CN110894493A

CN110894493A - 一种重编程间充质干细胞及其制备方法

Info

Publication number: CN110894493A
Application number: CN201911060199.6A
Authority: CN
Inventors: 刘晋宇; 时佳宏; 刘菲琳
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2020-03-20

Abstract

本发明提供了一种重编程间充质干细胞及其制备方法，属于干细胞的研究和应用领域，所述重编程间充质干细胞，包括初始间充质干细胞和由初始间充质干细胞携带并表达的编码NANOG、PBX1或ZIC3转录因子的基因。在本发明中，所述重编程间充质干细具有促进成骨、抑制成脂和减缓复制性细胞老化作用，解决了间充质干细胞随着体外传代而发生的复制性老化等问题；根据实施例的记载，所述重编程间充质干细胞增殖和抗老化潜能远远高于空载组间充质干细胞。

Description

一种重编程间充质干细胞及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞的研究和应用领域，尤其涉及一种重编程间充质干细胞及其制备方法。

背景技术

现代医学研究表明干细胞在组织修复、器官重建和基因治疗以及抗老化方面发挥着重要作用，特别是在治疗重大疾病、难治性疾病以及多发病和常见病等方面具有独特疗效，是继放疗、化疗和手术治疗之后一种全新的医疗方式。但干细胞移植治疗的安全性、有效性和伦理一直是干细胞再生医学研究和应用中必须解决的关键科学技术问题。这不仅取决于干细胞的来源，也与干细胞的质量、数量和移植治疗途径以及定向诱导分化效率紧密相关。其中干细胞的质量和数量是决定干细胞移植治疗安全性和有效性的基础和前提。为了获得足够量的、满足移植需求的干细胞，人们通常采用反复传代的方法来扩增干细胞。但反复传代扩增干细胞不可避免地引起干细胞复制性衰老，导致其质量、特别是增殖、分化潜能下降，严重影响干细胞移植治疗有效性，甚至诱发肿瘤发生等安全风险。特别是取自老年个体的干细胞不仅体外培养困难，而且扩增后很快老化，失去临床应用价值。因此如何减缓干细胞的衰老是安全、有效开展干细胞再生医学研究和临床应用的基础和前提。

为了减缓干细胞复制性衰老，人们通常在干细胞培养过程中加入一些诸如：碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、肝细胞生长因子、白血病抑制因子、非必需氨基酸以及转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、三碘甲腺原氨酸等一些外源性生物活性因子。这些外源性生物活性因子通过与干细胞膜表面受体或细胞核内受体结合，激活靶基因转录，通过信号转导通路或通过改变干细胞代谢稳态，来维持干细胞自我更新和多向分化潜能，减缓干细胞老化的发生。即便如此，仍有部分干细胞自发发生老化，推测这些外源性生物活性因子在减缓干细老化方面作用有限。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重编程间充质干细胞及其制备方法；所述重编程间充质干细胞具有促进成骨、抑制成脂和减缓复制性细胞老化作用，解决了间充质干细胞随着体外传代而发生的复制性老化等问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种重编程间充质干细胞，包括初始间充质干细胞和由初始间充质干细胞携带并表达的编码NANOG、PBX1或ZIC3转录因子的基因。

优选的，所述编码NANOG转录因子的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。具体如下：

atgagtgtggatccagcttgtccccaaagcttgccttgctttgaagcatccgactgtaaagaatcttcacctatgcctgtgatttgtgggcctgaagaaaactatccatccttgcaaatgtcttctgctgagatgcctcacacggagactgtctctcctcttccttcctccatggatctgcttattcaggacagccctgattcttccaccagtcccaaaggcaaacaacccacttctgcagagaagagtgtcgcaaaaaaggaagacaaggtcccggtcaagaaacagaagaccagaactgtgttctcttccacccagctgtgtgtactcaatgatagatttcagagacagaaatacctcagcctccagcagatgcaagaactctccaacatcctgaacctcagctacaaacaggtgaagacctggttccagaaccagagaatgaaatctaagaggtggcagaaaaacaactggccgaagaatagcaatggtgtgacgcagaaggcctcagcacctacctaccccagcctttactcttcctaccaccagggatgcctggtgaacccgactgggaaccttccaatgtggagcaaccagacctggaacaattcaacctggagcaaccagacccagaacatccagtcctggagcaaccactcctggaacactcagacctggtgcacccaatcctggaacaatcaggcctggaacagtcccttctataactgtggagaggaatctctgcagtcctgcatgcagttccagccaaattctcctgccagtgacttggaggctgccttggaagctgctggggaaggccttaatgtaatacagcagaccactaggtattttagtactccacaaaccatggatttattcctaaactactccatgaacatgcaacctgaagacgtgtga

优选的，所述编码PBX1转录因子的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。具体如下：

atggacgagcagcccaggctgatgcattcccatgctggggtcgggatggccggacaccccggcctgtcccagcacttgcaggatggggccggagggaccgagggggagggcgggaggaagcaggacattggagacattttacagcaaattatgaccatcacagaccagagtttggatgaggcgcaggccagaaaacatgctttaaactgccacagaatgaagcctgccttgtttaatgtgttgtgtgaaatcaaagaaaaaacagttttgagtatccgaggagcccaggaggaggaacccacagacccccagctgatgcggctggacaacatgctgttagcggaaggcgtggcggggcctgagaagggcggagggtcggcggcagcggcggcagcggcggcggcttctggaggggcaggttcagacaactcagtggagcattcagattacagagccaaactctcacagatcagacaaatctaccatacggagctggagaaatacgagcaggcctgcaacgagttcaccacccacgtgatgaatctcctgcgagagcaaagccggaccaggcccatctccccaaaggagattgagcggatggtcagcatcatccaccgcaagttcagctccatccagatgcagctcaagcagagcacgtgcgaggcggtgatgatcctgcgttcccgatttctggatgcgcggcggaagagacggaatttcaacaagcaagcgacagaaatcctgaatgaatatttctattcccatctcagcaacccttaccccagtgaggaagccaaagaggagttagccaagaagtgtggcatcacagtctcccaggtatcaaactggtttggaaataagcgaatccggtacaagaagaacataggtaaatttcaagaggaagccaatatttatgctgccaaaacagctgtcactgctaccaatgtgtcagcccatggaagccaagctaactcgccctcaactcccaactcggctggttcttccagttcttttaacatgtcaaactctggagatttgttcatgagcgtgcagtcactcaatggggattcttaccaaggggcccaggttggagccaacgtgcaatcacaggtggatacccttcgccatgttatcagccagacaggaggatacagtgatggactcgcagccagtcagatgtacagtccgcagggcatcagtgctaatggaggttggcaggatgctactaccccttcatcagtgacctcccctacagaaggccctggcagtgttcactctgatacctccaactga

优选的，所述编码ZIC3转录因子的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。具体如下：

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优选的，所述初始间充质干细胞包括毛囊间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙齿间充质干细胞、胚胎干细胞来源的间充质干细胞和诱导多能干细胞来源的间充质干细胞。

本发明提供了所述重编程间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)将携带编码NANOG、PBX1或ZIC3转录因子的基因的目的质粒、包装质粒共同转染293T细胞进行病毒包装获得重组病毒；

2)将所述重组病毒转染初始间充质干细胞获得重编程初始间充质干细胞。

优选的，步骤1)中所述包装质粒为PAX2和PMD2.G质粒。

优选的，步骤1)中所述目的质粒、包装质粒PAX2和包装质粒PMD2.G的质量比优选为(3.5～4.5):(2.5～3.5):1。

优选的，步骤1)中所述共同转染为将目的质粒、包装质粒、转染试剂与293T细胞混合培养30～40h。

优选的，步骤2)中所述转染为将重组病毒、polybrene混合液和初始间充质干细胞混合后培养65～75h。

本发明的有益效果：本发明提供的重编程间充质干细胞，包括初始间充质干细胞和由初始间充质干细胞携带并表达的编码NANOG、PBX1或ZIC3转录因子的基因；在本发明中，所述重编程间充质干细具有促进成骨、抑制成脂和减缓复制性细胞老化作用，解决了间充质干细胞随着体外传代而发生的复制性老化等问题；根据实施例的记载，所述重编程间充质干细胞增殖和抗老化潜能远远高于空载组间充质干细胞。

附图说明

图1为人毛囊间充质干细胞的分离、培养和鉴定，其中A为长梭形、成纤维样细胞从毛囊的毛乳头处向外爬出；B为培养至第4代人毛囊间充质干细胞；C为免疫荧光染色法鉴定表面标志；D为流式细胞术鉴定表面标志；E成骨分化潜能鉴定；F为成脂分化潜能鉴定。

图2为异位表达NANOG或过表达PBX1人毛囊间充质干细胞的制备；其中A为荧光显微镜观察NANOG异位表达和PBX1过表达情况，B为Western Blot检测Vector组、NANOG组和PBX1组NANOG和PBX1蛋白表达情况；

图3为异位表达NANOG或过表达PBX1促进人毛囊间充质干细胞增殖情况，其中A为细胞生长曲线检测Vector组、NANOG组和PBX1组细胞增殖情况，B为流式细胞术检测Vector组、NANOG组和PBX1组细胞周期分布,C为根据公式计算增殖指数PI＝[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100％；

图4为异位表达NANOG或过表达PBX1延缓人毛囊间充质干细胞衰老情况，其中A为第6代和第14代NANOG组和PBX1组衰老细胞阳性率均低于Vector组，B为衰老β-半乳糖苷酶染色结果的统计学分析；

图5为异位表达NANOG或过表达PBX1促进人毛囊间充质干细胞成骨分化、抑制成脂分化情况，其中A和B为定量分析Vector组、NANOG组和PBX1组诱导成骨分化后染色，和Vector组比，NANOG组和PBX1组钙盐结节形成比例多；C和D为定量分析Vector组、NANOG组和PBX1组诱导成脂分化后染色，和Vector组比，NANOG组和PBX1组脂滴形成比例少；

图6为NANOG质粒和PBX1质粒的质粒图谱，其中左图为NANOG质粒的图谱，右图为PBX1质粒的图谱。

具体实施方式

在本发明中，所述重编程间充质干细胞，能够稳定持久的表达NANOG、PBX1或ZIC3转录因子，具有促进成骨、抑制成脂和减缓复制性细胞老化作用。在本发明中，所述编码NANOG转录因子的基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.1所示；所述NANOG是一种在维持胚胎干细胞多潜能性核心转录调控因子，是干细胞发育成各类型细胞的“总开关”；NANOG通过下调p27KIP1的表达，激活ERK信号通路，抑制胚胎干细胞的衰老，维持胚胎干细胞的自我更新；NANOG还通过与DNMT1基因启动子结合，在OCT4协同下，维持间充质干细胞自我更新和处于不分化状态。

在本发明中，所述编码PBX1转录因子的基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.2所示；所述PBX1是转录因子TALE家族成员之一，与器官的发生和肿瘤的形成紧密相关；PBX1是肢芽定位、早期肢芽形成、肢体轴建立和协调等肢体形态发生过程不可缺少的关键基因，在多巴胺能生神经元发生、发育过程中也发挥重要作用。所述PBX1通过与肌生成素启动子结合，参与骨骼肌分化，增加RUNX2和OSTERIX基因的表达，调控骨密度和骨结节的形成；所述PBX1能够促进脂肪前体细胞增殖，抑制出生后脂肪细胞的成熟，提示PBX1在维持干细胞自我更新和向特定组织分化方面发挥重要作用，特别是在抗成体干细胞老化方面具有重要作用。

在本发明中，所述编码ZIC3转录因子的基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.3所示；所述ZIC3是锌指蛋白转录因子GLI家族成员之一，在胚胎干细胞中表达，并且受OCT3/4、SOX2和NANOG调控；所述ZIC3与OCT3/4、SOX2和NANOG之间形成调控网络，通过阻止胚胎干细胞向内胚层细胞分化，维持胚胎干细胞多分化潜能状态。过表达所述ZIC3能够显著增加OCT3/4、SOX2、KLF4诱导的小鼠胚胎成纤维细胞重编程。另外，所述ZIC3可高亲和力、特异性地与NANOG基因启动子结合，活化NANOG基因，且所述活化不依赖于转录因子OCT4/SOX2。

在本发明中，所述初始间充质干细胞包括但不限于毛囊间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙齿间充质干细胞、胚胎干细胞来源的间充质干细胞和诱导多能干细胞来源的间充质干细胞。在本发明具体实施过程，所述初始间充质干细胞为毛囊间充质干细胞。

本发明还提供了所述重编程间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：1)将携带编码NANOG、PBX1或ZIC3转录因子的基因的目的质粒、包装质粒共同转染293T细胞进行病毒包装获得重组病毒；2)将所述重组病毒转染初始间充质干细胞获得重编程初始间充质干细胞。

在本发明中，将携带编码NANOG、PBX1或ZIC3转录因子的基因的目的质粒、包装质粒共同转染293T细胞进行病毒包装获得重组病毒。在本发明中，所述目的质粒包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体和逆转录病毒载体；所述携带编码NANOG转录因子基因的目的质粒优选的购自长沙优宝生物科技有限公司；所述携带编码PBX1转录因子基因或者携带ZIC3转录因子的目的质粒优选的通过以下方法制备获得：本实验室构建并保存。在本发明中，所述包装质粒优选为PAX2和PMD2.G质粒。在本发明中，所述含有目的基因的病毒载体质粒、包装质粒PAX2和包装质粒PMD2.G的质量比优选为(3.5～4.5):(2.5～3.5):1，更优选为4:3:1。在本发明具体实施过程中，所述目的质粒、包装质粒在无血清培养基中混合后，与转染试剂混合。在本发明中，所述转染试剂优选的为EndoFectinTM Max，购自美国GeneCopoeia公司。在本发明中，所述共同转染为将混合后的含有目的基因的病毒载体质粒、包装质粒、转染试剂与293T细胞混合培养30～40h，优选的混合培养34～38h，更优选的混合培养36h。在本发明中，所述293T细胞采用常规的市售产品即可；所述混合培养优选的在二氧化碳培养箱中进行；所述混合培养6h后，优选的更换新鲜的培养基。本发明在所述混合培养后，收集病毒上清获得重组病毒。

本发明在获得所述重组病毒后，将所述重组病毒转染初始间充质干细胞获得重编程初始间充质干细胞。在本发明中，所述转染为将重组病毒、polybrene混合液和初始间充质干细胞混合后培养65～75h。在本发明中，所述重组病毒、polybrene混合液的比例优选为1000:1；所述培养的时间优选为72h；所述培养过程中，优选的在培养24h后更换新鲜的培养基；所述培养结束后获得重编程间充质干细胞。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

人毛囊间充质干细胞的分离、培养和鉴定

(1)消毒眼科剪及镊子，拔取志愿者枕部含完整毛囊的毛发数根。用无菌PBS(含有5×双抗青霉素溶解液和链霉素溶解液)冲洗毛发3次。

(2)剪去毛干，保留完整毛囊，置于24孔板中，轻轻加入DMEM/F-12培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。每3天更换新鲜培养基并观察细胞爬出情况。

(3)培养10～14d左右，待镜下见长梭形细胞从毛囊爬出，更换含10％FBS(Gibco，美国)的DMEM/F-12培养基继续培养。

(4)待细胞融合度达80％～90％，吸除培养基，PBS洗1次。

(5)加入37℃预热的0.25％胰酶(含0.02％EDTA)(BIOSHARP，中国)，镜下观察。待细胞变圆后，拍打培养板侧壁，待80％细胞飘起后，用含血清培养基终止消化。1000prm离心5min，收集细胞。用含有2ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培养基悬浮和培养细胞。每3天更换新鲜培养基，待细胞融合度达80％时，传代培养细胞。

对获得的人毛囊间充质干细胞进行鉴定，结果如图1中的C～F所示，通过成骨分化和成脂分化鉴定其分化潜能，通过免疫荧光法和流式细胞术鉴定其表明标志。

异位表达NANOG或过表达PBX1人毛囊间充质干细胞的制备

(1)第1天，293T铺板(600万/皿，规格100mm皿)，培养基(DMEM和10％FBS)。

(2)第2天(待融合度达80％)，EP管中500μL无血清培养基(Opti-MEM，Gibco，美国)加入目的质粒10μg(NANOG，购自长沙优宝生物科技有限公司(质粒图谱如图6左所示)；PBX1(质粒图谱如图6右所示)、包装质粒PAX27.5μg和PMD2G 2.5μg，静置5min；另一EP管中加入500μL无血清培养基，加入22μL转染试剂(EndoFectinTM Max，GeneCopoeia，美国)，静置5min。

(3)将上述含有质粒的500μL体系滴加到相应的含有转染试剂500μL体系中，构成1mL体系，用手轻弹EP管并甩三次后静置15min。

(4)在293T细胞中滴加上述1mL混合液，放入二氧化碳培养内培养。

(5)培养293T细胞6h后，换新鲜培养基(含10％FBS的DMEM培养液)。

(6)继续培养36h后，收集病毒上清，2000rpm离心5min。

(7)0.45μm滤器(Millipore，美国)过滤病毒上清。

(8)将上述制备获得的人毛囊间充质干细胞，弃去培养基，加入病毒上清与polybrene混合液。

(9)24h后更换新鲜培养基，继续细胞培养。

(10)72h后，荧光显微镜观察细胞培养转导情况。

(11)收集细胞蛋白，Westernblot检测蛋白表达情况。

结果如图2所示，通过免疫荧光染色和Westernblot法验证NANOG异位表达和PBX1过表达转导情况。

毛囊间充质干细胞增殖检测

(1)接种上述制备获得的重编程间充质干细胞(2×10⁴/孔，24孔板)。每隔1d换新鲜培养基(含血清不含因子)。

(2)分别在第2d、第4d、第6d和第8d消化细胞，并进行细胞计数。

(3)根据细胞计数结果，绘制细胞生长曲线。

结果如图3中的A所示，NANOG和PBX1促进细胞增殖。

毛囊间充质干细胞周期检测

(1)待细胞融合度达到80％，消化离心收集细胞。进行细胞计数。调整细胞数每管2×10⁶，弃掉培养基。用4℃预冷PBS洗细胞1次，1000rpm离心5min，弃上清。

(2)1mL4℃预冷PBS重悬细胞，4℃下500g离心细胞5min，弃上清。

(3)加1.5mL预冷(-20℃)70％乙醇，迅速混匀，-20℃保存过夜。

(4)4℃下500g离心细胞5min，弃上清，4℃预冷PBS洗细胞1次，500g离心5min，弃PBS。

(5)加200μL碘化丙啶/RNase(BD，美国)，重悬细胞，室温避光孵育30min。

(6)过300目尼龙筛网，上机检测。

(7)增殖指数(PI)计算公式PI＝[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100％

结果如图3中的B和C所示，NANOG和PBX1促进细胞周期进程。

毛囊间充质干细胞衰老检测

(1)提前1天铺板，2×10⁴/孔，24孔板铺板，待细胞融合度达到80％，吸除培养基，PBS洗1次(1mL/孔)，加固定液(500μL/孔)，室温固定15min。

(2)吸除固定液，用PBS洗3次，每次3min。

(3)吸除PBS，每孔加500μL工作液(由A液、B液、C液及X-Gal组成，来自碧云天β-半乳糖苷酶染色试剂盒)。

(4)保鲜膜包好24孔板，置于37℃烘箱(无CO₂)中过夜孵育。

(5)第2天吸除工作液，加PBS洗2遍，倒置荧光显微镜观察并拍照，染成蓝色的细胞记为衰老细胞。

结果如图4所示，NANOG和PBX1降低衰老细胞阳性率。

毛囊间充质干细胞成骨分化潜能检测

(1)待24孔板细胞融合度达到70％，弃掉培养基，PBS洗2次。

(2)加入成骨诱导液(700μL/孔)，每3天更换新诱导液，诱导30天。

(3)弃掉培养基，加200μL4％多聚甲醛，室温固定30min，ddH₂O漂洗3次。

(4)每孔加入200μL茜素红S染液，常温轻轻振摇20min，ddH₂O漂洗3次。

(5)加入200μLddH₂O，倒置显微镜拍照。

(6)弃去ddH₂O，加入10％CPC溶液充分溶解(37℃，30min)，酶标仪558nm检测吸光度。

结果如图5中的A和B中所示，NANOG和PBX1促进成骨分化。

毛囊间充质干细胞成脂分化潜能

(1)待24孔板细胞融合度达到90％，弃掉培养基，PBS洗2次。

(2)加入成脂诱导液(700μL/孔)，每3d更换新诱导液，诱导15d。

(3)弃掉培养基，加200μL4％多聚甲醛，室温下固定30min，PBS漂洗2次。

(4)70％异丙醇漂洗数秒。

(5)每孔加入200μL油红O染液(由6mL油红O储存液加4mL ddH2O配成)，常温轻轻振摇20min，PBS漂洗3次。

(6)加入200μL ddH₂O，倒置显微镜拍照。

(7)弃去ddH₂O，每孔加200μL异丙醇，常温振摇20min，酶标仪512nm检测吸光度。

结果如图5中的C和D所示，NANOG和PBX1抑制成脂分化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种重编程间充质干细胞及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 918

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgagtgtgg atccagcttg tccccaaagc ttgccttgct ttgaagcatc cgactgtaaa 60

gaatcttcac ctatgcctgt gatttgtggg cctgaagaaa actatccatc cttgcaaatg 120

tcttctgctg agatgcctca cacggagact gtctctcctc ttccttcctc catggatctg 180

cttattcagg acagccctga ttcttccacc agtcccaaag gcaaacaacc cacttctgca 240

gagaagagtg tcgcaaaaaa ggaagacaag gtcccggtca agaaacagaa gaccagaact 300

gtgttctctt ccacccagct gtgtgtactc aatgatagat ttcagagaca gaaatacctc 360

agcctccagc agatgcaaga actctccaac atcctgaacc tcagctacaa acaggtgaag 420

acctggttcc agaaccagag aatgaaatct aagaggtggc agaaaaacaa ctggccgaag 480

aatagcaatg gtgtgacgca gaaggcctca gcacctacct accccagcct ttactcttcc 540

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tataactgtg gagaggaatc tctgcagtcc tgcatgcagt tccagccaaa ttctcctgcc 780

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caacctgaag acgtgtga 918

<210> 2

<211> 1293

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggacgagc agcccaggct gatgcattcc catgctgggg tcgggatggc cggacacccc 60

ggcctgtccc agcacttgca ggatggggcc ggagggaccg agggggaggg cgggaggaag 120

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gcgcaggcca gaaaacatgc tttaaactgc cacagaatga agcctgcctt gtttaatgtg 240

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gagaagggcg gagggtcggc ggcagcggcg gcagcggcgg cggcttctgg aggggcaggt 420

tcagacaact cagtggagca ttcagattac agagccaaac tctcacagat cagacaaatc 480

taccatacgg agctggagaa atacgagcag gcctgcaacg agttcaccac ccacgtgatg 540

aatctcctgc gagagcaaag ccggaccagg cccatctccc caaaggagat tgagcggatg 600

gtcagcatca tccaccgcaa gttcagctcc atccagatgc agctcaagca gagcacgtgc 660

gaggcggtga tgatcctgcg ttcccgattt ctggatgcgc ggcggaagag acggaatttc 720

aacaagcaag cgacagaaat cctgaatgaa tatttctatt cccatctcag caacccttac 780

cccagtgagg aagccaaaga ggagttagcc aagaagtgtg gcatcacagt ctcccaggta 840

tcaaactggt ttggaaataa gcgaatccgg tacaagaaga acataggtaa atttcaagag 900

gaagccaata tttatgctgc caaaacagct gtcactgcta ccaatgtgtc agcccatgga 960

agccaagcta actcgccctc aactcccaac tcggctggtt cttccagttc ttttaacatg 1020

tcaaactctg gagatttgtt catgagcgtg cagtcactca atggggattc ttaccaaggg 1080

gcccaggttg gagccaacgt gcaatcacag gtggataccc ttcgccatgt tatcagccag 1140

acaggaggat acagtgatgg actcgcagcc agtcagatgt acagtccgca gggcatcagt 1200

gctaatggag gttggcagga tgctactacc ccttcatcag tgacctcccc tacagaaggc 1260

cctggcagtg ttcactctga tacctccaac tga 1293

<210> 3

<211> 1404

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgacgatgc tcctggacgg aggcccgcag ttccctgggc tgggagtggg cagcttcggc 60

gcgccgcgcc accacgagat gcccaaccgt gagccggcag gcatggggct gaatcccttc 120

ggggactcaa cccacgccgc cgccgccgcc gccgccgccg ctgccttcaa gctgagccct 180

gccgcggcgc acgatctatc ttcaggccag agctcggctt tcacgccgca gggttcgggc 240

tacgccaacg ccctgggcca ccatcaccac caccatcacc atcatcacca caccagccag 300

gtgcccagct acggtggcgc tgcctctgcc gccttcaact caacgcgcga gtttctgttc 360

cgccagcgca gctccgggct cagtgaggcg gcctcgggtg gcgggcagca cgggctcttc 420

gccggctcgg cgagcagcct gcatgctcca gctggcatcc ccgagccccc tagctacttg 480

ctgtttcccg ggctgcatga gcagggcgct gggcacccgt cgcccacagg gcacgtggac 540

aacaaccagg tccacctggg gctgcgtggg gagctgttcg gccgtgctga cccataccgc 600

ccagtggcca gcccgcgcac ggacccctac gcggccggcg ctcagtttcc taactacagc 660

cccatgaaca tgaacatggg agtgaacgtg gcggcccacc acgggcccgg cgccttcttc 720

cgttatatgc ggcagcctat caagcaggag ctgtcgtgca agtggatcga cgaggctcag 780

ctgagccggc ccaagaagag ctgcgaccgg accttcagca ccatgcatga gctggtgaca 840

catgtcacca tggagcatgt ggggggcccg gagcagaaca accacgtctg ctactgggag 900

gagtgccccc gggagggcaa gtctttcaag gcgaagtaca aactggtcaa ccacatccga 960

gtgcacacgg gcgagaagcc cttcccatgc cccttcccgg gctgcgggaa gatctttgcc 1020

cgttctgaga acctcaagat ccacaagagg acccacacag gtgagaaacc tttcaaatgt 1080

gaatttgaag gctgtgacag acgctttgcc aacagcagcg accgtaagaa gcacatgcat 1140

gtgcatacct cggacaagcc ctatatctgc aaagtgtgcg acaagtccta cacgcacccg 1200

agctccctgc gcaaacacat gaaggttcat gaatctcaag ggtcagattc ctcccctgct 1260

gccagttcag gctatgaatc ttccactcca cccgctatag cttctgcaaa cagtaaagat 1320

accactaaaa ccccttctgc agttcaaact agcaccagcc acaaccctgg acttcctcct 1380

aattttaacg aatggtacgt ctga 1404

Claims

1.一种重编程间充质干细胞，其特征在于，包括初始间充质干细胞和由初始间充质干细胞携带并表达的编码NANOG、PBX1或ZIC3转录因子的基因。

2.根据权利要求1所述的重编程间充质干细胞，其特征在于，所述编码NANOG转录因子的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的重编程间充质干细胞，其特征在于，所述编码PBX1转录因子的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的重编程间充质干细胞，其特征在于，所述编码ZIC3转录因子的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.根据权利要求1所述的重编程间充质干细胞，其特征在于，所述初始间充质干细胞包括毛囊间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙齿间充质干细胞、胚胎干细胞来源的间充质干细胞和诱导多能干细胞来源的间充质干细胞。

6.权利要求1～5任意一项所述重编程间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述包装质粒为PAX2和PMD2.G质粒；所述目的质粒包括慢病毒载体、腺病毒相关载体和逆转录病毒载体。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述目的质粒、包装质粒PAX2和包装质粒PMD2.G的质量比为(3.5～4.5):(2.5～3.5):1。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述共同转染为将目的质粒、包装质粒、转染试剂与293T细胞混合培养30～40h。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述转染为将重组病毒、polybrene混合液和初始间充质干细胞混合后培养65～75h。