KR100683199B1 - 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법 및그에 사용되는 배지 - Google Patents

신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법 및그에 사용되는 배지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 신경전구세포(neural progenitor cell)를 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH) 및 레티논산(retinoic acid, RA)을 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(1차 배양), (b) 단계 (a)에서 얻어진 배양물을 염기성 섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)를 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(2차 배양), 및 (c) 단계 (b)에서 얻어진 배양물을 아스코빈산(ascorbic acid, AA) 및 뇌-유래 신경영양 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)를 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(3차 배양)를 포함하는, 신경전구세포를 콜린성 신경세포(cholinergic neural cell)로 분화시키는 방법 및 그에 사용되는 배지를 제공한다.
본 발명에 따른 신경전구세포를 콜린성 신경세포(cholinergic neural cell)로 분화시키는 방법은 높은 분화율로 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시킬 수 있다.
콜린성 신경세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포

Description

신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법 및 그에 사용되는 배지{A process for differentiating a neural progenitor cell to a cholinergic neural cell and a culture medium therefor}
도 1은 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 사진이다(A 와 C는 40 배율이고 B와 D는 100 배율이다).
도 2는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 형태와 이뮤노피노타이핑(immunophenotyping) 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 제대혈 유래 제대혈 중간엽 줄기세포의 콜로니 형성사진이다. A는 이뮤노마그네틱(immunomagnetic) 방법을 이용하여 중간엽 줄기세포를 분리한 사진이다. B는 A 세포를 계대배양한 뒤 N2/N2 supplement에 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF를 첨가하여 세포를 증식시킨 사진이다. C와 D는 EGF와 bFGF에서 자란 세포들은 14일 동안 콜로니를 형성하였다. (A, B, C는 40 배율이고 D는 100 배율이다)
도 4는 신경적 세포로 분화하는 동안 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 형태를 관찰한 사진이다. A는 분화시키기 전 세포의 모양이고, B는 세포를 20 ng/ml bFGF 및 EGF 를 첨가시킨 배양액에 24시간 배양 했을 때의 세포의 형태이고, C는 신경분화배지에 1.5일 키운 사진이다.
도 5는 뉴론, 별아교세포, 희돌기아교세포에 특이적인 항체를 이용하여 면역 세포화학염색을 수행한 사진이다. (A) 뉴론의 특이적 항체인 β-튜블린 III 에 양성 반응을 나타내고 축색돌기와 수상돌기가 뻗은 뉴론 같은 형태를 가지고 있다. (B) 별아교세포의 특이적 항체인 GFAP에 양성반응을 나타낸 세포들이다. (C) 희돌기아교세포에 특이적 항체인 Gal-C에 양성반응을 보이며 희돌기아교세포의 특징적인 형태를 나타낸다.
도 6은 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 유도된 신경적 세포 분화의 분화율을 나타낸 그래프이다. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 1.5일 동안 신경분화배지에서 키운 뒤 신경세포, 별아교세포, 희돌기아교세포의 분화율을 측정하였다.
도 7은 중간엽 줄기세포의 신경 분화 단계에서 다양한 신경적 유전자의 발현양상을 나타낸 그림이다.
도 8은 신경분화 배지(A, B, C)와 콜린성 신경 분화 배지(D, E, F)에서 각각 키운 세포에서 콜린성 뉴론의 특이적인 항체를 이용하여 면역세포화학염색를 수행한 사진이다. 녹색 형광은 신경세포의 특이적 항체인 β-튜블린 III 을 나타내고 (A, D) 빨간색 형광은 콜린성 뉴런의 특이적 항체인 ChAT를 나타낸다 (B, E). C와 F는 앞의 두 사진을 겹친 사진이다.
도 9은 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 20일 간 콜린성 뉴런으로 유도를 시킨 뒤 분화율을 측정한 그래프이다.
도 10은 생후 5일째의 흰쥐의 뇌 절편에 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이식하여 콜린성 뉴론으로 분화를 시킨 면역조직화학 염색 사진이다. (A) PKH26이 표지된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, (B) 콜린성 뉴런에 특이적 항체인 ChAT, (C) 앞의 두 사진을 겹친 사진이다.
본 발명은 신경전구세포((neural progenitor cell)를 콜린성 신경세포(cholinergic neural cell)로 분화시키는 방법 및 그에 사용되는 배지에 관한 것이다.
주로 기저 전뇌에 위치한 콜린성 뉴론(cholinergic neurons)은 피질을 포함한 뇌의 다른 부분들로 축색돌기를 뻗어나간다. 콜린성 시스템은 기능적, 행동적, 병리적 단계와 연관되어 있으며 치매, 파킨슨 병, 근위축성 측색경화증을 포함한 많은 질병에서 콜린성 시스템의 퇴화가 일어난다. 콜린성 신경의 분화는 몇몇의 단계로 나뉘어진다. 배아줄기세포는 초기 신경외배엽 세포를 형성하고 이것은 로세트(rosettes)를 형성하며, 신경 외배엽성 전사 인자 Pax6를 발현한다. 그리고 후기 신경 외배엽성 세포는 신경관과 같은 구조를 형성하고 Pax6와 Sox1을 발현한다. 초기 단계에서 신경 외배엽성 세포들은 레티논산(retinoic acid, RA)에 의해 효율적으로 posteriorize 되며 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)의 존재하에서 콜린성 신경세포로 분화한다.
최근의 연구들은 배아줄기세포가 체외에서 특이적인 콜린성 신경으로 분화한다고 보고하였다. 인간의 배아줄기세포는 bFGF, RA, 그리고 Shh 처리에 의해 콜린성 뉴론으로 분화한다(Li XJ, Du ZW, Zarnowska ED, et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2005, 23(2): 215-221; 및 Shin S, Dalton S, Stice SL. Human motor neuron differentiation from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 2005, 14(3): 266-269. ). 그리고 쥐의 배아줄기세포는 쥐의 골수 기원 스트로멀 휘더 셀(stromal feeder cells)과 함께 공배양함으로써 콜린성 신경으로 분화 유도된다(Barberi T, Klivenyi P, Calingasan NY, et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 2003, 21(10): 1200-1207).
그러나 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)를 포함한 성체 줄기세포가 체외에서 특이적 콜린성 신경으로 분화한 연구결과는 아직 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 콜린성 신경세포로 분화시키기 위한 방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)로부터 신경전구세포(neural progenitor cell)를 얻고, 이를 특정 배지에서 배양할 경우, 높은 분화율로 콜린성 신경세포로 분화한다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 콜린성 신경세포로의 분화를 유도하기 위한 배지를 제공하 는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 신경전구세포(neural progenitor cell)를 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH) 및 레티논산(retinoic acid, RA)을 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(1차 배양), (b) 단계 (a)에서 얻어진 배양물을 염기성 섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)를 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(2차 배양), 및 (c) 단계 (b)에서 얻어진 배양물을 아스코빈산(ascorbic acid, AA) 및 뇌-유래 신경영양 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)를 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(3차 배양)를 포함하는, 신경전구세포를 콜린성 신경세포(cholinergic neural cell)로 분화시키는 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법에 있어서, 상기 1차 배양용 N2 배지는 50∼500 ng/ml의 SHH 및 0.1∼2 uM의 RA를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 2차 배양용 N2 배지는 1∼20 ng/ml의 bFGF 및 50∼500 ng/ml의 SHH 를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 3차 배양용 N2 배지는 100∼300 uM의 AA 및 10∼20 ng/ml의 BDNF 를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 더욱 바람직하게는, 상기 1차 배 배양용 N2 배지는 500 ng/ml의 SHH 및 1 uM의 RA를 포함하고, 상기 2차 배양용 N2 배지는 10 ng/ml의 bFGF 및 500 ng/ml의 SHH를 포함하고, 상기 3차 배양용 N2 배지는 200 uM의 AA 및 20 ng/ml의 BDNF를 포함한다.
본 발명에서 콜린성 신경세포로 분화를 유도시키기 위해 기본 배지로 사용되 는 N2 배지는 DMEM/F-12 (Dulbecco's modified Eagle's medium//F-12)로서, 넓은 범위의 동물 세포주의 성장을 보조하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 명세서에서는 N2 배지로 기재하고 있으나, N2 배지와 동등한 특성을 갖는 배지를 기본 배지로 사용하는 것도 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법에 있어서, 상기 신경전구세포로는 공지된 제조방법으로 얻어진 세포를 사용할 수 있다. 그러나, 생명윤리 문제를 야기하지 않은 성체 줄기세포 즉, 중간엽 줄기세포로부터 얻어진 신경전구세포가 바람직하게 사용될 수 있으며, 특히 상기 중간엽 줄기세포가 제대혈로부터 얻어진 것이 바람직하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 신경전구세포로는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)로부터 얻어진 세포가 바람직하게 사용될 수 있다. 즉, 상기 신경전구세포는 (a') 바르톤 젤리 유래 중간엽 줄기세포를 β-머캅토에탄올; 비필수 아미노산(nonessential amino acid)(예를 들어, L-알라닌; L-아스파라긴; L-아스파틱산; L-글루타민산; 글라이신; L-프롤린; 및 L-세린); 글루타민; 및 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 탈분화배지에서 배양하는 단계, 및 (b') 단계 (a')에서 얻어진 배양물을 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF); 염기성 섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF); 및 N2 보조제(N2 supplement)(예를 들어, 인슐린; 휴먼 트랜스페린; 프로게스테론; 푸트라신(Putrascine); 및 셀레나이트(Selenite))를 포함하는 N2 배지에서 배양하여 얻어지는 것이 바람직하다.
상기에서, 탈분화배지는 0.001%의 β-머캅토에탄올; 1X의 비필수 아미노산(nonessential amino acid); 2mM의 글루타민; 및 20%의 FBS을 포함하는 DMEM 배지가 바람직하고, 단계 (b')에서 사용되는 N2 배지는 20 ng/ml의 EGF; 20 ng/ml의 bFGF; 및 1X의 N2 보조제(N2 supplement)를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 신경전구세포(neural progenitor cell)의 도파민성 신경세포(dopaminergic neural cell) 분화용 배지가 제공된다.
즉, 본 발명은 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH) 및 레티논산(retinoic acid, RA)을 포함하는 N2 배지(A), 염기성 섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)를 포함하는 N2 배지(B), 및 아스코빈산(ascorbic acid, AA) 및 뇌-유래 신경영양 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)를 포함하는 N2 배지(C)로 이루어진 군으로부터 1 내지 3개 선택된, 신경전구세포(neural progenitor cell)의 콜린성 신경세포(cholinergic neural cell) 분화용 배지를 제공한다.
상기 N2 배지(A)는 50∼500 ng/ml의 SHH 및 0.1∼2 uM의 RA를 포함하는 것이 바람직하며, 500 ng/ml의 SHH 및 1 uM의 RA를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 N2 배지(B)는 1∼20 ng/ml의 bFGF 및 50∼500 ng/ml의 SHH를 포함하는 것이 바람직하며, 10 ng/ml의 bFGF 및 500 ng/ml의 SHH를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 N2 배지(C)는 100∼300 uM의 AA 및 10∼20 ng/ml의 BDNF를 포함 하는 것이 바람직하며, 200 uM의 AA 및 20 ng/ml의 BDNF를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 신경전구세포의 콜린성 신경세포 분화용 배지로는 상기 N2 배지(A)가 500 ng/ml의 SHH 및 1 uM의 RA를 포함하고, 상기 N2 배지(B)가 10 ng/ml의 bFGF 및 500 ng/ml의 SHH를 포함하고, 상기 N2 배지(C)가 200 uM의 AA 및 20 ng/ml의 BDNF를 포함하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따라, 신경전구세포 특히 제대혈에서 유래된 중간엽 줄기세포로부터 얻어진 신경전구세포를 체외에서 높은 분화율로 콜린성 신경세포로 분화시킬 수 있으며, 따라서, 콜린성 신경세포로 분화시켜 이식할 경우 콜린성 신경세포 변성에 의한 질환(예를 들어, 뇌졸증, 신경 퇴행성 이상)에 대한 치료제로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
참조예 1. RT-PCR
하기 실시예에서 RT-PCR은 다음과 같이 수행하였다 총 RNA 는 Tri-reagent (MRC사)를 이용하여 각 실험군에서 추출하였으며, 올리고-dT-프라이머(oligo-dT primer, Promega사)를 이용하여 5 μg의 총 RNA를 cDNA로 합성하였다.　역전사는 M-MLV 역전사 효소 (Promega사)를 이용하여 42℃에서 1시간, 99℃에서 5분 반응하였다. cDNA는 태그 폴리머라제(Taq polymerase, Promega사)를 이용하여 35 사이클 (cycle)로 증폭시켰다. 증폭된 cDNA는 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 분리하였으며 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, EtBr) 염색을 통하여 확인하였다. 프라이머의 서열과 그 크기는 표 1과 같다.
Figure 112006001462799-pat00001
참조예 2. 면역세포화학염색(immunocytochemistry)
하기 실시예에서 면역세포화학적 염색은 다음과 같이 시행하였다. 성체줄기세포가 배양된 커버 스립(cover slip) 을 0.2% 트리톤 X-100 (Triton X-100)이 포함된 PBS에 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum, Sigma사, U.S.A.)를 첨가한 용액에 1시간 동안 실온 처리하여 항체가 특정 단백질에만 결합할 수 있도록 블럭킹하였다. 그 다음 신경세포에 대한 항체인 β-튜블린 III(1:400, Sigma, USA), 별아교세포에 대한 항체인 GFAP(glial fibrillary acidic protein, 1:500, DakoCytomation사, 덴마크), 희돌기아교세포에 대한 항체인 Gal-C(galactocerebroside, 1:50, Chemicon International사, U.S.A.), 도파민성 신경세포에 대한 항체인 TH(1:250, Vector Lab.사),
콜린성 신경세포에 대한 항체인 ChAT(1:100, Chemicon사)를 일차 항체로 처리하여 4 ℃ 에서 24시간 동안 반응시켰다. 각 조직들을 인산 완충 생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 15분씩 3회 세척한 후에 형광이 붙어있는 이차 항체(Cy3-컨쥬게이티드 항-토끼 IgG(Cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG) 1:1000, Amersham사), FITC-컨쥬게이티드 항 토끼 IgG(FITC-conjugated goat anti rabbit IgG) (1:128, Sigma)) 로 4 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 음성 대조군은 각 군의 절편을 일차 항체를 제외하여 같은 과정을 수행하였다. 형광 표지된 세포들은 형광 현미경(Carl Zeiss Axioskop2+, Germany) 하에서 관찰하였으며, 도파민성 신경세포의 분화정도는 β-튜블린 III+세포와 TH+ 세포를 표지하여 이중 형광표지된 세포만을 측정하여 분화 정도를 확인하였으며, 콜린성 신경세포의 분화 정도는 β-튜블린 III+세포와 ChAT+ 세포를 표지하여 이중 형광 표지된 세포만을 측정하여 분화 정도를 확인하였다,
실시예 1. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분리와 배양
단핵구(mononuclear cell: MNC)를 제대혈에서 분리하였으며 제대수집은 미즈 산부인과(김해)에서 이루어졌다. 제대혈은 태반의 탯줄 정맥에서 헤파린이 든 제대혈 수집백(녹의공, 한국)을 사용하여 수집되었고 2시간 이내에 연구에 사용하였다. 혈액의 여러 세포들 중 줄기세포의 가능성을 가진 MNC는 피콜/하이파크 농도구배법(Ficoll/Hypaque gradient method)에 의해 분리하여 수집하였다. 수집된 혈액 40-50ml 을 50ml 튜브에 넣어 800 Xg에서 10분간 원심분리 한 뒤 중간층을 포함하여 약 10ml을 취하였다. 수집된 10 ml 가량의 혈액을 2%의 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA, Sigma사, U.S.A.) 와 페니실린-스트렙토마이신(100IU/ml; Sigma사, U.S.A.)이 첨가된 PBS 희석용액(isolation buffer)과 1:2가 되도록 희석하여 15ml 의 피콜-하이파크 플러스(Ficoll-Hypaque Plus, Amersham biosciences사, U.S.A.) 층에 섞이지 않게 주의하여 35ml을 얹는다. 20℃, 800 Xg로 30분간 원심 분리한 후 중간층에서 MNC 만을 수집하여 희석용액으로 2번 세척한 뒤(20℃, 500Xg와 300Xg에서 각각 20분씩) 4℃에서 15분간 130 Xg 느린 속도로 원심 분리하여 남은 혈소판을 제거하였다. 수집된 MNC는 희석용액에 4X107~8 cells/ml이 되도록 재부유시켰다. MNC는 CD34 단백질에 대한 항체가 입혀진 이뮤노마그네틱 비이드(immunomagnetic bead)를 사용한 분리법(Dynal CD34 progenitor cell collection system, Dynal Biotech ASA, 노르웨이)을 사용하여 CD34 음성과 양성 세포로 분리하였다. 분리한 세포는 DMEM 기본 배양액에 25% FBS와 10% DMSO가 첨가된 냉동 배지를 사용하여 1X107 cells/ml의 농도로 냉동시킨 뒤 액체질소에서 보관했다. 보관 7일 후 시험관을 해동 한 뒤 죽은 세포만을 푸른색으로 염색시키는 0.4% 트리판 블루 용액(Sigma 사, U.S.A.)과 5:1이 되도록 희석하여 37℃에서 5분간 배양했다. 염색 된 세포 현탁액을 헤마토사이토메터(hematocytometer)를 사용하여 생존율을 검사했다. 얻어진 CD34 음성 세포는 도 1과 같다.
실시예 2. 이뮤노피노타이핑(immunophenotyping)
제대혈에서 분리한 CD34 음성세포가 중간엽 줄기세포임을 확인하기 위하여 이뮤노피노타이핑(immunophenotyping)을 수행하였다. 배양된 세포를 4 % 파라포름알데히드로 4 ℃에서 2시간 동안 고정하였다. PBS로 세척 후, 3 % 과산화수소에서 반응시킨 후 2 % 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)으로 블럭킹(blocking) 하였다. 준비된 세포는 다음 중 한 가지 항체를 2% BSA가 포함된 PBS용액에 희석배수에 맞춰 희석하여 4 ℃에서 밤새 반응시켰다: 피브로넥틴(1:100), ICAM-1(1:200), 타입 I 콜라겐 (1:50), TRA-1-60 (1:150), 비멘틴(1:200). 반응이 끝난 세포는 바이오티닐레이티드 고우트 항-마우스 IgG(biotinylated goat anti-mouse IgG) 혹은 항-토끼 IgG(anti-rabbit IgG) 항체와 반응시켰다. 반응 후, 세포들을 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)으로 염색시키고, 카나다 발삼(Canada balsam)에 임베딩(embedding) 시켰다. 음성 대조군은 1차 항체 대신 PBS로 반응시키고 같은 과정을 수행하였다.
이뮤노피노타이핑(immunophenotyping) 결과, 제대혈 유래 CD34 음성 세포는 중간엽 줄기세포에 특이적인 항원들에 대해 양성반응을 나타내었으며(도 2). 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF) 및 염기성 섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF)를 첨가하여 낮은 농도(약 1X10/ml)로 배양하면 콜로니가 형성됨을 관찰하였다(도 3).
실시예 3. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 신경분화 유도
제대혈 유래 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화하는지를 확인하기 위하여 3단계의 배지(탈분화배지, 전분화배지, 신경분화배지)를 통해 바르톤 젤리 세포를 신경세포로 분화시켰다. 분리 배양한 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 트립신 처리하여 수집한 뒤 폴리-D-오르니틴/라미닌(poly-D-ornithine/laminin)이 코팅된 배양 접시(culture dish)에 1X104 cells/cm2의 밀도로 분주하여 배양하여, 0.001% β-머캅토에탄올, 1X 비필수 아미노산(nonessential amino acid, 조성(mg/L): L-알라닌 890.00; L-아스파라긴 1,320.00; L-아스파틱산 1,330.00; L-글루타민산 1,470.00; 글라이신 750.00; L-프롤린 1,150.00; 및 L-세린 1,050.00), 2mM 글루타민(glutamine), 20% FBS 가 첨가된 DMEM 배지(low glucose) 에서 1~3일 동안 탈분화시켰다 (탈분화배지). 탈분화된 줄기세포를 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF, 1X N2 보조제(N2 supplement, Gibco사 (조성(ug/ml): 인슐린 500; 휴먼 트랜스페린 10,000; 프로게스테론 0.63; 푸트라신(Putrascine) 1,611; 및 셀레나이트(Selenite) 0.52)가 첨가된 N2 배지에서 24시간 배양하여 신경전구세포로 분화시킨 후(전분화배지), 1X N2 supplement, 2% DMSO, 200uM BHA가 첨가된 N2 배지에서 5시간 분화시킨 후, 1X N2 supplement, 2% DMSO, 200uM BHA, 25mM KCl, 2mM 발프론 산(valproic acid), 1uM 히드록시코르티손(hydroxycortison)을 첨가한 N2 배지(신경분화배지)에서 3~7일간 추가 배양하였다.
상기와 같이 처리함으로써, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 신경세포와 유사한 모양의 형태적 변화를 일으켰다(도 4). 형태적으로 변화한 세포가 신경세포임을 확인하기 위해, 면역세포화학적 염색(참조예 2)을 실시하였다. 신경세포 특이적 항체인 β-튜블린 III,　 별아교세포의 특이적 항체인 GFAP, 희돌기아교세포에 대한 항체인 Gal-C가 양성반응을 나타내었다.(도 5).　 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분화율은 신경세포가 약 30 %, 별아교세포가 약 15%, 희돌기아교세포가 약 10% (도 6)로 나타났다.　
제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 신경 분화를 확인하기 위해 참조예 1에 따라 RT-PCR을 수행한 결과(도 7), 줄기세포 표지인자인 SCF, c-Kit 및 Stat-3 는 탈분화 배지에서만 발현이 되었으며, 신경 줄기 세포와 전구 세포 특이 표지인자로 사용된 네스틴(nestin)과 GPC-4는 분화 유도 배지로 옮겨 갈수록 점점 발현 정도가 증가하였다. 신경세포의 표지 인자인 NeuroD1, GFAP, MBP의 발현은 분화 유도배지에서만 발현되었다. 이러한 결과는 제대혈 유래 세포는 탈분화배지에서 배양 후 줄기세포의 특성을 가지게 되었으며 전분화배지에서 배양되면서 신경전구세포의 특성을 가지게 되고, 다시 신경분화배지에서 배양되면서 신경세포로 분화 하였음을 나타낸다.
실시예 4. 콜린성 신경세포 분화 유도
분리 배양한 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 폴리-D-오르니틴/라미닌(poly-D-ornithine/laminin)이 코팅된 배양 접시(culture dish)에 1X104 cells/cm2의 밀도로 분주하여 배양하고, 0.001% β-머캅토에탄올, 1X 비필수 아미노산(nonessential amino acid), 2mM 글루타민(glutamine), 20% FBS 가 첨가된 DMEM 배지(low glucose) 에서 1~3일 동안 탈분화시켰다 (탈분화배지). 탈분화된 줄기세포를 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF, 1X N2 보조제(N2 supplement)가 첨가된 N2 배지(전분화배지)에서 24시간 배양하여 신경전구세포로 분화시켰다. 신경전구세포를
500 ng/ml 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH, R&D사) 와 1 μM 레티논산(retinoic acid, RA, Sigma사) 가 첨가된 N2 배지에 옮겨 4일간 배양한 후, 다시 10 ng/ml bFGF 와 500 ng/ml SHH가 첨가된 N2 배지에서 4일간 배양하였다. 이후, 200 μM 아스코빈산(ascorbic acid, AA, Sigma 사) 와 20 ng/ml 뇌-유래 신경영양 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF, Gibco사) 가 첨가된 N2 배지에서 추가 배양함으로써 콜린성 신경으로의 분화를 유도하였다.
제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 신경 분화배지에서 분화를 유도한 뒤 도파민성 뉴론에 특이적 항체인 TH와 콜린성 뉴론에 특이적인 항체 ChAT를 이용하여 면역 세포 화학적 염색을 수행하였다(참조예 2). 이들 항체에 양성반응을 보인 세포들은 각각 5.1 ± 1.0 %, 7.2 ± 1.2 %, 였다. 이들 세포를 콜린성 신경분화 배지에서 분화를 유도한 뒤에는 전체의 세포 중 31.3 ± 3.2 %가 β-튜블린 항체에 양성 반응을 나타냈고 이 양성반응을 나타낸 세포 중 72.8 ± 3 % 가 ChAT에 양성반응을 나타내어(도 8 및 도 9), 일반 신경분화 배지에서보다 콜린성 신경 분화배지에서의 콜린성 신경 분화율이 유의하게 높음을 알 수 있다.
실시예 5. 뇌 조직 체외배양
생후 5일된 흰쥐를 경추 탈골로 희생시켜 곧 바로 뇌조직을 적출하여 생체미세절단기(1500, The Vibratome Company) 를 이용하여 400 ㎛의 두께로 절단하였다. 각 조직을 0.4 ㎛ Millicell culture insert (Millipore, MA, USA)에 얹어 1ml 의 배양배지가 담긴 6-웰 배양접시에 넣어 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 세포를 이식하기 전 3일간 배양하였다. 배양배지의 조성은 100 ml basal Eagle medium (with Earle's salts), 50 ml Earle's balanced salt solution (Gibco사), 50 ml heat-inactivated horse serum (Gibco사), 1 ml 200 mM L-글루타민, and 2 ml 50 % 글루코오즈 (Sigma사) 이다.
흰쥐의 뇌절편에 이식할 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 표지 하기 위해 PKH26을 사용하였다. 냉동 보관된 세포를 녹인 뒤 세척하여 DMSO를 제거한 후 0.4% 트리판 블루(trypan blue) 용액으로 생존률을 검사한 뒤 1X107 cells/ml이 되도록 1ml의 희석 용액 (diluent solution, Sigma사, U.S.A.) 에 희석하였다. 세포막에 결합하여 붉은색의 형광을 띄는 4μM의 PKH26(Sigma사, U.S.A.) 2㎕와 잘 혼합한 뒤 5분간 상온에서 배양하고 PBS로 3회 세척하였다. 표지된 세포는 로다민(rhodamine) 필터를 통해 관찰이 가능하다.
형광 표지한 세포를 DMEM 배지에 1X104 cells/5㎕가 되도록 준비한 다음 뇌 절편에 이식하였다. 세포를 이식한 뇌 절편은 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 10일간 배양하였으며 이때 콜린성 신경 분화 배지를 사용하여 이식된 세포가 도파민성 신경세포로 분화하도록 유도하였다. 10일 후 콜린성 신경세포(ChAT)에 대해 면역세포화학염색(참조예 2)을 시행하였다. 형광 표지된 세포들은 형광 현미경(Carl Zeiss Axioskop2+, Germany) 하에서 관찰하였으며, 콜린성 신경세포로의 분화 정도는 PKH26과 ChAT 가 이중 형광 표지 된 세포만을 측정하여 분화를 확인하였다.
상기와 같이 처리한 결과(도 10), 이식된 중간엽 줄기세포는 뇌 조직 내에서 생존해 있었으며, 그 중 일부는 신경세포로 분화하였음을 면역세포화학염색법을 통해 확인하였다.
본 발명에 따른 신경전구세포를 콜린성 신경세포(cholinergic neural cell)로 분화시키는 방법은 높은 분화율로 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시킬 수 있다.

Claims (18)

  1. (a) 신경전구세포(neural progenitor cell)를 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH) 및 레티논산(retinoic acid, RA)을 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(1차 배양),
    (b) 단계 (a)에서 얻어진 배양물을 염기성 섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)를 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(2차 배양), 및
    (c) 단계 (b)에서 얻어진 배양물을 아스코빈산(ascorbic acid, AA) 및 뇌-유래 신경영양 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)를 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(3차 배양)를 포함하는,
    신경전구세포를 콜린성 신경세포(cholinergic neural cell)로 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, (a) 신경전구세포(neural progenitor cell)를 50∼500 ng/ml의 SHH 및 0.1∼2 uM의 RA를 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(1차 배양),
    (b) 단계 (a)에서 얻어진 배양물을 1∼20 ng/ml의 bFGF 및 50∼500 ng/ml의 SHH를 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(2차 배양), 및
    (c) 단계 (b)에서 얻어진 배양물을 100∼300 uM의 AA 및 10∼20 ng/ml의 BDNF를 포함하는 N2 배지에서 배양하는 단계(3차 배양)를 포함하는,
    신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 1차 배양용 N2 배지가 500 ng/ml의 SHH 및 1 uM의 RA를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 2차 배양용 N2 배지가 10 ng/ml의 bFGF 및 500 ng/ml의 SHH를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 3차 배양용 N2 배지가 200 uM의 AA 및 20 ng/ml의 BDNF를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 1차 배양용 N2 배지가 500 ng/ml의 SHH 및 1 uM의 RA를 포함하고, 상기 2차 배양용 N2 배지가 10 ng/ml의 bFGF 및 500 ng/ml의 SHH를 포함하고, 상기 3차 배양용 N2 배지가 200 uM의 AA 및 20 ng/ml의 BDNF를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경전구세포가 제대혈 유 래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)로부터 얻어진 세포임을 특징으로 하는 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 신경전구세포가
    (a') 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 β-머캅토에탄올; 비필수 아미노산(nonessential amino acid); 글루타민; 및 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 탈분화배지에서 배양하는 단계, 및
    (b') 단계 (a')에서 얻어진 배양물을 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF); 염기성 섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF); 및 N2 보조제(N2 supplement)를 포함하는 N2 배지에서 배양하여 얻어진 세포임을 특징으로 하는 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 탈분화배지가 0.001%의 β-머캅토에탄올; 1X의 비필수 아미노산(nonessential amino acid); 2mM의 글루타민; 및 20%의 FBS을 포함하는 DMEM 배지인 것을 특징으로 하는 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 단계 (b')에서 사용되는 N2 배지가 20 ng/ml의 EGF; 20 ng/ml의 bFGF; 및 1X의 N2 보조제(N2 supplement)를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법.
  11. 50∼500 ng/ml의 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH) 및 0.1∼2 uM의 레티논산(retinoic acid, RA)을 포함하는 N2 배지(A),
    1∼20 ng/ml의 염기성 섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 50∼500 ng/ml의 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)를 포함하는 N2 배지(B), 및
    200 uM의 아스코빈산(ascorbic acid, AA) 및 20 ng/ml의 뇌-유래 신경영양 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)를 포함하는 N2 배지(C)
    로 이루어진 군으로부터 1 내지 3개 선택된, 신경전구세포(neural progenitor cell)의 콜린성 신경세포(cholinergic neural cell) 분화용 배지.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 상기 N2 배지(A)가 500 ng/ml의 SHH 및 1 uM의 RA를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
  14. 삭제
  15. 제11항에 있어서, 상기 N2 배지(B)가 10 ng/ml의 bFGF 및 500 ng/ml의 SHH를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제11항에 있어서, 상기 N2 배지(A)가 500 ng/ml의 SHH 및 1 uM의 RA를 포함하고, 상기 N2 배지(B)가 10 ng/ml의 bFGF 및 500 ng/ml의 SHH를 포함하고, 상기 N2 배지(C)가 200 uM의 AA 및 20 ng/ml의 BDNF를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
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