KR101372752B1

KR101372752B1 - 유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법

Info

Publication number: KR101372752B1
Application number: KR1020117003453A
Authority: KR
Inventors: 겐이치 데즈카; 도시유키 시바타; 다카히로 구니사다; 나리타카 다마오키; 도모코 다케다; 신야 야마나카; 가즈토시 다카하시
Original assignee: 고꾸리츠 다이가꾸호오징 기후다이가꾸; 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2008-10-02
Publication date: 2014-03-14
Also published as: KR20110041521A; JP2011529330A; JP5553178B2; CA2732401C; AU2008360135A1; WO2010013359A1; CA2732401A1; US20110201110A1

Abstract

본 발명은 핵 재프로그래밍 물질을 치수 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 체세포의 공급원으로서 치수 줄기 세포를 이용함으로써, 3 또는 4 가지 인자의 전달에 의해 인간 iPS 세포의 확립 효율을 현저하게 개선할 수 있다. 추가로, 치수 줄기 세포는 추출된 사랑니 및 치주병 등 때문에 추출된 치아로부터 단리 및 제조될 수 있어, 이들은 iPS 세포 은행을 위한 체세포 공급원으로서 광범위하게 사용될 수 있기 때문에, 용이하게 입수가능하다.

Description

유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법 {EFFICIENT METHOD FOR ESTABLISHING INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS}

본 발명은 유도된 다능성 줄기 (이하 "iPS" 로도 지칭함) 세포 확립의 효율 개선 방법 및 이를 위한 치수 (dental pulp) 줄기 세포의 용도에 관한 것이다.

최근, 마우스 및 인간 iPS 세포가 잇따라 확립되어 왔다. Takahashi 및 Yamanaka (1) 는, 네오마이신 내성 유전자가 Fbx15 유전자자리에 노크인 (knocked-in) 되어 있는 리포터 마우스로부터 유래된 섬유모세포에 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자를 도입하고, 상기 세포가 상기 유전자를 발현하게 함으로써 iPS 세포를 유도하였다. Okita 등 (2) 은, 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 푸로마이신-내성 유전자를 Nanog 의 유전자자리에 혼입하여 이의 발현이 Fbx15 발현 보다는 다능성 세포에서 제한된 유전자삽입 마우스를 생산하고, 이 마우스로부터 유래된 섬유모세포가 상술한 4 개의 유전자를 발현하게 한 다음, 푸로마이신-내성과 GFP-양성 세포를 선별함으로써, 배아 줄기 (ES) 세포와 거의 동일한 유전자 발현 및 후성적 개질을 보이는 iPS 세포 (Nanog iPS 세포) 의 확립에 성공했다. 유사 결과를 다른 군들 (3,4) 에 의해서 확인했다. 이후, iPS 세포가 또한 c-Myc 유전자 이외의 3 가지 인자에 의해 생산될 수 있음이 드러났다 (5).

게다가, Takahashi 등 (6) 은 마우스에서 사용된 것과 동일한 4 가지 유전자를 인간 피부에서 유래된 섬유모세포에 도입함으로써 iPS 세포의 확립에 성공하였다. 한편, Yu 등 (7) 은 Klf4 및 c-Myc 대신에 Nanog 및 Lin28 을 이용하여 인간 iPS 세포를 생산했다. Park 등 (8) 은 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 의 4 가지 인자에 더하여, 인간 세포의 불멸 유전자로서 공지된 TERT 및 SV40 Large T 항원을 이용하여 인간 iPS 세포를 생산했다. 상술한 바와 같이, 다능성에서 ES 세포와 필적되는 iPS 세포가 인간과 마우스 둘 모두에서 생산될 수 있음이 입증되어 졌다.

그러나, iPS 세포의 확립 효율은 1% 인 것과 같이 낮다. 특히, iPS 세포의 극도로 낮은 확립 효율은, c-Myc 외에 3 가지 인자 (Oct3/4, Sox2 및 Klf4) 를 체세포에 도입하여 iPS 세포를 생산할 때 문제되는데, 이는 iPS 세포로부터 분화된 조직 또는 개체에서 종양발생이 야기되는 것으로 우려된다.

3 또는 4 가지 인자의 전달 (transfer) 에 의한 인간 iPS 세포의 확립에 있어서, 인간 iPS 세포가 성인 인간 피부 섬유모세포 또는 윤활세포로부터, 및 태아 또는 신생아 섬유모세포로부터 확립되었다고 지금까지 보고되어 왔다 (참고문헌 5, 6, 7, 및 8 참고). 그러나, 이의 확립 효율은 극도로 낮다; 예를 들면 인간 iPS 세포는 3 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4) 의 전달에 의해 확립되었다는 Nakagawa 등의 연구에 따르면 (오로지 (5)), 겨우 0 내지 5 개 뿐인 ES-세포와 유사한 콜로니가 5x10⁵ 성인 인간 피부 섬유모세포 (HDF) 로부터 수득되었다.

특정 종류의 화학 물질을 이용하여 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 내 3 또는 4 가지 인자를 전달함으로써 iPS 세포의 확립 효율을 개선하는 것에 대한 몇몇 보고서들을 이용할 수 있다 (예를 들어 참고 문헌 9 및 10 참고). 그러나, 인간 iPS 세포의 확립 효율이 확립 효율 개선제 또는 임의의 기타 핵 재프로그래밍 (nuclear reprogramming) 인자를 이용하지 않고 단지 3 또는 4 가지의 인자를 도입함으로써 현저하게 개선되었다는 보고는 없다.

참고 문헌:

1. Takahashi, K. 및 Yamanaka, S., Cell , 126: 663-676 (2006)

2. Okita, K. 등, Nature , 448: 313-317 (2007)

3. Wernig, M. 등, Nature , 448: 318-324 (2007)

4. Maherali, N. 등, Cell Stem Cell, 1: 55-70 (2007)

5. Nakagawa, M. 등, Nat . Biotethnol ., 26: 101-106 (2008)

6. Takahashi, K. 등, Cell , 131: 861-872 (2007)

7. Yu, J. 등, Science , 318: 1917-1920 (2007)

8. Park, I.H. 등, Nature , 451: 141-146 (2008)

9. Huangfu D. 등, Nat . Biotechnol ., 26(7): 795-797 (2008)

10. Shi Y. 등, Cell Stem Cell , 2: 525-528 (2008)

본 발명의 개요

iPS 세포의 확립 효율 개선 수단 및 이를 이용하여 iPS 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비교적 용이하게 입수가능한 세포로부터 iPS 세포를 확립하는 수단을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적들을 달성하기 위해 예의 연구하였고, 인간 iPS 세포 제조를 위한 출발 재료인 체세포로서 치수 줄기 세포를 이용하면 (iPS 세포의 공급원으로서 역할하는 세포), iPS 세포의 확립 효율이 현저하게 증가된다는 점을 발견했다. 구체적으로, 본 발명자들은 3 가지 인자 (Oct3/4, Klf4, Sox2) 또는 4 가지 인자 (Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc) 를 인간 치수 줄기 세포에 도입함으로써 인간 iPS 세포 확립을 시도하였고, 처음으로, 통상적으로 성인 인간 피부 섬유모세포 (HDF) 로부터 수득된 것보다 훨씬 다량의 iPS 세포를 확립할 수 있다는 점을 발견했다.

그리하여, 본 발명은 하기를 제공한다:

[1] 핵 재프로그래밍 물질을 치수 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 iPS 세포의 생산 방법.

[2] 상기 [1] 에 있어서, 핵 재프로그래밍 물질이 Oct3/4, Klf4 및 Sox2, 또는 이들을 인코딩하는 핵산인 방법.

[3] 상기 [1] 에 있어서, 핵 재프로그래밍 물질이 Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc, 또는 이들을 인코딩하는 핵산인 방법.

[4] 상기 [1] 에 있어서, 치수 줄기 세포가 인간 기원의 것인 방법.

[5] iPS 세포를 생산하기 위한 체세포 공급원으로서의 치수 줄기 세포의 용도.

치수 줄기 세포를 사용하면, iPS 세포의 확립 효율을 현저하게 증가시키는 것이 가능하게 되므로, 이는 통상적으로 낮고, 특히 c-Myc 를 제외한 3 가지 인자를 전달함으로써 iPS 세포를 유도하는 경우에 확립 효율이 낮은 인간 iPS 세포를 유도하는데 있어서 유용하다. c-Myc 는 재활성화시 종양발생 야기의 우려가 있기 때문에, 3 가지 인자를 이용한 iPS 세포의 확립 효율 개선이 iPS 세포를 재생 의학에 적용할 때 지극히 유용하다.

추가로, 치수 줄기 세포는 추출된 사랑니, 치주병 등 때문에 추출된 치아로부터 단리 및 제조될 수 있기 때문에 용이하게 입수되어, 이들은 iPS 세포 은행용 체세포의 공급원으로서 사용되기 위한 새로운 적용으로 여겨질 것으로 기대된다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 치수 줄기 세포를 재프로그래밍하여 수득된 ES-유사 세포 (iPS 세포) 의 콜로니 개수 그래프를 나타낸다. 도 1 에서, DP28, DP31, DP47, DP54, DP75, 및 DP87 은 치수 줄기 세포에 대한 결과를 보이고, HDF 는 성인 인간 피부 섬유모세포에 대한 결과를 보인다. 세로좌표의 각 축은 콜로니의 개수를 나타낸다. 각각의 좌측 막대기는 ES-유사 콜로니의 개수를 나타내고; 각각의 우측 막대기는 콜로니의 총 개수를 나타낸다. "d26 에서의 3 가지 인자"는 3 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4) 의 전달 후 26 일째에 수득된 결과를 나타낸다. "d21 에서의 4 가지 인자" 는 4 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 의 전달 후 21 일째에 수득된 결과를 나타낸다.

도 2 는 치수 줄기 세포로부터 유래된 iPS 세포에서 유전자 발현의 조사 결과를 보이는 포토그래프이다. 치수 줄기 세포 (DP31, DP75) 로부터 유래된 iPS 세포 (iPS-DP31, iPS-DP75) 에서 ES 세포 특이적 마커 (Oct3/4, Sox2, Nanog) 의 발현을 RT-PCR 로 확인했다. 도 2 에서, 3f 는 3 가지 인자의 전달에 의해 제조된 클론을 나타내고, 4f 는 4 가지 인자의 전달에 의해 제조된 클론을 나타낸다. 3f 와 4f 아래에 있는 각 숫자는 클론 번호를 나타낸다. "ES" 는 ES 세포를 나타내고, "DP31" 및 "DP75" 는 치수 줄기 세포를 나타내고, "201B6" 은 성인 인간 피부 섬유모세포로부터 유래된 iPS 세포를 나타내고 (Cell , 131, p861-872 (2007)), "AHDF" 는 성인 인간 피부 섬유모세포를 나타낸다. NAT1 은 양성 대조군을 나타내고, RT-(OCT3/4) 는 음성 대조군을 나타낸다 (Oct3/4 의 PCR 반응은 역전사 반응의 수행 없이 수행했음).

도 1 과 같이 도 3 은 ES-유사 세포 (iPS 세포) 의 콜로니 개수 그래프를 나타낸다. 도 3A 는 3 가지 인자 (3F) 의 전달 결과를 나타내고; 도 3B 는 4 가지 인자 (4F) 의 전달 결과를 나타낸다. "4 ES 유사" 및 "4 전체" 는 각각 5x10⁴ 치수 줄기 세포로 수득된, ES-유사 콜로니 개수 및 콜로니의 총 개수를 나타내고; "5 ES 유사" 및 "5 전체" 는 각각 5x10⁵ 치수 줄기 세포로 수득된, ES-유사 콜로니 개수 및 콜로니의 총 개수를 나타낸다.

도 4 는 면역 염색으로 검출된 바와 같이 치수 줄기 세포 DP47 로부터 확립된 ES-유사 콜로니 (iPS-DP47) 가 ES 세포 마커 Nanog 및 Oct3/4 (Oct) 를 발현한다는 점과 이것은 또한 알칼리 포스파타아제 (ALP) 염색에 양성이라는 점을 입증하는 포토그래프를 나타낸다. 대조를 위해, 인간 ES 세포 (hES) 를 염색했다.

도 5 는 치수 줄기 세포 DP31 로부터 확립된 두 iPS 클론 (DP31 4f-3 및 DP31 3f-1) 에서 줄기 세포 마커 (SSEA1, SSEA3, TRA-1-81 및 NANOG) 의 발현을 입증하는 포토그래프를 나타낸다.

도 6 은 인간 치수 줄기 세포로부터 유래된 iPS 세포의 다능성을 나타낸다. 도 6A 는 치수 줄기 세포 DP31 로부터 확립된 두 iPS 클론 (DP31 4f-3 및 DP31 3f-1) 에서의 배아체 (embryoid bodies) 의 형성을 보이는 포토그래프를 나타낸다. 도 6B 는 iPS 클론에서 외배엽- (βIII-튜블린), 중배엽- (α-SMA) 및 내배엽- (AFP) 분화 마커의 발현을 나타내는 포토그래프를 나타낸다. 대조군: 오직 2 차 항체.

도 7 은 인간 줄기 세포로부터 확립된 iPS 세포로부터 유래된 기형종의 형성을 나타내는 포토그래프를 나타낸다. 기형종은 지방 조직 (b), 신경 조직 (c), 창자-유사 조직 (d), 연골 조직 (e) 및 신경관-유사 조직 (f) 와 같은 복수의 세포 유형을 포함하였다. (a): 기형종의 개관.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 핵 재프로그래밍 물질을 치수 줄기 세포와 접촉하는 것을 포함하는, iPS 세포의 생산 방법을 제공한다.

(1) 치수 줄기 세포

본 발명의 iPS 세포 생산 방법에서 사용된 체세포의 공급원으로, 치수 줄기 세포는 치아의 상아질 내부에서 치수 조직에 존재하며 치수, 상아질 등으로 분화할 수 있는 (주로 상아질모세포로 분화할 수 있음) 체세포 줄기 세포의 종이다. 치수 줄기 세포는 (i) 치과교정 처치에서 편의를 위해 추출된 치아 또는 치주병 등으로 인해 추출된 치아, 또는 (ii) 치과교정 처치에서 편의를 위해 추출된 사랑니 또는 사랑니 치주염 등의 치료를 위해 추출된 사랑니로부터 치수 조직을 제거하고, 조직을 적절한 크기로 조각낸 후 이 조각을 콜라게나아제와 같은 효소로 처리하고, 수득한 세포 현탁액을 중간엽 줄기 세포에 대한 배양 배지 (예를 들어, JP-T-HEI-11-506610 및 JP-T-2000-515023 참고; 예를 들어, 중간엽 줄기 세포 기본 배지 (Lonza), MesenPRO RS 배지 (GIBCO) 등은 시중에서 입수가능함) 에 심어, 세포를 통상의 방법으로 배양함으로써 수득할 수 있다.

치수 조직을 보유하는 임의의 치아가 치수 줄기 세포의 공급원으로서 사용될 수 있으나, 증식할 가능성이 높은 치수 줄기 세포가 많은 치아를 선택하는 것이 바람직하다. 특히, 핵 재프로그래밍 물질을 레트로바이러스 벡터를 이용하여 치수 줄기 세포로 도입하는 경우, 레트로바이러스 형질도입을 허용하는 세포는 분화 세포로 제한된다. 따라서, 유전자 전달 효율 관점에서 증식 가능성이 높은 치수 줄기 세포를 함유하는 치수 조직을 출발 재료로 사용하는 것이 바람직하다.

치수 줄기 세포의 가장 적합한 공급원은 치과교정을 목적으로 추출된 사랑니를 가진 젊은 사람 (예를 들어, 약 12 ~ 16 세의 인간) 의 사랑니로부터 유래된 치수 조직이다. 상기 연령의 사랑니는 여전히 치아 분화의 초기 단계 중 치아의 뿌리 형성 중에 있어 치수 조직이 매우 풍부하고, 치수 줄기 세포가 상대적으로 고밀도이며, 이의 증식 가능성이 매우 높다는 것을 특징으로 한다.

사랑니는 때때로 다른 연령군에서 치과교정 목적으로 추출되기 때문에, 또한 치수 조직은 사랑니 외에 편의를 위해 추출된 치아로부터 수득될 수 있기 때문에, 공급원 이용가능성이 높다.

치수 줄기 세포의 기타 잠재적인 공급원에는 치주병 치료를 위해 추출된 치아, 사랑니 치주염 때문에 추출된 사랑니 등이 포함된다. 이 경우에, 오염이라는 위험의 증가와 수득된 치수 조직이 소량이라는 단점이 있다. 그러나, 성인 (특히 연세드신 분들) 으로부터의 입수 용이성 때문에, 이들 물질은 생산된 iPS 세포로터 분화된 세포 또는 조직의 자가 이식을 고려할 때 치수 줄기 세포의 주된 공급원으로서 역할할 수 있다.

그러나, 치아우식증이 있는 추출된 치아를 선택할 때면, 이의 치수 조직이 염증이 발생되게 해서는 안된다는 점에 주의해야 한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 치수 줄기 세포는, 포유류를 비롯한 모든 동물 종으로부터 유래될 수 있는데, 이는 핵 재프로그래밍 물질을 치수 줄기 세포와 접촉시켜 iPS 세포의 확립을 허용한다. 구체적으로, 인간 또는 마우스 치수 줄기 세포가 사용될 수 있으며, 인간 기원의 것이 바람직하다. 치수 줄기 세포는 임의의 동물 종으로부터 수집될 수 있으나, 수득된 iPS 세포를 인간 재생 의학에 사용할 때, 그 환자 또는 동일한 유형의 HLA 를 공유하는 또 다른 사람으로부터 (이식편 거부가 부재하기 때문임) 치수 줄기 세포를 수집하는 것이 특히 바람직하다. iPS 세포가 인간에 투여 (이식) 되는 것이 아닌, 예를 들면 환자의 약물 감수성 및 약물 부작용의 존재 또는 부재를 결정하는 스크리닝을 위한 세포 공급원으로서 사용될 때에는, 치수 줄기 세포는 그 환자, 또는 약물 감수성 및 약물 부작용과 연관성이 있는 동일한 유전자 다형성을 공유하는 또 다른 사람으로부터 수집되어야 한다.

상술된 바와 같이 추출된 치아 또는 자연스럽게 떨어져버린 치아로부터 제조된 치수 줄기 세포는 즉시 핵 재프로그래밍 물질과 접촉되어 iPS 세포를 유도할 수 있거나, 또는 통상의 방법에 의해 동결 저장되어, 필요할 때마다 해동 및 배양하여, 핵 재프로그래밍 물질과 접촉시켜 iPS 세포를 유도할 수 있다. 따라서, 예를 들면 환자 자신의 젖니 또는 비교적 어릴 때 추출한 영구치 또는 사랑니로부터 치수 줄기 세포를 제조하고, 이들을 장기간 동결 보존하고, 세포/기관 이식이 그 후에 요구될 때 상기로부터 iPS 세포를 유도하고, 이 iPS 세포의 분화를 유도함으로써 자가 이식 세포, 조직, 기관 등을 수득할 수 있다.

(2) 핵 재프로그래밍 물질

본원에서 사용되는 바, "핵 재프로그래밍 물질(들)" 이란, 이것이 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산 (벡터가 혼입된 형태 포함), 저분자 화합물 등이던지 간에 상관없이, 치수 줄기 세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 임의의 물질(들)일 수 있다. 핵 재프로그램 물질이 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산인 경우에, 하기 조합이 바람직하다 (이하부터는 단백질성 인자의 명칭만을 나타낸다).

(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc

(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2 (여기서, Sox2 는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18 로 대체될 수 있다. Klf4 는 Klf1, Klf2 또는 Klf5 로 대체될 수 있다. 더욱이, c-Myc 는 T58A (활성 돌연변이체), N-Myc, 또는 L-Myc 로 대체될 수 있다)

(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-카테닌 (활성 돌연변이체 S33Y)

(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T

(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6

(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7

(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7

(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil

(WO 2007/069666 (상기 조합 (2) 와 관련해서, Sox2 를 Sox18 로 대체, Klf4 를 Klf1 또는 Klf5 로 대체에 대해서는 Nature Biotechnology , 26, 101-106 (2008) 참조); 조합 "Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2" 에 대해, 또한 Cell , 126, 663-676 (2006), Cell , 131, 861-872 (2007) 등 참조; 조합 "Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T" 에 대해서는 또한 Nature , 451, 141-146 (2008) 참조) 참조).

(9) Oct3/4, Klf4, Sox2 (Nature Biotechnology , 26, 101-106 (2008) 참조)

(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28 (Science , 318, 1917-1920 (2007) 참조)

(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40 Large T (Stem Cell Express, published online May 29, 2008, p1-16 참조)

(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28 (Cell Research (2008) 600-603 참조)

(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40 Large T (역시 Stem Cell Express, published online May 29, 2008, p1-16 참조)

(14) Oct3/4, Klf4 (Nature, Published online, 29 June 2008, p1-5 (doi:10.1038/nature07061) 참조)

(15) Oct3/4, c-Myc (Nature, Published online, 29 June 2008, p1-5 (doi:10.1038/nature07061) 참조)

(16) Oct3/4, Sox2 (Nature , 451, 141-146 (2008) 참조)

상기 (1)-(16) 이외이나, 이의 어느 하나 중 모든 성분을 포함하고, 임의로 달리 선택된 물질을 추가로 포함한 조합이 또한 본 발명에서 "핵 재프로그래밍"의 범위에 포함될 수도 있다. 치수 줄기 세포가 상기 (1) - (16) 중 어느 하나의 성분 하나 이상을 핵 재프로그래밍하기에 충분한 수준으로 내생적으로 발현한다면, 발현된 성분을 제외하고 남은 성분들만의 조합도 또한 본 발명의 "핵 재프로그래밍 물질" 에 포함될 수도 있다.

이들 조합 중에서, 3 가지 인자 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 의 조합이 (즉, 상기 (9)), 치료 목적으로 수득된 iPS 세포의 사용을 고려하는 경우에 바람직하다. 한편, 치료 목적으로 iPS 세포의 사용을 고려하지 않는 경우에는 (예를 들면, 이것이 약물 발견 스크리닝 등을 위한 연구 기구로서 사용되는 경우), 5 가지 인자 Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2 및 Lin28, 또는 상기 5 가지와 Nanog 으로 이루어진 6 가지 인자 (즉, 상기 (12)) 이 바람직하다.

상술된 각각의 단백질성 인자에 대한 마우스 및 인간 cDNA 서열 정보는 WO 2007/069666 에 기술된 NCBI 기탁 번호를 참고함으로써 획득할 수 있고 (상기에서는 Nanog 이 "ECAT4" 명칭으로 언급되고; Lin28 에 대한 마우스 및 인간 cDNA 서열 정보는 NCBI 기탁 번호 NM_145833 및 NM_024674 각각을 참고하여 획득할 수 있음), 당업자는 이들 cDNA 를 용이하게 단리할 수 있다. 핵 재프로그래밍 물질로서 이용되기 위해 의도하는 경우, 단백질성 인자 그 자체는, 수득한 cDNA 를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 이 벡터를 숙주 세포에 도입한 후, 이 세포를 배양하여 재조합 단백질성 인자를 수득한 배지로부터 회수함으로써 제조할 수 있다. 한편, 단백질성 인자를 인코딩하는 핵산을 핵 재프로그래밍 물질로서 이용하는 경우에는, 수득한 cDNA 를 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 구축하고, 벡터를 핵 재프로그래밍의 단계에 적용한다.

핵 재프로그래밍 물질의 치수 줄기 세포와의 접촉은 당해 공지된 세포로의 단백질 전달 방법을 이용하여 달성될 수 있는데, 단, 물질이 단백질성 인자인 경우이다. 이러한 방법에는 예를 들면, 단백질 전달 시약을 이용하는 방법, 단백질 전달 도메인 (PTD) 융합 단백질을 이용하는 방법, 미세주입 방법 등이 포함된다. 단백질 전달 시약은 BioPOTER 단백질 전달 시약 (Gene Therapy Systems), Pro-Ject^TM 단백질 트랜스펙션 시약 (PIERCE) 및 ProVectin (IMGENEX) (양이온 지질 기재); Profect-1 (Targeting Systems) (지질 기재); Penetrain Peptide (Q biogene) 및 Chariot Kit (Active Motif) (막-투과성 펩티드 기재) 등을 비롯하여 시중에서 입수가능하다. 전달은 이들 시약에 첨부된 프로토콜에 따라 달성될 수 있으며, 통상의 절차는 이하에 기술한다. 핵 재프로그래밍 물질을 적합한 용매 (예를 들어, 버퍼 용액, 예컨대 PBS 또는 HEPES) 중에서 희석하고, 전달 시약을 첨가, 혼합물을 실온에서 약 5 ~ 15 분 동안 인큐베이션하여 복합체를 형성하고, 이 복합체를 무혈청 배지로의 교환 이후에 세포에 첨가하고, 세포를 37℃ 에서 1 내지 수 시간 동안 인큐베이션한다. 이후, 배지를 제거하고 혈청-함유 배지로 대체한다.

발달된 PTD 에는, 초파리-유래 AntP, HIV-유래 TAT, 및 HSV-유래 VP22 와 같은 단백질의 세포 침투 도메인을 이용하는 것이 포함된다. 핵 재프로그래밍 물질의 cDNA 및 PTD 서열을 혼입하는 융합 단백질 발현 벡터를 제조하여 융합 단백질의 재조합 발현을 가능하게 하고, 이 융합 단백질을 회수하여 전달에 사용한다. 이러한 전달은 어떠한 단백질 전달 시약도 첨가하지 않는 것을 제외하고, 하기에 기술된 바와 같이 달성될 수 있다.

약 1 ㎛ 의 말미 (tip) 직경을 갖는 유리 바늘 (needle) 에 단백질 용액을 넣어 이 용액을 세포에 주사하는 방법인 미세주입은 단백질의 세포로의 전달을 확실히 한다.

치수 줄기 세포로의 전달 용이성을 고려하면, 핵 재프로그래밍 물질이 단백질성 인자 그 자체의 것이라기 보다는 단백질성 인자를 인코딩하는 핵산 형태로 사용되는 것이 바람직하다. 핵산은 DNA 또는 RNA 일 수 있거나, DNA/RNA 키메라일 수 있고, 핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 바람직하게, 핵산은 이중-가닥 DNA, 특히 cDNA 이다.

핵 재프로그래밍 물질의 cDNA 는, 숙주 역할하는 치수 줄기 세포에서 기능할 수 있는 프로모터를 갖는 적절한 발현 벡터로 삽입된다. 유용한 발현 벡터에는, 예를 들어 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 헤르페스바이러스, 동물 세포에서 발현을 위한 플라스미드 (예를 들어, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) 등이 포함된다. 사용되는 벡터의 종류는 수득된 iPS 세포의 목적 용도에 따라 적절히 선택될 수 있다.

발현 벡터에 사용된 유용한 프로모터에는, 예를 들어 SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터, RSV (라우스 육종 바이러스) 프로모터, MoMuLV (몰로니 마우스 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK (헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나아제) 프로모터 등이 포함된다. MoMuLV LTR, CMV 프로모터, SRα 프로모터 등이 바람직하다.

발현 벡터는 원한다면, 프로모터에 더하여 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 선별 마커 유전자, SV 40 복제 기점 등을 가질 수 있다. 선별 마커 유전자의 예에는 디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등이 포함된다.

핵 재프로그래밍 물질인 핵산을 갖는 발현 벡터는, 벡터 종류에 따라 당해 공지된 기술에 의해 세포로 도입될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 벡터의 경우, 핵산 함유 플라스미드를 적절한 패키징 (packaging) 세포 (예, Plat-E 세포) 또는 상보 세포주 (예, 293-세포) 에 도입하고, 배양물 상청액에서 수득한 바이러스 벡터를 회수한 다음, 이 바이러스 벡터에 적합한 방법으로 이 벡터를 세포에 감염시킨다. 플라스미드 벡터의 경우, 벡터를 리포펙션 방법, 리포솜 방법, 전기 천공 방법, 칼슘 포스페이트 공동-침전 (co-precipitation) 방법, DEAE 덱스트란 방법, 미세주입 방법, 유전자 총 (gun) 방법 등을 이용해 세포에 도입할 수 있다.

핵 재프로그래밍 물질이 저분자 화합물인 경우에는, 이 물질의 치수 줄기 세포와의 접촉은, 이 물질을 수성 또는 비(非)수성 용매 중 적절한 농도로 용해하여, 이 물질의 용액을 치수 줄기 세포의 배양에 적합한 배지 (예, 최소 기본 배지 (MEM), Dulbecco 변형 필수 배지 (Dulbecco's modified Eagle medium; DMEM), RPMI1640 배지, 199 배지, F12 배지 등, 약 5 내지 20% 우태아 혈청으로 보충됨; 또는 중간엽 줄기 세포 기본 배지 (Lonza) 등의 중간엽 줄기 세포용 배지) 에 첨가하여, 치수 줄기 세포에서 핵 재프로그래밍을 야기하기에 충분하나 세포독성이 없는 핵 재프로그래밍 물질의 농도를 수득하고, 이 세포를 주어진 기간 동안 배양함으로써 달성될 수 있다. 핵 재프로그래밍 물질의 농도는 사용된 핵 재프로그래밍 물질의 종류에 따라 달라지며, 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 의 범위로 적절히 선택된다. 접촉 기간은 세포의 핵 재프로그래밍을 달성하기에 충분한 임의 시간일 수 있다.

(3) iPS 세포 확립 효율 개선제

근래 들어, iPS 세포의 확립 효율을 개선하는 다양한 물질들이 제안되어 왔는데, 이 효율은 통상적으로 낮았다. 그리하여, iPS 세포의 확립 효율은 상술된 핵 재프로그래밍 물질에 더하여 상기 확립 효율 개선제를 치수 줄기 세포와 접촉시킴으로써 추가로 증진시킬 수 있음을 예상할 수 있다.

iPS 세포 확립 효율 개선제의 예에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 히스톤 데아세틸라아제 (HDAC) 저해제 [예를 들어, 발프로산 (VPA) (Nat . Biotechnol ., 26(7): 795-797 (2008)), 트리코스타틴 A, 나트륨 부티레이트, MC 1293, 및 M344와 같은 저분자 저해제, HDAC 에 대한 siRNA 및 shRNA 와 같은 핵산-기재 발현 저해제 (예, HDAC1 siRNA Smartpool^® (Millipore), HDAC1 에 대한 HuSH 29mer shRNA 구축물 (OriGene) 등),등], G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 저해제 [예를 들어, 저분자 저해제, 예컨대 BIX-01294 (Cell Stem Cell , 2: 525-528 (2008)), G9a 에 대한 siRNA 및 shRNA 와 같은 핵산-기재 발현 저해제 (예, G9a siRNA (인간) (Santa Cruz Biotechnology) 등) 등] 등이 포함된다. 핵산-기재 발현 저해제는 siRNA 또는 shRNA 를 인코딩하는 DNA 를 갖는 발현 벡터의 형태일 수 있다.

핵 재프로그래밍 물질의 상술된 성분 중에서, 예를 들어, SV40 large T 가 또한 iPS 세포 확립 효율 개선제 범위에 포함될 수도 있는데, 그 이유는 이것이 체세포의 핵 재프로그래밍에 본질적이지 않은 보조 인자이기 때문이다. 핵 재프로그래밍의 기작은 여전히 분명하지 않은 채 있지만, 핵 재프로그래밍에 필수적인 인자 이외의 보조 인자를 핵 재프로그래밍 물질로 간주할지, 또는 iPS 세포 확립 효율 개선제로 간주할지 여부는 중요하지 않다. 따라서, 체세포 핵 재프로그래밍 프로세스는, 핵 재프로그래밍 물질 및 iPS 세포 확립 효율 개선제의 체세포와의 접촉으로부터 생긴 총체적인 사건으로서 시각화되기 때문에, 당업자에게 있어서 그 둘을 구분하는 것이 언제나 필수적인 것처럼 보이는 것은 아니다.

iPS 세포 확립 효율 개선제의 치수 줄기 세포와의 접촉은, 개선제가 (a) 단백질성 인자, (b) 단백질성 인자를 인코딩하는 핵산, 또는 (c) 저분자 화합물 각각인 경우에, 핵 재프로그래밍 물질과 관련하여 상술된 방법과 동일한 방식으로 달성될 수 있다.

iPS 세포 확립 효율 개선제는, 치수 줄기 세포로부터 iPS 세포의 확립 효율이 개선재의 부재하에서 수득되는 수준과 비교할 때 상당히 개선되는 한, 핵 재프로그래밍 물질과 동시에 접촉될 수 있거나, 또는 미리 접촉될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 핵 재프로그래밍 물질이 단백질성 인자를 인코딩하는 핵산이고, iPS 세포 확립 효율 개선제가 화학적 저해제인 경우, 예를 들어 전자는 유전자 전달 처리와 단백질성 인자의 대량 발현 사이에 주어진 시간 차이가 수반되나, 후자는 신속하게 세포에 작용할 수 있어 유전자 전달 처리 후 주어진 시간 동안 세포를 배양한 후에 iPS 세포 확립 효율 개선제를 배지에 첨가할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 핵 재프로그래밍 물질 및 iPS 세포 확립 효율 개선제가 둘 다 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터의 형태로 사용되는 경우, 예를 들어 양자 모두는 세포에 동시에 도입될 수 있다.

치수 줄기 세포는 이의 배양에 적합한 당해 공지된 배지를 이용해 예비배양될 수 있다 (예를 들어, JP-T-HEI-11-506610, JP-T-2000-515023 참고; 예를 들어, 중간엽 줄기 세포 기본 배지 (Lonza), MesenPRO RS 배지 (GIBCO) 등이 시판중임). 치수 줄기 세포는 또한 5 내지 20% 우태아 혈청으로 보충한, 최소 기본 배지 (MEM), Dulbecco 변형 필수 배지 (DMEM), RPMI1640 배지, 199 배지 또는 F12 배지 등을 이용하여 예비-배양할 수 있다.

예를 들어, 양이온 리포솜과 같은 전달 시약을 핵 재프로그래밍 물질 (및 iPS 세포 확립 효율 개선제) 과의 접촉 달성에서 사용하는 경우에는, 전달 효율 감소를 막기 위해, 배지를 무혈청 배지로 사전에 대체하여 것이 종종 바람직하다. 핵 재프로그래밍 물질 (및 iPS 세포 확립 효율 개선제) 과의 접촉 후, 세포를 예를 들어 ES 세포 배양에 적합한 조건 하에서 배양할 수 있다. 인간 세포의 경우에는, 세포를, 분화 억제제로서 일반 배지에 첨가된 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 의 존재하에서 배양할 수 있다. 마우스 세포의 경우, 백혈병 저해 인자 (LIF) 를 bFGF 가 있음에도 불구하고 첨가하는 것이 바람직하다. 통상적으로, 세포는 공급자 세포로서 세포 분할을 종료하기 위한 조사 (radiation) 또는 항생제로 사전에 처리되어진 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 의 존재하에서 배양된다. STO 세포 등을 MEF 로 통상 사용하는 경우, SNL 세포 (McMahon, A.P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) 등이 iPS 세포 유도에 통상적으로 사용된다.

iPS 세포의 후보 콜로니를 선택하는 두 가지 접근법이 존재한다: 지시계(들)로서 약물 저항 및/또는 리포터 활성을 이용 및 현미경으로 형태 조사. 전자의 접근법에서, 예를 들어, 약물 내성 및/또는 리포터 활성에 대해 양성인 콜로니를, 재조합 치수 줄기 세포를 이용해 선택하는데, 이때 약물 내성 유전자 및/또는 리포터 유전자가 다능성 세포에서 특이적으로 고발현된 유전자의 유전자 자리에 타겟팅되어진다 (예를 들어, Fbx15, Nanog, Oct3/4 등, 바람직하게는 Nanog 또는 Oct3/4). 한편, 현미경으로의 형태 조사 방법에는, 예를 들어, [Takahashi 등의 Cell , 131, 861-872 (2007)] 에 기술된 방법이 포함된다. 리포터 세포를 이용하는 방법이 편리하고 유효하나, 현미경 조사에 의한 콜로니 선택이, iPS 세포를 인간 치료 목적으로 제조하는 경우에 안전성 면에서 바람직하다. 3 가지 인자 Oct3/4, Klf4 및 Sox2 이 핵 재프로그래밍 물질로서 사용될 때, 확립된 클론의 개수는 감소하나, 수득한 콜로니는 대부분, ES 세포의 질만큼 고품질인 iPS 세포이다.; 따라서, 심지어는 리포터 세포 없이도 iPS 세포를 효율적으로 확립하는 것이 가능하다. 특히, 본 발명은 3 가지 인자의 전달로써 iPS 세포의 확립 효율을 상당하게 개선하는데 유효하므로, 현미경으로의 형태 조사로써, 충분한 효율로 iPS 세포의 후보 콜로니를 선택하는 것이 가능해진다.

iPS 세포로서 선택된 콜로니의 세포의 동정은 각종의 당해 공지된 시험 방법, 예를 들어, 하기 실시예에 기술된 ES-세포-특이적 유전자 발현 분석 등으로 확인될 수 있다. 더 큰 정확성을 요구하는 경우에는, 선택된 세포를 마우스에 이식시켜 기형종 형성을 조사할 수 있다.

이에 따라 확립된 iPS 세포는 광범위한 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, ES 세포에 대해 보고된 분화 유도 방법을 통해, iPS 세포를 광범위한 종류의 세포 (예, 심근 세포, 망막 세포, 혈액 세포, 신경 세포, 혈관내피 세포, 인슐린 분비 세포 등), 조직 및 기관으로의 분화를 유도할 수 있다.

치수 줄기 세포는 교정 수술을 통해 추출된 치아/사랑니, 치아우식증, 치주병, 사랑니 치주염 등으로 인해 추출된 치아/사랑니 등으로부터 제조될 수 있기 때문에, 많은 사람들로부터 치수 줄기 세포를 용이하게 수집가능하다 (치수 줄기 세포 은행이 현재 이용가능함). 따라서, 본 발명의 치수 줄기 세포는 (1) 개별 인간들의 iPS 세포 또는 (2) 다중 HLA 항원 유형에 상응하는 iPS 세포를 제조하기 위한 공급원으로서 매우 유효하게 사용될 수 있다.

환자에게 세포 또는 조직의 이식이 긴급하게 요구되면, 환자의 체세포로부터 iPS 세포를 제조하여 이를 분화하게 하는 것은 질병 발병 후에 종종 소용없다. 상기 경우의 대비로, (1) 미리 개인의 체세포 또는 이로부터 분화된 세포 또는 조직으로부터 iPS 세포의 은행 제조, 또는 (2) 미리 각 HLA 항원 유형에 대해서 iPS 세포, 또는 이들로부터 분화된 세포 또는 조직의 은행을 제조함으로써, 상술된 문제점을 해결할 수 있어 비상사태에서도 이식을 할 수 있다. 본 발명의 치수 줄기 세포는 또한 맞춤제작의 재생 의학 또는 반맞춤 제작의 재생 의학 등에서 유효하게 사용될 수 있다.

더욱이, iPS 세포로부터 분화된 기능성 세포 (예, 간세포) 는, 기능성 세포의 실제 상태를 해당 기존 세포주가 하는 것보다 생체 내에서 더 잘 반영하는 것으로 여겨지기 때문에, 이들은 또한 약학적 후보 화합물 등의 유효성 및 독성에 대한 시험관 내 스크리닝에 적절히 사용될 수도 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예를 통해 더 상세히 설명하나, 본 발명이 이들로 제한되지는 않는다.

실시예

실시예 1: 인간 치수 줄기 세포로부터 iPS 세포의 확립 (1)

실험 절차

치수 줄기 세포를, 12 세 내지 24 세의 인간에서 추출된 치아로부터 제조했다 (DP28, DP31, DP47, DP54, DP75, DP87). 구체적으로, 치과교정 환자, 또는 사랑니 치주염을 앓는 환자로부터 추출된 각 사랑니에서 치수 조직을 제거하고, 안과 Cooper 가위를 이용해 이 조직을 약 1 내지 2 mm 로 조각내고, 이 후 조직 조각을 콜라게나아제 유형 I (1 mg/ml) 으로 37℃ 에서 0.5 내지 1 시간 동안 처리하였다. 이것을 중간엽 줄기 세포 기본 배지 (Lonza 에서 생산) 에서 배양하여, 치수 줄기 세포의 세포주를 확립했다. 대조군으로, 36세의 성인 인간 피부 섬유모세포 (HDF) 도 또한 준비했다. 문헌 [Cell, 131, 861-872 (2007)] 에 지시된 바와 같이 렌티바이러스를 이용해, 이들 세포가 마우스 에코트로픽 (ecotrophic) 바이러스 수용체 Slc7a1 유전자를 발현하게 하였다.

4 가지 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 또는 3 가지 (Oct3/4, Sox2, Klf4) 인간-유래 인자를 상기 세포 (8 x 10⁵ 개의 세포) 로, 문헌 [Cell , 131, 861-872 (2007)] 에 기술된 방법에 의해 레트로바이러스를 통해 도입하였다. 바이러스 감염 이후 6 일 째에, 세포를 회수하고, 공급자 세포 (5 x 10⁴ 또는 5 x 10⁵ 세포/100 mm 접시) 에 다시 심었다. 사용된 공급자 세포는, 사전에 미토마이신 C 로 처리하여 이의 세포 분할이 종료된 SNL 세포 (McMahon, A.P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) 였다. 다음날, 세포를 4 ng/ml 재조합 인간 bFGF (WAKO) 로 보충된 영장류 ES 세포 배양을 위한 배지 (ReproCELL) 로 옮겨 배양했다.

4 가지 인자를 혼입한 세포에 대해서, 레트로바이러스 감염 후 21 일째에 나타난 콜로니를 계수하였다. 콜로니의 형태를 평가하고 두 유형으로 계수하였다: ES-유사 세포 (iPS 세포) 및 비(非) ES-유사 세포 (비(非)-iPS 세포). 결과를 표 1 및 도 1 에 나타낸다 (도 1 은 표 1 의 그래프 표현임).

[표 1]

4 가지 인자를 혼입한 치수 줄기 세포의 6 개의 세포주 중 5 개에서, 피부 섬유모세포와 비교시, ES-유사 콜로니는 세포 계수가 5 x 10⁵ 세포인 경우에는 2 내지 8 배 더 큰 효율로 수득되었고, 세포 계수가 5 x 10⁴ 세포인 경우에는 5 내지 80 배 더 큰 효율로 수득되었다 (표 1, 도 1 에서 오른쪽 패널).

3 가지 인자를 혼입한 세포에 있어서, 레트로바이러스 감염 후 26 일째에 나타난 콜로니를 계수했다. 3 가지 인자를 혼입한 피부 섬유모세포에 있어서, 어떠한 콜로니도 26 일째에 관찰되지 않았으나, 치수 줄기 세포의 6 세포주 중 5 개의 세포주에 있어서는, 2 내지 19 개의 ES-유사 콜로니 (5 x 10⁴ 개의 세포) 또는 46 내지 176 개의 ES-유사 콜로니 (5 x 10⁵ 개의 세포) 를 수득했다 (표 1, 도 1 의 왼쪽 패널).

치수 줄기 세포로부터 확립된 iPS 세포는 피부 세포로부터 확립된 것과 같이, 인간 ES 세포의 것과 닮은 형태를 보이고, 공급자 세포 상에서 연속해서 증식할 수 있었다.

Rever Tra Ace 키트 (Takara) 를 이용하는 RT-PCR 분석은, DP31 및 DP75 로부터 확립된 ES-유사 콜로니가 인간 ES 세포 특이적 마커 유전자 Oct3/4, Sox2, 및 Nanog 를 발현하고, 이의 발현 양이 이전에 확립된 인간 ES 세포 및 피부 iPS 세포 (201B6) 로 수득된 것과 동등했음을 보였다 (도 2). 이 결과로 치수 줄기 세포로부터 확립된 세포를 iPS 세포로 동정하였다.

실시예 2: 인간 치수 줄기 세포로부터의 iPS 세포의 확립 (2)

실험 절차

4 또는 3 가지 인자를 실시에 1 과 동일한 방식으로 동일한 치수 줄기 세포에 도입함으로써, iPS 세포를 확립했다.

4 가지 인자를 혼입한 세포에 있어서, ES-유사 콜로니를 레트로바이러스 감염 후 각 세포주에 대해서 채집할 수 있을 때, 나타난 콜로니를 계수하였다. 콜로니를 형태학적으로 평가하고 두 유형으로 계수했다: ES-유사 세포 (iPS 세포) 및 비 ES-유사 세포 (비-iPS 세포). 결과를 도 3 에 나타낸다.

4 가지 인자를 혼입한 치수 줄기 세포 6 개의 세포주 중 5 개에서, HDF 와 비교시, ES-유사 콜로니는 세포 계수가 5 x 10⁵ 세포인 경우 2 내지 19 배 더 큰 효율로 수득되었고, 세포 계수가 5 x 10⁴ 세포인 경우에는 3 내지 9 배 더 큰 효율로 수득되었다 (도 3B).

3 가지 인자를 혼입한 세포에 있어서, 치수 줄기 세포의 6 개의 세포주 중 5 개에서, HDF 와 비교시, ES-유사 콜로니는 세포 계수가 5 x 10⁵ 세포인 경우 2 내지 10 배 더 큰 효율로 수득되었고, 세포 계수가 5 x 10⁴ 세포인 경우, HDF 와 함께 어떠한 ES-유사 콜로니도 나타나지 않았다. 대조적으로, 치수 줄기 세포의 6 가지 세포주 모두에서, ES-유사 콜로니가 생산되었는데, 일부 세포주에서는 무려 거의 200 개의 콜로니가 생산되었다 (도 3A).

DP47 로부터 확립된 ES-유사 콜로니를, 면역 염색에 의한 ES 세포 마커 Nanog 및 Oct3/4 의 발현에 관해서 검사하였다. 사용된 항체들은 R&D Systems 에서 제조하는 항-Nanog 및 Santa Cruz Biotechnology 에서 제조하는 항-Oct3/4 였다. 그 결과, 두 인자의 발현을 확인했다 (도 4). 확립된 콜로니는 알칼리 포스포타아제 활성에 대해 양성 판정되었다 (도 4). 이 결과로, 치수 줄기 세포로부터 확립된 세포를 iPS 세포로서 동정하였다.

실시예 3: iPS 세포에서 줄기 세포 마커 발현

실험 절차

실시예 1 에서 수득한 iPS 세포를 미토마이신 C-처리된 SNL 공급자 상에 놓고, 5 일 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 5% 정상 염소 혈청, 1% BSA 및 0.2% TritonX-100 를 함유한 PBS 로 침투 및 차단하였다. 줄기 세포 마커 (SSEA1, SSEA3, TRA-1-81, NANOG) 의 발현을 면역세포화학으로 검사했다. 1 차 항체로서, 항-SSEA1 (1:100, Developmental Studies Hybridoma Bank of Iowa University), 항-SSEA3 (1:100, Dr. Peter Andrews 의 선물), TRA-1-81 (1:100, Dr. Peter Andrews 의 선물) 및 항-NANOG (1:20, R&D systems) 를 사용했다. 사용된 2 차 항체는 하기와 같았다: Alexa 488-표지된 항-마우스 IgM (1:500, Invitrogen), Cy3-표지된 항-래트 IgM (1:500, Jackson Immunoresearch) 및 Alexa-546-표지된 항-염소 IgG (1:500, Invitrogen). 핵을 Hoechst 33342 (Invitrogen) 로 염색했다. 결과를 도 5 에 나타낸다. 분석된 iPS 클론 모두는 SSEA3, TRA-1-81 및 NANOG 단백질을 발현했다. 대조적으로, 일부 콜로니의 모서리에서 양성 세포가 관찰되었으나, 세포 대부분은 항-SSEA1 항체로 염색되지 않았다. 인간 ES 세포 및 iPS 세포의 유사 발현 패턴이 이전에 보고되었다. 이들 데이타는 인간 치수 줄기 세포로부터 유래된 iPS 세포도 또한 미분화된 ES 세포 마커 발현에서 ES 세포와 필적한다는 점을 시사하였다.

실시예 4: 인간 치수 줄기 세포로부터 유래된 iPS 세포의 다능성

실험 절차

이어서, 본 발명자들은 이들 iPS 세포가 시험관 내 분화에 의한 다능성인지 여부를 확인했다. 배아체를 형성하기 위해, 세포를 수확하고 폴리-히드록시에틸 메타크릴레이트 (HEMA)-코팅된 접시로 옮기고 8 일 동안 인큐베이션하였다. 부유 배양 (floating culture) 후, 형성된 배아체를 젤라틴-코팅된 플레이트에 두고 추가 8 일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 4% 포름알데히드로 고정하고, 5% 정상 염소 혈청, 1% BSA 및 0.2% TritonX-100 를 함유하는 PBS 로 침투 및 차단하였다. 분화 마커 (βIII-튜블린, α-SMA, AFP) 의 발현을 면역세포화학으로 검사하였다. 1 차 항체로서, 항-βIII-튜블린 (1:100, Chemicon), 항-α-민무늬근육 액틴 (α-SMA) (1:500, DAKO) 및 항-α-태아단백질 (AFP) (1:100, R&D systems) 을 사용하였다. Cy3-표지된 항-마우스 IgG (1:500, Chemicon) 를 2 차 항체로서 사용했다. 핵을 Hoechst 33342 (Invitrogen) 로 염색했다. 결과를 도 6 에 나타낸다. 부유 배양 후 8 일째에, iPS 세포는 배아체를 형성했다 (도 6A). 젤라틴-코팅된 플레이트 상에 인큐베이션 후, 세포는 각종 세포 유형으로 형태적으로 변했다. 면역세포화학은, iPS 세포가 3 가지의 배아 층, 예컨대 외배엽 (βIII-튜블린), 중배엽 (α-SMA) 및 내배엽 (AFP) 으로 분화되었음을 보였다 (도 6B). 분화 가능성에서의 어떠한 유의한 차이도 iPS 클론들 간에 발견되지 않았다.

실시예 5; 기형종 형성

실험 절차

본 발명자들은 기형종 형성 어세이를 통해 iPS 세포의 다능성을 추가로 분석했다. 세포를 1 시간 동안 10 μM Y-27632 (Wako) 로 처리한 다음 수확하였다. 세포를 10 μM Y-27632 로 보충된 DMEM/F12 중 약 1 x 10⁷ 세포/ml 로 현탁했다. 30 ㎕ 의 세포 현탁액을, Hamilton 주사기를 이용하여 Severe Combined Immunodeficiency (SCID; 중증복합 면역결핍증) 시험 마우스 (Charles River) 에 주입했다. 주입 후 2 또는 3 개월 후에, 기형종을 절개하고 10% 포르말린 함유 PBS 로 고정했다. 파라핀-내포 샘플을 썰고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다. 결과를 도 7 에 나타낸다. 기형종은, 지방 조직, 신경 조직, 창자-유사 조직, 연골 조직 및 신경관-유사 조직을 비롯하는 복수의 세포 유형을 포함하였는데, 이는 iPS 세포의 다능성을 입증하였다.

본 발명이 바람직한 구현예를 강조하면서 기술하였으나, 당업자가 이 바람직한 구현예를 변형할 수 있음은 분명하다. 본 발명이 본 명세서에서 상세하게 기술된 방법 이외의 방법에 의해 구현될 수 있도록 본 발명은 의도한다. 따라서, 본 발명은 첨부된 "청구항" 의 요지 및 영역에 포함된 모든 변형을 포괄한다.

특허 및 특허 출원을 비롯하여 본원에서 인용된 임의의 간행물에 개시된 내용은 본원에 개시된 정도로 그 전문이 본원에서 참조 인용된다.

Claims

핵 재프로그래밍 물질을 인간 치수 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 유도된 다능성 줄기 세포의 생산 방법으로서, 상기 핵 재프로그래밍 물질이 Oct3/4 및 Sox2, 또는 이들을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 인간 치수 줄기 세포가 12 세 내지 20 세의 인간으로부터 얻은 사랑니로부터 유래된 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 핵 재프로그래밍 물질이 Oct3/4, Klf4 및 Sox2, 또는 이들을 인코딩하는 핵산인 방법.
제 1 항에 있어서, 핵 재프로그래밍 물질이 Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc, 또는 이들을 인코딩하는 핵산인 방법.
유도된 다능성 줄기 세포를 생산하기 위한 체세포 공급원으로서 인간 치수 줄기 세포를 사용하는 방법으로서, 상기 인간 치수 줄기 세포가 12 세 내지 20 세의 인간으로부터 얻은 사랑니로부터 유래된 것인 방법.
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