JP2011177140A - 幹細胞培養用の無血清培地 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、インスリントランスフェリン亜セレン酸塩と、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞由来の胚栄養因子とを含んでなる、無血清培地を提供する。
【選択図】図3
Description
したがって、本発明は、幹細胞の効率的かつ安定な培養および増殖に用いうる新規な無血清培地の提供をその目的とする。
また、胚栄養因子は、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞の培養培地を採取し、そのまま後述する基礎培地中に添加することもでき、本発明にはかかる態様も包含される。
また、インスリントランスフェリン亜セレン酸塩の添加量は、その乾燥質量を基準として、好ましくは無血清培地の0.1〜5%(w/v) であり、より好ましくは1%(w/v)である。
また、本発明の無血清培地における、インスリントランスフェリン亜セレン酸塩と、前記胚栄養因子との質量比は、乾燥質量を基準として、好ましくは1000:1〜10:1であり、より好ましくは100:1である。
また、幹細胞の培養期間は、特に限定されないが、例えば、3〜7日間とすることができる。
また、以下の実験は、日本歯科大学研究倫理委員会の審理および承認を得て行われた。また、乳歯および智歯(いずれも上歯)は、被験者の承認の下で、以下の実験に用いられた。また、以下の実験結果は、5回の独立試験の結果を平均± SDで示している。また、統計解析手法は、one-way analysis of variance (ANOVA) およびBonferroni Multiple Comparison testを用い、有意差は* p < 0,05; ** p < 0,001; *** p <0,0005で示している。
胚栄養因子(ETF)の取得
胚栄養因子(ETF)は、HUMAN CELL 13(4):185-195, 2000 (pressed by Japan human cell society)に記載の方法に準じて以下のようにして取得した。
まず、ヒト子宮頸部扁平上皮癌由来のSKG-II-SF細胞を、ハムF12培地中、37℃にて3〜7日培養して培養液を得、この培養液を凍結乾燥し、得られた物質を生理食塩水で4℃で3日間透析した。次に、透析液を回収後に凍結乾燥し、得られた粉末を回収し、ETFを得た。ETFの組成は、表1に示される通りであった。
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) (Invitrogen(商標)、Eugene、USA)に、1% ITS-X (Invitrogen(商標)、 Eugene、USA) および 100 μg/ml のETF)を補足し、無血清培地を得た。
DMEMに、1% ITS-Xを補足し、無血清培地を得た。
参考例2:無血清培地
DMEMに、100 μg/ml のETFを補足し、無血清培地を得た。
参考例3:無血清培地
DMEMに、 100 μg/ml ETF、1mM ピルビン酸ナトリウム (Invitrogen(商標)、Eugene、USA)、25μg/ml アスコルビン酸 (和光純薬工業(株)、大阪、日本) および4ng/ml FGF-a (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA)を補足し、無血清培地を得た。
ポジティブコントロール:血清培地
DMEMに10% FBS(Hyclone、Utah、USA) を補足し、ポジティブコントロールとして血清培地を得た。
乳歯歯髄(DTPC)および智歯歯髄(WTPC)の単離
乳歯歯髄細胞(DTPC)を、吸収を起こした歯根管を通じて、滅菌した抜髄針を用いて得た。
また、智歯表面を洗浄し、滅菌したデンタル・フィッシャーバー(dental fissure burs)を用いてそのセメント-エナメル境界周囲部を切断して智歯の髄室を開いた。次に、智歯歯髄細胞(WTPC)を、抜髄針を用いて歯冠および歯根から採取した。
上記歯髄は、3 mg/ml コラーゲンI 型(和光純薬工業(株)、大阪、日本) 溶液中で、37°Cにて 1時間インキュベートした。次に、得られた細胞懸濁液を、25 cm2 フラスコ (TPP(商標)、トラサディンゲン(Trasadingen)、スイス) 中において、 10% FCS (HyClone, Road Logan, USA), 100U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンおよび0.25μg/ml アンホテリシン (Invitrogen, Eugene, USA)を補足した ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) (Invitrogen(商標)、 Eugene、USA)で培養した。4〜10代継代培養のDTPCまたはWTPCを1 × 105 細胞個/ 25 cm2 フラスコの濃度に調製して以下の実験に用いた。
増殖細胞におけるDNA合成中のBrdU取り込み量を指標とした細胞増殖率(%;ポジティブコントロール比)を以下の手法により測定した。
まず、単離したDTPCまたはWTPCの単核細胞(1 × 104 細胞/ウェル)を、96ウェルプレート (Iwaki, Tokyo, Japan)に播種し、48時間37℃にてインキュベートし、BrdU ラベリング溶液 (Cell Proliferation ELISA BrdU, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)でラベリングを行った。次に、マイクロプレートリーダー (Bio-Rad Benchmark Plus、Bio-Rad Japan、東京、日本)を用いて、 データの取得および分析を行った。
実施例1の細胞増殖率は参考例1〜3と比較して有意に高い値を示し、実施例1の細胞増殖率の平均値は、参考例1〜3の1.5〜1.7倍であった。
実施例1の細胞増殖率は参考例1〜3と比較して有意に高い値を示し、実施例1の細胞増殖率の平均値は、参考例1〜3の1.5〜1.6倍であった。
DTPCまたはWTPCを 1 x 104細胞/ウェルの濃度で4-チャンバースライド(Nalge Nunc Int., Naperville, USA)に配置した。次に、DTPCまたはWTPCを4% パラホルムアルデヒドで固定し、それら細胞における幹細胞マーカー、CD44H、ネスチン、サイトケラチン19(CK19)、およびP63 の発現を、免疫蛍光染色により検出した。ここで、CD44Hは、間葉系幹細胞のタイプを同定する指標となる1型膜貫通糖蛋白質であり、ネスチンは、中枢神経系(CNS)の幹細胞の有するクラスVI中間径フィラメント蛋白質であり、CK19は島細胞および導管細胞の前駆細胞である内胚葉細胞の特異的マーカー蛋白質であり、P63は上皮幹細胞における転写因子である。
また、核染色にはSYBR Green 1 (Trevigen)は用いた。
Claims (15)
- インスリントランスフェリン亜セレン酸塩、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞由来の胚栄養因子、および基礎培地を含んでなる、無血清培地。
- 前記胚栄養因子が、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞の培養培地から得られる、請求項1に記載の無血清培地。
- 前記胚栄養因子が、1L-1β、1L-6、1L-8、1L-10、1L-12、EGF、IGF、GH、PDGF-AB、IGF-BP-3、FGF-BASIC、VEGFおよびLIFを含んでなる、請求項1に記載の無血清培地。
- 前記胚栄養因子が、1L-1α、1L-1β、1L-2、1L-3、1L-4、1L-5、1L-6、1L-8、1L-10、1L-12、EGF、TNF-α、TGF-α、IGF、GH、PDGF-AB、IGF-BP-3、FGF-BASIC、VEGFおよびLIFを含んでなる、請求項1に記載の無血清培地。
- 前記培養培地が、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞を36〜38℃で培養した培地である、請求項3に記載の無血清培地。
- 前記培養が3〜5日間行われる、請求項5に記載の無血清培地。
- 前記基礎培地がダルベッコ改変イーグル培地である、請求項1に記載の無血清培地。
- 前記インスリントランスフェリン亜セレン酸塩の添加量が、前記無血清培地の0.1〜5%(w/v)である、請求項1に記載の無血清培地。
- 前記胚栄養因子の添加量が、前記無血清培地の0.001〜 0.1%(w/v)である、請求項1に記載の無血清培地。
- 前記インスリントランスフェリン亜セレン酸塩と、前記胚栄養因子との質量比が、1000:1〜10:1である、請求項1に記載の無血清培地。
- 幹細胞の培養に用いられる、請求項1に記載の無血清培地。
- 前記幹細胞が歯髄由来細胞である、請求項11に記載の無血清培地。
- 前記幹細胞がヒト細胞である、請求項11に記載の幹細胞。
- インスリントランスフェリン亜セレン酸塩、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞由来の胚栄養因子および基礎培地を含んでなる無血清培地中で、幹細胞を培養することを含んでなる、幹細胞の培養方法。
- 前記培養が36〜38℃で行われる、請求項14に記載の方法。
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