JP2015509381A - 多能性幹細胞の増殖及び維持のための明確な培地 - Google Patents
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Abstract
本発明は、明確な培地中の未分化多能性幹細胞の増殖を促進するための方法を提供する。とりわけ、本発明は、多能性幹細胞の培養、維持、及び増殖のための明確な細胞培養処方を提供し、明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することにより、少なくとも１０継代、細胞の多能性及び核型安定性が維持される。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＦＯＸＡ２を発現する明確な培地条件下で増殖した細胞集団が更に開示される。
Description
（関連出願の相互参照）
本明細書は、全ての目的のために、その全てが参考文献によって本明細書に組み込まれている、２０１２年３月７日に出願された、米国特許仮出願明細書第６１／６０７，７０６号の優先権を主張する。
本明細書は、全ての目的のために、その全てが参考文献によって本明細書に組み込まれている、２０１２年３月７日に出願された、米国特許仮出願明細書第６１／６０７，７０６号の優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、明確な培地条件下、多能性幹細胞の増殖及び維持の領域に関する。
本発明は、明確な培地条件下、多能性幹細胞の増殖及び維持の領域に関する。
未分化多能性幹細胞の増殖には伝統的に、多能性マーカーの接着、増殖及び維持を支持するのに十分な因子を提供する、「フィーダー」細胞が使用されてきた。ヒト胚性幹細胞の発生と培養のための初期の方法は、マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞の利用が必要であった。続く技術は、「条件培地」の利用と、フィーダー細胞を置換するための細胞外マトリックスコーティングの利用を包含した。条件培地は、ＭＥＦのような、フィーダー細胞によって改変された培地である。しかしながら、両方の方法は、多能性幹細胞の増殖を連続的に支持するために、条件培地又はフィーダー細胞のバッチにおいて矛盾が生じる。更に、両方のシステムは、異なる多能性幹細胞において異なって働きうる、未定義因子を提供する。したがって、多能性幹細胞の連続した増殖を支持する明確、安価、再生可能な培養培地の確立が、再生医療領域において、大きな関心が持たれている。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）の明確な特徴は、細胞が、様々な系統に分化する傾向を有することである。この望まれない分化は、望む特定の細胞型を続いて産出するために要求される均一で指向された分化を妨害しうる。事実、フィーダー細胞及び条件培地培養は、典型的に、特に増殖しているＥＳ細胞コロニーのエッジ周辺、又はコロニーの中心にて、あるレベルの望まない分化をもたらす。
最近の努力により、結果として、培地中のノックアウト血清交換（ＫＳＲ）のような、置換培養条件のホストによる、フィーダー細胞又は条件培地の置換がもたらされている（２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１８５〜１８９）。ＫＳＲは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の粗製の未定義画分を含む。他は、ＦＧＦ２、アクチビンＡ、及びインスリンを含む化学的に明確な培地中で多能性の長期間維持を示している（Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１８：４４９５〜４５０９）。ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を含む市販されている培地処方がまた、ヒト多能性幹細胞を維持及び増殖させるために既に使用されている。明確な培地の開発に焦点をあてた更なる先行技術としては、米国特許第７４４９３３４号、第７４４２５４８号、第７００５２５２号、第２００８／０２６８５３４号、第７４１０７９８号、第７２９７５３９号、及び第６８００４８０号が挙げられる。更に、最近の発行物は、明確な培地中でさえ、ＥＳ細胞の増殖を実際に遅くするか、それらの多能性状態を減少させうる不必要な試薬が存在することを強調して、８つの成分に対するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を更に精製した（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１，８：４２４〜４２４）。精製されたｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地は、ＮａＨＣＯ3によって調整したｐＨを有する、インスリン、セレン、トランスフェリン、アスコルビン酸、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、及びＴＧＦβ又はノーダルを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地からなる。
したがって、最小数の添加成分を有する一方で、多能性細胞の増殖に関して一貫性を提供する完全に明確な培地条件に対する必要性がいまだ存在することが明白である。
本発明は、多能性幹細胞の培養、維持、及び増殖のための明確な細胞培養処方を提供し、明確な細胞培養処方は、基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びアスコルビン酸を含み、明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、幹細胞の多能性及び核型安定性が維持される。本発明のいくつかの実施形態において、細胞培養処方は更に、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）を含む。本発明のいくつかの実施形態において、細胞培養処方は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む。
本発明は、多能性幹細胞の培養、維持、及び増殖のための、明確な細胞培養処方を提供し、明確な細胞培養処方は、基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、アスコルビン酸、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペピチドを含み、明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、幹細胞の多能性及び核型安定性が維持される。本発明のいくつかの実施形態において、細胞培養処方は、ＭＣＤＢ−１３１を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、ＩＴＳ−Ｘは、本発明の明確な細胞培養処方のために、インスリン、トランスフェリン、及びセレンを供給する。本発明のいくつかの実施形態において、ＩＴＳ−Ｘは、約０．５％〜約２％存在する。本発明のいくつかの実施形態において、ＩＴＳ−Ｘは約１％存在する。本発明のいくつかの実施形態において、脂肪酸を含まないアルブミンは、試薬グレードである。本発明のいくつかの実施形態において、試薬グレード脂肪酸を含まないＢＳＡは、約０．２％〜約２．５％存在する。本発明のいくつかの実施形態において、試薬グレード脂肪酸を含まないＢＳＡは、約２％存在する。
いくつかの実施形態において、本発明の明確な細胞培養処方中ＴＧＦ−βリガンドは、ＴＧＦ−β１である。本発明のいくつかの実施形態において、ＴＧＦ−β１は、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ存在する。本発明のいくつかの実施形態において、ＴＧＦ−β１は約１ｎｇ／ｍＬ存在する。
本発明のいくつかの実施形態において、ｂＦＧＦは、細胞培養処方中、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ存在する。本発明のいくつかの実施形態において、ｂＦＧＦは、明確な細胞培養処方中、約５０ｎｇ／ｍＬにて存在する。本発明のいくつかの実施形態において、ｂＦＧＦは、明確な細胞培養処方中、約１００ｎｇ／ｍＬにて存在する。
本発明のいくつかの実施形態において、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ存在する。本発明のいくつかの実施形態において、ＩＧＦ−１は、明確な細胞培養処方中、約２０ｎｇ／ｍＬにて存在する。
本発明のいくつかの実施形態において、アスコルビン酸は、明確な細胞培養処方中、約０．２ｍＭ〜約０．３ｍＭ存在する。本発明のいくつかの実施形態において、アスコルビン酸は、明確な細胞培養処方中、約０．２５ｍＭにて存在する。
１つの実施形態において、本発明は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、（インスリン、トランスフェリン、及びセレンを供給するために）ＩＴＳ−Ｘ、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−１）、及びアスコルビン酸から本質的になる明確な細胞培養処方に関する。
１つの実施形態において、本発明は、ＭＣＤＢ−１３１、（インスリン、トランスフェリン、及びセレンの供給源として）ＩＴＳ−Ｘ、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、アスコルビン酸、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドから本質的になる明確な細胞培養処方に関する。
１つの実施形態において、本発明は、ヒト多能性幹細胞の増殖のための方法に関し、本方法には、ヒト多能性幹細胞を、明確な細胞培養処方中、フィーダーを含まないマトリックス上で培養することを含み、明確な細胞培養処方は、基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びアスコルビン酸を含み、明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、細胞の多能性と核型安定性が維持される。いくつかの実施形態において、明確な細胞培養処方は更に、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養処方は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む。
１つの実施形態において、本発明は、ヒト多能性幹細胞の増殖のための方法に関し、本方法は、ヒト多能性幹細胞を、明確な細胞培養処方中、フィーダーを含まないマトリックス上で培養することを含み、明確な細胞培養処方は、基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、アスコルビン酸、ＩＧＦ−１、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞の増殖のための方法で使用される細胞培養処方は、ＭＣＤＢ−１３１を含む。
本発明の実施形態は、５０％より大きい細胞集団が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＦＯＸＡ２のタンパク質発現に対して陽性であり、ＳＳＥＡ−４及びＺＦＰ４２のタンパク質発現が陰性又は低い、インビトロ細胞集団である。集団は、ＩＧＦ−１、インスリン、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−Ｂリガンド、及び脂肪酸を含まないアルブミンを補った基本培地を含む、明確な細胞培養処方中で多機能性幹細胞を培養することによって得られ、明確な細胞培養処方はアスコルビン酸を含まない。
本発明のいくつかの実施形態において、明確な細胞培養処方は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地を含む。本発明のいくつかの実施形態において、細胞培養処方は、ＩＴＳ−Ｘのようなインスリンを含む。本発明のいくつかの実施形態において、ＩＴＳ−Ｘは、約０．５％〜約２％存在する。本発明のいくつかの態様において、ＩＴＳ−Ｘは、約１％にて存在する。本発明のいくつかの実施形態において、脂肪酸を含まないアルブミンは、試薬グレードである。本発明のいくつかの態様において、試薬グレード脂肪酸を含まないアルブミンは、約０．２％〜約２．５％存在する。本発明のいくつかの実施形態において、試薬グレード脂肪酸を含まないアルブミンは、約２％にて存在する。本発明のいくつかの態様において、ＴＧＦ−Ｂリガンドは、ＴＧＦ−Ｂ１である。本発明のいくつかの実施形態において、ＴＧＦ−Ｂ１は、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ存在する。本発明のいくつかの態様において、ＴＧＦ−Ｂ１は、約１ｎｇ／ｍＬにて存在する。
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を、説明又は例示する下記の小項目に分割する。
定義
幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉層の組織を生じ、胚盤胞への注入後、すべてではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉層の組織を生じ、胚盤胞への注入後、すべてではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
幹細胞は、（１）全ての胚性及び胚外性細胞型が惹起されうることを意味する、全能性、（２）全ての胚性細胞型が惹起されうることを意味する多機能性、（３）細胞系統の一サブセットが惹起されうるが、すべて特定の組織、器官又は生理学的システム内であることを意味する、多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞制限寡能性前駆細胞を含む前駆細胞、血液の正常の成分である、すべての細胞型及び要素（例えば血小板）を産出可能である。）、（４）多能性幹細胞よりもより制限された細胞系統サブセットを惹起可能であることを意味する、寡能性、及び（５）単一の細胞系統（例えば精子形成幹細胞）が惹起されうることを意味する、単分化能性、として、それらの発生潜在力によって分類される。
分化は、専門化されていない（「中立の」）又は比較的専門化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でより専門化された（「分化決定された」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系統は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。ある細胞の系統とは、所定の発生及び分化の遺伝体系内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。
本明細書で言うところの「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
「基本培地」は、培養中、多能性幹細胞の増殖を支持可能である、塩、栄養素、及びビタミンの溶液を意味する。基本培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＣＤＢ培地、ＲＰＭＩなどから選択されてよい。ＤＭＥＭはまた、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭ−Ｆ１２とも呼ばれる）、又はＤＭＥＭ−高グルコース（ＤＭＥＭ−ｈｇとも呼ばれる）であってもよい。ＭＣＤＢ培地は、入手可能な任意のＭＣＤＢ培地、具体的にＭＣＤＢ−１３１から選択されてよい。あるいは、基本培地は、胚性幹細胞の多能性の増殖及び維持を許容するために、適切な比にて、上記した基本培地処方を混合することによって選択されてよい。いくつかの実施形態において、本発明の明確な細胞培養処方中の基本培地は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２である。いくつかの実施形態において、本発明の細胞培養処方中の基本培地は、ＭＣＤＢ−１３１である。
「フィーダー細胞」は、その上に多能性幹細胞が蒔かれる、非多能性幹細胞を意味する。フィーダー細胞は、多能性幹細胞による接着、増殖、及び多能性マーカーの維持に対して支持するための、十分に可溶性及び不溶性の因子を提供する。
「条件培地」は、フィーダー細胞から由来した可溶性因子を更に補った培地を意味する。
「細胞外マトリックス」又は「明確なマトリックス」又は「合成マトリックス」は、多能性幹細胞による多能性マーカーの接着、増殖、及び維持のために提供可能な、１つ以上の基質を意味する。インスリン様増殖因子１を意味する「ＩＧＦ」及び「ＩＧＦ−１」は本明細書で互換的に使用される。ヒトにおいて、本タンパク質は、肝臓によって作製され、ヒト成長ホルモンに寄与するもののほとんどに関与する。
本明細書で使用するところの、「ＦＧＦ２」及び「ｂＦＧＦ」は、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子を同定するために、互換的に使用される。
「ＴＧＦベータ」、「ＴＧＦ−Ｂ」、及び「ＴＧＦ−β」は、本明細書で互換的に使用される。ＴＧＦ−βリガンドは、骨形態形成蛋白（ＢＭＰｓ）、増殖分化因子（ＧＤＦｓ）、アクチビン類（アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ）、ノーダル及びＴＧＦ−βｓから選択されてよい。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、アクチビンＡ、及びＴＧＦ−β３から選択されてよい。
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現している（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、結果として、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０の欠損、Ｔｒａ１−８１発現（存在するならば）、及びＳＳＥＡ−１の発現の増加となる。未分化多能性幹細胞は典型的に、アルカリホスファターゼ活性を有し、この活性は、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ＣＡ）によって記述されたように、４％パラホルムアルデヒドでの細胞の固定と、続く基質としてのＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄとの発現によって検出可能である。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現している（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、結果として、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０の欠損、Ｔｒａ１−８１発現（存在するならば）、及びＳＳＥＡ−１の発現の増加となる。未分化多能性幹細胞は典型的に、アルカリホスファターゼ活性を有し、この活性は、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ＣＡ）によって記述されたように、４％パラホルムアルデヒドでの細胞の固定と、続く基質としてのＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄとの発現によって検出可能である。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉層のすべて、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３胚葉由来の細胞型の根拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に対して評価することにより決定することができる。
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」を有することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がすべて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性細胞は、種々のフィーダー層を用いて培養中に、又はマトリックスタンパク質コート容器を用いることによって、簡単に増殖しうる。あるいは、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）のような明確な培地との組み合わせで、化学的に明確な表面を、細胞の常用増殖のために使用してよい。多能性細胞は、酵素的、機械的、又はＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）のような種々のカルシウムキレーターの利用を用いて、培養プレートから簡単に取り除くことができる。あるいは、多能性細胞を、任意のマトリックスタンパク質又はフィーダー層がない状態で、懸濁液中で増殖させてよい。
多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定例として、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のような、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚芽細胞の樹立株が挙げられる。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される１次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。また、誘導可能多能性細胞（ＩＰＳ）、又はＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２のような多数の多能性関連転写因子の強制発現を用いて、成体体性細胞より誘導可能な再プログラムされた多能性細胞も好適である（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，２０１１，１２：１６５〜１８５）。
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定例として、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のような、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚芽細胞の樹立株が挙げられる。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される１次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。また、誘導可能多能性細胞（ＩＰＳ）、又はＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２のような多数の多能性関連転写因子の強制発現を用いて、成体体性細胞より誘導可能な再プログラムされた多能性細胞も好適である（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，２０１１，１２：１６５〜１８５）。
ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８；２８２：１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，１９９８；３８：１３３〜１６５；１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７８４４〜７８４８）によって記述されたように調製してよい。
多能性幹細胞の特徴は当業者によく公知であり、多能性幹細胞の追加特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、Ｔｒａ １−８１の１以上の発現が挙げられる。
典型的に胚性幹細胞の培養中に存在する分化マーカーとしては、例えばＡＦＰ、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、Ｔ（ＢＲＹ）、及びＭＩＸＬ１に対してが挙げられる。
本発明の実施形態において、ヒト多能性幹細胞を、少なくとも１０継代増殖した細胞の多能性及びｋａｒｙｏｔｙｐｉｃ安定性を維持する一方で、多能性幹細胞の増殖を維持するために、アスコルビン酸、ＩＧＦ、インスリン、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−Ｂリガンド、及び脂肪酸を含まないアルブミンを含む明確な培地中で培養する。
本発明の実施形態は、５０％より大きい細胞集団が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＦＯＸＡ２陽性のタンパク質発現に対して陽性であるが、ＳＳＥＡ−４及びＺＦＰ４２のタンパク質発現が低い、インビトロ細胞集団である。
本発明の別の態様は、結果として、５０％より大きい細胞集団が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＦＯＸＡ２に対するタンパク質染色によって陽性であり、ＳＳＥＡ−４及びＺＦＰ４２のタンパク質発現が低い細胞集団となる、ＩＧＦ、インスリン、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−Ｂ、脂肪酸を含まないアルブミンを含み、アスコルビン酸を含まない、インビトロの明確な細胞培養処方を記述する。
本発明は更に、以下の実施例によって例示されるが、限定はされず、他に言及しない限り、部及びパーセンテージは、重量によってであり、度は摂氏である。これらの実施例が、本発明の好ましい実施形態を示している一方で、実例としてのみ提供されることを理解されたい。以上の議論及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の必須の特徴が、その精神及び範囲を逸脱しないで、種々の利用及び条件に適合することが出来ることを確認することが可能である。したがって、本明細書で示し、記述したことに加えて、本発明の種々の改変が、前述から当業者に明らかであろう。そのような改変はまた、付随する請求項の範囲内であることが意図される。本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
（実施例１）
未分化胚性幹細胞の増殖用の最適な培地成分を同定するための、種々の培養条件の試験
ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）コートディッシュ上で培養し、ＥＤＴＡを用いて継代した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（少なくとも３５継代〜４０継代）の細胞を開始集団として使用して、種々の培地成分を試験した。細胞を、室温にて５〜１０分間ＥＤＴＡ処理を用いて、小コロニーとして継代した。培養を、それぞれの継代にて、１：６〜１：１０の比で常用に分割した。表Ｉは、それらの未分化形態及び多様性マーカーを維持する一方で、Ｈ１細胞を増殖させるそれらの能力について試験した初期培地処方を記載している。
未分化胚性幹細胞の増殖用の最適な培地成分を同定するための、種々の培養条件の試験
ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）コートディッシュ上で培養し、ＥＤＴＡを用いて継代した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（少なくとも３５継代〜４０継代）の細胞を開始集団として使用して、種々の培地成分を試験した。細胞を、室温にて５〜１０分間ＥＤＴＡ処理を用いて、小コロニーとして継代した。培養を、それぞれの継代にて、１：６〜１：１０の比で常用に分割した。表Ｉは、それらの未分化形態及び多様性マーカーを維持する一方で、Ｈ１細胞を増殖させるそれらの能力について試験した初期培地処方を記載している。
*：Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ**（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＬｉＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、グルコース（Ｓｉｇｍａ）、明確な脂質***（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、試薬グレード脂質を含まないＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，Ａｎｋｅｎｙ，ＩＡ）、ＴＧＦ−β１（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ｂＦＧＦ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＧＦ−１（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（０．８５％ ＮａＣｌ中２００ｍＭ Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂質豊富なＢＳＡ−Ａｌｂｕｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＴＳ−Ｘ（インスリン、トランスフェリン、セレン−Ｘ−サプリメント；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、標準グレードニュージーランドＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣｏｏｐｅｒｓｂｕｒｇＰＡ）、標準グレードＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ）、ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＰＤ０３２５９０１（Ｓｉｇｍａ）、Ｙ２７６３（Ｓｉｇｍａ）
** Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．９９〜１７６ １０００ｘ液体は、１．２０ｍｇ／Ｌ ＡＩＣＩ3・６Ｈ2Ｏ、０．１７ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ3、２．５５ｍｇ／Ｌ Ｂａ（Ｃ2Ｈ3Ｏ2）2、０．１２ｍｇ／Ｌ ＫＢｒ、２．２８ｍｇ／Ｌ ＣｄＣｌ2、２．３８ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．３２ｍｇ／Ｌ ＣｒＣｌ3（無水）、４．２０ｍｇ／Ｌ ＮａＦ、０．５３ｍｇ／Ｌ ＧｅＯ2、０．１７ｍｇ／Ｌ ＫＩ、１．２１ｍｇ／Ｌ ＲｂＣｌ、及び３．２２ｍｇ／Ｌ ＺｒＯＣｌ2・８Ｈ2Ｏを含む。
*** Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１１９０５０３１は、１００．０ｍＬ／Ｌエチルアルコール（２００ｐｒｏｏｆ）及び２ｍｇ／Ｌアラキドン酸、２２０ｍｇ／Ｌコレステロール、７０ｍｇ／Ｌ酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、０ｍｇ／Ｌエチルアルコール１００％、１０ｍｇ／Ｌリノレン酸、１０ｍｇ／Ｌリノレイン酸、１０ｍｇ／Ｌミリスチン酸、１０ｍｇ／Ｌオレイン酸、１０ｍｇ／Ｌパルミチン酸、１０ｍｇ／Ｌパルミトイル酸、９００００ｍｇ／ＬプルロニックＦ−６８、１０ｍｇ／Ｌステアリン酸、及び２２００ｍｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ８０（登録商標）（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を含む。
ＩＨ−４及びＩＨ−５を用いて培養した細胞が、２継代後増殖を失敗したので、ＩＨ−４及びＩＨ−５の利用は、更なる評価のためには停止した。継代２にて、ＩＨ−２にて増殖した細胞が、分化した細胞とパックされたコロニーの欠損と一致した形態における有意な変化を示した。培地ＩＨ−１、ＩＨ−３、及びＩＨ−６を更なるなる評価のために選択した。継代３〜５にて、ＩＨ−６にて培養した細胞が、ＥＳコロニーの周辺にて、分化した細胞の形態学的証拠を示した（図１Ｃを図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｄと比較）。
５継代の後、ＩＨ−１及びＩＨ−３のみを更に、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養した細胞と比較した。５〜１８継代時に、試料をＩＨ−１、ＩＨ−３、及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１培養から回収し、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、核型解析（Ｇ−バンド又はＦＩＳＨ）、及び免疫蛍光染色によって評価した。ＦＩＳＨ解析からの結果を表ＩＩにて示す。これらの結果は、ＩＨ−１培地又はＩＨ−３培地中で培養したＨ１細胞が、通常の核型を示す一方で、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養した細胞が、１０及び１８継代にて、異常な１２トリソミーを提示したことを示している。
更に、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で増殖した細胞と同様に、ＩＨ−１培地中で連続して継代した細胞が、コロニー周辺で非常に僅かに分化した細胞を伴って、特徴的なＥＳコロニー形態を維持した。しかしながら、ＩＨ−３培地中で増殖した細胞は、１０継代を過ぎて、特徴的なＥＳコロニー形態を失い始めた）（図１Ａ、図２Ａ、及び図３Ａを参照のこと）。
多能性に寄与する表面及び内部マーカーの評価を使用して、多能性の維持における被検処方の影響を査定した。表ＩＩＩにて示したように、５継代にて、ＩＨ−１及びＩＨ−３中で培養した細胞は、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で増殖した培養と同様の表面マーカープロファイルを示した。しかしながら、１０継代まで、ＩＨ−３培地中で培養したＨ１細胞は、ＳＳＥＡ−４の発現の有意な低下と、ＴＲＡ１−６０及び１−８１の発現の穏やかな低下を示した。１０継代ＩＨ−１培地中で培養したＨ１細胞は、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養したものと同様の発現パターンを維持した。
多能性に寄与する表面及び内部マーカーの評価を使用して、多能性の維持における被検処方の影響を査定した。表ＩＩＩにて示したように、５継代にて、ＩＨ−１及びＩＨ−３中で培養した細胞は、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で増殖した培養と同様の表面マーカープロファイルを示した。しかしながら、１０継代まで、ＩＨ−３培地中で培養したＨ１細胞は、ＳＳＥＡ−４の発現の有意な低下と、ＴＲＡ１−６０及び１−８１の発現の穏やかな低下を示した。１０継代ＩＨ−１培地中で培養したＨ１細胞は、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養したものと同様の発現パターンを維持した。
驚くべきことに、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１及びＩＨ−１培地中で培養したＨ１細胞と同様に、ＩＨ−３培地中で培養したＨ１細胞は、１１継代にて、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２の強力な発現を維持した（表ＩＶ）。これは、ＩＨ−３培地中で培養したＨ１細胞に対する、ＳＳＥＡ−４の非常に低い発現レベルににもかかわらずであった。
図４に示されるように、Ｎａｎｏｇ（図４Ｄ）、ＯＣＴ４（図４Ｃ）、ＳＯＸ２（図４Ｂ）、及びＺＰＦ４２（図４Ａ）のようなコア多能性マーカーのｍＲＮＡ発現が、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１中で培養されたＨ１細胞と同一のレベルまで、ＩＨ−１、及びＩＨ−３培地中で培養されたＨ１細胞に対して、５継代を通して維持された。しかしながら、ＩＨ−１又はｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養されたＨ１細胞と比較して、１０〜１８継代まで、ＺＦＰ４２の発現の有意な減少があり、一方でＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、及びＳＯＸ２の発現は、ＩＨ−３培地中で増殖した細胞に対して、有意に変化しなかった（図５Ａ及び図６Ａを参照のこと）。更に、１８継代、ＩＨ−３培地中で培養したＨ１細胞のＦＡＣＳ解析は、＞９７％の細胞が、ＯＣＴ４＋（図７Ｃ）、ＳＯＸ２＋（図７Ｆ）、及びＫＩ−６７＋（図７Ｂ）であった。およそ１％の細胞が、ＳＯＸ１７＋（図７Ｄ）であり、約８５％の細胞がＦＯＸＡ２＋（図７Ｅ）であった。図８Ａ〜図８Ｆは、１８継代、ＩＨ−３培地中で培養したＨ１細胞の免疫蛍光染色の画像を示す。これらの画像は、有意な数のＯＣＴ４及びＳＯＸ２陽性細胞がまたＦＯＸＡ２＋であったことを例示している。ＩＨ３培地中で培養したＨ１細胞が、少なくとも７０％の細胞が、Ｏｃｔ４＋、ＮＡＮＯＧ＋、ＳＯＸ２＋、ＫＩ−６７＋、ＺＦＰ４２−及びＦＯＸＡ２＋である表現型を獲得した。これは、本技術分野でまだ記述されていない細胞集団を表す。
（実施例２）
アスコルビン酸をスパイクしたＩＨ−３培地中のＨ１細胞の培養が、未分化胚性幹細胞の主要な特徴を回復する
ＩＨ−３中で培養したＨ１対ＩＨ−１及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養したものに対するＳＳＥＡ−４及びＺＰＦ４２における降下の理由を同定するために、ギャップ解析を実施し、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１及びＩＨ−１中では存在し、ＩＨ−３培地中では存在しない主要な試薬を同定した。ＩＨ−３培地には、表Ｖにて示したように、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ、アスコルビン酸、塩酸リチウム、又は明確な脂質を補った。
アスコルビン酸をスパイクしたＩＨ−３培地中のＨ１細胞の培養が、未分化胚性幹細胞の主要な特徴を回復する
ＩＨ−３中で培養したＨ１対ＩＨ−１及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養したものに対するＳＳＥＡ−４及びＺＰＦ４２における降下の理由を同定するために、ギャップ解析を実施し、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１及びＩＨ−１中では存在し、ＩＨ−３培地中では存在しない主要な試薬を同定した。ＩＨ−３培地には、表Ｖにて示したように、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ、アスコルビン酸、塩酸リチウム、又は明確な脂質を補った。
ＩＨ−３中１４継代培養したＨ１細胞を、続いて上記培地処方中で培養し、ＩＨ−３培地中で培養した細胞と比較した。種々の継代において、種々の培地処方を用いて培養したＨ１細胞を、多能性マーカーに対してアッセイした。表ＶＩに示されるように、５つの続く継代後、ＩＨ−３−２（アスコルビン酸を補ったＩＨ−３）培地中で培養したＨ１細胞は、他の被検培地中で培養した細胞と比較して、そのＳＳＥＡ−４発現を小さい割合回復した。
図９Ｄに示されるように、ＩＨ−３−２培地中で培養したＨ１細胞は、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養した細胞（図９Ａ）と同様に、典型的な胚性幹細胞形態を維持した。しかしながら、ＩＨ−３、ＩＨ−３−１、ＩＨ−３−３、及びＩＨ−３−４中で培養したＨ１細胞は、緩いコロニー形態を示した（図９Ｂ、図９Ｃ、及び図９Ｆを参照のこと）。以上の培地処方中で培養した細胞のＰＣＲ解析は更に、ＩＨ−３−２培地中で培養したＨ１細胞が、いくらかのＺＦＰ４２の発現と、ＦＯＸＡ２のダウンレギュレートされた発現を再獲得したことを確認した（図１０Ａ〜図１０Ｅを参照のこと）。以上のデータは、アスコルビン酸の存在が、それらの特徴的なコロニー／細胞形態及び分化マーカーの低発現とともに、ＥＳ細胞の多能性を維持するために必要であることを示している。このデータに基づいて、ＩＨ−３培地中のＨ１細胞の続く培養に更に、０．２５ｍＭアスコルビン酸を補った。
ＩＨ−３−２中に培養した細胞は、ＥＳ細胞の特徴的コロニー形態のいくらかを回復し、一方で、他のＩＨ培地処方中で培養した細胞は、緩い形態を提示した。
（実施例３）
ＩＨ−３及びＩＨ−１培地中のＨ１細胞の長期培養が、多能性及び安定核型を維持する
実施例１にて記述したように、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）コートディッシュ上で培養し、ＥＤＴＡを用いて継代した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（継代３５〜継代４０）を開始集団として用いて、ＩＨ−１、ＩＨ−３−２及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を用いた長期培養を評価した。細胞を、室温にて５〜１０分間ＥＤＴＡ処理を用いて、小コロニーとして継代した。被検培地の成分を、表ＶＩＩにて記載する。
ＩＨ−３及びＩＨ−１培地中のＨ１細胞の長期培養が、多能性及び安定核型を維持する
実施例１にて記述したように、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）コートディッシュ上で培養し、ＥＤＴＡを用いて継代した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（継代３５〜継代４０）を開始集団として用いて、ＩＨ−１、ＩＨ−３−２及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を用いた長期培養を評価した。細胞を、室温にて５〜１０分間ＥＤＴＡ処理を用いて、小コロニーとして継代した。被検培地の成分を、表ＶＩＩにて記載する。
図１１Ａ〜図１１Ｄにて見られるように、ＩＨ−１、ＩＨ−３−２、及びＩＨ−３ＲＴ中、２０継代培養したＨ１細胞は、典型的なＥＳ形態を維持した。ＩＨ−１、ＩＨ−３−２、及びＩＨ−３ＲＴ中、１５継代培養したＨ１細胞のＰＣＲ解析の結果を、図１２Ａ〜図１２Ｆにて示す。ＩＨ−１、ＩＨ−３−２、及びＩＨ−３ＲＴ中、２０継代培養したＨ１細胞のＰＣＲ解析の結果を、図１３Ａ〜図１３Ｆにて示す。これらの解析は、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養したＨ１細胞と同様に、ＩＨ−１、ＩＨ−３−２、及びＩＨ−３ＲＴ（組換えヒトトランスフェリン）培地中、１５又は２０継代培養した細胞が、全てのコア多能性マーカーを維持し、一方でＦＯＸＡ２及びＡＦＰの非常に低い発現を示すことを確認した。継代１５及び継代２０でのＦＡＣＳ解析はまた、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養したＨ１細胞と同一のレベルまで、多能性細胞に関する表面マーカーの発現も確認した（表ＶＩＩＩを参照のこと）。
ＩＨ−１、ＩＨ−３−２、及びＩＨ−３ＲＴ中で連続して培養したＨ１細胞は、Ｇ−バンド及びＦＩＳＨ解析によって測定したように、通常の核型を示した。しかしながら、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１中、１０〜２０継代培養したＨ１細胞は、異常な染色体数を示した（表ＩＸを参照のこと）。
（実施例４）
ＩＨ−１、ＩＨ−３、及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養したＨ１細胞に関する等価増殖率
先の被検培地中で培養した細胞の増殖率を比較するために、ＩＨ−１、ＩＨ−３−２及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養したＨ１細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって放出し、５×１０5細胞／１０ｃｍ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−コートディッシュの密度にて播いた。単一細胞のアポトーシスを減少させ、接着を増強するために、放出した細胞を、１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）で前処理した。培地を、播種後３日まで、毎日交換した。３日目、細胞を単一細胞として放出し、ヘモサイトメーターを用いて計数した。表Ｘに示されるように、すべての３つの培地処方中で培養した細胞が、等価の倍加時間を示した。
ＩＨ−１、ＩＨ−３、及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養したＨ１細胞に関する等価増殖率
先の被検培地中で培養した細胞の増殖率を比較するために、ＩＨ−１、ＩＨ−３−２及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で培養したＨ１細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって放出し、５×１０5細胞／１０ｃｍ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−コートディッシュの密度にて播いた。単一細胞のアポトーシスを減少させ、接着を増強するために、放出した細胞を、１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）で前処理した。培地を、播種後３日まで、毎日交換した。３日目、細胞を単一細胞として放出し、ヘモサイトメーターを用いて計数した。表Ｘに示されるように、すべての３つの培地処方中で培養した細胞が、等価の倍加時間を示した。
（実施例５）
高品質脂肪酸を含まないＢＳＡは多能性細胞の増殖を許容する
ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）コートディッシュ上で培養し、ＥＤＴＡを用いて継代した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（継代３５〜継代４０）を、開始集団として使用して、２％ Ｓｉｇｍａ ＢＳＡ（カタログ番号Ａ２１５３；ロット：０６１Ｍ１８０４Ｖ）又は脂肪酸を含まないＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号７５００８０４、ロット：１１Ｇ５４００１）のいずれかを補ったＩＨ−３−２培地を用いて、短期培養を評価した。細胞を、室温にて５〜１０分間ＥＤＴＡ処理を用いて、小コロニーとして継代した。図１４Ａ及び図１４Ｂは、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡ（図１４Ａ）又は脂肪酸を含まないＢＳＡ（図１４Ｂ）を含む培地処方中、４日間培養したＨ１細胞の位相コントラスト画像を表す。図１５Ａ及び図１５Ｂは、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡ（図１５Ａ）又は脂肪酸を含まないＢＳＡ（図１５Ｂ）を含む培地処方中、３継代培養したＨ１細胞の位相コントラスト画像を表す。図１４Ａにて見られるように、早ければ播種後４日に、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡを用いた培養中、分化細胞の形態学的な証拠が存在した。しかしながら、脂肪酸を含まないＢＳＡで処理した培養中、グロス分化細胞形態学的な証拠は存在しなかった（図１４Ｂを参照のこと）。同一の傾向が３継代にて留意され、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡを用いた培養中、分化細胞の形態学的証拠が存在した（図１５Ａを参照のこと）一方で、脂肪酸を含まないＢＳＡを含む培地中で培養した細胞中、グロス分化細胞形態学的証拠は存在しなかった（図１５Ｂを参照のこと）。更に、試薬グレード脂肪酸ＢＳＡを含む培地中で培養した細胞と比較して、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡを含む培地中で培養した細胞の培養密度における有意な降下が存在した（図１５Ａと図１５Ｂを比較）。
高品質脂肪酸を含まないＢＳＡは多能性細胞の増殖を許容する
ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）コートディッシュ上で培養し、ＥＤＴＡを用いて継代した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（継代３５〜継代４０）を、開始集団として使用して、２％ Ｓｉｇｍａ ＢＳＡ（カタログ番号Ａ２１５３；ロット：０６１Ｍ１８０４Ｖ）又は脂肪酸を含まないＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号７５００８０４、ロット：１１Ｇ５４００１）のいずれかを補ったＩＨ−３−２培地を用いて、短期培養を評価した。細胞を、室温にて５〜１０分間ＥＤＴＡ処理を用いて、小コロニーとして継代した。図１４Ａ及び図１４Ｂは、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡ（図１４Ａ）又は脂肪酸を含まないＢＳＡ（図１４Ｂ）を含む培地処方中、４日間培養したＨ１細胞の位相コントラスト画像を表す。図１５Ａ及び図１５Ｂは、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡ（図１５Ａ）又は脂肪酸を含まないＢＳＡ（図１５Ｂ）を含む培地処方中、３継代培養したＨ１細胞の位相コントラスト画像を表す。図１４Ａにて見られるように、早ければ播種後４日に、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡを用いた培養中、分化細胞の形態学的な証拠が存在した。しかしながら、脂肪酸を含まないＢＳＡで処理した培養中、グロス分化細胞形態学的な証拠は存在しなかった（図１４Ｂを参照のこと）。同一の傾向が３継代にて留意され、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡを用いた培養中、分化細胞の形態学的証拠が存在した（図１５Ａを参照のこと）一方で、脂肪酸を含まないＢＳＡを含む培地中で培養した細胞中、グロス分化細胞形態学的証拠は存在しなかった（図１５Ｂを参照のこと）。更に、試薬グレード脂肪酸ＢＳＡを含む培地中で培養した細胞と比較して、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡを含む培地中で培養した細胞の培養密度における有意な降下が存在した（図１５Ａと図１５Ｂを比較）。
Ｓｉｇｍａ ＢＳＡ又は脂肪酸を含まないＢＳＡを含む培地処方中、３継代培養したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中、ＡＦＰ（図１６Ａ）、ＭＩＸＬ１（図１６Ｂ）、及びＴ（ＢＲＹ）（図１６Ｃ）の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを、図１６Ａ、１６Ｂ、及び１６Ｃにて示す。３継代でのＰＣＲデータは明確に、Ｓｉｇｍａ ＢＳＡを含む培地中で培養した細胞に対する、分化細胞と関連したマーカーの有意なアップレギュレーションを示した。このデータは明確に、脂肪酸を含まないＢＳＡの利用が、細胞の多能性、コロニー形態、及び増殖の維持において重要であることを示している。
（実施例６）
多能性幹細胞は、広範囲の濃度の脂肪酸を含まないＢＳＡ及びｂＦＧＦを用いた、ＩＨ−３培地中、増殖可能であり、多能性を維持可能である。
多能性幹細胞は、広範囲の濃度の脂肪酸を含まないＢＳＡ及びｂＦＧＦを用いた、ＩＨ−３培地中、増殖可能であり、多能性を維持可能である。
ｍＴｅｓｒ（登録商標）１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）コートディッシュ上で培養し、ＥＤＴＡを用いて継代した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（３５継代〜４０継代）の細胞を、開始集団として使用して、表ＸＩにて示したように補ったＩＨ−３培地を用いて、短期及び長期培養を評価した。
１０継代時点で、細胞を、多能性及び分化関連遺伝子に対して、ＰＣＲによって形態学的に評価した。更に、細胞を、１２番染色体及び１７番染色体に対して、ＦＩＳＨ解析を用いて、核型安定性について評価した。図１７Ａ〜図１７Ｄは、表ＸＩにて記載した培地処方中、１０継代培養したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の、ＳＯＸ２（図１７Ａ）、ＰＯＵ５Ｆ１（図１７Ｂ）、ＮＡＮＯＧ（図１７Ｃ）、及びＦＯＸＡ２（図１７Ｃ）の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。これらの図にて示されるように、以上の処方の全てが、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で増殖した細胞に関連する、多能性マーカーの強力な発現を維持した。しかしながら、０〜０．５％ ＢＳＡ中で増殖した細胞は、他の被検処方と比較して、これらの培養中、より高いレベルの自発性分化を示している、ＦＯＸＡ２のより高い発現を示した。図１８Ａ〜図１８Ｅは、表ＸＩにて列記したＩＨ−３−２（図１８Ａ）、ＩＨ−３Ｐ−２（図１８Ｂ）、ＩＨ−３Ｐ−３（図１８Ｃ）、ＩＨ−３Ｐ−４（図１８Ｄ）、及びＩＨ−３Ｐ−５（図１８Ｅ）培地処方中、１０継代培養したＨ１細胞の位相コントラスト画像を表す。これらの図中に示されるように、本実施例にて試験した全ての処方が、グロス分化形態の最小の証拠を伴って、ＥＳコロニーの形成を可能にした。
表ＸＩＩにて見られるように、表ＸＩ中で記載した培地処方中、１０継代培養したＨ１細胞は、ＦＩＳＨ解析によって測定されたように、１２番染色体及び１７番染色体に対して、正常なカウントを維持した。以上のデータは、ＩＴＳ−Ｘ、試薬グレード脂肪酸を含まないＢＳＡ、ＴＧＦ−Ｂ１、ＩＧＦ−１、及びアスコルビン酸を補った、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地からなる明確な培地が、広範囲の濃度の脂肪酸を含まないＢＳＡとｂＦＧＦを使用した時に、細胞の多能性を維持する一方で、多能性細胞の増殖を許容することを示している。
Claims (17)
- 多能性幹細胞の培養、維持及び増殖のための明確な細胞培養処方であって、前記細胞培養処方は基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びアスコルビン酸を含み、前記細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、細胞の多能性と、核型安定性が維持される、細胞培養処方。
- 前記細胞培養処方が更に、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）を含む、請求項１に記載の明確な細胞培養処方。
- 前記細胞培養処方が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む、請求項１又は２に記載の明確な細胞培養処方。
- 前記細胞培養処方が更に、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む、請求項１に記載の明確な細胞培養処方。
- 前記細胞培養処方が、ＭＣＤＢ−１３１を含む、請求項４に記載の明確な細胞培養処方。
- ＩＴＳ−Ｘが、インスリン、トランスフェリン、及びセレンを供給する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
- 前記脂肪酸を含まないアルブミンが、試薬グレードである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
- 前記ＴＧＦ−βリガンドが、ＴＧＦ−β１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
- ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１から本質的になる、明確な細胞培養処方。
- ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、及びアスコルビン酸から本質的になる、明確な細胞培養処方。
- ＭＣＤＢ−１３１、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ、アスコルビン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドから本質的になる、明確な細胞培養処方。
- ヒト多能性幹細胞の増殖のための方法であって、明確な細胞培養処方中、フィーダーを含まないマトリックス上で、ヒト多能性幹細胞を培養する工程を含み、前記明確な細胞培養処方が、基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びアスコルビン酸を含み、前記明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、細胞の多能性と、核型安定性が維持される、方法。
- 前記明確な細胞培養処方が更に、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）を含む、請求項１２に記載の方法。
- 前記細胞培養処方が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
- 前記明確な細胞培養処方が更に、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
- 前記明確な細胞培養処方が、ＭＣＤＢ−１３１を含む、請求項１５に記載の方法。
- ＩＴＳ−Ｘ、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−Ｂ１、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した多能性細胞のインビトロ集団であって、前記集団中の細胞の少なくとも７０％が、Ｏｃｔ４＋、ＮＡＮＯＧ＋、ＳＯＸ２＋、ＫＩ６７＋、ＦＯＸＡ２＋及びＺＦＰ４２−である、多能性細胞のインビトロ集団。
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