CN1171991C - 人神经干细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人神经干细胞的培养方法,包括以下步骤:1、配制由DMEM和F12以1∶1混合而成的基础培养液、胰岛素、盐酸丁二胺、硒化钠、氢化可的松、L-谷氨酰胺、人转铁蛋白和黄体酮组成的人神经干细胞培养基;2、即时采集病员本人自体血清;3、将采集的病员本人自体血清加入配制出的人神经干细胞培养基中,在35℃~38℃、加3~7%的CO

Description

人神经干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法,尤其是涉及一种人神经干细胞的培养方法。

背景技术

神经干细胞研究是1998年以来的国内外新研究课题。神经干细胞是中枢神经系统的多潜能细胞,是脑内三种主要细胞(神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)的共同前体细胞,具有以下特性:(1)处于未分化状态,无成熟细胞的特异性标志;(2)具有多向分化潜能,即演变成不同类型成熟细胞的能力;(3)可通过不对称分裂而自我复制或更新,产生与自己相同的子代细胞,从而维持细胞数目的稳定。神经干细胞的来源主要有四个方面:胚胎干细胞或胚胎神经组织、神经嵴细胞、脑组织、骨髓基质。正由于神经干细胞是具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力,能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞,因此培养神经干细胞旨在将作为种子细胞源的一定组织细胞(如病员自体骨髓间充质细胞等)在特制的培养基中调控分化成具有增殖及分化潜能的神经干细胞,以便进行病员自体回输、治疗中枢神经系统功能损害,为临床进一步应用于病员相关疾病的神经干细胞移植治疗奠定实验基础。

对于一般的胚胎干细胞而言,在适宜环境下可以分化生长成各种不同的组织细胞,故人们可用胚胎干细胞培育出各种新组织甚至器官进行移植。而对于神经干细胞而言,主要焦点在于成功地从不同途径培养、获得足够数量的神经前体细胞,以供移植治疗、或进行转基因操作攻击肿瘤的生长、观察某些合成/天然化合物的神经活性等。比如,若能从病员自体抽得骨髓组织作为神经干细胞的种子细胞,在一定条件下诱导分化为神经干细胞、进而回输于病员自体体内,并在局部微环境作用下产生多巴胺能神经细胞,就可用于治疗其帕金森症。而令这种技术应用的关键前提,是能否使骨髓源等种子细胞在特定环境中培养成所需的神经干细胞。而现有采用的合成细胞培养基主要作用是为不同种类组织细胞提供一般生存生长的微环境,如Eagle,DMEM,F12,RPMI1640,CMRL1066,L15,199,MB752/1等,其主要含有成份为氨基酸、维生素、无机盐、糖类等,利用这些合成培养基培养细胞的方法是不能将不同来源的种子细胞(如骨髓组织细胞等)培养成所需的神经干细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能使人类骨髓组织等不同来源种子细胞定向发育分化为人神经干细胞的培养方法,可随时准确无误地为医学科研教学及临床应用提供相关需要的神经干细胞。

为实现上述目的,本发明由以下步骤组成:1、配制人神经干细胞培养基,该培养基的配制步骤为:a、取DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液,加纯净水至浓度为10~25g/L,并充分搅拌溶解,制得细胞的一般基础培养液;b、再取胰岛素(Insulin)、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、盐酸丁二胺(Putrescine)、硒化钠(Sodium Selenide)、人转铁蛋白(Transferrin)、氢化可的松(Hydrocortisone)、黄体酮(Progesterone)依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀;c、以1~10当量浓度的氢氧化钠调pH为7.4~8.0;d、层流细胞培养室抽滤消毒,4℃储存备用;2、取步骤1配制出的人神经干细胞培养基,取新鲜血清加入培养基中,血清的含量为培养基的5~20%;将加入血清的培养基置于培养箱,在35℃~38℃、加3~7%的CO2温箱孵育11~21天。

本发明步骤1中所述培养基所包含各组分的重量配比为:DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液      10000~25000胰岛素(Insulin)                          4.5~12.5L-谷氨酰胺(L-Glutamine)                  3.5~12.5盐酸丁二胺(Putrescine)                   9.2~35.6硒化钠(Sodium Selenide)                  0.01~0.51人转铁蛋白(Transferrin)                  50.0~150.0氢化可的松(Hydrocortisone)               5.0~35.0黄体酮(Progesterone)                     0.01~0.55本发明与现有技术相比,具有以下的优点:1、由于本发明中的DMEM和F12混合而成的基础培养液作为一般种子细胞生长发育的基本微环境;胰岛素可通过促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸,从而促进细胞增殖分裂,特别是促进神经干细胞生长;L-谷氨酰胺可促进神经干细胞发育生长期间核酸、蛋白质的合成;盐酸丁二胺能刺激、诱导神经干细胞增殖;硒化钠参与、促进神经干细胞代谢;人转铁蛋白可结合铁离子,减少其毒性和被细胞所利用,同时使神经干细胞数量增多、减少成纤维细胞数;氢化可的松促进神经干细胞生长发育;黄体酮促进神经干细胞生长。用本发明方法培养的神经干细胞经过免疫细胞化学鉴定表达特有的高亲和力抗原NESTIN;表达NESTIN抗原的神经干细胞可进一步分化为神经元、神经胶质细胞,证明本发明方法能有效地诱导包括骨髓组织种子细胞在内的各种来源组织细胞分化为神经干细胞,其诱导时间为11~21天;2、将本发明方法培养的神经干细胞移植至脊髓损伤患者的病灶周围,移植3个月后患者的临床症状有明显改善,表现为运动功能、知觉功能、代谢功能等不同程度的恢复,最理想者可由原来的长期卧位到能扶物体站立;3、以病员自体血清成份维持神经干细胞生长,效果佳,且不存在移植细胞异种血清蛋白免疫排斥的可能;4、本发明方法简单,可重复性强,操作简便易行;为有关神经干细胞及其应用的科研、教学、临床应用等能起到不可估量的作用,同时也孕育着巨大的社会效益和经济效益。

具体实施方式

本实施例包括以下步骤:1、配制人神经干细胞培养基,该培养基的配制步骤为:a、取DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液12g,加纯净水至浓度为12g/L,并充分搅拌溶解,制得细胞的一般基础培养液;b、再取胰岛素(Insulin)5mg、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)3.9mg、盐酸丁二胺(Putrescine)10mg、硒化钠(Sodium Selenide)0.03mg、人转铁蛋白(Transferrin)50mg、氢化可的松(Hydrocortisone)10mg、黄体酮(Progesterone)0.02mg依次加入步骤1所制得的基础培养液中,充分搅拌均匀,并以纯净水定容为1000毫升,此时呈橙黄微浊状态;c、以5当量浓度的氢氧化钠调pH为7.8,此时培养基呈桃红色清亮状态;d、层流细胞培养室抽滤消毒(过滤膜孔直径为0.22μm规格),4℃储存备用。

2、即时采集病员本人自体血清,采集步骤为:a、准备10ml规格玻璃离心管、一次性无菌注射器、酒精棉;b、常规消毒、前臂静脉取血10毫升,不加任何抗凝剂;c、将静脉血置于无菌玻璃离心管中,室温或4℃条件下,离心1500~1800rmp,10分钟,可得到3~6ml病员自体血清,收集血清;3、取步骤1配制出的人神经干细胞培养基10g,取步骤2即时采集病员本人自体血清1g加入培养基中;将加入血清的培养基置于培养箱,在37℃、加5%的CO2温箱孵育15天。

Claims (2)

1.一种人神经干细胞的培养方法,其特征在于由以下步骤组成:(1)配制人神经干细胞培养基,该培养基的配制步骤为:a、取DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液,加纯净水至浓度为10~25g/L,并充分搅拌溶解,制得细胞的一般基础培养液;b、再取胰岛素、L-谷氨酰胺、盐酸丁二胺、硒化钠、人转铁蛋白、氢化可的松、黄体酮依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀;c、以1~10当量浓度的氢氧化钠调pH为7.4~8.0;d、层流细胞培养室抽滤消毒,4℃储存备用;(2)取步骤1配制出的人神经干细胞培养基,取新鲜血清加入培养基中,血清的含量为培养基的5~20%;将加入血清的培养基置于培养箱,在35℃~38℃、加3~7%的CO2温箱孵育11~21天。
2.根据权利要求1所述的一种人神经干细胞的培养方法,其特征在于步骤1中所述培养基所包含各组分的重量配比为:DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液       10000~25000胰岛素                4.5~12.5L-谷氨酰胺            3.5~12.5盐酸丁二胺            9.2~35.6硒化钠                0.01~0.51人转铁蛋白            50.0~150.0氢化可的松            5.0~35.0黄体酮                0.01~0.55
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