KR102015815B1 - 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 방법 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell)의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 방법으로서, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하는 과정; 상기 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하는 과정; 상기 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하는 과정; 상기 피더 비포함 배지에 유도만능줄기세포를 첨가하여 배양하는 과정; 상기 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제를 첨가하는 과정; 상기 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화하도록 유도하기 위해, 피더 비포함 배지에 BMP4 및 KGF를 순차적으로 첨가하는 과정; 및 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양하는 과정;을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 방법 및 시스템 {Method for Culturing Cornea Epithealial Cell by Inducing Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cell and System for the Same}
본 발명은 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
각막 상피 세포는 각막의 가장 바깥쪽에 위치하며, 각막을 구성하고, 각막의 투명성을 유지하는 중요한 역할을 담당하는 세포층이다. 각막 상피 세포의 변형 또는 결핍은 각막 표면의 상처 회복 및 투명성 유지의 기능을 저하시킴으로써, 각막이 퇴화되는 결과를 초래할 수 있다.
각막 상피 세포는 각막 윤부의 각막 상피 원 세포 (corneal epithelial progenitor cells or limbal stem cells)로부터 분화되며, 각막 상피층에 각막 상피 세포의 변형 또는 결핍이 발생 시 이를 항상 보충한다. 그러나 유전적 요인이나 화상 및 질병과 같은 후천적 요인에 의해 각막 윤부의 줄기세포가 결핍되면, 각막 상피 세포를 형성할 수 없고, 따라서 각막 상피층을 보충할 수 없으며, 결국 각막은 퇴화된다.
이러한 원인에 의한 각막 상피층 질환을 치료하기 위해, 각막 상피 세포 재생을 위한 많은 연구가 실시되었다. 구체적으로, 각막 상피층 질환을 치료하기 위해, 각막 윤부를 이식하려는 시도가 있었으나, 만족 할 만한 효과를 거두지는 못하였다. 또한, 중간엽 줄기세포, 성체줄기세포 및 구강상피 세포 (oral mucosal cell)를 이용하여 각막 상피 세포로 분화시키고, 이를 이용하여 치료하기 위한 시도 또한 각막 상피 세포로의 분화능이 기대에 미치지 못하여 큰 효과를 기대하기 어려웠다.
따라서, 각막 상피 세포 이상에 대한 치료 효과를 향상시킬 수 있는 기술의 필요성이 높은 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 발명자들은 심도 있는 연구와 다양한 실험을 거듭한 끝에, 이후 설명하는 바와 같이, 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell)의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 방법으로서, 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하고, 피더 비포함 배지에서 유도만능줄기세포를 배양한 후, BMP4및 KGF를 순차적으로 첨가하여 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화하도록 유도하는 경우, 각막 이식 시 면역 반응이 낮은 각막 상피 세포의 배양이 가능하고, 각막 상피 세포로의 분화능이 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 방법은,
DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하는 과정;
상기 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하는 과정;
상기 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하는 과정;
상기 피더 비포함 배지에 유도만능줄기세포를 첨가하여 배양하는 과정;
상기 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제를 첨가하는 과정;
상기 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화하도록 유도하기 위해, 피더 비포함 배지에 BMP4 및 KGF를 순차적으로 첨가하는 과정; 및
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양하는 과정;을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포 배양용 첨가제는 홀로 트랜스페린(Holo transferrin), bFGF, TGF 베타1, 및 인슐린을 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제는 EGF 및 인슐린을 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 BMP4 및 KGF를 순차적으로 첨가하는 과정에서, BMP4를 첨가하고 약 2일 내지 4일간 처리 후, KGF를 첨가할 수 있고, 상세하게는 BMP4를 첨가하고 약 3일간 처리 후KGF를 첨가할 수 있다
하나의 구체적인 예에서, 상기 BMP4 및 KGF를 순차적으로 첨가하는 과정에서, KGF를 첨가하고 약 2일 내지 4일간 처리 할 수 있고, 상세하게는 KGF를 첨가하고 약 3일간 처리 할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 PI 배양액은 판세린(Panserin):이소코브 미디아(Isocove Media)를 중량을 기준으로 2:1내지 1:2, 상세하게는 1:1로 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 1주 내지 3주 동안 배양할 수 있다.
본 발명은 또한, 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 시스템을 제공한다.
상기 시스템은, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하고, 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 제조된 피더 비포함 배지;
상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포;
상기 피더 비포함 배지에 첨가되는 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제;
상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포 및 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제가 포함된 배지에 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화하도록 유도하기 위해 순차적으로 첨가되는 BMP4 및 KGF; 및
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 배양하기 위한 PI배양액;을 포함할 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 방법 및 시스템은, 각막 이식 시 면역 반응이 낮은 각막 상피 세포를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 시스템은 유도만능줄기세포로부터 각막 상피 세포로의 분화능을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 시스템으로부터 제공되는 각막 상피 세포는 세포 분화에 대한 기초연구 및 병인기전 규명연구에 모델로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 시스템으로부터 제공되는 각막 상피 세포는 장기이식의 대체를 위한 치료제 개발 연구모델로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 시스템은 유도만능줄기세포로부터 여러 신체 장기로의 분화기술에 적용하기 위한 플랫폼 기술로서 활용될 수 있다.
도 1은 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 시간 경과에 따라 촬영한 사진이다;
도 2는 비교예 1의 피더 포함 배지에서 7일간 배양한 유도만능줄기세포를 촬영한 사진이다;
도 3 및 도 4는 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 비분화 iPSC 마커로 면역염색하고, 단백질 발현 배열(array)을 사용한 결과를 촬영한 사진이다;
도 5 내지 도 8은 실시예 1에 대한 각막 줄기세포 마커 및 각막 상피 세포 마커의 발현 상태를 촬영한 사진이다;
도 9는 실시예 1의 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포의 Air Lift 실험 결과를 촬영한 사진이다.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 참조하여 설명하지만, 이는 본 발명의 더욱 용이한 이해를 위한 것으로, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
유도만능줄기세포를 배양하기 위하여, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하고, pH 7.4로 조절하였다. 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제로서 홀로 트랜스페린을 10 ㎍/ml, bFGF을 100 ng/mL, TGF 베타1을 1.74ng/ml, 및 인슐린을 20 ㎍/ml 첨가하였다.
피더(feeder)를 사용하여 줄기세포를 배양하는 경우, 분화된 각막 상피 세포를 이식 시 면역 반응이 문제될 수 있으므로, 피더를 사용하지 않는 피더 비포함 배지를 제조하기 위하여, 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질(Vitronectin Recombinant Human Protein)을 코팅하고, 다음으로 유도만능줄기세포를 7일간 배양하였다.
비트로넥틴 재조합 인간 단백질 코팅은 다음의 과정을 통해 실시하였다. 6 well plate 배양 용기 기준으로, 9 ml의 DPBS(Ca2+ 및 Mg2+가 없는 Phosphate buffered Saline)에 60 ㎕의 비트로넥틴 재조합 인간 단백질 (50 ㎍/ml)을 투입하여 희석하고, 이를 각 well에 1.5 ml 넣고, 건조하지 않게 한 다음, 냉장상태 (약 4 ℃)에서 12시간 반응시켰다. 이후, 1시간 동안 실온에서 반응 시키고, PBS로 세척하였다.
배양된 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화시키기 위해, 우선, 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제로서, EGF를 10 ng/ml 및 인슐린을 5 ㎍/ml 첨가하였다.
다음으로, 외배엽 프로지니터(ectoderm progenitors)를 초기에 유도하기 위하여 BMP4를 100 ng/ml 첨가하고 3일간 처리하였고, 다음으로 각막 상피 세포로 분화를 위하여 KGF를 200 ng/ml 첨가하고 3일간 처리하였다.
다음으로, 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 판세린(Panserin):이소코브 미디아(Isocove Media)를 중량을 기준으로 1:1로 혼합한 PI 배양액에서 약 1주 내지 3주 동안 배양하였다.
<비교예 1>
유도만능줄기세포를 배양하기 위하여, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하고, pH 7.4로 조절하였다. 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제로서 홀로 트랜스페린을 10 ㎍/ml, bFGF을 100 ng/mL, TGF 베타1을 1.74ng/ml, 및 인슐린을 20 ㎍/ml 첨가하였다. 피더로서 MMC (mitomycin C) 처리한 MEF (mouse embryonic fibroblast) 피더를 25,000 cells/cm2 첨가하고, 다음으로 유도만능줄기세포를 배양하였다.
<비교예 2>
유도만능줄기세포를 배양하기 위하여, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하고, pH 7.4로 조절하였다. 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제로서 홀로 트랜스페린을 10 ㎍/ml, bFGF을 100 ng/mL, TGF 베타1을 1.74ng/ml, 및 인슐린을 20 ㎍/ml 첨가하였다.
기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질(Vitronectin Recombinant Human Protein)을 코팅하여 제조된 피더 비포함 배지에서, 유도만능줄기세포를 배양하였다.
배양된 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화시키기 위해, 우선, 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제로서, EGF를 10 ng/ml 및 인슐린을 5 ㎍/ml 첨가하였다.
다음으로, BMP4를 100 ng/ml 첨가하고 2일 내지 14일간 처리한 후, 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 판세린(Panserin):이소코브 미디아(Isocove Media)를 중량을 기준으로 1:1로 혼합한 PI 배양액에서 약 1주 내지 3주 동안 배양하였다.
<실험예 1>
실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포와, 비교예 1의 피더 포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포의 배양 상태를 관찰하였다. 그 결과를 촬영한 사진을 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1은 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 시간 경과에 따라 촬영한 사진이고, 도 2는 비교예 1의 피더 포함 배지에서 7일간 배양한 유도만능줄기세포를 촬영한 사진이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포가 비교예 1의 피더 포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포에 비해, 콜로니를 명확하게 형성하고 있음을 확인할 수 있고, 이는 실시예 1의 유도만능줄기세포가 크기와 형태가 균일한 상태로 배양된 것으로 볼 수 있다.
<실험예 2>
실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 비분화 iPSC 마커인 SOX2, OCT4A, SSEA4, TRA-1-81, TRA1-60S로 면역염색하고, 단백질 발현 배열(array)을 사용하여 확인하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
우선, 도 3을 참조하면, 배양된 유도 만능 줄기세포(iPSC)에서 줄기세포 특성이 있음을 나타내는 단백질 마커인 TRA-1- 81, TRA1-60S, SSEA4, OCT4A의 발현 유무를 확인하였다.
다음으로, 도 4를 참조하면, 배양된 유도 만능 줄기세포에서 단백질을 분리하고, 단백질 발현 양상을 비교하기 위하여 줄기세포 마커에 대한 protein array를 실시하였고, 줄기세포의 마커인 SOX2, OT 3/4의 발현을 확인하였다.
<실험예 3>
실시예 1의 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포 및 비교예 2의 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를, PI 배양액에서 배양 전 및 3주간 배양한 후에 대하여 각각, 각막 줄기세포 마커 (ABCG2, △Np63, Pax6, CK14) 및 각막 상피 세포 마커 (CK3, CK12)로 발현 상태를 분석하였다.
그 결과, 비교예 2의 경우 BMP4로 최대 2주간 처리하여 분화과정을 거쳐도, 각막 줄기세포와 각막 상피 세포 마커의 발현은 제한적이었다. 반면에, 실시예 1의 경우, 각막 윤부 마커인 CK14, Pax6가 모두 발현되었고, KGF처리 후, 각막줄기세포 마커보다 각막 상피세포 마커의 발현이 강하게 관찰되었다. 실시예 1에 대한 각막 줄기세포 마커 및 각막 상피 세포 마커의 발현 상태를 촬영한 사진을 도 5 내지 도 8에 나타내었다.
<실험예 4>
실시예 1의 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포의 각막 상피세포층 형성 능력을 확인하기 위한 Air Lift 배양을 실시하였고, 전자현미경을 통해서 관찰하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었고, 이를 통해, 다층의 세포층이 형성되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상 본 발명의 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims (11)

  1. 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell)의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 방법으로서,
    상기 각막 상피 세포로 분화를 유도하기 전에,
    피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하는 과정;
    상기 피더 비포함 배지에 유도만능줄기세포를 첨가하여 배양하는 과정;
    상기 피더 비포함 배지에 EGF 및 인슐린을 포함하는 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제를 첨가하는 과정;
    유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화하도록 유도하기 위해, 피더 비포함 배지에 BMP4 및 KGF를 순차적으로 첨가하는 과정; 및
    상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 배양하는 과정;
    을 포함하고,
    상기 BMP4 및 KGF를 순차적으로 첨가하는 과정에서, BMP4를 첨가하고 2일 내지 4일간 처리 후 KGF를 첨가하고, 상기 KGF를 첨가하고 2일 내지 4일간 처리하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 피더 비포함 배지를 제조하는 과정은,
    DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하는 과정;
    상기 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하는 과정; 및
    상기 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하는 과정을 포함하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포 배양용 첨가제는 홀로 트랜스페린(Holo transferrin), bFGF, TGF 베타1, 및 인슐린을 포함하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제4항에 있어서, 상기 PI 배양액은 판세린(Panserin):이소코브 미디아(Isocove Media)를 중량을 기준으로 2:1 내지 1:2로 포함하는 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 1주 내지 3주 동안 배양하는 방법.
  11. 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 시스템으로서,
    DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하고, 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 제조된 피더 비포함 배지;
    상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포;
    상기 피더 비포함 배지에 첨가되는, EGF 및 인슐린을 포함하는 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제;
    상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포 및 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제가 포함된 배지에 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화하도록 유도하기 위해 순차적으로 첨가되는 BMP4 및 KGF; 및
    상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 배양하기 위한 PI배양액;
    을 포함하고,
    상기 순차적으로 첨가되는 BMP4 및 KGF는, BMP4를 첨가하고 2일 내지 4일간 처리 후 KGF를 첨가하고, 상기 KGF를 첨가하고 2일 내지 4일간 처리된 것인, 시스템.
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