔用惰性缓冲液溶液洗涤，将与报道化合物例如酶报道分子(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)缀合的识别抗原的抗体加入孔中，温育一段时间，除去过量的缀合抗体，孔用惰性缓冲液溶液充分洗涤，并测量所保留的报道分子的量或活性。在ELISA中，目标抗体不必与报道化合物缀合；而是可将与报道化合物缀合的第二抗体(其特异性结合识别抗原的抗体)加入孔中。此外，可首先将抗体包被各孔，而不是用抗原包被各孔。在这种情况下，在将目标抗原加入包被孔中后，可加入与报道化合物缀合的第二抗体。目标抗体不必与报道化合物缀合；而是可将与报道化合物缀合的第二抗体(其特异性结合识别抗原的抗体)加入孔中。本领域技术人员应了解有关可被修改以提高受检信号的实验变量以及本领域已知的ELISA的其它变量。
5.9.5抗病毒活性测定
可针对抗病毒活性体外对由本文所述重组RNA病毒或其组合物表达的效应子RNA进行评价。在一个实施方案中，体外测定效应子RNA对病毒(例如流感病毒)生长的作用。可通过本领域已知的或本文描述的任何方法评价病毒的生长(参见例如第5.10.2节)。在一个具体的实施方案中，细胞用0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、0.1和1、或1和10、或MOI0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10MOI的重组RNA病毒感染。通过噬斑测定或本文描述的任何其它病毒测定法，测定上清液中的病毒效价。体外测定法包括这样的方法，即体外采用本领域众所周知的或本文描述的方法，在培养的细胞中测量病毒复制变化(例如通过噬斑形成测定)或病毒蛋白(例如通过蛋白质印迹分析测定)或病毒RNA(例如通过RT-PCR或RNA印迹分析测定)的产生。
5.9.6细胞毒性测定
可采用本领域众所周知的许多测定法，来评价在暴露于重组RNA病毒或其组合物后细胞(感染或未感染的)或细胞系的存活率，并由此确定重组RNA病毒或组合物的细胞毒性。例如，可通过以下方法来评价细胞增殖：测量溴脱氧尿苷(BrdU)掺入(参见例如Hoshino等，1986,Int.J.Cancer38，369；Campana等，1988,J.Immunol.Meth.107:79)；(3H)胸苷掺入(参见例如Chen,J.,1996,Oncogene13:1395-403;Jeoung,J.,1995,J.Biol.Chem.270:1836773)；通过直接的细胞计数；或通过检测已知基因例如原癌基因(例如fos、myc)或细胞周期标志物(Rb、cdc2、细胞周期蛋白A、D1、D2、D3、E等)的转录、翻译或活性的变化。可通过锥虫蓝染色或使用本领域已知的其它细胞死亡或存活标志物，来对细胞存活率进行评价。在一个具体的实施方案中，测量细胞ATP的水平以确定细胞存活率。
在具体的实施方案中，应用本领域的测定标准，例如测量胞内ATP水平的CellTiter-Glo测定试剂盒(Promega)，测量3天和7天时间内的细胞存活率。细胞ATP减少表明细胞毒性作用。在另一个具体的实施方案中，可在中性红摄取测定中测量细胞存活率。在其它实施方案中，形态变化的目视观察可包括膨大、粒度、边缘参差不齐的细胞、薄膜状外观、变成圆形、从孔表面脱落或其它变化。这些变化指定为T(100%毒性)、PVH(部分毒性-毒性非常重-80%)、PH(部分毒性-毒性重-60%)、P(部分毒性-40%)、Ps(部分毒性-毒性轻-20%)或0(无毒性-0%)，与所见细胞毒性一致。通过这些数据的回归分析来确定50%细胞抑制(细胞毒性)浓度(IC50)。
在一个具体的实施方案中，用于细胞毒性测定的细胞是动物细胞，包括原代细胞和细胞系。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在某些实施方案中，在一个或多个下列细胞系中对细胞毒性进行评价：U937，人单核细胞细胞系；原代外周血单核细胞(PBMC)；Huh7，人肝胚细胞瘤细胞系；293T，人胚肾细胞系；以及THP-1，单核细胞。在某些实施方案中，在一个或多个下列细胞系中对细胞毒性进行评价：MDCK、MEF、Huh7.5、Detroit或人气管支气管上皮(HTBE)细胞。
可在动物模型中针对体内毒性对重组RNA病毒或其组合物进行测试。例如，还可使用用于测试病毒活性的本文描述的动物模型和/或本领域已知的其它动物模型以测定本文所述重组RNA病毒的体内毒性。例如，将各种浓度的重组RNA病毒给予动物。随后，随时间变化监测动物的致死率、体重减轻或无法增加体重和/或可表明组织损伤的血清标志物的水平(例如作为广泛性组织损伤的指示物的肌酸磷酸激酶水平、作为可能的肝损伤的指示物的谷氨酸草酸转氨酶或丙酮酸转氨酶水平)。还可对这些体内测定法作改动以测试各种给药方式和/或剂量以外方案的毒性。
可在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法，测定重组RNA病毒的毒性和/或功效，以例如测定LD50(50%群体致死剂量)和ED50(50%群体治疗有效剂量)。毒性作用和治疗作用的剂量比为治疗指数，它可表示为LD50/ED50之比。优选具有大的治疗指数的重组RNA病毒。虽然可以使用具有毒副作用的重组RNA病毒，但是应当小心设计将这类重组RNA病毒靶向受累组织的位点的递送系统，以使对未感染细胞的潜在损害降至最低，从而降低副作用。
可利用从细胞培养测定和动物研究中获得的数据，来配制人用的各种剂量的重组RNA病毒。这类重组RNA病毒的剂量优选处于几乎无毒或无毒的范围内。剂量可在该范围内变化，这取决于所用剂型和所用给药途径。对于用于本文所述方法的任何重组RNA病毒，最初可从细胞培养测定中估算有效剂量。本文提供了有关剂量确定的其它信息。
此外，本领域技术人员已知的任何测定法可用来评价本文所述重组RNA病毒和组合物的预防和/或治疗功用。
5.9.7在非人动物中的体内活性
在用于人之前，优选针对所需治疗或预防活性对重组RNA病毒及其组合物进行体内测定。例如，可采用使用非人动物作为模型的体内测定法，确定给予重组RNA病毒或其组合物和/或其它疗法是否是优选的。
可测试重组RNA病毒及其组合物在动物模型系统中的活性，动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、山羊、绵羊、狗、兔、豚鼠等。在一个具体的实施方案中，在小鼠模型系统中测试重组RNA病毒及其组合物。这类模型系统是广泛使用的，并为技术人员所熟知。
一般而言，用作疾病模型的非人动物用重组RNA病毒或其组合物或者安慰剂治疗。随后，可针对疾病状况和进程对动物进行监测，并可评价重组RNA病毒预防和/或治疗疾病的能力。在某些实施方案中，进行组织病理学评价，以评估重组RNA病毒的作用。可采用本领域技术人员已知的方法，对用重组RNA病毒治疗的动物的组织和器官进行评价。
5.9.7.1抗癌症研究
可使用癌症动物模型，测试本文所述重组RNA病毒或其药物组合物的生物活性。这类动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔等。在一个具体的实施方案中，在小鼠模型系统中测试本文所述重组RNA病毒的抗癌活性。这类模型系统是广泛使用的，并为技术人员所熟知，例如SCID小鼠模型或转基因小鼠。
可通过将重组RNA病毒或其药物组合物给予动物模型，并验证重组RNA病毒或其药物组合物在所述动物模型有效降低癌症的严重程度，来确定本文所述重组RNA病毒或其药物组合物的抗癌活性。癌症动物模型的实例一般包括但不限于陪伴动物的自然发生的肿瘤(参见例如Vail和MacEwen，2000,Cancer Invest18(8):781-92)。肺癌动物模型的实例包括但不限于描述于Zhang和Roth(1994，体内8(5):755-69)的肺癌动物模型和p53功能受损的转基因小鼠模型(参见例如Morris等，1998，J La State Med Soc150(4)：179-85)。乳腺癌动物模型的实例包括但不限于过量表达细胞周期蛋白D1的转基因小鼠(参见例如Hosokawa等，2001,Transgenic Res10(5):471-8)。结肠癌动物模型的实例包括但不限于TCR b和p53双重敲除小鼠(参见例如Kado等，2001,Cancer Res.61(6):2395-8)。胰腺癌动物模型的实例包括但不限于PancO2鼠胰腺腺癌转移模型(参见例如Wang等，2001,Int.J.Pancreatol.29(1):37-46)和用皮下胰腺肿瘤中产生的nu-nu小鼠(参见例如Ghaneh等，2001,Gene Ther.8(3):199-208)。非霍奇金淋巴瘤动物模型的实例包括但不限于重症联合免疫缺陷(“SCID”)小鼠(参见例如Bryant等，2000，Lab Invest80(4):553-73)和IgHmu-HOX11转基因小鼠(参见例如Hough等，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(23):13853-8)。食道癌动物模型的实例包括但不限于用于人乳头瘤病毒16E7型癌基因的小鼠转基因(参见例如Herber等，1996,J.Virol.70(3):1873-81)。结肠直肠癌动物模型的实例包括但不限于Apc小鼠模型(参见例如Fodde和Smits，2001，Trends Mol Med7(8):36973和Kuraguchi等，2000)。
5.9.8在人类中的测定法
在一个实施方案中，在患有疾病的受试人中评价重组RNA病毒或其组合物预防或治疗疾病的能力。按照该实施方案，将重组RNA病毒或其组合物给予人对象，并测定重组RNA病毒或组合物对疾病的作用。
在另一个实施方案中，在患有疾病的人中，对重组RNA病毒或其组合物减轻与疾病有关的一种或多种症状的严重程度的能力进行了评价。按照该实施方案，将重组RNA病毒或其组合物或对照给予患有疾病的受试人，并测定重组RNA病毒或组合物对所述疾病的一种或多种症状的作用。可通过将用对照治疗的对象与用重组RNA病毒或组合物治疗的对象进行比较，来鉴定减轻一种或多种症状的重组RNA病毒或其组合物。可采用熟悉所述疾病的医师已知的技术，来确定重组RNA病毒或其组合物是否减轻与所述疾病有关的一种或多种症状。
在另一个实施方案中，将重组RNA病毒或其组合物给予健康受试人，并监测作为疫苗的功效。采用熟悉感染性疾病的医师已知的技术，来确定重组RNA病毒或其组合物作为疫苗是否有效。
5.10试剂盒
本文提供装有一个或多个容器的药包或试剂盒，容器中装有一种或多种本文所述药物组合物的成分，例如一种或多种本文提供的重组RNA病毒。本文提供的试剂盒还可装有一种或多种本文提供的重组RNA病毒，即试剂盒中的重组RNA病毒并非配作为药物组合物，而是配制用于实验目的。本文还提供装有一种或多种本文所述嵌合病毒基因组区段或嵌合基因的试剂盒。任选附于这类容器的可以是按监管药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定形式的说明书，所述说明书反映了人用药物的制造、使用或销售已获所述机构批准。
在上述方法中可使用本文所包括的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒装有本文所述重组RNA病毒。在一个具体的实施方案中，试剂盒装有重组流感病毒。在另一个具体的实施方案中，试剂盒装有重组新培斯病毒。在另一个具体的实施方案中，试剂盒装有一种或多种本文所述的嵌合病毒基因组区段或嵌合基因。
6.6.实施例
6.1实施例1：
该实施例表明，可对流感病毒进行改造以产生功能性miRNA而又不使病毒生长受损。
6.1.1材料与方法
6.1.1.1细胞培养
将HEK293、MDCK、CAD和鼠成纤维细胞在补充10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM(Mediatech)培养基中培养。切酶缺陷型成纤维细胞由A.Tarakhovsky(Rockefeller University，NYC)和Donal O’Carrol(EMBL，Monterotondo)提供，CAD细胞由T.Maniatis(Columbia University，NYC)提供。
6.1.1.2病毒设计和拯救
通过PCR，接着通过三向连接，来产生修饰的NS区段(A/PR/8/34)。使用引物5’-CCATTGCCTTCTCTCCCGGGACATACTGCTGAGGATGTC-3’(SEQ ID NO:5)和5’-GACATCCTCAGCAGTATGTCCCGGGAGAGAAGGCAATGG-3’(SEQID NO:6)，通过位点定向诱变使NS1ORF中的剪接受体位点(5215’tcttccaggacat3’533)突变以防止此位点处NS mRNA被剪接(5215’tctCccGggacat3’533)。用携带SapI和XhoI位点的引物(5’-GATCGCTCTTCTGGGAGCAAAAGCAGG-5’(SEQ ID NO:7)和5’-CCCCTCGAGTCAAACTTCTGACCTAATTGTTCCC-5’(SEQ IDNO:8))，自该剪接受体位点突变型NS区段扩增相当于NS1ORF连同vRNA的3’非编码区的片段(1-716个核苷酸)。使用携带XhoI和SapI位点的引物(5’-CGCTCGAGCACCATTGCCTTCTCTTCCAGG-3’(SEQ ID NO:9)和5’-CATCGCTCTTCTATTAGTAGAAACAAGG-3’(SEQ ID NO:10))，自NS质粒扩增相当于NEP/NS2和vRNA的5’-非编码区(Wt NS区段中的核苷酸508-890)的片段。NS1和NEP/NS2片段用SapI和XhoI消化，并连接至用SapI切割的pDZ拯救载体。采用之前描述的反求遗传学技术，来拯救重组病毒(参见例如Hoffmann等(2000)Proc Natl Acad Sci U S A97(11):6108-6113；以及Fodor等(1999)J Virol73(11):9679-9682)。简单地说，将8种pDZ质粒(代表IAV基因组的8个区段)每一种的0.5μg转染至293T细胞。24小时后，将293T细胞与上清液注射到8日龄卵中。感染后48小时，从尿囊液中收获重组病毒。在噬斑纯化后，通过对vRNA的RT-PCR产物测序，证实了修饰的NS区段。通过进行标准位点定向诱变，将ClaI限制位点进一步引入到NS vRNA的基因间区。使用ClaI插入位点以连接miR-124-2鼠基因座(chr3:17,695,454-17,696,037)或之前描述的4拷贝的miR-142-3p靶(参见例如Brown等(2007)Nat Biotechnol25(12):1457-1467)。
6.1.1.3病毒感染
按规定的感染复数(MOI)进行病毒感染。在含有规定的细胞系的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)的培养基中，接种病毒1小时，培养基补充了0.3%牛血清白蛋白(BSA，MP Biomedicals)和青霉素/链霉素。然后吸出接种物，或用新鲜的完全培养基更换规定次数，或置于补充0.5或5%BSA和L-(甲苯磺酰基酰氨基-2-苯基)乙基氯甲酮(TPCK)胰蛋白酶的最小必需培养基中。
6.1.1.4RNA印迹分析
按前述文献描述的方法，进行RNA印迹法和探针标记(参见例如Pall和Hamilton(2008)Nat Protoc3(6):1077-1084)。所用探针包括：抗miR-124：5’-TGGCATTCACCGCGTGCCTTAA-3’(SEQ ID NO:11)，抗miR-93：5’-CTACCTGCACGAACAGCACTTTG-3’(SEQ ID NO:12)，miR-142-3p：5’-TCCATAAAGTAGGAAACACTACA-3’(SEQ ID NO:13)和抗U6：5’-GCCATGCTAATCTTCTCTGTATC-3’(SEQ ID NO:14)。
6.1.1.5蛋白质印迹分析
从15%SDS-PAGE凝胶上分离的总蛋白质中产生蛋白质印迹。将已分离的蛋白质转印到硝化纤维(Bio-Rad)上，用5%脱脂乳在25℃下封闭1小时，然后与规定抗体一起在4℃下温育过夜。全部按在5%脱脂乳中的1微克/ml浓度使用肌动蛋白(Abcam)、NS1、NEP/NS2和NP(由P.Palese，MSSM，NYC提供)抗体。以1:5000稀释度在25℃下使用第二小鼠和兔抗体(GEHealthcare)1小时。按规定使用Immobilon Western Chemiluminescent HRP底物(Millipore)。
6.1.1.6免疫荧光
通过与4%甲醛在4℃下温育过夜，将细胞固定在玻璃盖玻片上。在2次PBS洗涤后，细胞用含0.5%NP40洗涤剂的PBS透化10分钟后，立即再洗涤2次。细胞用含0.5%牛白蛋白溶液(BSA)的PBS在室温下封闭30分钟。以1:500浓度将第一抗体在室温下温育2小时。单克隆抗体(E7-β-微管蛋白)获自Developmental Studies Hybridoma Bank。在含0.5%BSA的PBS中洗涤4次后，将细胞与1:750的第二抗体、罗丹明Red-X(Fisher)一起温育1小时，与所加入的Hoechst33342染料(Invitrogen)一起温育其余15分钟。在4次洗涤后，用Prolong Gold Antifade(Invitrogen)将盖玻片封在玻璃载玻片上。用Leica TCS SP5DMI显微镜以60x放大倍数拍摄图像。
6.1.1.7定量PCR
使用KAPA
Figure BDA00002819658700711
FAST qPCR Master Mix(KAPA Biosystems)，对指定的cDNA样品进行常规定量PCR，并且采用
Figure BDA00002819658700712
MicroRNA Assays(Applied Biosystems)，进行微小RNA定量PCR。在Mastercycler ep realplex(Eppendorf)上进行实验。在各个实验中，使用微管蛋白或snoRNA202作为内源持家基因，使用模拟物感染的或模拟物转染的样品作为校准物，根据一式多份计算ΔΔCT值。该值表示与模拟物感染的或转染的样品相比各种状况的倍数差异。误差棒表示倍数减少(fold induction)的+/-标准差。下文描述了用于QRT-PCR的引物。
6.1.1.85’RACE
采用用于cDNA末端快速扩增的5’RACE系统，2.0版(Invitrogen)，对病毒感染的样品进行5’RACE。按照生产商的说明书，进行该方法。简单地说，使用病毒cRNA特异性引物5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTAT-3’(SEQ ID NO:15)，进行第一链cDNA合成。cDNA使用S.N.A.P.纯化柱纯化，然后使用TdT，加dCTP尾。然后采用EconoTaq(VWR)，用所提供的Abridged Anchor引物和嵌套NEP引物5’-AATGGATCCAAACACTGTGTCA-3’(SEQ ID NO:16)，扩增cDNA。然后使用
Figure BDA00002819658700713
Gel提取试剂合(Qiagen)，对片段进行凝胶纯化，并使用TOPO TA
Figure BDA00002819658700714
试剂盒(Invitrogen)克隆用于测序。
6.1.1.9多周期生长曲线
用规定病毒以MOI0.01感染MDCK细胞。在规定时间，取出225μl上清液。一式三份在补充0.01%DEAE-葡聚糖(Sigma)和0.1%NaHCO3(Sigma)的MEM-琼脂覆盖物中，使上清液在连续稀释的MDCK细胞中形成噬斑。在感染后2天之后，统计噬斑。
6.1.1.10FACS
通过合成，并通过HindIII和BamH1限制性内切酶，将4个完全互补的miR-124靶位点插入pEGFPC1质粒(Genebank检索号U55763)中，来产生GFP_miR-124t。对重悬浮于含2%FBS的PBS的2x10e6个细胞/ml进行FACS分析。用Cytomics Fc500(Beckman)仪器，通过FL1通道对GFP表达进行定量测定。
6.1.1.11qPCR引物
所用qPCR和RT引物包括：PB25’-ATCGGAATCGCAACTAACGA-3(SEQ ID NO:17)和5’-TTTGCGGACCAGTTCTCTCT-3’(SEQ ID NO:18)。犬微管蛋白5’-GGTTCGAGTTCTGGAAGCAG-3’(SEQ ID NO:19)和5’-GGGGATGTAGTGCTCATCGT-3’(SEQ ID NO:20)，NEP/NS25’-CACTGTGTCAAGCTTTCAGGACATACTG-3’(SEQ ID NO:21)和5’-CTCGTTTCTGTTTTGGAGTGAGTG-3’(SEQ ID NO:22)，NS1(对于标准RT)5’-GGGCTTTCACCGAAGAGGGAGC-3’(SEQ ID NO:23)和5’-GTGGAGGTCTCCCATTCTCA-3’(SEQ ID NO:24)，NS5’cRNA5’-GACCAAGAACTAGGCGATGC-3’(SEQ ID NO:25)和5’-CGCTCCACTATCTGCTTTCC-3’(SEQ ID NO:26)，NS3’cRNA5’-AAGGGTGAGACACAAACTGAAGGT-3’(SEQ ID NO:27)和5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTAT-3’(SEQ ID NO:28)，以及NS环5’-CCATCGATGAGCTCCAAGAGAGGGTGAA-3’(SEQ ID NO:29)和5’-CCATCGATTCTCCCCACCCTTCCTAACT-3’(SEQ ID NO:30)，鼠微管蛋白5’-TGCCTTTGTGCACTGGTATG-3’(SEQ ID NO:31)和5’-CTGGAGCAGTTTGACGACAC-3’(SEQ ID NO:32)。
6.1.2结果
对甲型流感病毒进行改造以编码已知的微小RNA基因座，并确定对miRNA加工、PTGS活性、病毒复制的影响。因为构成甲型流感病毒基因组的8个负链区段中的2个在感染期间经过剪接(参见例如Palese和Shaw(2007)，载于Fields Virology第5版，编辑Knipe，DM和Howley，PM.(Raven，Philadelphia)，第1648-1698页)，所以对在病毒内含子的情况下病毒是否可允许插入哺乳动物pri-miRNA，从而模拟多种充分表征的内源miRNA(参见例如Kim和Kim(2007)EMBO J26(3):775-783)进行了研究。为了进行这些研究，选择区段8，因为它比经过剪接的2个病毒转录物短，因此认为对于添加遗传物质更易控制。区段8编码2种蛋白质，对细胞抗病毒活性提供阻断的非结构蛋白1(NS1)(参见例如Salvatore等(2002)J Virol76(3):1206-1212)，以及负责在病毒逸出前成熟RNP复合体穿梭至胞质并参与控制病毒复制的核输出蛋白(NEP，亦称NS2)(参见例如O'Neill等(1998)EMBO J17(1):288-296；及Robb等(2009)J Gen Virol90(Pt6):1398-1407)。由于编码NEP/NS2的N端的mRNA与NS1的C端转录物重叠，因此内源剪接受体位点被破坏，并在NS1的终止密码子外再造(图1A)。这种非重叠裂解的ORF的合成在区段8内产生基因间区，其延长NS1的3’UTR和NEP/NS2的剪接套索。为了确定病毒是否可允许细胞pri-miRNA的插入，将合成的(scbl)基因组序列或鼠miR-124-2基因座(以5’至3’(miR-124)和3’至5’(miR-124(R))两个方向)克隆至区段8的基因间区，通过使用基于质粒的拯救系统来产生病毒(参见例如Hoffmann等(2000)Proc Natl Acad Sci U SA97(11):6108-6113；及Fodor等(1999)J Virol73(11):9679-9682)。使纯化的病毒在10日龄的含胚鸡卵中繁殖，生长至约为10e8-10e9噬斑形成单位(pfu)/毫升(pfu/mL)的效价。如前所述，再将Scbl、miR-124和miR-124(R)片段克隆至红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein，RFP)表达质粒(pRFP)的基因间区(参见例如Makeyev等(2007)Mol Cell27(3):435-448)。观察到病毒依赖性miR-124合成与转染的基于质粒的miR-124产生的水平相当(图1B)。此外，miR-124表达受pre-miRNA的方向限制，这就表明仅以其内源5’至3’方向表达。此外，miR-124表达需要剪接NEP/NS2，因为仅表达在3’UTR具有miR-124发夹的NS1的构建体，无法产生小RNA(图6)。此外，尽管NS13’UTR延伸和NEP/NS2的内含子长度，但是合成序列的插入或pri-miR-124两者均不影响病毒蛋白表达，正如区段5上编码的核蛋白(NP)和均在区段8上编码的NS1或NEP/NS2的稳固水平所表明的一样(图1C)。为了测定NS重组病毒的复制能力，进行了多周期生长曲线(图1D)。重组NS病毒的复制表明了稳固生长，且与野生型(wt)甲型流感/PR/8/34病毒相比，病毒效价无显著降低。
为了确定含有在NEP/NS2合成期间产生的pri-miRNA的套索是否可被内源细胞机器继续加工，在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中进行了含miR-124的甲型流感病毒感染，并在多个时间点收获。病毒产生的miR-124的小RNA RNA印迹表明，早在感染后4小时miRNA便大量表达(图2A)。病毒-miR-124的稳固表达在感染期间持续，水平与针对内源miR-93观察到的相当。此外，虽然感染后4小时内pre-miR-124明显，但其在稍后时间的不存在表明，miRNA的病毒产生并不压制细胞输出机器，一个之前报道的有关miRNA腺病毒递送的现象(参见例如Grimm等(2006)Nature441(7092):537-541)。为了确保pre-miR-124的加工模拟内源切酶最终产物，通过茎环特异性RT-PCR进行了miR-124的实时定量(参见例如Chen等(2005)Nucleic Acids Res33(20):e179)。因为该测定对成熟miRNA的3’端有特异性，并区分得出因少至单个核苷酸而不同的相关miRNA，因此在响应含经改造的miR-124的病毒时观察到的稳固的25倍诱导表明，成熟产物可能是内源miR-124理想的模拟物(图2B)。通过PB2合成测量，miR-124的产生还与病毒复制相关(图2C)。为了确保来自甲型流感病毒的miR-124的产生被内源细胞机器加工，在野生型和切酶缺陷型成纤维细胞中进行了用合成对照和miR-124产生病毒的感染。通过小RNA RNA印迹对总RNA进行了分析，证实miR-124只在被编码miR-124的甲型流感病毒感染的野生型细胞中产生(图2D)。通过miR-93表达的缺失，证实了由于切酶缺乏所致的miRNA产生丧失。通过茎环特异性RT-PCR进一步证实了这些结果(图2E)。总之，这些结果表明，可对甲型流感病毒进行改造以在重新(de novo)病毒感染的情况下递送高水平的miR-124。
编码miRNA的RNA病毒的约束之一是发夹本身在病毒复制期间可形成Drosha底物，其可导致基因组剪接，产生两个截然不同的片段和miRNA发夹。这种现象显然可影响病毒子代输出，并可能诱导干扰缺损(DI)颗粒的形成。在甲型流感病毒的情况下，miR-124发夹的切割可导致病毒cRNA在miR-124茎的基部断裂(图3A)。为了针对切割活性监测cRNA水平，使用寡聚dT引物或对3’cRNA非编码区(NCR)(其在NS1和NEP/NS2mRNA两者中均不存在)有特异性的引物(参见例如Palese和Shaw(2007)，载于Fields Virology第5版，编辑Knipe，DM和Howley，PM.(Raven，Philadelphia)，第1648-1698页)，在来自被合成对照或含miR-124的病毒感染的成纤维细胞的RNA上进行了反转录(RT)。虽然寡聚dT RT合成NS1和NEP/NS2mRNA两者(以及NS cRNA)，但3’cRNA RT选择性扩增NScRNA并排除mRNA，正如缺乏NEP/NS2而显而易见(图3B)。为了确定Drosha是否能够直接从基因组加工miRNA发夹，采用这种区别性RT反应以监测重新病毒感染期间cRNA的5’、3’和发夹区。NS区段的定量PCR(qPCR)表明，在合成对照和产miR-124的甲型流感病毒间同样再出现5’和3’端(图3C和3D)。5’和3’区段末端的相同出现表明，这些两种病毒间的NS合成水平相当。为了确保qPCR数据不反映病毒回复体的出现，使用对miR-124NS环有特异性的引物以表明基因组发夹仍然存在(图3E)。因为cRNA切割可导致抑制进一步的vRNA/cRNA合成，相当水平的cRNA强有力的表明病毒基因组RNA不是Drosha介导的切割的有利底物。为了确定基因组RNA是否被任何水平的Drosha加工，对cRNA进行了5’RACE(5’互补端的快速扩增)(图3F)。除全长cRNA产物以外，该项分析从miR-124产生病毒扩增第二异常cRNA种类。在测序时，这种约500个核苷酸产物被鉴定为cRNA的异源群。虽然所分离的一些种类包括具有大的内部缺失的5’和3’cRNA端，但片段无一在miR-124发夹基部终止；这就表明随机复制中间体而不是Drosha介导的活性。总之，对NS cRNA(图3)或NS1的3’UTR(图6)缺乏Drosha活性表明miR-124的唯一来源是在NEP/NS2合成期间产生的套索。
在RNA病毒基因组的情况下编码miRNA的第二种阻碍是编码内含子发夹的基因组链与所产生的miRNA变得完全逆向互补，因此用作潜在的miRNA靶。在流感病毒的情况下，由mRNA产生的发夹可导致在vRNA上形成miRNA靶。这在cRNA或mRNA的情况下不会发生，因为沿miRNA茎环的不完全结合。为了确定这种现象是否引起对RNA病毒产生的miRNA的显著限制，对其它病毒进行改造以确定vRNA是否可进行miRNA介导的抑制。对于这些研究，使用编码基因间区的区段8在NS1的3’UTR中或在vRNA的情况下引入miR-142靶位点(图4A)。通过miR-142发夹的质粒递送实现miR-142的外源表达，并通过小RNA RNA印迹来证实(图4B)。因为这种miRNA已被证实有效诱导miR-142靶的转录抑制(参见例如Brown等(2007)Nat Biotechnol25(12):1457-1467)，因此研究当靶向mRNA(mRNAt)和/或vRNA(vRNAt)时是否可影响NS1的水平。MDCK细胞或稳定表达miR-142的MDCK细胞，用MOI0.1的合成对照、mRNAt或vRNAt重组病毒感染18小时(图4C)。总蛋白质分析表明，对照(ctrl)和vRNAt重组病毒中的NS1水平显示不论miR-142表达如何都无显著差异。相比之下，mRNA(mRNAt)的miR-142寻靶，导致NS1以miR-142依赖性方式急剧丧失，但病毒NP水平保持不受影响。总而言之，这些结果表明，基因组RNA对miRNA/RISC复合体的可及性不足以影响病毒的总体转录物水平。
最后，为了评价病毒产生的miRNA是否被加载到RISC复合体上，并且能够介导PTGS，测定了是否可使编码绿色荧光蛋白(GFP)的miR-124靶元件的串联重复序列(GFP_124)沉默。重组病毒感染和随后的GFP_124转染表明，只在表达miR-124的甲型流感病毒的情况下，绿色细胞数减少47.4%(图5A)。此外，为了确保病毒感染可在内源细胞转录物上诱导PTGS，使用神经元前体细胞系(CAD)以确定miR-124表达是否可刺激如前所述的神经元样分化(参见例如Makeyev等(2007)Mol Cell27(3):435-448)。为此，CAD细胞未经处理、经血清饥饿的或用合成的或产miR-124的甲型流感病毒毒株感染(图5B)。在感染后24小时或血清饥饿后48小时，固定细胞，通过共焦显微术检查，表明血清饥饿或病毒产生的miR-124的表达足以诱导神经元样形态。总之，这些结果表明可对甲型流感病毒进行改造以编码内源完全功能性的miRNA。
6.1.3结论
对甲型流感病毒毒株进行改造以编码功能性miRNA，其合成至与相当于极丰富的细胞miRNA的水平。病毒产生的miRNA在将PTGS赋予靶mRNA的能力方面模拟其内源对应物。
6.2实施例2：
该实施例表明，可对阳性单链质型病毒新培斯病毒进行改造以产生功能性miRNA。
将mmu-pri-miR-124-2基因座(chr3:17,695,454-17,696,037)插入新培斯病毒(毒株s51)结构基因下游唯一的BstEII限制位点上，并包括双份亚基因组启动子(图7A)。重组毒株(Sindbis-124)能够感染CAD细胞(图7B)，并在以MOI1.0感染后4-36小时内在人成纤维细胞中产生pre-miR-124和miR-124两者(图7C)。
6.2.1Sindbis产生的miR-124需要切酶但是不依赖于核输出蛋白-5
核输出蛋白-5阳性293成纤维细胞、核输出蛋白-5阴性293成纤维细胞、切酶阳性永生化鼠成纤维细胞和切酶阴性永生化鼠成纤维细胞用模拟物对照、Sindbis-124或编码合成的(scbl)RNA基因座的新培斯病毒(毒株s51)感染，并对细胞加工pre-miR-124和产生miR-124的能力进行了评价。用Sindbis-124感染的核输出蛋白-5阳性和核输出蛋白-5阴性细胞产生miR-124(图13，泳道9和12)。相比之下，仅用Sindbis-124感染的切酶阳性细胞，而非用Sindbis-124感染的切酶阴性细胞产生miR-124(图13，泳道3和6)。因此，Sindbis产生的miR-124需要切酶用于加工，但不需要核输出蛋白-5用于加工，这就表明通过新培斯病毒的miR-124产生不依赖于核(图13)。
6.3实施例3：
可使用模型miRNA，产生靶向目标基因的微小RNA。为了从模型RNA产生靶向目标基因的这类人工miRNA，可遵循某些参数，例如(i)在人工miRNA中模型miRNA的总体预测结构可以是保守的；(ii)人工miRNA可含有模型pre-miRNA的5’和3’侧翼序列；(iii)发夹的凸起在人工和模型miRNA之间可相同；和(iv)沿人工miRNA茎上的互补性可与模型miRNA的匹配。
6.3.1人NFKBIA基因
为了靶向人NFKBIA基因(保藏号NG_007571.1；GENE ID NO：4792)，可仿照miR-30a(GENE ID NO:407029)设计异源RNA，如图10A所示。
6.3.2流感病毒核蛋白基因
为了靶向流感病毒核蛋白基因(保藏号EF190975.1)，可仿照miR-30a设计异源RNA，如图10B所示。
6.3.3人EGFR基因
为了靶向人EGFR基因(GENE ID：1956)，可仿照has-miR-585(GENEID 693170)设计异源RNA，如图10C所示。
6.3.4人KRAS基因
为了靶向人KRAS基因(GENE ID：3845)，可照仿has-miR-585(GENEID 693170)设计异源RNA，如图10D所示。
6.3.5人ELANE基因
为了靶向人ELANE基因(GENE ID：1991)，可仿照has-miR-585(GENE ID 693170)设计异源RNA，如图10E所示。
6.3.6志贺氏菌属HepA基因
为了靶向志贺氏菌属Hep A基因(保藏号NC_008258.1)，可仿照has-miR-585(GENE ID 693170)设计异源RNA，如图10F所示。
6.3.7SARS冠状病毒核蛋白基因
为了靶向SARS冠状病毒核蛋白基因(保藏号AY291315.1)，可仿照has-miR-585(GENE ID 693170)设计异源RNA，如图10G所示。
6.4实施例4:
可产生包含靶向目标基因的效应子RNA的重组RNA病毒。
6.4.1节段负链RNA病毒
可制备产生效应子RNA的重组节段负链RNA病毒(例如正黏病毒)。
6.4.1.1套索-经典
可产生包含基因区段的重组节段负链RNA病毒(例如正黏病毒)，所述基因区段包含形成典型套索的效应子RNA重组节段负链RNA病毒可包含基因区段，所述基因区段包含：(a)存在于重组节段负链RNA病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成重组节段负链RNA病毒基因可读框的部分的第一核苷酸序列；(c)剪接供体位点；(d)异源RNA序列；(e)剪接受体位点；(f)构成重组节段负链RNA病毒基因可读框的部分的第二核苷酸序列；和/或(g)存在于重组节段负链RNA病毒基因区段的5’非编码区的包装信号。
为了靶向流感病毒核蛋白基因(保藏号EF190975.1)，可设计可起典型套索作用的异源RNA，如图11A所示。
6.4.1.2套索--胞质过客链递送
可产生包含基因区段的重组节段负链RNA病毒(例如正黏病毒)，所述基因区段包含构成用于胞质过客链递送的套索的效应子RNA。重组节段负链RNA病毒可包含基因区段，所述基因区段包含：(a)存在于重组节段负链RNA病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成重组节段负链RNA病毒基因可读框的部分的第一核苷酸序列；(c)剪接供体位点；(d)所设计的形成发夹的异源RNA序列，所述发夹具有自RISC排除的目标序列；(e)剪接受体位点；(f)构成重组节段负链RNA病毒基因可读框的部分的第二核苷酸序列；和/或(g)存在于重组节段负链RNA病毒基因区段5’非编码区的包装信号。
为了靶向流感病毒核蛋白基因(保藏号EF190975.1)，可设计可起用于胞质过客链递送的套索的作用的异源RNA，如图11B所示。
6.4.1.3套索--核海绵
可产生包含基因区段的重组节段负链RNA病毒(例如正黏病毒)，所述基因区段包含效应子RNA，所述效应子RNA构成用作核海绵的套索。重组节段负链RNA病毒可包含基因区段，所述基因区段包含：(a)存在于重组节段负链RNA病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成重组节段负链RNA病毒基因可读框的部分的第一核苷酸序列；(c)剪接供体位点；(d)编码所需RNA靶的互补RNA的串联重复序列的内含子；(e)剪接受体位点；(f)构成重组节段负链RNA病毒基因可读框的部分的第二核苷酸序列；和/或(g)存在于重组节段负链RNA病毒基因区段5’非编码区的包装信号。
为了靶向流感病毒核蛋白基因(保藏号EF190975.1)，可设计可起用作核海绵的套索的作用的异源RNA，如图11C所示。
6.4.1.4所释放的核酶
可产生包含基因区段的重组节段负链RNA病毒(例如正黏病毒)，所述基因区段包含通过核酶释放的效应子RNA。重组节段负链RNA病毒的基因组可包含：(a)存在于重组节段负链RNA病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成重组节段负链RNA病毒基因可读框的第一核苷酸序列；(c)大于10个尿嘧啶碱基的序列段；(d)剪接供体位点；(e)异源RNA序列；(e)核酶识别基序；(f)自催化RNA(例如丁型肝炎核酶)；(g)剪接受体位点；和/或(h)存在于重组节段负链RNA病毒基因区段5’非编码区的包装信号。
为了靶向流感病毒核蛋白基因(保藏号EF190975.1)，可设计包含通过核酶释放的效应子RNA的异源RNA，如图所示11D。
6.4.2单链负义RNA病毒
可制备产生效应子RNA的重组单链负义RNA病毒(例如来自弹状病毒科或副粘病毒科的病毒)。重组单链负义RNA病毒的基因组可包含：(a)存在于重组单链负义RNA病毒基因组3’非编码区的聚合酶起始位点；(b)重组单链负义RNA病毒的病毒复制所需的任何数目的病毒区段；(c)其5’和3’序列符合聚合酶起始或终止要求的异源RNA序列；(d)病毒复制所需的任何其余病毒区段；和/或(e)存在于重组单链负义RNA病毒基因组5’非编码区的聚合酶复制位点。
为了靶向弹状病毒科的病毒的基因，可如图11E所示设计基因组区。
6.4.3单链正义RNA病毒
可制备产生效应子RNA的重组单链正义RNA病毒(例如披膜病毒科的病毒)。重组单链正义RNA病毒的基因组可包含：(a)存在于重组单链负义RNA病毒基因组5’非编码区的聚合酶起始位点；(b)非结构病毒蛋白的可读框；(c)亚基因组RNA合成的内部识别序列；(d)结构病毒蛋白的可读框；(d)亚基因组RNA合成的第二内部识别序列；(e)其5’和3’序列符合聚合酶起始或终止要求的异源RNA序列；和/或(f)存在于包括3’保守序列元件(CSE)和聚A尾的重组单链负义RNA病毒基因组3’非编码区的聚合酶复制位点。
为了靶向披膜病毒科的病毒的基因，可如图11F所示设计基因组区。
本说明书所引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用结合到本文中，就像各个出版物或专利申请具体而单独指明通过引用予以结合一样。虽然为了清楚理解的目的通过例证和实例对前面的发明进行了某种详细地描述，但是根据本发明的教导对本领域普通技术人员而言将是显而易见的是，可在不偏离随附权利要求的精神或范围的情况下，对其进行某些改动或修改。
6.5实施例5
该实施例表明，新培斯病毒来源的miR-124是不依赖于DGCR8的功能性微小RNA，并且Sindbis来源的miR-124可通过切酶产生，并对在脊椎动物细胞的抗病毒能力方面加以利用。
6.5.1Sindbis来源的miR-124是不依赖于DGCR8的功能性微小RNA
按实施例2所述对产生miR-124的新培斯病毒(Sindbis-124)进行改造。为了研究Sindbis来源的miR-124的分子性质，野生型鼠成纤维细胞用经改造的病毒感染，并将得自这些感染的RNA与得自使用缺少切酶、DGCR8或IFN-I受体组分IFNAR1的成纤维细胞进行的相同实验的RNA进行了比较(图16A)。在感染24小时后，野生型鼠成纤维细胞显示特别来自Sindbis-124感染的miR-124稳固合成。如实施例2所示，Sindbis产生的miR-124取决于切酶活性，然而，Sindbis来源的miR-124的合成不依赖于DGCR8这种微处理器的必需RNA结合组分。这与内源miR-93不同，其像缺乏切酶的细胞一样，DGCR8的缺失导致内源miRNA完全丧失。还测定了Sindbis来源的miR-124的不依赖于DGCR8和核输出蛋白-5的产生是否需要抗病毒特异性组分。为此，将缺乏功能性IFN-I受体的细胞用Sindbis-124感染。与丧失DGCR8或核输出蛋白-5的细胞类似，这些细胞显示稳固的miR-124合成，无证据表明在所观察到的非典型加工和细胞自主抗病毒防御之间存在相互影响。
为了确定Sindbis来源的miR-124是否是功能性的，构建了人工构建体，其中绿色荧光蛋白(GFP)包括具有miR-124的反向互补序列的串联重复序列的3’UTR(GFP_miR-124t)，从而使之易受PTGS活性的影响(图16B)。GFP_miR-124t的转染导致在不存在任何其它处理时的稳固GFP表达。相比之下，p124诱导GFP_miR-124t的PTGS至低于蛋白质印迹检测的水平。此外，虽然用新培斯病毒处理导致宿主蛋白质合成总体下降(一种α病毒中的普遍特性)，但是这种作用因Sindbis来源的miR-124的产生而显著加强，这就表明病毒产生的miR-124能够诱导PTGS。
因此，Sindbis来源的miR-124是不依赖于DGCR8的功能性微小RNA，这与依赖于DGCR8的甲型流感病毒产生的miR-124不同，事实是甲型流感病毒是核型的(参见例如Varble等，2011，RNA Biology8:190-194)。
6.5.2在抗病毒能力中可利用Sindbis来源的miR-124
由于不依赖于Dgcr8的加工，由新培斯病毒产生的切酶依赖性小RNA以多种方式模拟无脊椎动物的抗病毒反应，因此对Sindbis来源的miR-124是否可通过切酶产生以及抗病毒能力能否在脊椎动物细胞中加以利用进行了研究。虽然在永生化人成纤维细胞未观察到减毒的证据，但是因响应以高MOI进行的感染而在这些细胞中的快速复制可能掩蔽了这种表型。因此，对在野生型(WT)、Dcr1-/-和Ifnar1-/-成纤维细胞中，在低MOI的情况下，对SV和Sindbis-124的病毒的复制性质进行了比较(图33A)。虽然在感染后48小时，在WT细胞中，SV和Sindbis-124感染两者均增加到高效价，但是Sindbis-124显示约2log减弱(p=0.008)。这种减弱不是RdRp处的位阻或PAMP产生增加的结果，因为在切酶敲除细胞中SV和Sindbis-124之间的水平无显著不同(p=0.164)，但在缺乏IFN-I信号转导时仍保持1log的差异(p=0.015)。
为了表明miR-124可直接用于靶向病毒，将成纤维细胞用仅载体或p124转染，随后经模拟物处理或用SV或Sindbis-124感染的这些细胞(图33B)。虽然质粒来源的miR-124的表达不影响SV核心水平，但是Sindbis-124蛋白降低达5.8倍。Sindbis-124的miR-124寻靶可能在负链(-)基因组的水平上发生，因为基因组中miR-124靶的平均自由能(mfe)仅为-24.9kcal/mol，并且不含大于6-nt的种子序列(图33C)。这与具有完整miR-124靶且mfe为-45.1kcal/mol的(-)基因组不同。
6.6实施例6
该实施例表明，根据与标准siRNA转染相比，产人工微小RNA的载体可产生与相当的miRNA水平的事实，人工微小RNA在破坏特定基因表达方面与传统siRNA一样有效。
如实施例3所示，可遵循某些参数使用模型miRNA，来产生靶向目标基因的微小RNA。再举例来说，为了靶向人TAT1基因(GENE ID：6772；保藏号GU211348.1)，可设计仿照miR-124的异源RNA，如图17A-B所示。图17A中描述的成熟amiRNA(SEQ ID NO:45)在人TAT1的478-497位置处结合。
为了确定经改造以产生STAT1siRNA的发夹(称为STAT1amiRNA)能否在细胞水平表达，将人肺泡细胞(A549)用模拟物转染或用STAT1siRNA或STAT1amiRNA转染，接着进行探测STAT1siRNA(或作为对照的U6RNA)的RNA印迹分析。如图17C所示，检测出STAT1siRNA或STAT1amiRNA两者的表达，表明在各种情况下STAT1siRNA均表达。
接下来，为了确定人工STAT1siRNA(STAT1amiRNA)在破坏STAT1基因表达时是否有效，将人肺泡细胞(A549)用表达STAT1amiRNA的质粒或表达野生型miR-24的质粒转化，并在浓度为100单位/mL的通用干扰素β(PBL Biomedical)存在和不存在时培养12小时。随后，进行探测STAT1蛋白质表达(或作为对照的β-肌动蛋白)的蛋白质印迹分析。如图17D所示，人工STAT1siRNA(STAT1amiRNA)有效地减少STAT1基因表达，正如在IFN-I存在和不存在时均缺乏STAT1蛋白表达所表明的一样。
6.7实施例7
该实施例表明病毒中miRNA不依赖于核的合成的体内证据，并证实该不依赖于核的途径的分子组分，因为它们与典型的miRNA合成相当。
6.7.1材料与方法
6.7.1.1小RNA RNA印迹分析和深度测序
如前所述进行小RNA RNA印迹和探针标记(参见Perez等，Proc NatlAcad Sci USA107，11525-11530(2010)；以及Pall和Hamilton，Nat Protoc3，1077-1084(2008))。所用探针包括：抗miR-124：5’-TGGCATTCACCGCGTGCCTTAA-3’(SEQ ID NO:40)，抗miR-93：5’-CTACCTGCACGAACAGCACTTTG-3’(SEQ ID NO:41)和抗U6：5’-GCCATGCTAATCTTCTCTGTATC-3’(SEQ ID NO:42)，抗miR-122：5’-CAAACACCATTGTCACACTCCA-3’(SEQ ID NO:43)和抗miR-124-星体：5’-ATCAAGGTCCGCTGTGAACACG-3’(SEQ ID NO:44)。对于深度测序分析，如前所述产生miR-124特异性小RNA文库(参见Pfeffer等,NatMethods2,269-276(2005))。感染后16小时，提取得自表达miR-124的新培斯病毒(SV)、VSV和甲型流感病毒(IAV)的感染样品的总RNA，在12%变性tris-脲凝胶上分离出小RNA种类。然后如前所述将小RNA种类分离、纯化并扩增(参见Shapiro等，RNA16，2068-2074(2010))。然后将样品在Illumina GA llx hiseq2000测序机中运行，并对pri-miR-124-2基因座制图。
6.7.1.2用于胞质miR-124合成的载体设计
其它文献已描述了表达miR-124的Sindbis和甲型流感病毒的产生(参见Varble等，Proc Natl Acad Sci USA107，11519-11524(2010)；Shapiro等，RNA16，2068-2074(2010))。如前所述产生并拯救表达pri-miR-124基因组区段(chr3:17,695,454-17,696,037)的VSV(参见Stojdl等,Cancer Cell4,263-275(2003))。同样，如前所述，通过将pri-miR-122(基因组座标(genomic coordinate))克隆至人工亚基因组启动子中来产生SV122(参见Shapiro等，RNA16，2068-2074(2010))。由质粒pEGFP-C1(GenBank检索号U55763)产生GFPmiR-124。pri-miR-1243’非翻译区使用连接至pCRTOPO2.1(Invitrogen)的mmu-miR-124-2鼠基因座(chr3:17,695,454-17,696,037)产生，并使用XhoI和BamH1亚克隆。pri-miR-124的pCR TOPO2.1克隆用T7和M13R引物进行PCR扩增，并作为具有pCAGGs T7聚合酶的PCR片段转染。
6.7.1.3细胞培养物
Dicer1-/-和Argonaute2-/-成纤维细胞获自Alexander Tarakhovsky(Rockefeller University)和Donal O’Carroll(EMBL，Monterotondo，Italy)(参见Perez等，Nat Biotechnol27，572-576(2009)；以及O'Carroll等,GenesDev21，1999-2004(2007))。RNAenfl/fl成纤维细胞获自Dan Littman(NYU)(参见Chong等,Genes Dev24，1951-1960(2010)，并在补充丙酮酸的培养基中培养。Dgcr8fl/fl成纤维细胞获自Robert Blelloch(UCSF)。如前所述TRBP2-/-成纤维细胞获自Anne Gatignol，(McGill University)(参见Zhong等,Nat Genet22，171-174(1999))。PACT-/-成纤维细胞获自Ganes C.Sen(Cleveland Clinic)(参见Patel等，EMBO J17，4379-4390(1998))。将所有细胞在补充10%FBS和青霉素/链霉素的DMEM中培养，除非另有说明。Floxed细胞用MOI为300和500的表达GFP或GFP_Cre的腺病毒(分别为vector biolabs#1060和#1700)感染，随后在腺病毒感染后5天，按所述方法处理。通过洗涤细胞，并将其与无血清的培养基一起温育，来进行血清饥饿实验。为了证实细胞分裂丧失，将细胞与10um CFSE(分子探针)一起在37℃下温育10分钟。CFSE用25%BSA猝灭，洗涤，再铺板在含或不含10%血清的DMEM中。CFSE标记后24和48小时，将细胞固定(BD FACS溶解液)，在FACS Calibur(BD)上运行，并使用Flojo(Treestar)分析。如前所述在幼仓鼠肾(BHK)细胞中进行mIR-124的转录后沉默，通过萤光素酶测定(参见Perez等，Nat Biotechnol27，572-576(2009))。简单地说，细胞用在3’UTR内含有scp1的萤光素酶转染，分别用MOI为3、0.5和5的WT或表达miR-124的SV、VSV和IAV感染。感染后12小时，按照生产商的说明书，将细胞裂解并分析。将所有萤光素酶值归一化至renilla，并按一式三份进行。将来自表达124的病毒的萤光素酶表达与WT病毒感染的进行比较。对于GFP的转录后沉默，如前所述，将BHK细胞用miR-124靶定的GFP(GFP_124t-3’UTR)的转染(参见Varble等，Proc Natl Acad Sci USA107，11519-11524(2010))，转染后2小时，或用表达miR-124的质粒(p124)共转染，或分别用MOI1、3、5的SV124、VSV124和IAV124感染。感染后16小时，提取蛋白质，并通过蛋白质印迹进行分析。
6.7.1.4体内感染
将IFNαR1-/-小鼠用异氟烷麻醉，用2x105pfu SV124静脉内感染或用2x107pfu VSV124或1x107pfu IAV124的i.n.感染。对于VSV，感染后第1天取出肺，对于SV和IAV，感染后第2天取出肺。
6.7.1.5蛋白质印迹分析、免疫沉淀和qPCR
如前所述进行蛋白质印迹分析(参见Perez等，Proc Natl Acad Sci USA107，11525-11530(2010))。所用抗体包括：抗Pan-肌动蛋白(NeoMarkers，Freemont CA)、抗GFP多克隆(Santa Cruz Biotechnologies sc-73556sc)、抗SV核心(ATCC，VR-1248AF)、抗VSV G(Genscript-A00199)、抗Flag(sigma)和抗IAV NP(BEI Resources)。将印迹与第二兔或小鼠抗体以1:5000在室温下温育1小时。按照生产商的说明书，使用Immunobilon WesternChemiluminescent HRP Substraight(Millipore)。在293细胞中进行免疫沉淀。细胞用12μg带flag标签的Ago2或带flag标签的GFP转染，随后用野生型或表达miR-124的SV、VSV或IAV感染。感染后12小时收获蛋白质提取物，与蛋白质-G-PLUS琼脂糖(Santa Cruz Biotechnologies)和10μg抗Flag(Sigma)一起在4℃下进行免疫沉淀12小时。洗涤珠粒，用TRIzol(Invitrogen)提取RNA。使用KAPA SYBR FAST qPRC Master Mix(KAPA Biosystems)进行cDNA样品的qPCR。在Mastercycler ep realplex(Eppendorf)上进行PCR反应。肌动蛋白用作内源持家基因，相对于肌动蛋白一式多份计算ΔΔ循环阈值(ΔΔCT)值。数值表示相对于模拟物感染的样品的倍数变化。
6.7.1.6统计分析
应用双尾不配对斯氏t检验，对指定的样品进行统计分析。如果p值小于0.05，则数据视为显著。
6.7.2结果
6.7.2.1miRNA的胞质介导的合成
实施例1和2表明甲型流感病毒(IAV)、核负义RNA病毒和新培斯病毒(SV)、胞质正义RNA病毒产生成熟功能性miRNA的能力。在两个实施例两者中，将mmu-miR-124-2基因座插入病毒的非编码区(图19A)导致与病毒复制相当的miR-124合成(图18A和图19B)。鉴于胞质正义RNA病毒能够产生miRNA，尽管达不到核微处理器，但尝试以确定这些结果能不延伸至负极性的另一种胞质RNA病毒。为此，对水泡性口炎病毒(VSV)进行改造以编码mmu-mir124-2基因座，作为插入糖蛋白(G)和大的聚合酶(L)基因之间的独立病毒转录物(VSV124)(图19A)。miRNA基因座的插入不妨碍重组病毒的拯救，像IAV124和SV124一样，VSV124感染导致稳固的miR-124合成(图18A)。RNA印迹分析显示pre-miR-124和成熟miR-124的可检测水平，两种产物迁移至在由miR-124的质粒介导的核表达中观察到的相同的约60nt和20nt产物处(图19C)。由于来源于SV和VSV的pri-miR-124转录物均可含有由相应的病毒聚合酶介导的5’帽和3’聚A尾(参见Lichty等，Trends Mol Med10，210-216(2004)；及Jose等，Future Microbiol4，837-856(2009))，因此对成熟miRNA的产生是否需要这些修饰进行了研究。为此，将mmu-miR-124-2基因座插入T7启动子的上游，并确定能否观察到miR-124表达(图18B)。由于T7聚合酶不具有加帽活性也不具有poly A活性，因此miR-124的任何加工均独立于这些修饰。出人意料的是，这些分析显示了来源于胞质T7产生的初级转录物的pre-miR-124和miR-124两者的证据。此外，这种加工，像来源于VSV124和SV124的miR-124一样，难与质粒来源的miR-124(p124)相区分(图18B)。这些结果表明，初级miRNA的胞质加工对病毒感染无特异性，也不需要5’帽或3’聚A尾。
6.7.2.2胞质来源的miRNA的体内生产
鉴于来自不同的RNA来源的体外pri-miRNA胞质加工的证据，对这种活性能否体内重现进行了研究。为了比较直接的不依赖于固有抗病毒反应的病毒来源的miRNA合成，使用I型干扰素(IFN-I)信号转导缺陷型小鼠(参见Muller等，Science264，1918-1921(1994))。为此，IFNα受体I(Ifn　R1)敲除小鼠用SV124、VSV124或IAV124感染，在感染后测量miR-124的水平。重组病毒在感染动物的肺内产生高水平的miR-124(图20)。总之，该体内数据证实胞质miRNA合成为真实的生物学过程，并非限于转化细胞的特性。
6.7.2.3胞质来源的miRNA表明星体链蓄积
为了确定胞质来源的miR-124的测序特征，野生型(WT)鼠成纤维细胞用第6.7.2.2节中描述的3种病毒载体的每一种感染，且通过深度测序对小RNA部分进行了分析(图21A)。将所俘获的小RNA与583nt病毒来源的pri-miR-124的比对表明，约400,000个具体读数被定位在该转录物。不出意料，对于每种感染，最丰富的种类定位于成熟miR-124产物，表明了在细胞中高达经概况分析的总miRNA的4%的水平。由于miR-124表达限于脑部(参见Makeyev等，Mol Cell27，435-448(2007))，因此模拟物感染的细胞的水平表示小于经概况分析的总miRNA的0.001%。除病毒来源的miR-124的总体丰度以外，小RNA概况分析的另一个显著特征是星体链RNA的蓄积(“miR-124*”；图21A)。只限于质型病毒，通过深度测序俘获的星体链的量表示多达定位于pre-miR-124的RNA的40%(图21B)。这个数值与从核来源的miRNA中观察到数值完全不同，其中来自小脑的内源水平(其中miR-124大量表达)仅为总pre-miR-124计数0.2%。核来源的IAV124也反映出这种低水平的星体链RNA。通过RNA印迹也说明了miR-124和miR-124*的蓄积，这就证实了我们的深度测序分析，并进一步验证了来自胞质pri-miR-124加工的星体链的大量产生和稳定性(图22)。最后，对来源于这些情况每一种的miR-124序列的比较表明产生胞质加工，其显示几乎无5’异质性的出乎意料的高准确性(图21B)。总之，星体链的蓄积为胞质来源的病毒miR-124合成的高水平产生提供了独特的性质，而加工的准确性在很大程度上意味着小RNA加工机器的冗余水平。
6.7.2.4与Ago2缔合的胞质来源的miR-124介导PTS
因为在胞质miRNA加工期间miRNA星体链存在的增加可表明缺乏RISC加载和随后的双链体分离，因此对病毒来源的胞质miRNA是否与Ago2缔合进行了研究。经模拟物处理的或用表达miR-124的病毒感染的表达表位加标签的Ago2或绿色荧光蛋白(-GFP)的细胞用于免疫沉淀，通过RNA印迹对相关RNA进行了分析(图23A和24)。虽然从感染的表位加标签的表达GFP的细胞的免疫沉淀中未检测到病毒产生的miR-124，但不论胞内来源与否，Ago2均与miR-124缔合(图23A)。为了检查病毒产生的miR-124的PTS活性，表达含有Scp1的3’UTR的萤火虫萤光素酶、编码内源miR-124靶的细胞(参见Makeyev等，Mol Cell27，435-448(2007)；及Visvanathan等,Genes Dev21，744-749(2007))，用重组产miR-124的病毒感染，并与其亲代对应物进行比较。用SV124和VSV124感染对萤光素酶转录物具有显著的抑制，两者表明约60%抑制(图23B)。出人意料的是，miR-124的IAV介导的递送仅趋向于靶标表达降低，但未达到统计显著性，一种反映IAV感染和萤光素酶构建体表达之间的复杂动力学的结果(图23B)。鉴于IAV124不能明显抑制萤光素酶表达，进行了测试功能性的第二种测定。表达miR-124靶定的GFP(在3’UTR处含有4个完整靶位点)的细胞用产miR-124的病毒感染，并与模拟物感染或质粒来源的miR-124进行比较。与基于萤光素酶的数据一致，SV124和VSV124两者均诱导GFP的显著沉默，但是IAV124表明GFP水平降低约50%，与质粒来源的miRNA类似(图23C)。总之，这些结果表明胞质来源的miRNA是介导PTS的有效策略。
6.7.2.5胞质miRNA加工不是miRNA特异性的
由于胞质miRNA加工的分析限于mmu-miR-124-2，因此如前所述，对表达mmu-miR-122的第二种重组新培斯病毒(SV122)进行了改造(参见Shapiro等，RNA16，2068-2074(2010))。病毒拯救和随后在人成纤维细胞中的感染显示miR-122(一种通常限于肝细胞的miRNA)稳固表达(参见Jopling等，Science309，1577-1581(2005))，这就表明与来自肝细胞的内源加工无可分辨的差异(图25A)。mmu-miR-124和mmu-miR-122的合成强有力的表明，胞质miRNA加工不是前体miRNA类所特有的。
6.7.2.6胞质miRNA加工是不依赖于细胞分裂的
已使用新培斯病毒证实miR-124和miR-122胞质合成两者，且鉴于只可从SV124感染的细胞中检测miRNA种类的整个范围(即pri-miR-124、pre-miR-124和成熟-miR-124)，故选择该模型用于进一步的生化研究。鉴于永生化细胞中SV介导的miR-124加工的准确性，据推测快速分离可提供进入核微处理器的胞质pri-miR-124，导致pre-miR-124的产生。为力求满足该模型，通过血清饥饿阻止细胞周期以确定这能否消除miR-124产生。为了完全阻止，细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)处理，并在处理后24和48小时(hpt)通过流式细胞术监测，表明了完全阻断分裂(图26A)。虽然无分裂细胞的SV124感染的确引起病毒复制水平降低，尽管接种物大小增加(图26B)，但miR-124种类的相对水平不受影响(图25B)。这些数据表明，对于胞质介导的miRNA合成不需要细胞分裂。
6.7.2.7Sindbis产生的小RNA是切酶依赖性的但不依赖于TRBP2、PACT和Ago2
力求确定对于Sindbis产生的小RNA的合成是否需要典型miRNA加工机器的胞质组分，感染Dicer1、Tarbp、Prkra和Eif2c2(分别编码切酶、TRBP2、PACT和Ago2)遭破坏的细胞，以确定在感染后miR-124水平是否受影响(图27A-D)。为了确定切酶的表达是否影响SV产生的pre-miR-124的形成，以高感染复数(MOI)感染Dicer1缺陷型细胞，以检查可在合成期间蓄积的可观察得到的RNA副产品。SV124感染的Dicer1敲除细胞的RNA印迹分析显示丰富水平的pri-miR-124和60nt pre-miRNA，与WT细胞相比仅缺乏miR-124(图28A)。pre-miR-124的水平和大小与在SV124感染的WT细胞中产生的相当，这就表明切酶不参与Sindbis产生的小RNA的pri-miRNA切割(图28A)。为了评价胞质miRNA加工中的TRBP2依赖性，将Tarbp敲除细胞用SV124感染。虽然在SV124感染期间pri-miR-124的水平下降，相当于病毒复制减少(图27B)，但是该pri-miR-124和miR-124的相对比率类似于受感染的WT细胞，这就表明了TRBP2独立性(图28B)。同样，在缺乏另一种dsRNA结合蛋白的细胞中的SV124感染，PACT也表明未丧失miR-124产生(图28C)。
鉴于之前的结果表明Ago2在miR-451不依赖于切酶的产生中的作用(参见Chendrimada等，Nature436，740-744(2005)；Cheloufi等，Nature465，584-589(2010)；以及Yang等，Proc Natl Acad Sci USA107，15163-15168(2010))及其胞质定位，尽管miR-124不符合切割的结构要求，但仍对Ago2是否在Sindbis产生的小RNA产生中具有作用进行了研究(参见Cheloufi等，Nature465，584-589(2010)；Cifuentes等，Science328，1694-1698(2010)；以及Yang等，Proc Natl Acad Sci USA107，15163-15168(2010))。为此，感染Ago2缺陷型细胞，以对病毒来源的胞质miR-124合成与野生型细胞的胞质miR-124合成进行比较。这些数据表明加工无改变，尽管病毒复制水平相同(图28D和图27D)。总之，这些结果表明，切酶是胞质miRNA加工的必不可少的组分，在dsRNA结合蛋白PACT和TARBP中可能示需要其作用。
6.7.2.8Drosha的胞质微处理器样功能的证据
鉴于SV124的胞质定位，结合以不依赖切酶的方式产生的pre-miRNA的存在(图25A)，对负责60nt pre-miRNA产生的核酸酶进行了研究。为此，对Dgcr8-和Drosha-(RNAen-/-)缺陷型细胞中SV124小RNA合成进行了表征(图29)。由于这两种成纤维细胞衍生的细胞系是条件性敲除，因此细胞最初用表达GFP或GFP-Cre的重组复制缺陷型腺病毒载体(分别为AdV_GFP和AdV_Cre)处理。RNAenfl/fl和DGCR8fl/fl细胞处理后6天，证实除丧失载体依赖性GFP表达以外，还完全丧失内源miR-93，这就表明Dgcr8和Drosha功能完全丧失(图29A)。此外，鉴于miRNA的半寿期，该数据表明，Drosha功能和DGCR8功能两者早在感染后2天便遭破坏。为了确保在SV124接种时遭完全破坏，在载体处理后5天感染细胞。虽然尽管丧失Dgcr8，SV124小RNA合成仍维持，但丧失Drosha导致病毒体(vitron)合成受抑制(图29A-B)。然而，qPCR分析和pri-miR-124水平表明，虽然Dgcr8缺失不影响SV124转录物水平，但是Drosha缺失导致复制显著丧失，其nsP1水平表明降低超过2个数量级(图29B和图30)。因此，为了确定复制水平是否足以产生可检测的miRNA，野生型成纤维经细胞模拟物处理或用相同MOI的SV124感染，在感染后0、2、4、8、12和24小时，对miRNA种类进行了定量测定(图29C)。早在感染后4小时便检出Sindbis来源的pri-miR-124、pre-miR-124和成熟miR-124的产生，并在感染后24小时达到最大水平。pri-miR-124和成熟产物的定量测定显示可根据pri-miR-124水平预测可检测miR-124的水平(图29D)。该标准曲线还表明在Drosha不存在时检测的pri-miR-124水平就足够产生可检测的miR-124水平，因此，缺乏pre-miR-124或miR-124得出结论，即Sindbis小RNA产生是Drosha依赖性的。这些数据与以下报道中的发现一致：Drosha的siRNA介导的敲减影响(虽然不完全)由重组蜱媒脑炎病毒产生的miRNA的功能性(参见Rouha等，Nucleic Acids Res38，8328-8337(2010))。总之，这些数据表明，Drosha可在胞质内起切割胞质pri-miRNA的作用，虽然与独特的dsRNA结合蛋白一起。
6.7.3结论
该实施例验证了用于成熟miRNA产生的新的胞质加工机制，并且证实了用于小RNA介导的治疗的基于载体的递送策略。
6.8实施例8
该实施例表明，可使用病毒载体将微小RNA递送到特定的目标组织。
6.8.1甲型流感病毒
如实施例1中所述，对甲型流感病毒(IAV)进行改造以表达miR-124(IAV124)。Balb/C小鼠或经模拟物处理(IAV对照)或用1x104噬斑形成单位的IAV124鼻内感染。在感染后1、3和5天，从小鼠中收获整个肺，通过探测miR-124表达和探测作为对照的miR-93表达的RNA印迹，对得自所收获的肺的总RNA进行了分析。
如图31所示，IAV递送miR-124至小鼠肺中，并且在感染时期微小RNA在肺中持续蓄积，与IAV向性一致。
6.8.2水泡性口炎病毒
如实施例7所述，对水泡性口炎病毒(VSV)进行改造以表达miR-124(VSV124)。Balb/C小鼠或经模拟物处理(VSV对照)或用1x104噬斑形成单位的VSV124鼻内感染。在感染后2天，从小鼠中收获心脏、脾脏和肝，通过探测miR-124表达并探测作为对照的miR-93表达的RNA印迹对来自所收获的器官中的总RNA进行了分析。
如图所示32，所检测的miRNA水平反映了小RNA合成和VSV复制之间的相关性。
6.8.3结论
该实施例表明，可使用病毒载体，将微小RNA在体内递送至多个组织中。
本说明书所引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用结合到本文中，就像各个出版物或专利申请具体而单独指明通过引用予以结合一样。虽然为了清楚理解的目的通过例证和实例对前面的发明进行了某种详细地描述，但是根据本发明的教导对本领域普通技术人员而言将是显而易见的是，可在不偏离随附权利要求的精神或范围的情况下，对其进行某些改动或修改。
表1：序列
Figure BDA00002819658700891
Figure BDA00002819658700911
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Claims (27)

1.嵌合病毒基因组区段，其中所述嵌合病毒基因组区段来源于RNA病毒，且其中所述嵌合病毒基因组区段包含异源RNA，其中所述异源RNA在细胞中转录，产生干扰靶基因在细胞中表达的效应子RNA。
2.权利要求0的嵌合病毒基因区段，其中所述嵌合病毒基因区段包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成正黏病毒基因可读框的部分的第一核苷酸序列；(c)剪接供体位点；(d)异源RNA序列；(e)剪接受体位点；和(f)构成正黏病毒基因可读框的部分的第二核苷酸序列；和(g)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。
3.权利要求0的嵌合病毒基因区段，其中所述嵌合病毒基因区段包含：(a)存在于正黏病毒基因区段3’非编码区的包装信号；(b)构成第一正黏病毒基因和第二流感病毒基因的可读框的部分的第一核苷酸序列；(c)剪接供体位点；(d)构成第一正黏病毒基因可读框的部分的第二核苷酸序列；(e)异源RNA序列；(e)剪接受体位点；(f)构成第二正黏病毒基因可读框的部分的第三核苷酸序列；和(g)存在于正黏病毒基因区段5’非编码区的包装信号。
4.权利要求0的嵌合病毒基因区段，其中所述第一正黏病毒基因是流感病毒NS1基因，所述第二正黏病毒基因是流感病毒NS2基因。
5.权利要求0的修饰的流感病毒基因区段，其中所述第一正黏病毒基因是流感病毒M1基因，所述第二正黏病毒基因是流感病毒M2基因。
6.权利要求0的嵌合病毒基因组区段，其中所述RNA病毒是节段单链负义RNA病毒或节段双链RNA病毒。
7.嵌合病毒基因组，其中所述嵌合病毒基因组来源于RNA病毒，且其中所述嵌合病毒基因组包含异源RNA，其中所述异源RNA在细胞中转录，产生干扰靶基因在细胞中表达的效应子RNA。
8.权利要求0的嵌合病毒基因组，其中所述RNA病毒是非节段单链负义RNA病毒或非节段单链正义RNA病毒。
9.权利要求0的嵌合病毒基因组区段或权利要求7的嵌合病毒基因组，其中所述效应子RNA是miRNA、mirtron、shRNA、siRNA、piRNA、svRNA或反义RNA。
10.重组RNA病毒，其包含权利要求0的嵌合病毒基因组区段或权利要求7的嵌合病毒基因组。
11.核酸，其编码权利要求0的嵌合病毒基因组区段或权利要求7的嵌合病毒基因组。
12.权利要求0的核酸，其中所述核酸是DNA。
13.制备权利要求0的重组RNA病毒的方法，其中所述方法包括将权利要求0的核酸导入细胞，所述细胞表达用于产生重组RNA病毒的所有其它组分；从细胞上清液中纯化出重组RNA病毒。
14.权利要求0的重组RNA病毒，其中所述病毒包含减毒突变。
15.基质，其包含权利要求0-0中任一项的嵌合病毒基因组区段；或权利要求0-0中任一项的嵌合病毒基因组；或权利要求0的DNA；或权利要求0的重组RNA病毒。
16.权利要求0的基质，其中所述基质是细胞或卵。
17.药物组合物，其包含权利要求0的重组RNA病毒。
18.免疫原性组合物，其包含权利要求0的重组RNA病毒。
19.治疗和/或预防对象的疾病方法，所述方法包括将权利要求0的重组RNA病毒给予对象，其中所述效应子RNA干扰在疾病中过量表达或异位表达的基因的表达。
20.权利要求1的嵌合病毒基因组区段，其中所述RNA病毒是正黏病毒、本雅病毒或沙粒病毒。
21.权利要求20的嵌合病毒基因组区段，其中所述正黏病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、托高土病毒或传染性鲑鱼贫血病病毒；其中所述本雅病毒是布尼奥罗病毒、汉坦病毒、Dugbe病毒、山谷热病毒或番茄斑萎病毒；或其中所述沙粒病毒是拉沙病毒、胡宁病毒、马休波病毒或淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。
22.权利要求7的嵌合病毒基因组，其中所述RNA病毒是弹状病毒、副粘病毒、线状病毒、丁型肝炎病毒、波纳病毒、细小核糖核酸病毒、披膜病毒、黄病毒、冠状病毒、呼肠病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多蜱热病毒。
23.权利要求22的嵌合病毒基因组，其中所述弹状病毒是水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒或狂犬病相关病毒；其中所述副粘病毒是新城疫病毒(NDV)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、仙台病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)或偏肺病毒；其中所述线状病毒是依波拉病毒或马尔堡病毒；或其中所述披膜病毒是新培斯病毒。
24.在一个或多个容器装有嵌合病毒基因组区段的试剂盒，其中所述嵌合病毒基因组区段来源于RNA病毒，且其中所述嵌合病毒基因组区段包含异源RNA，其中所述异源RNA在细胞中转录，产生干扰靶基因在细胞中表达的效应子RNA。
25.在一个或多个容器中装有嵌合病毒基因组的试剂盒，其中所述嵌合病毒基因组来源于RNA病毒，且其中所述嵌合病毒基因组包含异源RNA，其中所述异源RNA在细胞中转录，产生干扰靶基因在细胞中表达的效应子RNA。
26.在一个或多个容器装有重组RNA病毒的试剂盒，其中所述重组RNA病毒包含嵌合病毒基因组区段，其中所述嵌合病毒基因组区段来源于RNA病毒，且其中所述嵌合病毒基因组区段包含异源RNA，其中所述异源RNA在细胞中转录，产生干扰靶基因在细胞中表达的效应子RNA。
27.在一个或多个容器中装有重组RNA病毒的试剂盒，其中所述重组RNA病毒包含嵌合病毒基因组，其中所述嵌合病毒基因组来源于RNA病毒，且其中所述嵌合病毒基因组包含异源RNA，其中所述异源RNA在细胞中转录，产生干扰靶基因在细胞中表达的效应子RNA。
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