JP6128511B2 - iPS細胞の高効率な樹立方法 - Google Patents
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Description
このような樹立効率の高いiPS細胞樹立方法として例えば特許文献1の技術がすでに知られている。
特許文献1は、歯髄由来細胞は皮膚由来線維芽細胞よりも高効率でiPS細胞を樹立できることを開示している。本文献においては、入手が容易な歯髄を出発材料とすると従来の皮膚由来線維芽細胞を出発材料とする場合より高効率でiPS細胞を樹立できることが開示されている。
なお、特許文献2は、歯髄が未分化多能性細胞を含むことを開示しているが、遺伝子を導入して多能性を誘導する技術ではなく、そこで示されている多能性は歯及び歯周辺組織に限られている。
このように歯髄を利用したiPS細胞の製造技術はすでに知られているものの、歯髄をさらに複数の部位に分けてiPS細胞樹立に関する特性を比較検討するという発想は全く含んでいなかった。
すなわち、特許文献1の技術は、歯髄全体をまるごと粉砕・酵素処理するものであり(すなわち出発材料の大部分が歯冠部由来であり)、歯髄組織がiPS細胞樹立により適した部位と適さない部位にさらに分けられるという概念は一切示唆されていない。
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
〔1〕歯根部歯髄に由来する細胞に核初期化物質を接触させることを含む、iPS細胞の製造方法。
〔2〕核初期化物質が、Oct3/4, Klf4およびSox2またはそれらをコードする核酸である、前記〔1〕記載の方法。
〔3〕核初期化物質が、Oct3/4, Klf4, Sox2およびc-Mycまたはそれらをコードする核酸である、前記〔1〕記載の方法。
〔4〕歯根部歯髄に由来する細胞が、ヒト乳歯の歯根部歯髄由来間葉系細胞である、前記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕iPSを製造するための体細胞ソースとしての、歯根部歯髄に由来する細胞の使用。
また、歯根部歯髄由来細胞は、矯正治療により抜歯した歯などから調製することができるため、多数の人の歯根部歯髄由来細胞を容易に収集することができる。
また、歯根部歯髄由来細胞を自己由来の細胞から容易に調整することができるため、オーダーメイド再生医療やセミオーダーメイド再生医療においても有効に用いることができる。
歯根部歯髄の組織は、矯正治療に伴う便宜抜歯等で抜去された歯の歯頚部近心および遠心から、歯髄を傷つけないようにして歯科用ダイヤモンドで楔を入れまず歯を歯冠と歯根に分割する。、次に、歯冠と歯根をゆっくりと引き離して、歯根から歯髄組織が分離することにより得ることができる。このようにして得られた歯髄組織を組織外生法や、また適当な大きさの組織片に刻んだ後コラゲナーゼ等で酵素処理し、得られる細胞懸濁液を間葉系幹細胞用の培地に播種して、常法に従って培養することで歯根部歯髄由来細胞を得ることができる。
後述する実施例では、歯冠側近心隅角相当部の歯髄組織を歯冠部歯髄(図1Aのa−1)と根尖相当部から3mm程度歯冠側の歯髄組織を歯根部歯髄(図1Aのb−1)として用いた。
なお、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一である他人から歯根部歯髄由来細胞を採取することが特に好ましい。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), N-Myc, L-Mycで置換可能である。)
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
(以上、WO 2007/069666を参照(但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell,126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照)
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2(Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28(Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照)
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40 Large T(Stem Cells Express, published online May 29, 2008, p1-16を参照)
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28(Cell Research (2008) 600-603を参照)
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40 Large T(Stem Cells Express, published online May 29, 2008, p1-16も参照)
(14) Oct3/4, Klf4(Nature, Published online, 29 June 2008,p1-5 (doi:10.1038/nature07061)を参照)
(15) Oct3/4, c-Myc(Nature, Published online, 29 June 2008,p1-5 (doi:10.1038/nature07061)を参照)
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008)を参照)
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
ヒト乳歯から分取した歯冠部歯髄と歯根部歯髄からの間葉系細胞の採取
1.歯冠部歯髄と歯根部歯髄の採取
日本大学歯学部付属歯科病院にて、矯正治療のために、抜去が必要となった7歳男児の上顎左側乳中切歯を抜歯(歯の状態は歯根吸収は認めない)後、歯の歯頚部近心および遠心から、歯科用ダイヤモンドディスクにて、歯髄を傷つけないように、楔を入れ,挺子により歯を歯冠と歯根に分割する。次に、歯冠と歯根をゆっくりと引き離すと、歯根から歯髄組織が分離できた。次に、分離した歯根歯髄を眼科用ピンセットにて根尖相当部の歯髄を掴み,歯冠より歯髄を分離して,歯髄組織を一塊に摘出した。摘出した歯髄はNo.11メスにて歯冠部と歯根部の歯髄に単離した。
以下の実施例では、歯冠側近心隅角相当部(図1Aのa)の歯髄組織を歯冠部歯髄と根尖相当部から3mm程度歯冠側(図1Aのb)の歯髄組織を歯根部歯髄として用いた。
2.歯冠部歯髄由来間葉系細胞と歯根部歯髄由来間葉系細胞の調整
細胞の獲得方法は、組織外生法を用いた。歯冠部歯髄及び歯根部歯髄の両組織片(直径1mm)を直径35mmディッシュに静置し、組織が浮かないように、15%FBSおよび1%のペニシリンストレプトマイシン添加のMEM−α(wako)0.5mlを添加した。培養3〜5日後に、静置した各組織から細胞を外生した。それらの細胞群を歯冠部歯髄由来間葉系細胞と歯根部歯髄由来間葉系細胞とし、継代・培養後、下記実施例の実験日まで、バンバンカー液(日本ジェネティクス)中に移し、−80℃のフリーザー内にて保管した。
1.実験方法
(1)iPS細胞樹立用細胞群の調整
我々がヒト乳歯から採取した歯髄由来間葉系細胞の対照群として、東京大学医科学研究所がCell Appricationより購入した新生児皮膚線維芽細胞(HDFn)を用いた。
iPS細胞の樹立方法は、の高山らの方法に従った。(Takayama et al. J. Exp. Med. Vol.207 No.13 2817-2030, 2010)。東京大学医科学研究所が作製した、Oct3/4,Sox2,KLF4,c-Mycの各iPS細胞誘導因子をMXsレトロウイルスベクターで組み込んだウイルス産生用293GPG細胞を通法に従って培養し、その上澄み液(上清液)を濃縮して-80℃にて凍結保存した。歯冠部歯髄由来間葉細胞(図2A)、歯根部歯髄由来間葉細胞(図2B)、およびHDFnは15%FBSおよび1%のペニシリンストレプトマイシン添加のMEM−α培地(wako)で培養・増殖し、iPS細胞の樹立には各歯髄由来間葉細胞において継代数4-5回、HDFn は継代数9-10回の細胞群を用いた。
(2)iPS細胞の樹立方法
樹立用の細胞はゼラチンを塗布した25cm2培養皿に2.0x105個の細胞を播種し、この日をday0とした。翌日と翌々日(day1 と2) に連続して最終濃度10ug/mlとなるようにProtamineを培地に添加し,ヒト由来Oct3/4, Sox2, KLF4, c-Mycの4因子またはc-Mycを除いた3因子の各因子のウイルス濃縮液を10ulずつ添加した。Day2のレトロウイルス感染24時間後に新鮮培地に交換し、Protaminを添加した(day3)。Day5において、あらかじめ、凍結保存しているフィーダー細胞(1継代目のMEF)を培養皿に播種し,播種翌日に50Gy電離放射線にて処理後、継代し、ゼラチンを塗布した10cm培養皿に7.5x105個の細胞を播種した。培地はDMEM基礎培地にFBS(牛胎児血清)を10%,2mM L-グルタミン,100Uペニシリン,0.1mg/ml ストレプトマイシンを添加した合成培地を用いた(Day6)。Day7において、ウイルス感染させた各種細胞群を0.05%トリプシン-EDTAで、培養皿から剥がして回収後,前日にあらかじめ準備しているMEF細胞の上に5x104個の細胞を播種した。その翌日(day8) に、培地をヒトES/iPS細胞用培地(DMEM/F12, 20%KNOCKOUT Serum Replacement, NON-ESSENTIAL AMINO ACID SOLUTION, 2-MerCAPTOETHANOL, 5ng/ml basic FGF, 2mM L-グルタミン,100Uペニシリン,0.1mg/ml ストレプトマイシン)に交換し,培養を継続した。その後、培地を2日に1度交換することで、細胞の未分化性を維持した。
4因子(Oct3/4, Sox2, KLF4,c-Myc)を遺伝子導入した細胞群において,導入30日後にアルカリホスファターゼ(ALP)染色(Vector Labolatories)を行ない、陽性を示したiPS細胞様コロニーを顕微鏡下で観察し、そのコロニー数を数えた。形態学的にiPS細胞様であること、およびALP染色が陽性であることの二つの条件を示すコロニーをiPS細胞のコロニーと定義し、そのコロニー数により樹立効率を下記式にしたがい算出した。
樹立効率(%)=コロニー数÷播種した細胞数×100
3因子(Oct3/4, Sox2,KLF4)を遺伝子導入した細胞群においては、導入35日後に、ALP染色し、陽性を示したiPS細胞様コロニーを顕微鏡下にて観察し、そのコロニー数を数えて樹立効率を計算した。
2.結果および考察
結果を表1,表2に示す。
歯根部歯髄由来間葉系細胞は歯冠部歯髄由来間葉系細胞より4因子の導入において2.0倍、3因子の導入において約5倍も樹立効率が高くなる結果となった。
歯冠部歯髄由来間葉系細胞および歯根部歯髄由来間葉系細胞におけるiPS細胞の樹立効率の違いが明らかとなったので、次に、前記両細胞のウイルスの導入効率に違いが無いことを確認した。
1.実験方法
6ウェルプレートに実施例1の細胞群を1.0x105個、培養皿(n=3)に播種後、15%FBSおよび1%のペニシリンストレプトマイシン添加のMEM−α培地(wako)にて培養した。播種翌日,GFPで標識したpMYベクター(タイター:2x107IU/ml) をM.O.I(Multiplicity Of Infection)1にて感染後、最終濃度10ug/mlのProtamineを添加した。ウイルス感染より2日後にフローサイトメーター(BD社 Aria)にて、導入効率を解析した。これらの実験を4回施行後,平均GFP陽性細胞の割合を測定したところ、歯冠部歯髄由来間葉系細胞は38.75%、歯根部歯髄由来間葉系細胞は37.28%となった。t検定による統計学的解析の結果,両細胞のウイルス導入効率に有意差は認めなかった(図3)。この結果から、iPS細胞の樹立効率の違いは、細胞の特性の違いによるものであることが示された。
1.実験方法
実施例1と同じ歯冠部歯髄由来間葉系細胞と歯根部歯髄由来間葉系細胞に4因子を導入して、形成されたES細胞様コロニーをES細胞マーカーと考えられている遺伝子の発現解析と抗体を用いた免疫細胞化学的な解析を行い、iPS 細胞が樹立していることを確認する。この実験では、ウイルス感染後23日目にES細胞様コロニーをピックアップし, 電離放射線処理したMEF上にて、継代・培養して、それらのコロニーを維持し、解析に用いた。
継代数7回目のiPS細胞の遺伝子発現解析を行った。実験には、歯冠部歯髄由来間葉系細胞および歯根部歯髄由来間葉系細胞から樹立されたiPS細胞のクローンをそれぞれ3つの細胞群を選択した。
はじめに、抗SSEA4-PE抗体(R&D FAB1435P)を付与後、FACS(BD社、Aria)にて、MEF上からiPS細胞を分取した。次に、分取したiPS細胞群をTRIZOL Regent (Life Technologies)を用いてTotal RNAを抽出し,Rever Tra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO)でcDNAに変換し,Takara Ex Taq Hot Start Version (Takara)を使用してRT-PCR解析を行った。GAPDH(22サイクル)を内部標準として用いた。歯冠部および歯根部歯髄由来間葉系細胞から樹立されたiPS細胞様コロニーは,未分化細胞に特異的なREX1, NANOG, endoOct3/4, endoSox2 (24-27サイクル)を発現した(図4)。ウイルス感染させた4因子(Tg-Oct3/4, Tg-Sox2, Tg-c-Myc,Tg-KLF4)は感染後7日目には発現していたが,iPS細胞様コロニーには発現が認められなかったり、減少していた(21サイクル)(図4)。
歯冠部および歯根部歯髄由来間葉系細胞から樹立され、11もしくは12継代した各iPS細胞3クローンずつにおいて、アルカリホスファターゼ染色(Vector Labolatories)を施行した。すべてのクローンはALP陽性であることが示された(図5AとB)。
11もしくは12継代目の3つのクローン細胞において、未分化マーカーとして考えられているSSEA4 (図6AとD), TRA-1-60 (図6BとE), TRA-1-81(図6CとF)のタンパク発現について、免疫組織化学的手法にて観察した。6ウェルプレートに電離放射線処理したMEFを播種後、それぞれ3クローンのiPS細胞のコロニーを5日間培養した。培養後の細胞を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し,0.1%Triton-Xを含むPBSで透過処理後,4%正常ヤギ血清を含むPBSで30分間ブロッキングした。次に、ES cell characterization kit(Chemicon, SCR001)を用い,ブロッキング液で50倍希釈した一次抗体を1時間作用させ、PBSで500倍希釈した二次抗体を1時間作用させた。なお、使用した二次抗体は以下のとおりである;Alexa-488-標識抗-マウスIgG(Invitrogen A11029), Alexa-594-標識抗-マウスIgG (Invitrogen A11032)。歯冠部および歯根部歯髄由来間葉系細胞から樹立されたiPS細胞様細胞のクローンは、共にSSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81を発現することが確認された。
また、誘導されたiPS細胞様細胞の染色体異常の有無を調べるため、G-bandによる核型解析を行なった。歯冠および歯根部歯髄由来間葉系細胞から樹立された20継代目のiPS細胞様細胞を、ゼラチンでコーティングしてMEFを播種した25cm2培養皿上で培養し、日本遺伝子研究所(仙台)に解析を依頼した。結果はどちらも46,XY[20]で、染色体に異常は認められなかった(図7A,B)。
以上の結果より,乳歯歯冠部歯髄由来間葉系細胞および乳歯歯根部歯髄由来間葉系細胞から樹立した細胞は、いずれもiPS細胞であることが確認された。
ヒト乳歯歯冠部および歯根部歯髄間葉系細胞からの樹立したiPS細胞の分化多能性を確認するために奇形腫の形成能を検討した。
1.実験方法
実験動物は7-8週齢のNOD/SCIDマウス(♂)を使用した。両細胞から樹立したiPS細胞(図8A:歯冠部歯髄由来間葉系細胞から樹立したiPS細胞、図8B:歯根部歯髄由来間葉系細胞から樹立したiPS細胞)を回収し,iPS培地で細胞塊の浮遊液を遠心した後,ペレットを10uMのY-27632を添加したcold PBS液にて懸濁した。1.0x106 cells/20ulになるように細胞の懸濁液を調整し、ハミルトンマイクロシリンジにて、マウスの片側の精巣の被膜下に細胞を注入した。細胞注入12週後に4%パラホルムアルデヒド液で潅流固定後、試料を摘出し(図9Aと図9B),浸漬・固定した。組織学的解析法の通法にしたがい、脱水,透徹,浸漬しパラフィン包埋した。試料は4umに薄切し,ヘマトキシリンおよびエオジン染色した。
2.結果
歯冠部歯髄由来iPS細胞を移植した試料の染色結果を図10A,B,およびCに示す。Aは消化管様構造、Bは脂肪細胞様の形態、Cは色素上皮細胞様の形態を示した。
歯根部歯髄由来iPS細胞を移植した試料の染色結果を図11A,BおよびCに示す。Aは消化管様構造、Bは軟骨用構造、Cは神経管様構造を示した。
歯冠部歯髄由来間葉系細胞および歯根部歯髄由来間葉系細胞から樹立されたiPS細胞は、内胚葉、中胚葉、外胚葉の細胞に分化し、特有の組織形成能を示したことから,分化多能性を持つことが明らかとなった。
Claims (5)
- 歯根部歯髄に由来する単離された細胞に核初期化物質を接触させることを含む、iPS細胞の製造方法。
- 核初期化物質が、Oct3/4, Klf4およびSox2またはそれらをコードする核酸である、請求項1記載の方法。
- 核初期化物質が、Oct3/4, Klf4, Sox2およびc-Mycまたはそれらをコードする核酸である、請求項1記載の方法。
- 歯根部歯髄に由来する単離された細胞が、ヒト乳歯の歯根部歯髄由来間葉系細胞である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- iPSを製造するための体細胞ソースとしての、歯根部歯髄に由来する単離された細胞の使用。
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