CN115948524B - Gcna在提高重编程效率、干细胞原始态多能性及促进原始生殖细胞转化中的应用 - Google Patents
Gcna在提高重编程效率、干细胞原始态多能性及促进原始生殖细胞转化中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115948524B CN115948524B CN202211388309.3A CN202211388309A CN115948524B CN 115948524 B CN115948524 B CN 115948524B CN 202211388309 A CN202211388309 A CN 202211388309A CN 115948524 B CN115948524 B CN 115948524B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gcna
- reprogramming
- cells
- primitive
- ipscs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 102100034626 Germ cell nuclear acidic protein Human genes 0.000 title abstract description 81
- 101000995459 Homo sapiens Germ cell nuclear acidic protein Proteins 0.000 title abstract description 77
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title abstract description 31
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 210000001173 gonocyte Anatomy 0.000 title abstract description 5
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 title abstract description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 5
- 101150068770 Gcna gene Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 9
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 9
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 abstract description 7
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 abstract description 4
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 abstract description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 abstract description 4
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 4
- 101100043050 Mus musculus Sox4 gene Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 abstract description 3
- -1 klf4 Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 19
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 19
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000003822 preparative gas chromatography Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 7
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 101710096898 Germ cell nuclear acidic protein Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 3
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000008668 cellular reprogramming Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 2
- 210000003794 male germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100510259 Caenorhabditis elegans klf-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101150047844 F1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 101100068092 Mus musculus Gcna gene Proteins 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150037203 Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 101150008740 cpg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150014604 cpg-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012536 packaging technology Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了GCNA在提高重编程效率、干细胞原始态多能性及促进原始生殖细胞转化中的应用。目前体外重编程体系中iPSCs由体细胞过表达关键多能性转录因子OSKM(Oct4,Sox4,Klf4,c‑Myc)重编程而来，然而重编程效率低。本发明在重编程体系中引入GCNA，不仅可提高重编程效率，达到在短期内获得大量iPSCs的目的，其次还能提高干细胞原始态多能性，具有更广泛的再生医学应用前景，同时作为生殖细胞特异性标志物，GCNA具有促进干细胞转化为原始生殖细胞的潜能，可推动体外精子细胞分化技术的发展。
Description
技术领域
本发明涉及生殖细胞核抗原(germ cell nuclear antigen，GCNA)在提高重编程效率及干细胞原始态多能性中的应用，过表达GCNA可提高重编程效率及干细胞原始态多能性，推动再生医学发展。目前体外重编程体系诱导效率低，限制多能干细胞在临床中的转化应用。本发明通过RT-qPCR及Western blot在RNA及蛋白质水平上证实GCNA在干细胞中显著差异性表达，提示它可能参与干细胞多能性调控；进一步通过过表达及重编实验证实GCNA可提高重编程效率、干细胞原始态多能性并促进向原始生殖细胞(Primordial germcells,PGCs)转化。本发明首次挖掘出GCNA在提高重编程效率、干细胞原始态多能性及定向分化中的潜在作用，为优化干细胞在再生医学中的应用提供理论基础。
背景技术
干细胞及再生医学领域国际竞争日趋激烈，已成为衡量一个国家生命科学与医学发展的重要指标。研究发现胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)具有原始态和始发态(Primed)两种不同的多能性状态:原始态ESCs来源于尚未植入子宫的内细胞团，而Primed ESCs来源于植入子宫后的上胚层。原始态及Primed ESCs具有不同的细胞形态、基因表达水平及表观遗传学改变：(1)细胞形态上:/> ESCs紧密聚集成球，增殖快，而Primed ESCs扁平疏松，生长慢；(2)基因表达上:/> ESCs高表达许多与原始态多能性相关的转录因子，如Nanog和KLFs等，而Primed ESCs高表达与早期分化相关的标志基因；(3)Pou5F1增强子活性上:/>中Pou5F1远端增强子活化程度高，而Primed中Pou5F1近端增强子活化程度高；(4)分化能力上：虽然/>和Primed ESCs都具有分化成其他成体细胞的能力，但是Primed ESCs不具备产生嵌合体及生殖系传递的能力，分化潜能低，且更难培养，不易进行基因操作，因此原始态ESCs对于再生医学的应用价值更高。
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)由体细胞过表达关键多能性转录因子OSKM(Oct4,Sox4,Klf4,c-Myc)重编程而来，具有自我更新及向三个胚层分化的多能性，为再生医学的发展带来全新的技术平台。例如，若能将不育症患者来源的体细胞重编程为iPSCs，并体外诱导分化为单倍体精子细胞，再结合辅助生殖技术，将为无精子症患者生育带有自身遗传物质的后代带来新希望。但将体细胞诱导为iPSCs的重编程体系及将iPSCs诱导为生殖细胞的定向分化体系存在如下瓶颈问题：(1)重编程体系效率低、耗时长，且应用癌基因c-Myc诱导重编程存在潜在致癌风险。(2)iPSCs处于原始态(原始态state)多能性对于其向原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)分化至关重要，但现有技术产生的iPSCs均为始发态(Primed state)，转化为原始态较难，故iPSCs受原始态限制定向分化为PGCs效率较低。如何在短时间内由患者来源的体细胞诱导出大量安全可用的原始态iPSCs并高效定向分化为可供临床应用靶细胞，仍是目前亟待解决的关键问题。
生殖细胞核抗原(germ cell nuclear antigen，GCNA)是一种在真核生物中表达了近20亿年的古老蛋白，主要在携带有遗传信息的细胞中高表达，如多能干细胞及精子细胞。由于它最初是因为TRA98及GCNA1这两种单克隆抗体在小鼠的睾丸组织中检测到而发现，因此命名为生殖细胞核抗原。小鼠GCNA的编码基因位于X染色体，后期的研究发现该蛋白在结构上主要由天然无序蛋白区，金属蛋白酶结构域，C2C2锌指蛋白及双螺旋HMG盒组成。因为它编码的序列简单，但重复性高，具有高亲水性及带电性，因此被认为是一种天然无序蛋白，可广泛参与信号传递、DNA转录、细胞分裂和蛋白质聚集等重要过程。目前的研究主要集中在GCNA对生殖功能的影响，认为GCNA基因异常与人类不育症密切相关，可在复制过程中促进DNA修复，稳定基因组。
除男性生殖细胞外，GCNA在多能干细胞中亦显著高表达，但目前尚无研究探索其调控干细胞多能性的具体作用及潜在机制。本发明首次发现GCNA可提高iPSCs重编程诱导效率及干细胞原始态多能性，故可尝试用于优化体外重编程体系，不仅可缩短体细胞重编程为iPSCs的诱导周期，还可以提高iPSCs原始态多能性，从而具有更全更广的分化潜能，推动再生医学发展。
发明内容
本发明的目的是提供GCNA在提高重编程效率、干细胞原始态多能性及促进原始生殖细胞转化中的应用。
本发明基于RNA-seq中GCNA在ESCs中显著高表达，而在体细胞Fib中不表达，首次探索GCNA在干细胞领域中的潜在功能；首先，通过RT-qPCR及Western blot在不同细胞、不同组织中验证mRNA及蛋白质水平上GCNA的转录差异，明确GCNA在干细胞ESCs及iPSCs中高表达，与干细胞多能性密切相关；其次，通过重编程试验，证实GCNA可缩短iPSCs克隆形成时间并提高克隆形成数，整体提高重编程效率，且诱导形成的iPSCs关键多能性基因的转录水平更高；再者，通过过表达实验证实GCNA可提高干细胞原始态多能性，过表达GCNA后ESCs形态上更隆起，关键相关多能性基因表达水平更高，且Pou5F1远端增强子更活化。
1.GCNA在干细胞中显著高表达，与多能性相关
本发明通过比较ESCs及Fib细胞RNA-Seq结果，发现GCNA在ESCs中显著高表达，而在Fib中不表达(图1)，因此将GCNA定为研究对象首先明确它与干细胞多能性是否相关。
通过RT-qPCR在重编程过程的细胞中比较GCNA差异性表达，发现它在ESCs及重编程成功的iPSCs中高表达，而在Fib及重编程未成功的细胞(URC)中不表达，如图2。通过PCR在小鼠不同组织中明确GCNA表达差异，发现GCNA仅在睾丸组织中表达，而其他分化终末阶段的组织器官中并不表达，如图3。通过Western blot在重编程过程的细胞中比较GCNA差异性表达，同样在蛋白质水平上，GCNA仅仅在多能干细胞中表达，如图图4。通过拟胚体分化实验证实随着体外拟胚体分化，GCNA表达水平与关键多能性基因一样进行性下降，如图5。
这些研究结果均支持GCNA仅在干细胞及保存有遗传信息的男性生殖细胞中表达，且随着干细胞分化表达水平进行性下降，GCNA与干细胞多能性密切相关。
2.GCNA可提高重编程效率
DOX-OSKM-MEFs在DOX存在的情况下可直接调控OSKM因子表达，驱动细胞重编程为iPSCs。在DOX-OSKM-MEFs中分别稳定转染GCNA过表达质粒及对照质粒，同时将未作转染处理的正常MEFs作空白对照，在转染3次以后收集1个副孔细胞提取RNA，逆转录成cDNA后通过RT-qPCR确认GCNA的表达水平在MEFs细胞中提高了10余倍，如图6。
随后更换含DOX诱导培养液进入到重编程阶段，GCNA组在诱导第12天即出现iPSC克隆，而对照组尚无克隆形成，如图7。
通过计数Nanog阳性克隆数，发现GCNA组形成的克隆数是其他两组的2倍左右，如图8，提示在OSKM因子重编程的体系中过表达GCNA可提高iPSCs诱导效率。最后挑选形成的iPSCs单克隆，比较各组之间关键多能性基因的表达发现GCNA组iPSC关键多能性基因表达水平更高，由此可明确GCNA在重编程过程中的重要调控作用。
3.GCNA可提高干细胞原始态多能性并促进向PGCs转化
将合成的GCNA过表达质粒通过慢病毒包装后稳定转染ESCs，同时选取对照质粒转染ESCs与正常ESCs作为对照组。发现过表达GCNA的ESCs形态上更隆起聚集，克隆形成能力更高，更趋于 ESCs，如图9。将转染成功的细胞挑出继续传代培养后，提取RNA、DNA及蛋白质，分别进行RT-qPCR、甲基化测定及Western blot，证实随着GCNA在mRNA，如图10及蛋白质水平上过表达，如图11，关键多能性基因尤其是原始态相关基因(Pou5F1、Nanog、Klf2、Klf4及Tcl1)转录水平显著提高，如图12。而且，通过甲基化水平测定，发现ESCs过表达GCNA后，其Pou5F1基因调控区的远端增强子及启动子区域CpG甲基化水平降低，如图13，提示远端增强子活性更强，更趋于向原始态状态转化。同时，过表达GCNA的ESCs其PGCs相关特异性基因表达水平更高，如Prdm1，Prdm14，Tfap2c及Nanos3，见图14，提示GCNA具有促进多能干细胞向PGCs定向分化的潜能。
本发明的有益效果：
目前体外重编程体系中iPSCs由体细胞过表达关键多能性转录因子OSKM(Oct4,Sox4,Klf4,c-Myc)重编程而来，然而重编程效率低。本发明在重编程体系中引入GCNA，不仅可提高重编程效率，达到在短期内获得大量iPSCs的目的，其次同时还能提高干细胞原始态多能性，从而可定向分化为有临床治疗需求的组织细胞，如通过PGCs转化最终分化为精子细胞，以推进再生医学发展。
附图说明
图1RNA-Seq中GCNA在胚胎干细胞(E14)中高表达，而成纤维细胞(Fib)中不表达；
图2RT-qPCR中GCNA在多能干细胞E14及iPSC中高表达，而Fib及未重编程成功的细胞(URC)中不表达；
图3PCR证实GCNA在除睾丸组织以外的其他分化终末阶段组织器官中不表达；
图4Western blot明确蛋白质水平上GCNA仅在多能干细胞E14及iPSC中表达，在Fib及URC中不表达；
图5拟胚体分化实验中GCNA的表达与关键多能性基因一样随着胚胎分化而进行性下降；
图6重编程实验在MEF中过表达GCNA，RT-qPCR提示mRNA水平上GCNA转录水平提高10余倍；
图7重编程实验诱导第12天，过表达GCNA MEF已成功诱导成iPSC，形成克隆形态；
图8重编程实验中与对照组相比，过表达GCNA后克隆形成数明显增多至2倍左右；
图9 E14中过表达GCNA后，与对照组相比，克隆形态更隆起聚集，趋于原始态状态；
图10过表达实验中E14转染过表达质粒后，GCNA在mRNA转录水平上提高5倍余；
图11过表达实验中E14转染过表达质粒后，GCNA在蛋白质表达水平上明显增高；
图12 E14过表达GCNA后，原始态相关多能性基因的转录水平明显提高；
图13 E14过表达GCNA后，关键多能性基因Pou5F1远端增强子(CpG1)及启动子(CpG3)甲基化水平明显降低。
图14 E14过表达GCNA后，PGCs相关特异性基因表达水平显著提高，。
具体实施方式
实施例1：验证GCNA在干细胞中显著高表达
RNA提取及cDNA合成
提取小鼠Fib、E14、iPSCs及小鼠各脏器组织RNA，应用DNA酶消化DNA后经逆转录合成cDNA，通过RT-qPCR及PCR比较各细胞及组织中的基因表达差异。
(1)RNA提取具体步骤：
收集6孔板1孔的Fib及iPSCs(约2-5×105)，加1mL TRIzol溶剂，充分混匀并静置5min。或剪取小鼠各脏器组织，如肺、心、大脑、小脑、肌肉等，研磨过后加入1mL的TRIzol溶剂，充分混匀后静置5min。加入氯仿200μL，颠倒混匀15sec，在室温静置3min，并用12000r/min离心15min。取出上清并加入等量异丙醇，室温静置10min，4℃，12000r/min离心10min。弃去上清，加入75％乙醇溶液，12000r/min离心5min，共两次。弃去上清，待颗粒由白色变为半透明后加入30-50μL无RNA酶的去离子水。测浓度后-80℃保存备用。
(2)RNA逆转录合成cDNA具体步骤
测RNA浓度，将RNA稀释至200-400ng/μL，取2μL放入含有12μL液体石蜡的0.6mL的EP管中。加入1μL的DNA酶I混合液，37℃孵育30min去除DNA，75℃孵育10min灭活DNA酶I，并在冰上迅速冷却。加入3μLcDNA混合液，37℃孵育60min逆转录合成cDNA，95℃孵育3min灭活M-MLV逆转录酶，加Milli-Q H2O稀释至50μL作为PCR底物，保存至-20℃冰箱备用。
实时定量PCR(Real-time PCR)
Real-time PCR实验采用Fast SYBR Green Master Mix(Roche)试剂盒，具体反应体系如下：
整个反应体系在冰上避光配制，每个反应设3个副孔，体系加入PCR板时避免产生气泡，避免影响反应读值，加样结束后封膜，简单离心后放入PCR仪。
拟胚体分化实验
拟胚体分化实验用来体外模拟干细胞向三胚层分化发育的过程，在拟胚体形成的过程中，多能性基因的表达进行性下降，三胚层相关的基因表达逐渐上调。采用悬滴法及悬浮法结合进行拟胚体分化实验，明确GCNA转录水平是否随着干细胞分化而变化。具体的实验步骤如下：
(1)将生长至60-70％的胚胎干细胞消化后用不含白血病抑制因子(leukemiainhibitory factor，LIF)的knockout培养液重悬，计数后将细胞稀释至密度为3×104mL。
(2)准备10cm培养皿，加入10mL新鲜配置的PBS，将培养皿的盖子倒置，分别点滴20-30μL上述稀释好的胚胎干细胞，每个盖子可点滴20滴左右。轻轻将盖子扣在皿底，放到孵箱培养4天左右。期间收集D0、D2及D4细胞提取RNA。
(3)D4将拟胚体从培养皿盖上冲至超低吸附力的培养皿中，添加足够的培养液放入摇床中继续悬浮法培养拟胚体。
(4)每隔1天收集细胞至15mL试管中室温下静置沉淀30min，弃上清更换培养液。并收集D6、D8细胞提取RNA。
将D0、D2、D4、D6及D8提取的RNA进行逆转录合成cDNA，通过实时定量PCR明确多能性干细胞及GCNA转录水平的变化趋势。
实施例2：验证GCNA可提高重编程效率
将慢病毒质粒四环素调控基因TetO-OSKM转染MEFs，诱导培养基添加DOX后便可诱导OSKM因子表达形成iPSCs。将iPSCs形成拟胚体再分化成纤维样细胞，即得到DOX-OSKM-MEFs，这种二代MEFs在DOX存在的情况下可直接调控OSKM因子表达，驱动细胞重编程。在DOX-OSKM-MEFs中分别稳转GCNA过表达质粒及对照质粒，同时将未作转染处理的正常MEFs作空白对照，随后更换含DOX诱导培养液进行重编程，观察三组iPSCs克隆形成的时间及数目，比较诱导效率。具体如下：
(1)复苏原代MEFs细胞：冻存的DOX-OSKM-MEFs原代细胞，复苏到6孔盘，用MEFs培养基培养。
(2)转染：将复苏的MEFs分盘至12孔细胞培养板中，密度为每孔2×104；分别转染GCNA过表达质粒及VectorCT对照质粒，并选择未做转染处理的正常MEFs细胞做空白对照；连续转染3次后通过荧光亮度及RT-qPCR验证转染效率。
(3)诱导重编程：更换为重编程培养液，加入DOX诱导OSKM因子表达，进入诱导重编程阶段，期间每天观察MEFs形态变化，记录首个iPSCs克隆出现时间；在D21即诱导第14天左右，通过Nanog免疫荧光染色确定形成iPSCs克隆的多能性，并计数比较三组之间Nanog阳性克隆数。
(4)iPSCs培养：将重编程过程中形成的iPSCs单克隆挑出，在滋养层细胞上继续应用iPSCs培养基培养，收集细胞提取RNA，比较三组之间多能性基因的表达差异。
实施例3：验证GCNA可提高干细胞原始态多能性并促进向PGCs分化构建GCNA过表达质粒
设计3’及5’端引物对GCNA全长进行扩增，构建入lenti-RsRED过表达质粒中，具体步骤如下：首先通过PCR体外扩增GCNA，将PCR产物跑核酸胶，验证特异条带大小，紫外灯下将其切下利用凝胶核酸回收试剂盒回收DNA，测浓度待用。其次，用快速限制性内切酶EcoRI和EcoRV分别切开GCNA目的片段及lenti-RsRED目的载体，使用适当浓度核酸胶跑胶验证，利用凝胶核酸回收试剂盒回收酶切后的目的片段及目的载体。然后进行连接，回收酶切后的目的片段及目的载体用T4连接酶22℃连接0.5h。随后转化、摇菌、涂盘、挑菌鉴定，最终将测序结果完全正确的菌液摇菌提质粒。
慢病毒包装及感染
通过慢病毒包装技术将携带有目的基因的载体包装成慢病毒并整合至被感染细胞内，应用3质粒系统，将过表达质粒包装成能够感染Fib和iPSCs的慢病毒。
(1)慢病毒包装
6孔板培养293T细胞，长至70％左右时更换为不含血清及双抗的Opti-MEM培养液1.8mL。将目的质粒(过表达及对照质粒)0.8μg、psPAX20.8μg及pMD2G 0.4μg加入100μLOpti-MEM中，静置5min；同时将1μL浓度为5μg/μL的PEI加入100μL Opti-MEM中，同样静置5min。随后将两种液体混合均匀，静置20min后加入293T培养液中。6-8h换成2mL含有10％正常血清和1％双抗的正常DMEM培养液中继续培养。观察荧光亮度判断瞬转效率，收集24h、48h、72h病毒上清4℃贮存。将收集的病毒上清液用0.45μM滤膜过滤，分装存于-80℃冰箱备用。
(2)细胞的慢病毒感染及筛选
6孔板培养Fib和iPSCs，培养方法同上，生长至50％-60％时准备感染病毒。取1-2μL浓度为10mg/mL的Polybrene助转剂(终浓度为8ng/μL)与制备好的慢病毒液混合均匀，加入总体积为2mL的培养液中。24h后换液，用适量浓度为0.1μg/μL的嘌呤霉素加入培养液中进行筛选，嘌呤霉素从浓度为0.5μg/mL开始。观察细胞的死亡情况，逐渐增加嘌呤霉素的浓度至2μg/mL，筛选出稳定表达目的基因的单克隆细胞株，提取RNA、DNA并冻存于液氮罐中备用。
免疫荧光染色
iPSCs的多能性可通过多能性标志物染色而进一步明确，常见的多能性标志物如碱性磷酸酶、Oct4、Sox2、Nanog及SSAE-1等。因重编程试验中的MEFs细胞本身通过DOX可诱导出OSKM因子的表达，因此我们在这个阶段进行的免疫荧光染色选用Nanog抗体。具体步骤如下：固定：细胞室温下4％多聚甲醛固定10min，PBS清洗3次，每次5min。破膜：应用0.5％v/v TritonX-100冰上破膜5min，PBS再次清洗3次，每次5min。封闭：用1％w/v BSA室温封闭30min。抗体孵育：用1％BSA稀释Nanog抗体至2μg/mL，室温孵育3h，PBS清洗3次，每次5min。用0.2％BSA稀释Alexa 647二抗至2μg/mL，室温孵育45min，PBS清洗3次，每次5min。观察：DAPI染色10min，PBS清洗2次后荧光显微镜观察。
甲基化水平测定
选择EZ DNA甲基化试剂盒，利用亚硫酸氢钠法分析Oct4增强子区域DNA甲基化改变情况。未甲基化CpG位点被转化成TpG，甲基化CpG位点则保持不变，采用甲基化引物对C→T转化后的DNA进行PCR扩增，将扩增的PCR DNA克隆到Pjet1.2载体测序，明确过表达GCNA对Fib Pou5F1增强子区域CpG位点甲基化水平的影响。
Claims (2)
1.GCNA在提高OSKM因子重编程小鼠成纤维细胞为小鼠诱导多能干细胞的效率中的应用。
2.GCNA在提高小鼠胚胎干细胞原始态多能性中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211388309.3A CN115948524B (zh) | 2022-11-08 | 2022-11-08 | Gcna在提高重编程效率、干细胞原始态多能性及促进原始生殖细胞转化中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211388309.3A CN115948524B (zh) | 2022-11-08 | 2022-11-08 | Gcna在提高重编程效率、干细胞原始态多能性及促进原始生殖细胞转化中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115948524A CN115948524A (zh) | 2023-04-11 |
| CN115948524B true CN115948524B (zh) | 2024-05-24 |
Family
ID=87281302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211388309.3A Active CN115948524B (zh) | 2022-11-08 | 2022-11-08 | Gcna在提高重编程效率、干细胞原始态多能性及促进原始生殖细胞转化中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115948524B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002065261A (ja) * | 2000-08-30 | 2002-03-05 | Mitsubishi Kasei Institute Of Life Sciences | 生殖細胞の取得方法 |
| CN102093981A (zh) * | 2010-12-17 | 2011-06-15 | 深圳市北科生物科技有限公司 | 一种高效诱导人类体细胞重编程为多潜能干细胞的方法 |
| CN110894493A (zh) * | 2019-10-28 | 2020-03-20 | 吉林大学 | 一种重编程间充质干细胞及其制备方法 |
| CN111019886A (zh) * | 2019-12-18 | 2020-04-17 | 卓越细胞工程(香港)有限公司 | 新的干性因子和其用于培养胚胎干细胞的方法或培养体系 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003247135A1 (en) * | 2002-07-23 | 2004-02-09 | Nanodiagnostics, Inc. | Embryonic stem cell markers and uses thereof |
| US9497943B2 (en) * | 2008-06-13 | 2016-11-22 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Nucleic acid constructs encoding reprogramming factors linked by self-cleaving peptides |
| US10894948B2 (en) * | 2014-08-22 | 2021-01-19 | Cambridge Enterprise Limited | Resetting pluripotent stem cells |
-
2022
- 2022-11-08 CN CN202211388309.3A patent/CN115948524B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002065261A (ja) * | 2000-08-30 | 2002-03-05 | Mitsubishi Kasei Institute Of Life Sciences | 生殖細胞の取得方法 |
| CN102093981A (zh) * | 2010-12-17 | 2011-06-15 | 深圳市北科生物科技有限公司 | 一种高效诱导人类体细胞重编程为多潜能干细胞的方法 |
| CN110894493A (zh) * | 2019-10-28 | 2020-03-20 | 吉林大学 | 一种重编程间充质干细胞及其制备方法 |
| CN111019886A (zh) * | 2019-12-18 | 2020-04-17 | 卓越细胞工程(香港)有限公司 | 新的干性因子和其用于培养胚胎干细胞的方法或培养体系 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115948524A (zh) | 2023-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2821481B1 (en) | Culture medium for preparing neural stem cells and use thereof | |
| Wasik et al. | Reprogramming and carcinogenesis—Parallels and distinctions | |
| JP2019524070A (ja) | 血液細胞の人工多能性幹細胞へのリプログラミングのための新規及び効率的な方法 | |
| ES2575605T3 (es) | Método de generación de células madre pluripotentes inducidas y células diferenciadas | |
| Lorenzo et al. | Generation of mouse and human induced pluripotent stem cells (iPSC) from primary somatic cells | |
| WO2010004989A1 (ja) | 多能性幹細胞の製造方法 | |
| KR20130101135A (ko) | 유도 다능성 줄기세포 제조방법 및 유도 다능성 줄기세포 제조용 배지 | |
| CN112961833A (zh) | 一种将永生化淋巴细胞系重编程为诱导多能干细胞的方法 | |
| CN103348002A (zh) | 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法 | |
| Deng et al. | Let-7f promotes the differentiation of neural stem cells in rats | |
| CN110499331A (zh) | 外源性人端粒酶反转录酶基因重组慢病毒颗粒的获得方法 | |
| CN101984050A (zh) | 用于产生诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型及其制备方法和应用 | |
| CN115948524B (zh) | Gcna在提高重编程效率、干细胞原始态多能性及促进原始生殖细胞转化中的应用 | |
| CN101613717A (zh) | 用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法 | |
| CN116529361B (zh) | 使用多顺反子sox2、klf4和任选的c-myc产生诱导多能干细胞 | |
| CN104450622B (zh) | 一种重组细胞系、其制备方法和应用 | |
| KR20070111570A (ko) | 인간의 뇌 암 조직으로부터 확립된 신규 암 줄기 세포주ｇｂｍ 2 | |
| CN113528576A (zh) | 含有nlrp7纯和突变的复发性葡萄胎患者特异性诱导多能干细胞系及构建方法 | |
| WO2009146098A2 (en) | Stem cells and uses thereof | |
| US20150361391A1 (en) | Method for inducing tailored pluripotent stem cells using extract of plant stem cells or plant dedifferentiated stem cells, and pluripotent stem cells produced by means of the method | |
| CN113999816B (zh) | 一种表达hoxa10的人脐带间充质干细胞系及其制备方法和应用 | |
| WO2021241524A1 (ja) | 増殖能が高い心筋細胞を選別する方法 | |
| KR100662706B1 (ko) | 양수세포를 배양한 후 수거한 배양액을 이용한 인간배아 줄기세포의 배양방법 | |
| CN114410688B (zh) | 一种lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法 | |
| CN113584086B (zh) | 一种小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为黑素细胞的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |