KR102029931B1 - 단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템 - Google Patents

단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR102029931B1
KR102029931B1 KR1020160101954A KR20160101954A KR102029931B1 KR 102029931 B1 KR102029931 B1 KR 102029931B1 KR 1020160101954 A KR1020160101954 A KR 1020160101954A KR 20160101954 A KR20160101954 A KR 20160101954A KR 102029931 B1 KR102029931 B1 KR 102029931B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pluripotent stem
induced pluripotent
stem cells
medium
cells
Prior art date
Application number
KR1020160101954A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180017704A (ko
Inventor
주천기
목지원
주희정
최준섭
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020160101954A priority Critical patent/KR102029931B1/ko
Priority to US16/323,459 priority patent/US20190177690A1/en
Priority to PCT/KR2017/008466 priority patent/WO2018030720A1/ko
Publication of KR20180017704A publication Critical patent/KR20180017704A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102029931B1 publication Critical patent/KR102029931B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Abstract

본 발명은 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell)의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법으로서, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하는 과정; 상기 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하는 과정; 상기 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하는 과정; 상기 피더 비포함 배지에 유도만능줄기세포를 첨가하여 배양하는 과정; 상기 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제를 첨가하는 과정; 상기 유도만능줄기세포를 각막 줄기세포 유사 세포주로 분화하도록 유도하기 위해, 피더 비포함 배지에 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정; 및 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양하는 과정;을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템 {Method for Culturing Cornea Stem Cell Like Cell by Inducing Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cell Using Protein Ligand and System for the Same}
본 발명은 단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
줄기세포는 우리 몸을 구성하는 모든 세포로 분화될 수 있는 만능세포를 의미한다. 이론적으로 줄기세포는 모든 세포로 분화될 수 있으며, 이들의 분화 메커니즘을 이해하고 원하는 세포로 분화시킨다면, 각종 신체 장기를 복원 또는 재생하는 것이 가능하다.
다만, 줄기세포는 생체에 이식되면 스스로 증식하고 분화하여 암세포화 되는 성질을 가지고 있기 때문에, 줄기세포 자체를 조직의 재생이나 치료에 사용할 수는 없다.
또한, 세포주화 된 만능유도줄기세포(iPSC)는 배양하는 기간이 길수록, 계대 배양하는 횟수가 많아 질수록 줄기세포의 능력이 감소되며, 원하지 않는 세포로 분화되거나 사멸될 가능성이 높아져 기대 효과가 저하된다.
따라서, 만능유도줄기세포를 줄기세포의 성격을 계속 유지시키며 배양할 수 있고, 분화될 세포에 가장 적합한 상태로 배양하여, 줄기세포를 원하는 세포로 분화시키는 비율을 향상시킬 수 있는 기술에 대한 필요성이 높은 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 발명자들은 심도 있는 연구와 다양한 실험을 거듭한 끝에, 이후 설명하는 바와 같이, 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell)의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법으로서, 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하고, 피더 비포함 배지에서 유도만능줄기세포를 배양한 후, BMP4및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하여 유도만능줄기세포를 각막 줄기세포 유사 세포주로 분화하도록 유도하는 경우, 각막 이식 시 면역 반응이 낮은 세포를 제공할 수 있고, 각막 줄기세포 유사 세포주로의 분화능이 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법은,
DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하는 과정;
상기 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하는 과정;
상기 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하는 과정;
상기 피더 비포함 배지에 유도만능줄기세포를 첨가하여 배양하는 과정;
상기 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제를 첨가하는 과정;
상기 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화하도록 유도하기 위해, 피더 비포함 배지에 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정; 및
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양하는 과정;을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포 배양용 첨가제는 홀로 트랜스페린(Holo transferrin), bFGF, TGF 베타1, 및 인슐린을 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제는 EGF 및 인슐린을 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정에서, BMP4를 첨가하고 약 2일 내지 4일간 처리 후, Wnt3a를 첨가할 수 있고, 상세하게는 BMP4를 첨가하고 약 3일간 처리 후Wnt3a를 첨가할 수 있다
하나의 구체적인 예에서, 상기 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정에서, Wnt3a를 첨가하고 약 2일 내지 4일간 처리 할 수 있고, 상세하게는 Wnt3a를 첨가하고 약 3일간 처리 할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 PI 배양액은 판세린(Panserin):이소코브 미디아(Isocove Media)를 중량을 기준으로 2:1내지 1:2, 상세하게는 1:1로 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 1주 내지 3주 동안 배양할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양 후, 계대 배양하는 과정을 더 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 계대 배양 시, 계대 배양액은 에피 미디아(Epi media), FBS, 히드로코르티손, 인슐린, 콜레라독소(choleratoxin), 및 EGF를 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 3주 동안 배양한 후 계대 배양할 수 있다.
본 발명은 또한, 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 시스템을 제공한다.
상기 시스템은, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하고, 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 제조된 피더 비포함 배지;
상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포;
상기 피더 비포함 배지에 첨가되는 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제;
상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포 및 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제가 포함된 배지에 유도만능줄기세포를 각막 줄기세포 유사 세포주로 분화하도록 유도하기 위해 순차적으로 첨가되는 BMP4 및 Wnt3a; 및
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 배양하기 위한 PI배양액;을 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양 후, 계대 배양하기 위한 계대 배양액을 더 포함할 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템은, 각막 이식 시 면역 반응이 낮은 각막 상피 세포를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 시스템은 유도만능줄기세포로부터 각막 줄기세포 유사 세포주로의 분화능을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 시스템으로부터 제공되는 각막 상피 줄기세포 유사 세포주는, 각막 상피 세포의 분화 연구 및 각막 질환 치료를 위한 각막 상피 이식 연구에 응용 및 활용할 수 있다.
도 1은 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 시간 경과에 따라 촬영한 사진이다;
도 2는 비교예 1의 피더 포함 배지에서 7일간 배양한 유도만능줄기세포를 촬영한 사진이다;
도 3 및 도 4는 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 비분화 iPSC 마커로 면역염색하고, 단백질 발현 배열(array)을 사용한 결과를 촬영한 사진이다;
도 5 내지 도 8은 실시예 1에 대한 마커의 발현 상태를 촬영한 사진이다;
도 9는 실시예 1의 Wnt3a 처리 후 PI 배양액에서 1주 동안 배양한 세포에 대해, Air Lift를 3주간 수행한 결과를 촬영한 사진이다;
도 10은 마커 Pax6, CK3, 및 Hoechst를 사용하여, 실시예 1 및 실시예 2에서 계대 배양된 세포들의 증식율을 측정한 사진이다;
도 11은 실시예 1의 계대 배양액에서 배양한 각막 상피 줄기 세포를 Air Lift 배양한 결과를 촬영한 사진이다.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 참조하여 설명하지만, 이는 본 발명의 더욱 용이한 이해를 위한 것으로, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
유도만능줄기세포를 배양하기 위하여, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하고, pH 7.4로 조절하였다. 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제로서 홀로 트랜스페린을 10 ㎍/ml, bFGF을 100 ng/mL, TGF 베타1을 1.74ng/ml, 및 인슐린을 20 ㎍/ml 첨가하였다.
피더(feeder)를 사용하여 줄기세포를 배양하는 경우, 분화된 각막 상피 세포를 이식 시 면역 반응이 문제될 수 있으므로, 피더를 사용하지 않는 피더 비포함 배지를 제조하기 위하여, 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질(Vitronectin Recombinant Human Protein)을 코팅하고, 다음으로 유도만능줄기세포를 7일간 배양하였다.
비트로넥틴 재조합 인간 단백질 코팅은 다음의 과정을 통해 실시하였다. 6 well plate 배양 용기 기준으로, 9 ml의 DPBS(Ca2+ 및 Mg2+가 없는 Phosphate buffered Saline)에 60 ㎕의 비트로넥틴 재조합 인간 단백질 (50 ㎍/ml)을 투입하여 희석하고, 이를 각 well에 1.5 ml 넣고, 건조하지 않게 한 다음, 냉장상태 (약 4 ℃)에서 12시간 반응시켰다. 이후, 1시간 동안 실온에서 반응 시키고, PBS로 세척하였다.
배양된 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화시키기 위해, 우선, 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제로서, EGF를 10 ng/ml 및 인슐린을 5 ㎍/ml 첨가하였다.
다음으로, 외배엽 프로지니터(ectoderm progenitors)를 초기에 유도하기 위하여 BMP4를 100 ng/ml 첨가하고 3일간 처리하였고, 다음으로 각막 줄기세포 유사 세포주로 분화를 위하여 Wnt3a를 100 ng/ml 첨가하고 3일간 처리하였다.
다음으로, 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 판세린(Panserin):이소코브 미디아(Isocove Media)를 중량을 기준으로 1:1로 혼합한 PI 배양액에서 약 1주 내지 3주 동안 배양하였다.
PI 배양액에서 약 1주 내지 3주 동안 배양한 세포들을 계대 배양하였다. 계대 배양액은 DMEM:F12를 중량을 기준으로 3:1로 혼합한 에피 미디아에, FBS (Fetal Bovine Serum, 소태아혈청)를 중량을 기준으로 5%로 첨가하고, 히드로코르티손을 50 ng/ml, 인슐린을 5 ㎍/ml, 콜레라독소를 30 ng/ml, 및 EGF를 10 ng/ml 포함하도록 제조하여 사용하였다.
<실시예 2>
실시예 1에서 계대 배양액을 PI 배양액과 동일한 조성으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다.
<비교예 1>
유도만능줄기세포를 배양하기 위하여, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하고, pH 7.4로 조절하였다. 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제로서 홀로 트랜스페린을 10 ㎍/ml, bFGF을 100 ng/mL, TGF 베타1을 1.74ng/ml, 및 인슐린을 20 ㎍/ml 첨가하였다. 피더로서 MMC (mitomycin C) 처리한 MEF (mouse embryonic fibroblast) 피더를 25,000 cells/cm2 첨가하고, 다음으로 유도만능줄기세포를 배양하였다.
<실험예 1>
실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포와, 비교예 1의 피더 포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포의 배양 상태를 관찰하였다. 그 결과를 촬영한 사진을 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1은 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 시간 경과에 따라 촬영한 사진이고, 도 2는 비교예 1의 피더 포함 배지에서 7일간 배양한 유도만능줄기세포를 촬영한 사진이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포가 비교예 1의 피더 포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포에 비해, 콜로니를 명확하게 형성하고 있음을 확인할 수 있고, 이는 실시예 1의 유도만능줄기세포가 크기와 형태가 균일한 상태로 배양된 것으로 볼 수 있다.
<실험예 2>
실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 비분화 iPSC 마커인 SOX2, OCT4A, SSEA4, TRA-1-81, TRA1-60S로 면역염색하고, 단백질 발현 배열(array)을 사용하여 확인하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
우선, 도 3을 참조하면, 배양된 유도 만능 줄기세포(iPSC)에서 줄기세포 특성이 있음을 나타내는 단백질 마커인 TRA-1- 81, TRA1-60S, SSEA4, OCT4A의 발현 유무를 확인하였다.
다음으로, 도 4를 참조하면, 배양된 유도 만능 줄기세포에서 단백질을 분리하고, 단백질 발현 양상을 비교하기 위하여 줄기세포 마커에 대한 protein array를 실시하였고, 줄기세포의 마커인 SOX2, OT 3/4의 발현을 확인하였다.
<실험예 3>
실시예 1의 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포로부터 분화된 세포를, PI 배양액에서 배양 전 및 3주간 배양한 후에 대하여 각각, 각막 줄기세포 마커 (ABCG2, △Np63, Pax6, CK14) 및 각막 상피 세포 마커 (CK3, CK12)로 발현 상태를 분석하였다.
그 결과, 실시예 1의 경우, Wnt3a를 처리하여 3주간 배양 시 각막 줄기세포 마커인 ABCG2 및 △Np63와 각막 상피 세포 마커인 CK3 및 CK12가 모두 관찰되었다. 실시예 1에 대한 마커의 발현 상태를 촬영한 사진을 도 5 내지 도 8에 나타내었다.
도 7및 도 8을 참조하면, Wnt3a 처리 후 3주 동안 배양된 줄기세포(iPSC)에서 CK14, Pax6를 확인한 결과 두 단백질의 발현되었음을 알 수 있다. 또한, Wnt3a를 처리한 배양된 줄기세포(iPSC)에서 각막 상피 줄기세포의 마커인 ABCG2의 발현은 일부 감소하였으나 각막 상피 세포 분화 마커인 CK3의 발현은 증가하였음을 알 수 있다.
<실험예 4>
실시예 1의 유도만능줄기세포로부터 분화된 각막 상피 줄기세포의 각막 상피세포 분화 능력을 확인하기 위한 Air Lift 배양을 실시하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9를 참조하면, 실시예 1의 Wnt3a 처리 후 PI 배양액에서 1주 동안 배양한 세포에 대해, Air Lift를 3주간 수행한 결과 약 3층 내지 4층의 각막 상피 세포층이 형성되었음을 확인할 수 있었다.
<실험예 5>
실시예 1 및 실시예 2에서 계대 배양된 세포들을 증식율을 측정하였다. 마커 Pax6, CK3, 및 Hoechst를 사용하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었고, 에피 미디아를 포함하는 계대 배양액을 사용한 실시예 1의 결과를 왼쪽에 나타내었고, PI 배양액을 계대 배양액으로 사용한 실시예 2의 결과를 오른쪽에 나타내었다.
도 10을 참조하면, 에피 미디아를 포함하는 계대 배양액을 사용한 실시예 1의 경우에 더욱 높은 밀집도를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
또한, 계대 배양 이전에 PI 배양액에서 1주, 2주, 및 3주간 배양 후, 각각을 계대 배양하였다. PI 배양액에서 3주간 배양 후 계대 배양한 세포가 각막 상피 세포의 형태를 가장 잘 유지하면서 각막 상피 세포와 각막 상피 줄기세포 마커의 발현을 지속적으로 유지하였다. 이를 통해, 분화율이 70%이상인 각막 줄기세포 유사 세포주를 얻을 수 있었다.
<실험예 6>
에피 미디아를 포함하는 계대 배양액에서 배양한 각막 상피 줄기 세포를 Air Lift 배양한 결과, 다층의 세포층이 형성되었음을 전자현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었고, 이를 통해, 다층의 세포층이 형성되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상 본 발명의 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims (15)

  1. 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell)의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법으로서,
    유도만능줄기세포를 각막 줄기세포 유사 세포주로 분화하도록 유도하기 위해, 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)에 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정; 및
    상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 배양하는 과정;
    을 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 각막 상피 세포로 분화를 유도하기 전에,
    피더 비포함 배지를 제조하는 과정;
    상기 피더 비포함 배지에 유도만능줄기세포를 첨가하여 배양하는 과정; 및
    상기 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제를 첨가하는 과정을 더 포함하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 피더 비포함 배지를 제조하는 과정은,
    DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하는 과정;
    상기 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하는 과정; 및
    상기 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하는 과정을 포함하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포 배양용 첨가제는 홀로 트랜스페린(Holo transferrin), bFGF, TGF 베타1, 및 인슐린을 포함하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제는 EGF 및 인슐린을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정에서, BMP4를 첨가하고 2일 내지 4일간 처리 후 Wnt3a를 첨가하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정에서, Wnt3a를 첨가하고 2일 내지 4일간 처리하는 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 PI 배양액은 판세린(Panserin):이소코브 미디아(Isocove Media)를 중량을 기준으로 2:1 내지 1:2로 포함하는 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 1주 내지 3주 동안 배양하는 방법.
  11. 제10 항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양 후, 계대 배양하는 과정을 더 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 계대 배양 시, 계대 배양액은 에피 미디아(Epi media), FBS, 히드로코르티손, 인슐린, 콜레라독소(choleratoxin), 및 EGF를 포함하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 3주 동안 배양한 후 계대 배양하는 방법.
  14. 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 시스템으로서,
    DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하고, 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 제조된 피더 비포함 배지;
    상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포;
    상기 피더 비포함 배지에 첨가되는 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제;
    상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포 및 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제가 포함된 배지에 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화하도록 유도하기 위해 순차적으로 첨가되는 BMP4 및 Wnt3a 및
    상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 배양하기 위한 PI배양액;
    을 포함하는 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양 후, 계대 배양하기 위한 계대 배양액을 더 포함하는 시스템.
KR1020160101954A 2016-08-10 2016-08-10 단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템 KR102029931B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160101954A KR102029931B1 (ko) 2016-08-10 2016-08-10 단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템
US16/323,459 US20190177690A1 (en) 2016-08-10 2017-08-04 Method and system for culturing corneal stem cell-like cell line by inducing differentiation of induced pluripotent stem cell using protein ligand
PCT/KR2017/008466 WO2018030720A1 (ko) 2016-08-10 2017-08-04 단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160101954A KR102029931B1 (ko) 2016-08-10 2016-08-10 단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180017704A KR20180017704A (ko) 2018-02-21
KR102029931B1 true KR102029931B1 (ko) 2019-10-08

Family

ID=61163307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160101954A KR102029931B1 (ko) 2016-08-10 2016-08-10 단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20190177690A1 (ko)
KR (1) KR102029931B1 (ko)
WO (1) WO2018030720A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020201629A1 (en) * 2019-04-01 2020-10-08 Tampere University Foundation Sr Method for obtaining or maintaining abcg2-positive corneal limbal stem cells
EP3871697A1 (en) 2020-02-28 2021-09-01 Korea University Research and Business Foundation Nano-ligand for promoting cell adhesion and differentiation of stem cells and method of promoting cell adhesion and differentiation of stem cells by using the same
KR102361797B1 (ko) 2020-02-28 2022-02-14 고려대학교 산학협력단 나노리간드 및 이를 이용한 대식세포의 세포 부착 및 재생 촉진 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015042356A1 (en) * 2013-09-19 2015-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation
WO2016114285A1 (ja) * 2015-01-15 2016-07-21 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞からの角膜上皮細胞の分化誘導

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015042356A1 (en) * 2013-09-19 2015-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation
WO2016114285A1 (ja) * 2015-01-15 2016-07-21 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞からの角膜上皮細胞の分化誘導

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARVO Annual Meeting Abstract:Investigative Ophthalmology & Visual Science, 제55권, 1 페이지(2014)*
Cytotherapy, 제18권, 546-561 페이지(전자공개, 2016.04.)*
Microscopy Research and Technique, 제73권, 1045-1052 페이지(2010)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180017704A (ko) 2018-02-21
US20190177690A1 (en) 2019-06-13
WO2018030720A1 (ko) 2018-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6574458B2 (ja) 多能性幹細胞を培養するための新規な方法および培養培地
JP5227318B2 (ja) 細胞増殖培地
KR102029931B1 (ko) 단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템
US20120142103A1 (en) Method for inducing differentiation into epithelial progenitor cell/stem cell population and corneal epithelial cell population from induced pluripotent stem cells
CN111269885A (zh) 制备端脑或其前体组织的方法
CN110770334A (zh) 角膜内皮细胞标记及其应用
KR102015815B1 (ko) 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 방법 및 시스템
US9068167B2 (en) Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined conditions using matrix overlay methods
CN106754657B (zh) 一种猴胚胎干细胞的无血清培养基
Moraveji et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 promotes efficient derivation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis
JP2021168679A (ja) 奇形腫の形成が抑制された多分化能性幹細胞由来の神経前駆体球の製造方法
US20170266235A1 (en) Method for producing cholinergic neural cells
US10760051B2 (en) Process for preparing astrocytes
CN113528441B (zh) 快速高效的临床级色素上皮细胞诱导方法、试剂盒及应用
KR101613677B1 (ko) 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법
KR102013064B1 (ko) 테라토마 유래 오가노이드 제조 방법
KR100683199B1 (ko) 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법 및그에 사용되는 배지
Suga et al. A morphology-based assay platform for neuroepithelial-like cells differentiated from human pluripotent stem cells
JP2013236558A (ja) 細胞増殖抑制剤
KR20090085019A (ko) 줄기세포 및 피더세포의 공배양용 배지 조성물
US20230119089A1 (en) Method for differentiating pluripotent stem cells into underlying connective tissue fibroblasts of an epithelium
KR20110130622A (ko) 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법
KR101588109B1 (ko) 키메라를 이용한 유도만능줄기세포 유래 체내 신경줄기세포 생산 방법
CN116769695A (zh) 从畸胎瘤、类器官和拟胚体中产生人细胞和组织的培养基和方法
KR100856706B1 (ko) 혈관내피 성장인자를 이용한 인간배아 줄기세포로부터도파민 신경세포로의 분화 촉진 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant