CN111330008B - miR-93抑制剂在制备修复牙本质的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于修复牙本质的药物，属于牙本质再生药物领域。发明人通过研究发现，miR-93的抑制剂具备促进牙本质再生的作用，其原理是通过抑制miR-93来提高组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达，调节牙髓细胞成牙本质向分化和牙本质的形成。本发明能促进天然牙本质再生，可作为盖髓术中所使用的盖髓剂，能克服现有盖髓剂所致牙髓弥漫性钙化、操作技术要求高、引起牙齿变色等问题，具备良好的应用前景。

Description

miR-93抑制剂在制备修复牙本质的药物中的用途
技术领域
本发明属于牙本质再生药物领域，尤其涉及miR-93抑制剂在制备修复牙本质的药物中的用途。
背景技术
牙齿是人体中最坚硬的器官，外形上分为牙冠、牙颈和牙根三部分。结构组成上又分为牙釉质(珐琅质)、牙本质(象牙质)、牙髓(神经腺)等。牙釉质和牙本质保护牙髓组织，避免感染发生牙髓炎。
机械损伤、龋坏或牙本质发育不全类疾病会造成牙本质缺损。当缺损暴露牙髓组织时，为修复和保留牙髓，常采用牙髓切断术，即切除感染的部分牙髓组织，在牙髓断面放置药物，促进牙髓断面形成修复性牙本质(reparative dentin)，保留下方活髓组织，从而最大限度保留牙齿正常组织，恢复牙齿功能；前述的药物被称为盖髓剂。提高盖髓剂的疗效，促进修复性牙本质的形成，是提高手术成功率的关键。目前常见的盖髓剂包括氢氧化钙试剂、三氧化矿物凝聚体(MTA)等。虽然其使用已有较长的历史，但也存在明显的问题，如形成的牙本质桥存在裂隙，可能引起牙髓弥漫性钙化，操作技术要求高，引起牙齿变色等。另外，现有的盖髓剂促进牙本质再生的能力不够理想。
目前研究者们致力于研究新型生物材料，以促进牙本质的再生。其原理在于，牙髓组织中含有牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPCs)，具有自我增殖和多向分化能力。在某些生物因子的调控下，可促使牙髓干细胞分化形成成牙本质细胞(odontoblast)，分泌牙本质基质，形成新的牙本质硬组织，即修复性牙本质(reparativedentin)。因此探索这类生物材料成为牙本质修复药物研究的方向。
MicroRNA-93(miR-93)，也称为miR-93-5p，属于非编码短链RNA序列，可以通过靶向结合在基因mRNA的3’非编码区(3’UTR)，调节基因的表达，从而调控细胞的分化方向。研究发现miR-93可调控血管生成、免疫细胞功能、癌细胞生物性能等，而罕见其在牙齿硬组织生成及修复中的报道。
发明内容
本发明的目的是提供miR-93在制备修复牙本质的药物中的用途。
本发明的技术方案包括：
本发明首先提供了miR-93抑制剂在制备修复牙本质的药物中的用途。本发明的miR-93抑制剂，是指能通过碱基互补配对原理，降低牙髓干细胞内miR-93的活性的物质。
如前述的用途，所述药物是诱导牙髓细胞分化形成成牙本质细胞的药物。
优选地，所述药物是盖髓剂。盖髓剂，指的是在牙髓切断术中用于覆盖在牙髓断面，促进牙髓断面形成修复性牙本质的药物。
如前述的用途，所述抑制剂的活性成分是：与miR-93碱基互补配对的核酸，或与miR-93的前体碱基互补配对的核酸。
如前述的用途，所述抑制剂以病毒为载体，优选地，所述病毒是腺相关病毒。
如前述的用途，所述miR-93抑制剂的活性成分是序列为CTACCTGCACGAACAGCACTTTG的核酸分子。
本发明还提供了一种修复牙本质的药物，所述药物以miR-93抑制剂为活性成分。
如前述的药物，所述药物是诱导牙髓细胞分化形成成牙本质细胞的药物。
优选地，所述药物是盖髓剂。
如前述的药物，所述抑制剂的活性成分是：与miR-93碱基互补配对的核酸，或与miR-93的前体碱基互补配对的核酸。
如前述的药物，所述抑制剂以病毒为载体；优选地，所述病毒是腺相关病毒。
如前述的药物，所述miR-93抑制剂的活性成分是序列为CTACCTGCACGAACAGCACTTTG的核酸分子。
本发明修复牙本质的药物，通过抑制miR-93来诱导牙髓细胞分化为成牙本质细胞，分泌形成修复性牙本质，来实现牙本质再生。在构思上与现有盖髓剂不同，为牙本质再生提供新的治疗思路。
本发明修复牙本质的药物，在动物模型中验证了受损牙齿能再生牙本质，可弥补现有盖髓剂在疗效上的不足，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：大鼠磨牙牙髓切断术模型的构建流程。取5周龄大鼠，麻醉固定后，术前清洁上颌第一磨牙，行颌面开髓，生理盐水冲洗，髓腔止血，髓腔内放置凝胶海绵，注射病毒药物，涂布粘接剂，注射并固化流体树脂，完成大鼠磨牙牙髓切断术模型的构建。
图2：miR-93表达下调病毒药物促进修复性牙本质的形成。收集牙髓切断术后4周及6周的大鼠磨牙，microCT发现miR-93表达下调病毒的药物促进牙髓中修复性牙本质的形成，并且随观察时间的延长，修复性牙本质的生成增多。
图3：miR-93表达下调病毒药物通过调控JMJD3表达调节修复性牙本质形成。收集牙髓切断术后6周的大鼠磨牙，免疫组化染色发现，miR-93表达下调病毒促进修复性牙本质的形成(图C’中*标记)。修复性牙本质周围成牙本质细胞中JMJD3蛋白表达升高(图C’中橙色箭头标记)。
图4：人牙髓干细胞分化为成牙本质细胞过程中miR-93表达模式。A)光镜下显示人牙髓细胞形态；B)流式细胞术检测人牙髓细胞具有间充质干细胞表面标记物特征，即CD29阳性，CD90阳性，CD34阴性，CD45阴性；C)牙髓干细胞可矿化诱导形成成牙本质细胞，表达碱性磷酸酶(ALP)活性，分泌牙本质基质形成矿化结节；D)牙髓干细胞分化为成牙本质细胞过程中，miR-93表达下调；E)牙髓干细胞分化为成牙本质细胞过程中，JMJD3表达升高；F)牙髓干细胞分化为成牙本质细胞过程中，JMJD3的异构体UTX表达无明显变化。
图5：miR-93表达下调病毒药物促进牙髓干细胞分化形成成牙本质细胞。A)转染病毒后牙髓细胞内表达GFP荧光，证实病毒转染进入细胞并稳定表达；B)qRT-PCR验证转染后细胞内miR-93表达下调；C)ALP和茜素红染色检测miR-93表达下调药物促进牙髓干细胞分化形成成牙本质细胞，并分泌形成基质矿化结节；D)miR-93表达下调药物促进牙髓细胞表达成牙本质向分化基因Osterix(OSX)；E)miR-93表达下调药物促进牙髓细胞表达成牙本质向分化基因Osteocalcin(OCN)。
图6：miR-93通过调控靶基因JMJD3调控牙髓干细胞分化。A)转染后细胞中miR-93表达下调促进JMJD3基因的表达；B)miR-93表达下调对UTX的表达无明显调控作用；C)TargetScan及miRBase数据库预测miR-93靶向作用于JMJD3 mRNA的位点及序列；D)双荧光素酶报告基因检测miR-93可靶向结合在JMJD3 mRNA的3’UTR区域，抑制JMJD3的表达。
具体实施方式
实施例1 miR-93表达下调病毒促进体内牙本质生成
1.方法
1.1质粒构建以及病毒包埋
使用AAV Helper-Free System生产重组AAV颗粒(即miR-93表达下调病毒)，它能使牙髓干细胞内miR-93表达下调，为本发明的一种优选miR-93抑制剂，其流程如下：
1)设计大鼠源性miR-93-5p(rno-miR-93-5p)目的片段，即miR-93-5p的反向互补序列CTACCTGCACGAACAGCACTTTG(SEQ ID NO.1)。将上述序列克隆进入病毒载体GV479，为实验组(AAV-miR-93-down组)。对照组(AAV-Scramble组)插入的序列为CGCTGAGTACTTCGAAATGTC(SEQ ID NO.2)。该病毒载体包含反向末端重复(ITR)序列及多克隆位点(MCS)片段。其元件顺序为U6-MCS-CAG-EGFP。
2)将上述重组表达质粒同pHelper(携带腺病毒来源的基因)和pAAV-RC(携带AAV复制和衣壳基因)共转染进AAV-293细胞(提供AAV复制和包装所需的反式作用因子)。
3)从被感染AAV-293细胞中收集AAV病毒颗粒上清液。
4)将上述上清液进行2次CsCl密度梯度离心和1次超滤，用以去除上清液中的细胞蛋白和残留的CsCl离子，以此纯化病毒。
5)用定量PCR法测定得到病毒的滴度，测序引物为pGCSIL-F，引物序列为CCATGATTCCTTCATATTTGC(SEQ ID NO.3)。最终获得的病毒滴度为2.32×1012v.g./mL。分装并于-80℃保存病毒。
实验组得到miR-93表达下调病毒；对照组得到对照病毒。
1.2大鼠磨牙牙髓切断术模型的构建
将SD大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，随机分成3组仰卧固定，双侧上颌第一磨牙，用1/4#球钻在咬合面开髓，暴露完整髓腔，生理盐水冲洗髓腔内牙本质碎屑，生理盐水小棉球置于牙髓断面，待牙髓止血后，牙髓断面放置可吸收凝胶海绵，显微注射器注射1ul药物试剂于牙髓断面，树脂材料充填窝洞(图1)。按照注射药物试剂的不同，分为以下几组：1)未处理组(sham组)，未进行开髓操作；2)对照组(AAV-scramble组)，注射对照病毒(携带序列如SEQ ID NO.2所示DNA的病毒)；3)实验组(AAV-miR-93-down组)，注射miR-93表达下调病毒。术后第4周、6周处死大鼠。全身福尔马林灌注，取出实验磨牙牙周矩形颌骨骨块，置于4％多聚甲醛中固定24小时，行microCT检测及石蜡切片免疫染色，检测修复性牙本质的形成情况及成牙本质细胞蛋白表达情况。
2.结果
MicroCT扫描结果显示：放置AAV-Scramble药物的大鼠第一磨牙牙髓腔内无明显修复性牙本质形成，而放置AAV-miR-93-down药物的大鼠牙根根管口形成牙本质样结构，并且随封药时间延长到6周，牙本质样结构增多(图2)。免疫组织化学染色发现根管口确为新形成的硬组织样结构，即修复性牙本质(图3C’，*标记)。
修复性牙本质结构周围细胞miR-93下游靶基因JMJD3的表达升高(图3C’，橙色箭头所示，棕色为阳性表达细胞)。
JMJD3是组蛋白甲基化H3K27me3标记的负调控因子(Yachuan Zhou，Liwei Zheng，Feifei Li，Mian Wan，Yi Fan，Xin Zhou，Wei Du，Caixia Pi，Dixin Gui，Binpeng Zhang，Jianxun Sun，Xuedong Zhou.Bivalent Histone Codes on WNT5A during OdontogenicDifferentiation.Journal of Dental Research.2018 Jan；97(1)：99-107.)，而H3K27me3标记可抑制牙髓干细胞中牙本质向分化的基因Osterix(OSX)，ALP，Osteocalcin(OCN)，Collagen Ia(Col-1a)的转录，进而抑制所述基因表达。
本发明中的AAV-miR-93-down作为miR-93抑制剂，通过调控下游JMJD3酶的表达，可解除H3K27me3标记对牙髓干细胞中牙本质向分化的基因Osterix(OSX)，ALP，Osteocalcin(OCN)，Collagen Ia(Col-1a)的抑制，促进牙髓干细胞的分化过程，分泌形成修复性牙本质。
3.结论
本发明的AAV-miR-93-down作为miR-93抑制剂，可以促进牙髓干细胞的分化过程，分泌形成修复性牙本质，可以用于制备盖髓剂。
发明人通过TargetScan及miRBase数据库查询人种属及大鼠种属的miRNA-93-5p序列，发现人种属hsa-miR-93-5p(Accession：MIMAT0000093)与大鼠种属mo-miR-93-5p(MIMAT0000817)具有相同的序列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO.4)。实施例1中的重组AAV颗粒，其直接作用是抑制大鼠miR-93表达，也能抑制人的miR-93，进而通过调控下游JMJD3酶的表达促进牙髓干细胞的分化过程，分泌形成修复性牙本质。
实施例2 人牙髓干细胞的培养及鉴定
1.方法
临床收集12-25岁因正畸需求或阻生齿拔除的牙齿样本，用无菌生理盐水反复冲洗离体牙后，置于PBS中2小时内收集牙髓组织样本。牙科裂钻切割牙颈部一周，暴露牙髓腔。用灭菌后的拔髓针取出牙髓组织，注意操作轻柔避免损伤组织。用无菌PBS溶液冲洗取出的牙髓组织，置于预先配置的普通培养基(含有15％胎牛血清FBS和1％双抗的DMEM培养基)中。用无菌眼科剪将牙髓组织尽可能剪碎，转移至1.5mL的EP管中，加入1mLI型胶原酶(3mg/mL)，放入孵箱孵育1.5小时，期间每隔10分钟剧烈震荡一次，后转移至15mL离心管中离心(1100rmp/min)离心5分钟去除上清，加入1mL胰酶反复吹打1分钟后加入2mL培养基终止消化，离心(1100rmp/min)5分钟去除上清。加入1mL培养基重悬组织，接种于培养皿中混匀，培养箱内培养牙髓细胞。3天后观察细胞贴壁生长情况，进行换液。当细胞汇合度达到80％或者不再有细胞爬出组织块后，进行细胞传代。PBS漂洗培养皿中细胞2次，加入1mL的2.5％胰酶，置于37℃孵箱1-2分钟后，轻拍侧壁，镜下观察牙髓细胞呈悬浮状态后，加入2mL培养基终止细胞消化过程，轻轻吹打细胞转移至15mL离心管中，离心弃上清后，加入培养基重悬细胞，吹打接种于新的培养皿中，孵箱培养牙髓细胞。
光镜下观察牙髓细胞的形态。流式细胞术检测牙髓干细胞表面标记物(CD29,CD90,CD34,CD45)的表达。红色荧光(PE)标记CD29和CD90，绿色荧光(FITC)标记CD34和CD45。配置矿化诱导培养基(odontogenic medium，OM，加入10mmol/Lβ甘油磷酸钠，50mg/LViatmin C，10-8mol/L地塞米松到普通培养基中)加入牙髓细胞中，诱导成牙本质向分化，碱性磷酸酶(ALP)活性染色和茜素红染色检测分化标记物碱性磷酸酶的表达及牙本质基质的分泌。
2.结果
实验结果如图4，光镜下观察牙髓干细胞形态类似于成纤维细胞，呈长梭形(图4A)。传代收集第2代(P2)牙髓干细胞行流式细胞术检测，结果显示人牙髓细胞表达间充质干细胞特有的表面标记物CD29及CD90，表达率分别高达99.6％及67.7％(图4B)，而不表达造血系统特有的标记物CD34及CD45，表达率仅为0.2％及0.4％(图4B)。在矿化诱导条件下，人牙髓细胞可以向成牙本质细胞方向分化。ALP染色显示矿化诱导3天、7天、14天后细胞表达碱性磷酸酶活性；茜素红染色(ARS)显示牙髓干细胞矿化诱导7天、14天后分泌产生矿化基质，出现红色矿化结节(图4C)。
3.结论
本实验例成功分离得到了牙髓干细胞。
实施例3 miR-93表达下调病毒促进牙髓干细胞分化形成牙本质细胞并分泌牙本质基质
1.方法
将实施例2中得到的人牙髓干细胞的P2代接种在六孔板中，融合度达到90％细胞状态良好时，加入矿化诱导培养基(OM)，进行成牙本质向分化诱导，37℃、5％CO2条件下孵箱内培养，隔1天行细胞换液。收集未分化时期(第0天，0d)、分化早期(第7天，7d)、分化晚期(第14天，14d)的细胞，利用miRNeasy Kit(Qiagen Inc)提取细胞中含microRNA的总RNA，根据逆转录试剂盒操作流程合成cDNA，利用microRNAassay定量qPCR检测检测牙髓干细胞分化为成牙本质细胞的过程中，miR-93以及靶向基因JMJD3和UTX的表达模式。引物序列见表1。
将P2人牙髓干细胞接种在10cm培养皿中，培养24-48小时后，汇合度达到70％-80％细胞状态良好时，将实施例1中的miR-93表达下调病毒(5×107TU/mL)加入培养液中，37℃、5％CO2条件下培养24小时后，吸出含病毒颗粒的培养液，重新向培养皿中加入普通培养液，继续培养。转染第三天后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GFP的表达。
待观察到细胞内荧光标记后，胰蛋白酶消化细胞，传代培养至六孔板中。传代后用培养基培养细胞至汇合度达到90％。利用miRNeasy Kit(Qiagen Inc)提取含microRNA的总RNA，利用microRNAassay定量qPCR检测转染后牙髓干细胞内miR-93的敲低效率。
转染后的牙髓干细胞传代至六孔板中，细胞融合度达到90％后吸出普通培养基，加入等量矿化诱导培养基，37℃、5％CO2条件下孵箱内培养，隔1天行细胞换液。收集未分化时期(第0天，0d)、分化早期(第7天，7d)、分化晚期(第14天，14d)的细胞。PBS清洗3次细胞，4％多聚甲醛固定细胞15分钟，PBS清洗3次细胞，加入ALP染液(碧云天碱性磷酸酶活性检测试剂盒)避光37℃孵箱培养第7天的细胞，显微镜下观察细胞染色状态。加入茜素红染液(Sigma)常温孵育培养第14天的细胞，显微镜下观测细胞分泌牙本质基质结节的情况。利用Trizol试剂收集0d、7d、14d细胞的总RNA，利用荧光实时定量聚合酶链锁反应(qRT-PCR)检测成牙本质向分化基因Osterix(OSX)和Osteoclacin(OCN)的表达，检测miR-93靶基因JMJD3和UTX的表达。引物序列见表1。
表1引物序列
基因 引物序列
JMJD3 Forward：CCTGAGGGTGAGCAACTCC(SEQ ID NO.5)
Reverse：GGGGGTGAAGGTCTGTGTTTT(SEQ ID NO.6)
UTX Forward：GGCAGTGGAACGGTACGAAT(SEQ ID NO.7)
Reverse：TCCTGCAGCAATGAGAGCTT(SEQ ID NO.8)
OSX Forward：TCTGCGGGACTCAACAACTC(SEQ ID NO.9)
Reverse：TAGCATAGCCTGAGGTGGGT(SEQ ID NO.10)
OCN Forward：ATTGTGGCTCACCCTCCATC(SEQ ID NO.11)
Reverse：CCAGCCTCCAGCACTGTTTA(SEQ ID NO.12)
GAPDH Forward：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT(SEQ ID NO.13)
Reverse：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG(SEQ ID NO.14)
搜索TargetScan以及miRBase数据库，预测miR-93的3’非编码区域(3’UTR)具有靶向结合JMJD3 mRNA的位点。双荧光素酶报告基因技术验证miR-93可以靶向作用于JMJD3的mRNA片段，从而抑制JMJD3的表达。1)质粒构建流程如下：设计包含miR-93结合位点序列的JMJD3 mRNA的3’UTR寡核苷酸序列，并设计相应突变位点，退火处理后将序列插入pmiR-RB-ReportTM双荧光素酶报告载体中。对照组载体名称为pmiR-RB-ReportTMh-KDM6B(NM_001080424.2complete 3’UTR)-WT(Ribobio)，突变组载体名称为pmiR-RB-ReportTMh-KDM6B(NM_001080424.2 complete 3’UTR)-MUT(778-784GCACTTT＞CGTGAAA)(Ribobio)。所用载体的报告荧光为海肾荧光素酶基因(hRluc)，校正荧光为萤火虫荧光素酶基因(hluc)(做内参校正)，将基因的3’UTR区克隆至hRluc基因下游。2)荧光检测实验流程如下：取对数生长期的293T细胞，以每孔1.0×104细胞接种于96孔板中，细胞孵箱培养24小时。取OPTI-MEM培养基稀释
Figure BDA0002382323190000081
hsa-miR-93-5p mimics和
Figure BDA0002382323190000082
miRNA mimic NegativeControl#22(Ribobio)，报告基因载体和突变载体，OPTI-MEM培养基稀释Lipo6000TM转染试剂，分别静置5分钟后二者混合，轻轻摇匀，静置5分钟。将96孔板每孔加入90uL培养基，再加入上述10uL混合液，使得每孔培养基中mimics转染浓度为50nM，质粒浓度为50ng/孔，转染6小时后更换培养基。利用
Figure BDA0002382323190000091
Luciferase Assay System(Promega)试剂盒处理细胞，GLOMAX 96分光光度计检测每孔细胞的荧光值，单因素方差分析每组细胞的荧光值差异。
2.结果
实验结果如图4-6，未分化牙髓细胞(0d)、分化早期(7d)和分化晚期(14d)成牙本质细胞相比，细胞中miR-93的表达水平随分化过程而下调(图4D)，提示miR-93可能对牙髓细胞的成牙本质向分化过程有负性调控作用。miR-93的靶基因JMJD3随分化过程表达升高(图4E)，而其异构体UTX的表达无明显变化(图4F)。
转染后的牙髓细胞中，荧光标记显示细胞表达GFP绿色荧光(图5A)，说明病毒转染进入细胞，并在细胞内稳定表达。qRT-PCR检测发现与对照组(AAV-Scramble)相比，病毒转染(AAV-miR-93-down)下调细胞中miR-93的表达水平，并具有统计学差异(图5B)。ALP染色显示miR-93下调的成牙本质细胞中碱性磷酸酶活性升高，茜素红染色显示miR-93下调促进成牙本质细胞分泌更多的矿化结节(图5C)。qRT-PCR检测发现下调牙髓细胞中miR-93的表达可以促进成牙本质向分化基因OSX和OCN的表达(图5D，5E)。以上结果均提示，利用AAV-miR-93-down能下调牙髓细胞中miR-93的表达水平，并且促进牙髓细胞分化形成成牙本质细胞，分泌更多的牙本质基质形成矿化结节。
为进一步分析miR-93调控牙髓细胞分化的机制，qRT-PCR检测转染后细胞中miR-93靶基因JMJD3和UTX的表达，发现miR-93表达下调可以促进JMJD3的表达升高，而异构体UTX的表达无明显差异(图6A，6B)。TargetScan和miRBase数据库预测miR-93可以靶向结合在JMJD3 mRNA的3’UTR区域，其结合位点及序列如图所示(图6C)。双荧光素酶报告基因检测验证miR-93可以靶向结合在JMJD3 mRNA的3’UTR区域，从而在转录后水平抑制JMJD3的表达。
3.结论
本实验里结果与实施例1一致，说明miR-93抑制剂通过上调JMJD3酶的表达，进而解除H3K27me3标记对牙髓干细胞中牙本质向分化的基因的抑制，促进牙髓干细胞的分化过程，分泌形成修复性牙本质。
综上，miR-93抑制剂可以使大鼠成功形成修复性牙本质，在人牙髓干细胞的牙本质诱导实验中也证实了miR-93抑制剂可以用于人的牙本质修复。将miR-93抑制剂作为活性成分，用于制备修复牙本质的药物(比如盖髓剂)，具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
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ctacctgcac gaacagcact ttg 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
cgctgagtac ttcgaaatgt c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
ccatgattcc ttcatatttg c 21
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
caaagugcug uucgugcagg uag 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 5
cctgagggtg agcaactcc 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 6
gggggtgaag gtctgtgttt t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 7
ggcagtggaa cggtacgaat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 8
tcctgcagca atgagagctt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 9
tctgcgggac tcaacaactc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 10
tagcatagcc tgaggtgggt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 11
attgtggctc accctccatc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 12
ccagcctcca gcactgttta 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 13
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 14
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (13)

1. miR-93-5p抑制剂在制备修复牙本质的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是诱导牙髓细胞分化形成成牙本质细胞的药物。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是盖髓剂。
4.如权利要求1~3任一所述的用途，其特征在于，所述抑制剂的活性成分是：与miR-93-5p碱基互补配对的核酸，或与miR-93-5p的前体碱基互补配对的核酸。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于：所述抑制剂以病毒为载体。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于：所述病毒是腺相关病毒。
7.如权利要求4所述的用途，其特征在于：所述miR-93-5p抑制剂的活性成分是序列为CTACCTGCACGAACAGCACTTTG的核酸分子。
8.一种修复牙本质的药物，其特征在于：所述药物以miR-93-5p抑制剂为活性成分。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药物是诱导牙髓细胞分化形成成牙本质细胞的药物；所述药物是盖髓剂。
10.如权利要求8或9所述的药物，其特征在于，所述抑制剂的活性成分是：与miR-93-5p碱基互补配对的核酸，或与miR-93-5p的前体碱基互补配对的核酸。
11.如权利要求10所述的药物，其特征在于：所述抑制剂以病毒为载体。
12.如权利要求11所述的药物，其特征在于：所述病毒是腺相关病毒。
13.如权利要求10所述的药物，其特征在于：所述miR-93-5p抑制剂的活性成分是序列为CTACCTGCACGAACAGCACTTTG的核酸分子。
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