JP2007524411A - 角膜輪部由来の未分化幹細胞を有する組織系 - Google Patents

Abstract

本開示は自己再生性の輪部幹細胞を用いた組織系を記載し、ここで輪部幹細胞は主に未分化幹細胞（ＵＳＣ）である。組織系は単離された角膜輪部組織に由来し、そして、眼表面の損傷、特に輪部幹細胞不全を原因とするものを回復させるために適している。組織系は、例えば幹細胞特異的表面マーカー、例えば段階特異的胚性抗原マーカー４（ＳＳＥＡ−４）を発現する細胞を選択して分類することにより、ＵＳＣに対して組織系を選択的に増大させることにより、形成される。単離後、ＵＳＣをリッチ化培地の存在下に組織基材上で培養することにより組織系を形成し、これは移植、インプラント処置又はグラフト処置のために適している。

Description

（連邦支援研究又は開発に関する陳述）
該当せず。

（発明の分野）
本開示は、角膜輪部組織に由来し、そして、損傷又は疾患を有する眼表面を回復させるために適する、哺乳類未分化幹細胞、好ましくはヒト未分化幹細胞を含む組織系に関する。

（関連技術の説明）
幹細胞は生物の生涯に亘り細胞の交換及び組織の再生のために必要である。幹細胞は強力な増殖能力を有し、そして幹細胞に応じて数種の細胞系統に分化し、そして/または移植により組織を再生する細胞である。胚性幹（ＥＳ）細胞は無制限に自己新生し多能性の能力を有する典型的な幹細胞である。ＥＳ細胞は胚盤胞期の胚の内細胞塊に由来する。成人幹細胞はまた特殊化未分化幹細胞であり、これは出生後、成人期を通して生物が細胞を交換し、組織を再生する能力を保持する。一般的な理解においては、成人幹細胞はＥＳ細胞と比較して自己新生能力は低く、複数の系統に分化するが、一般的に多能性とは説明されていない。成人幹細胞（「組織特異的幹細胞」とも称される）は骨髄（非特許文献１）、神経組織（非特許文献２）、胃腸組織（非特許文献３）、表皮組織（非特許文献４）、肝組織（非特許文献５）及び間葉組織（非特許文献６）を含む成人身体の種々の組織のうちの極めて少数において発見されている。特に、哺乳類眼の角強膜輪部中に発見された成人幹細胞は健康な目の表面の維持のために必須であり、そして、健康な眼及び角膜表面の動的平衡に関与している。

眼表面は角膜上皮、結膜上皮及び前角膜涙液膜よりなる。健康な眼においては角膜上皮細胞は涙液プールに持続的に流れ込み、角強膜輪部幹細胞で補充されている。この新生は角膜輪部により生産された新しい細胞が輪部から求心的に、そして上皮の基底層から前方に移動して角膜上皮細胞を補充する場合に起こる（非特許文献７）。適切な補充が行われない場合は、不健康で異常な眼表面が不明瞭な視力又は眼の不快感のような症状をもたらす場合がある。輪部幹細胞の不全及び枯渇は例えば角膜表面上への結膜組織の要素の内生に起因する異常な角膜表面が形成される場合があり、それが角膜性の盲目、疼痛、光恐怖症等をもたらす場合がある（非特許文献８）。異常な角膜表面に起因する視力の消失は眼の残余が健康であるという事実にも関わらず起こる場合がある。

一次的な輪部幹細胞不全は無虹彩症、多発性内分泌機能低下関連角膜炎、輪部炎及び特発性疾患のような遺伝的状態により誘発される場合がある。無虹彩症は角強膜輪部の不完全な分化により誘発される遺伝的に決定される眼の異常であり、そして眼表面の異常並びに虹彩の非存在を特徴とする。二次的な輪部幹細胞の損失は後天的な状態、例えばスティーブン・ジョンソン症候群、感染症（例えば重度の細菌性角膜炎）、眼表面の腫瘍、化学的又は熱的な傷害又は紫外線照射への曝露により誘発される輪部幹細胞の外傷性破壊、複数の手術又は寒冷療法、角膜の上皮内の新生物、末梢潰瘍性及び炎症性の角膜炎、虚血性角膜炎、角膜症、コンタクトレンズ又はレンズ洗浄液により誘導される毒性作用、免疫学的状態、眼の瘢痕性類天疱瘡、翼状片症、擬似翼状片症等からも起こる場合がある。

即ち、高い増殖能力を有する輪部幹細胞は、それらが角膜表面の平衡を維持するために必要な角膜上皮細胞の確実な供給を与えるため、生存性で健康な眼表面の維持のために重要であることは明らかである（非特許文献９）。損傷又は疾患を有する目における輪部幹細胞の枯渇は輪部幹細胞の原料の再導入なくしては正常化することができない（非特許文献１０；非特許文献１１）。従って、輪部幹細胞の損失に起因する損傷は目への輪部幹細胞の原料の再導入なくしては修復できない（非特許文献９；非特許文献１２；非特許文献１３）。

角膜表面障害の後に正常な視力を回復するために幾つかの手法が試みられているが、それらの手法は一般的に輪部幹細胞の損失に関連又は起因する損傷の修復のためには十分ではない。１つの従来の手法は対象の目の表面上に直接羊膜を移植することにより輪部幹細胞の不全に起因する損傷した角膜表面を修復することである（非特許文献８）。羊膜移植は上皮化を促進し、正常な上皮表現型を維持し、炎症を低減し、瘢痕形成を低減し、組織の付着を低減し、そして目の血管化を低減することがわかっている。しかしながら、羊膜移植は均一に良好に行えないという不都合な点を有し、最終的な結果は患者の出発点からはそれほど差がない場合が多い（非特許文献１４）。この技術はまた角膜輪部幹細胞の正常な集団の回復においては限定された成功例しか有していない（非特許文献１５；非特許文献１６）。更にまた、羊膜移植は一般的に、患者の目に輪部幹細胞のかなりの集団が存在していれば成功の可能性が大きくなることから、患者が部分的輪部幹細胞不全に罹患している場合にのみ適用される。Ｈｕ等（特許文献１）が開示したような、ヒト羊膜上皮細胞を単離してそれを角膜表面上皮にまで分化させるための方法はやはり、それらが極めて労力集約的であり、輪部幹細胞の収率は低いという不都合な点を有している。

輪部幹細胞不全を治療するための別の手法では角膜移植を行うが、これもやはり、治療の最終的な成功は、レシピエントの角膜上皮によるドナーの角膜上皮の緩徐な置き換えに依存しており、これはレシピエントの目の輪部幹細胞の不全により予後不良であるため、慢性の眼表面の治療のためには問題がある（非特許文献１７）。更に別の輪部幹細胞不全治療の手法はレシピエントの目にドナーの目に由来する輪部グラフトを移植することである。この技術では好ましくは同じ患者に由来する健康な目から採取した、各々が輪部の弧の長さにおいて約６〜７ｍｍに亘っている２個の大型の遊離した結膜輪部グラフトを移植する。この操作法は結膜移植よりも効果的に角膜表面を回復させることがウサギモデルにおいて明らかにされており（非特許文献１８）、そして、多くの患者において経験されている眼の不快感を緩解するため、並びに、角膜の表面及び視力を回復するために使用されている。しかしながら、この操作法に伴う１つの大きな問題点はそれが患者の健康な目に由来する輪部幹細胞の大量の採取を必要とし、これは健康な目を、輪部幹細胞不全及び他の点においては健康な目の輪部幹細胞のこのような重度の損失から生じる別の合併症の危険に曝す可能性があるということである。

生存中のドナーから大量の輪部生検試料を採取するという難点を鑑みて、健康な目に由来する輪部上皮の少量の生検試料のみを採取することに依存している輪部幹細胞不全の治療のための他の方法が開発されている（非特許文献１９）。これ等の方法では２〜３週間プラスチックのペトリプレート上で輪部生検試料を培養する。輪部細胞がコンフルエントに達した後、それらをトリプシン処理することにより細胞培養物から収集し、患者の損傷を有する目に移植する。輪部生検試料を羊膜上に生育させる手法も行われている（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）が、これ等の培養物から単離して移植した輪部細胞は長期間のフォローアップでは不安定であり、特に重度の輪部幹細胞不全を有する患者では、満足できる眼表面修復を行えなかった（非特許文献２３）。羊膜を用いる別の手法は特許文献２に開示されており、これは特別に処理した羊膜上でエクスビボ培養された上皮幹細胞の移植を記載している。外科的グラフトを形成するための方法は輪部幹細胞の排他的選択のための単離工程の如何なる種類も使用しておらず、幹細胞層の分布はグラフト全体を通じて非均一である。グラフトのこれ等の特徴は特に輪部幹細胞不全の患者においては、移植された上皮細胞の安定性の欠如をもたらす。

グラフトを形成するための別の手法は特許文献３に記載されており、これは目の輪部及び／又は輪部周囲、又は、目の円蓋及び／又は結膜の領域に由来する生検試料を用いてインビトロでヒト目表面上皮の生検試料を生育させる方法を開示している。細胞を培養した後、それらを滅菌ガーゼ又は半剛性のレンズのような適当な担体を用いて目内に移植する。しかしながらこの方法は移植された分化した上皮細胞における輪部幹細胞の制限された供給のために、重度の輪部幹細胞不全患者では損傷を是正することができない場合がある。更にまた、重度の眼又は角膜の損傷を有する患者においては、コンタクトレンズの挿入は、すでに損傷を受けた表面上のコンタクトレンズの存在が刺激及び不快感を起こし、そして目の状態を更に悪化させて他の合併症を誘導するため、必ずしも望ましいものではない。別の特許出願である特許文献４は輪部幹細胞を培養するための修飾された表面を有するコンタクトレンズを使用する角膜疾患を治療するための角膜修復装置を開示している。方法は、例えば輪部幹細胞が損傷を受けた目の治癒を支援するためにレンズ上に播種された後に一定して放出されるかどうか不明確であることを含む幾つかの難点を有しており、そして、コンタクトレンズは１０％もの少ない輪部幹細胞を有する細胞集団で播種されており、これは重度の輪部幹細胞不全の患者においては良好な角膜修復のためには不十分である。

同様に、特許文献５は損傷又は疾患を有する角膜上皮表面の治療のための生体工学複合体グラフトを開示しており、そこでは複合体グラフトは分化した上皮細胞の多層上皮を含んでいる。ここでもまた、分化した上皮細胞のこれらのグラフトは輪部幹細胞が重度に不全である患者における良好な眼の修復のために必要な未分化輪部幹細胞の限定された集団を有するのみである。特許文献６は眼損傷を有する患者のためのグラフトとして使用するための輪部幹細胞の培養物に由来するインビトロのヒト上皮角膜板を再構築する方法を開示している。輪部幹細胞はクローン分析及びＫ１９、Ｋ１２、Ｋ３及びｐ６３のようなマーカーの使用により選択される。これ等のマーカーは細胞の角膜の性質を示すことが知られているが、単離された細胞が未分化であるかどうかを決定するためには、特に特異的なものではない。更にまた、開示において示されたクローン分析は基底輪部層に属するホロクローンである細胞が得られるように選択を行っており、必ずしも輪部幹細胞の細胞集団をリッチ化するために選択していない。従って、これ等のグラフトは重度の輪部幹細胞不全の患者における眼損傷を修復するためには十分適していないと考えられる。

特許文献７はまたともに分化クラスター（ＣＤ）に属する膜蛋白マーカーＣＤ３４又はＣＤ１３３を発現する幹細胞を選択することにより角膜組織から幹細胞を発見して単離するための方法を開示している。しかしながら、これ等のマーカーは輪部幹細胞よりもむしろヒト造血細胞系統を単離するために特異的である。従って、この方法は角膜組織の生検試料を汚染する可能性のある血球を優先的に選択する場合があり、この方法を用いて単離された細胞の未分化状態は評価されていない。
国際公開第００／７３４２１号パンフレット 米国特許出願公開第２００３／０２０８２６６号明細書 欧州特許第０５７２３６４号明細書 国際公開第０３／０３０９５９号パンフレット 米国特許出願公開第２００２／００３９７８８号明細書 米国特許第６，６１０，５３８号明細書 国際公開第０３／０９３４５７号パンフレット Ｗｅｉｓｓｍａｎ、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２０００年、第２８７巻、ｐ．１４４２−１４４６ Ｇａｇｅ、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２０００年、第２８７巻、ｐ．１４３３−１４３８ Ｐｏｔｔｅｎ、「Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．」、１９９８年、第３５３巻、ｐ．８２１−８３０ Ｗａｔｔ、「Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．」、１９９７年、第３５３巻、ｐ８３１ ＡｌｉｓｏｎおよびＳａｒｒａｆ、「Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．」、１９９８年、第２９巻、ｐ．６７８−６８３ Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１９９９年、第２８４巻、ｐ．１４３−１４７ Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓら、「Ｃｅｌｌ」、１９８９年、第５７巻、ｐ．２０１−２０９ Ａｎｄｅｒｓｏｎら、「Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．」、２００１年、第８５巻、ｐ．５６７−５７５ Ｔｓｅｎｇ、「Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．」、１９９６年、第２３巻、ｐ．４７−５８ Ｈｏｌｌａｎｄら、「Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｓｏｃ．」、１９９６年、第９４巻、ｐ．６７７−７４３ Ｔａｎら、「Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．」、１９９６年、第１０３巻、ｐ．２９−３６ Ｔｓａｉら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、２０００年、第３４３巻、ｐ．８６−９３ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、「Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．」、２００１年、第８５巻、ｐ．６０４−６０９ Ｐｒａｂｈａｓａｗａｔら、「Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ」、１９９７年、第１１５巻、ｐ．１３６０−６７ Ｓｈｉｍａｚａｋｉら、「Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ」、１９９７年、第１０４巻、ｐ．２０６８−２０７６ Ｔｓｅｎｇら、「Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．」、１９９７年、第１２４巻、ｐ．７６５−７７４ Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、１９８６年、第３１５巻、ｐ．５７−５９ Ｔｓａｉら、「Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ」、１９９０年、第９７巻、ｐ．４４６−４５５ Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら、「Ｌａｎｃｅｔ」、１９９７年、第３４９巻、ｐ．９９０−９９３ Ｋｏｉｚｕｍｉら、「Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ」、２０００年、第４１巻、ｐ．２５０６−２５１３ Ｋｏｉｚｕｍｉら、「Ｃｏｒｎｅａ」、２０００年、第１９巻、ｐ．６５−７１ Ｄｕａら、「Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．」、２０００年、第４４巻、ｐ．４１５−４２５ Ｊｕｎ Ｓｈｉｍａｚａｋｉら、「Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．」、２００２年、第１０９巻、ｐ．１２８５−１２９０

何れかの輪部細胞移植片の安定性及び良好度は、眼表面を再生するために生存輪部幹細胞を継続して再生するその能力に依存している。輪部幹細胞不全を治療するために現在使用されている移植片又はグラフトは一般的に、限定された量のみ存在する場合がある輪部幹細胞よりもむしろ分化した角膜上皮細胞を高いパーセンテージで含有する。そのような移植片又はグラフト中のドナー上皮は輪部幹細胞の限定された供給のため、短い期間のみ生存するのが一般的である。或いは、移植片は透明な角膜上皮をもたらすが、十分な輪部幹細胞が存在しないために、異常な上皮表面及び不良な治癒が生じ、これにより眼表面を修復したり視力を改善させたりすることができなくなる。従って、輪部幹細胞不全を有する目に輪部幹細胞を供給することを意図しているこれ等の手法は重篤な限界を有しており、これは、移植片又はグラフトに存在する自己再生能力を有する未分化輪部幹細胞の限定された供給に起因するものである。即ち、輪部幹細胞を再生して目に持続的に供給する能力を有する輪部幹細胞の十分な集団を提供することにより眼表面の障害を修復及び再構築することがより良好に行える移植片又はグラフトを提供することが望まれている。

（発明の簡単な要旨）
本開示は組織系を記載するものであり、ここで組織系は輪部幹細胞を含み、そして組織系の細胞の少なくとも約３０〜９０％が未分化幹細胞（ＵＳＣ）である。好ましくはＵＳＣは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の輪部幹細胞を組織系中に含む。種々の実施形態において、ＵＳＣはＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１及び幹細胞因子よりなる群から選択される幹細胞マーカー遺伝子１つ以上を発現する。好ましい実施形態においては、ＵＳＣは段階特異的胚性抗原マーカー４（ＳＳＥＡ−４）に関して陽性である。好ましい実施形態においては、組織系中のＵＳＣ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％が輪部幹ＳＳＥＡ−４に関して陽性である。他の好ましい実施形態においては組織系の細胞はＫ３／Ｋ１２、Ｋ１９及びｐ６３よりなる群から選択される細胞表面マーカー１つ以上を発現する。他の好ましい実施形態においては組織系は角強膜輪部組織に由来する。角強膜輪部組織は何れかの適当な哺乳類から得てよいが、ヒト組織が特に好ましい原料である。好ましくは組織系が多層組織系である。

本発明の開示はまた、下記工程：
（ａ）ドナーから角膜輪部組織を単離すること；
（ｂ）角膜輪部組織を培養して培養物中の角膜輪部細胞を増殖させること；
（ｃ）幹細胞特異的表面マーカーが未分化幹細胞（ＵＳＣ）により発現される場合に、幹細胞特異的表面マーカー１つ以上を選択するために角膜輪部細胞を分類することにより培養角膜輪部細胞から輪部幹細胞の集団を単離すること；
（ｄ）組織系を形成するためにＵＳＣの単離された集団を培養すること；
を含む、組織系が未分化幹細胞を含むような組織系を形成する方法を提供する。

好ましい実施形態においては、輪部幹細胞は、組織系の細胞の少なくとも約４０〜５０％、より好ましくは組織系の細胞の少なくとも約６０〜７０％、最も好ましくは組織系の細胞の少なくとも約８０〜９０％を含む。他の好ましい実施形態においては、輪部幹細胞はＵＳＣ、最も好ましくはヒトＵＳＣを含む。好ましくはＵＳＣは組織系の輪部幹細胞の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を含む。好ましい実施形態においては、ＵＳＣはＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１及び幹細胞因子よりなる群から選択される幹細胞マーカー遺伝子１つ以上を発現する。他の好ましい実施形態においては、組織系の細胞はＫ３／Ｋ１２、Ｋ１９及びｐ６３よりなる群から選択される細胞表面マーカー１つ以上を発現する。組織系を形成するために使用する角膜輪部組織は、何れかの適当な哺乳類から単離してよく、特に好ましい原料はヒト組織である。好ましくは、上記方法により形成された組織系はレシピエント、特に片方又は両方の眼において輪部幹細胞欠損を有するレシピエントへの移植、インプラント処置又はグラフト処置に適している。他の好ましい実施形態においては、レシピエント及びドナーは同様である。

組織系を形成するための上記した方法の他の好ましい実施形態においては、角膜輪部組織は好ましくは輪部幹細胞及びＵＳＣの好ましい生育を支援する培地中、例えば栄養血清及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、組み換えヒト表皮成長因子（ｒｈＥＧＦ）、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）よりなる群から選択される１つ以上の可溶性因子を更に添加したＤＭＥＭ又はＦ１２のような培地中で培養する。好ましくは、角膜輪部組織は培養物中の角膜輪部細胞がほぼコンフルエント、例えば８０％コンフルエントとなるまで培養する。

好ましい実施形態においては角膜輪部組織は例えば細胞外マトリックス担体又は生体コーティングペトリ皿のような、細胞外マトリックス又は生体コーティング表面のような適切な支持体物質上で培養する。好ましくは、細胞外マトリックスはヒト羊膜である。支持体物質はフィブリノーゲン、ラミニン、コラーゲンＩＶ、テナシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ウシ下垂体抽出物、ＥＧＦ、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子及びヒドロコルチゾン又はこれ等の組み合わせのような付着因子１つ以上で生体コーティングしてよい。細胞外マトリックス担体上で培養した角膜輪部細胞は好ましくはＵＳＣを単離する前に支持体物質から解離させる。好ましい実施形態においては角膜輪部細胞はＵＳＣの集団を単離するための磁気親和性細胞分類（ＭＡＣＳ）又は蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）のような当該分野でよく知られている方法を用いて分類する。他の実施形態においては、ＵＳＣを単離するために選択される１つ以上の幹細胞特異的表面マーカーは、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、幹細胞因子、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ５４及びＣＤ１１７を包含する（ただし、これらに限定されない）。特に好ましい実施形態において、ＵＳＣを選択するために使用される幹細胞特異的表面マーカーはＳＳＥＡ−４である。ＵＳＣはこれ等のマーカー１つ以上を発現する場合があり、従ってこれ等のマーカーを用いて角膜輪部細胞の集団から優先的に選択される。特定の実施形態においては、分類されたＵＳＣは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＳＳＥＡ−４陽性細胞を含む。

好ましい実施形態においてはＵＳＣの単離された集団を組織基材上で培養して組織系を形成する。好ましい実施形態においては、組織基材は哺乳類羊膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ラミニン、コラーゲン−ＩＶ又はコラーゲン−ＩＶシート、テナシン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン及びフィブリノーゲン及びトロンビンのシート（フィブリンシーラント、Ｒｅｌｉｓｅａｌ（商標））又は何れかのこれ等の組み合わせである。組織基材はまた支持体物質、例えばヒト羊膜、ラミニン、コラーゲンＩＶ、テナシン、フィブリノーゲン、トロンビン、フィブロネクチン又はこれ等の組み合わせ（ただし、これらに限定されない）で生体コーティングしてよい。特定の好ましい実施形態においては、組織基材はヒト羊膜、より好ましくは支持体物質で生体コーティングされたヒト羊膜である。ＵＳＣの単離された集団は好ましくは実質的な分化を起こすことなく細胞を増殖させることができる培地中、例えば不活性化されたヒト胚性線維芽細胞から得られたコンディショニングされた培地でリッチ化された培地、ヒト白血病抑制因子でリッチ化された培地、又は、ジメチルスルホキシド、組み換えヒト表皮成長因子、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン及び塩基性線維芽細胞成長因子よりなる群から選択される可溶性因子１つ以上を補給された培地中で培養する。

以下の図面は本明細書の部分を構成するものであり、本開示の特定の特徴を更に明らかにすることを意図している。本開示は本明細書に記載した特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれ等の図面の１つ以上を参照することにより、更に良好に理解される。

（発明の詳細な説明）
本発明の開示は好ましくは自己再生性であり角膜輪部組織に由来する未分化幹細胞（ＵＳＣ）を含む組織系、並びに組織系の形成方法及びその用途を記載する。本明細書においては、「組織系」とは哺乳類対象への移植、インプラント処置又はグラフト処置に適する、好ましくは適切な組織基材上にＵＳＣを含む細胞の集団である。好ましくは、組織系は移植片、インプラント又はグラフト、例えば外科用グラフト又は複合グラフトに細胞の多層凝集物を付したものである。本明細書においては、「未分化幹細胞」又は「ＵＳＣ」という用語は未分化又は実質的に未分化の細胞又は未拘束の前駆細胞を指し、幹細胞特異的マーカー、好ましくは胚性幹細胞特異的マーカー１つ以上を発現するものである。本開示のＵＳＣはＥＳ細胞様の特性及び特徴、例えばＥＳ特異的マーカー、例えばＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ、Ｔｒａ−１−６０の発現、及び／又は、培地中の長期の増殖を示す。更に、本開示のＵＳＣは増殖して子孫細胞を形成してよく、これは環境の条件に応じて未分化又は分化した細胞であってよい。例えば本開示のＵＳＣは目の眼表面の健康な機能に必須である角膜上皮細胞に分化する能力を有する。本明細書においては、「分化」という用語は未分化幹細胞又は前駆細胞がより特殊化された経過を取る過程を指す。

好ましい実施形態においては、ＵＳＣを有する組織系はヒトドナーの角強膜又は角膜の輪部組織に由来する。特に、本発明の開示は自己再生ＵＳＣを伴った組織系であり、好ましくはＵＳＣの大集団、例えば少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％のＵＳＣを含む。大集団又は高いパーセントのＵＳＣが組織系内に存在することは、哺乳類対象への移植、インプラント処置又はグラフト処置後の損傷又は疾患を有する眼表面を回復させる組織系の能力を大きく向上させる。更にまた、組織系におけるＵＳＣの高い比率は、眼表面の健康な機能に必須である生存性の輪部幹細胞による眼表面の持続的再生により、より長期間に亘り系を安定にすることができる。特定の実施形態においては、組織系は複数のＵＳＣを有する細胞外マトリックス担体、例えば羊膜を含む複合体グラフトであり、この場合、複数のＵＳＣは細胞外マトリックス担体上にエクスビボで培養される。

好ましくは、組織系は損傷又は疾患を有する目に移植、インプラント処置又はグラフト処置され、そして、特に損傷又は疾患を有する目における重度の輪部幹細胞不全を有する対象において、眼表面の障害を修復することができる。本明細書においては、損傷又は疾患を有する目における重度の輪部幹細胞不全を有する対象は、その損傷又は疾患を有する目において、まったく輪部幹細胞を有さない場合がある。好ましい実施形態においては、ＵＳＣを有する組織系を形成するために使用する輪部組織生検試料のドナーはまた組織系移植片、インプラント又はグラフトのレシピエントである（即ち自己組織系）。或いは、輪部組織生検試料のドナーがレシピエントでない場合は、ドナーは好ましくは生体適合性ドナー、例えば移植片又はグラフトのレシピエントの近親であるか、又は、生体適合性（例えば組織適合性）の死体に由来するものであってよい（即ち同種異系の組織系）。組織拒絶の問題を回避するためには移植された細胞又は組織は移植片のレシピエントと遺伝子的に同一であることが一般的には望ましい。

本明細書に開示した組織系を得るための原料として角膜輪部組織を用いることの多大な利点はドナーから角膜輪部組織を得ることが比較的容易であることである。方法は、安全、単純及び効率的である最小限の手術のみを必要とし、そして角膜輪部組織の少量の生検試料を必要とするのみである。角膜輪部組織は角膜内に存在し、透明で非血管性の組織であり、前眼の外表面に位置する。環境による侵害から保護し、目への光の効率的な透過を可能にする。角膜は２つの主要なコンパートメント、即ち（１）前眼非角化重層扁平上皮層、及び（２）伏在する固有質よりなる。ヒト角膜は３種の既知細胞型、即ち、角膜上皮細胞；間質性の角膜実質細胞（角膜線維芽細胞）；及び間質を伴った角膜内皮細胞の伏在層を有する。角膜上皮は５〜７細胞の厚みを有し、角膜の前表面を被覆する細胞の多層である。通常は角膜上皮細胞の天然のターンオーバーが起こり、その際、表在する上皮細胞は上皮表面から脱落し、下部から生じるもので置き換えられる。基底上皮細胞は、周囲から内部に向かって遊走し、より深部の角膜上皮細胞の集団を補充する。

角膜輪部（角強膜輪部としても知られる）は角膜と眼球結膜及び強膜の間にある幅約１ｍｍの輪状の過渡的な区域である。これは透明の角膜と強膜の間に線を形成する僅かな溝として眼球の外表面上に現れる。高度に血管化され、角膜の代謝に関与する。輪部及び結膜の上皮細胞は安定な前眼涙液膜と一緒になって角膜の一体性を維持している。補給される角膜上皮の原料は成人幹細胞であることが知られているが、これ等の細胞の厳密な位置及び特徴は未知であった。ＥＳ細胞様の特性を有する角膜輪部のＵＳＣの集団の存在は、本発明者等により単離され、特性化されるまでは未知であった。本開示は損傷又は疾患を有する目の眼表面を回復するために使用してよい角強膜輪部に由来するＵＳＣの高いパーセントを有する組織系を記載する。

角膜輪部組織を単離するための典型的な操作法はドナーの目の角膜表面の上部又は側部の四分円から輪部組織０．８〜３ｍｍ^２よりなる少量の生検試料を外科的に摘出することである。このような生検試料を例えば層間角膜切除術により角膜輪部から得るための操作法は当該分野でよく知られている。ドナーより生検試料を摘出した後、それは、輪部組織の生検試料を本明細書に開示した組織系内に培養できるような施設まで輸送しなければならない。輪部組織の生検試料の十分な部分が、組織系をそこから得ることができるように、輸送中に生存し続けることが重要である。好ましくは、輪部組織生検試料は生検試料の生存性を支援する培地中で輸送又は保存する。生検試料を輸送するための好ましい培地はヒト臍帯血清（３〜５％）、ＤＭＳＯ（０．１〜０．５％）、ｒｈＥＧＦ（０．５〜２ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（０．５〜５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（０．５〜５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．５〜５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．１〜０．５μｇ／ｍｌ）、コレラ毒Ａ（０．０１〜０．１ナノモル／ｌ）、ゲンタマイシン（１０〜５０μｇ／ｍｌ）及びアンホテリシンＢ（０．５〜１．２５μｇ／ｍｌ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びＨａｍのＦ−１２（比率１：１）を包含する。好ましくは、輪部細胞生検試料をドナーからの外科的摘出後４８時間以内に培地中に入れる。

輪部組織がドナーから生検試料採取された後、これを好ましくは細胞外マトリックス又は生体コーティング表面、例えば細胞外マトリックス担体又は生体コーティングペトリ皿のような適切な支持体物質とともに培地中で培養する。輪部組織生検試料は未損傷の体外移植組織として培養するか、又は、培養の前に解離させて単細胞懸濁液としてよい。好ましい実施形態においては、支持体物質の存在は組織培養プレートへの生検試料中の輪部幹細胞の結合を促進し、これにより輪部幹細胞の生育を促進する。好ましくは体外移植組織は小片に切断した後に培地に入れる。輪部組織を培養するために有用な支持体物質の例はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）及びその等価物、哺乳類羊膜、好ましくはヒト羊膜、ラミニン、テナシン、エンタクチン、ヒアルロン、フィブリノーゲン、コラーゲン−ＩＶ、ポリ−Ｌ−リジン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−オルニチン、フィブロネクチン、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）等を包含し、これ等は単独又は他の支持体物質と組み合わせて使用する。支持体物質はまた、１つ以上の別の成長因子又は付着因子、例えばフィブリノーゲン、ラミニン、コラーゲンＩＶ、テナシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ウシ下垂体抽出物、ＥＧＦ、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、ヒドロコルチゾン又はその組み合わせで処理してもよい。

ヒト羊膜は生検試料採取された輪部組織を培養するために好ましいものであり、そして、当該分野でよく知られている方法を用いて製造できる（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許６，１５２，１４２及びＴｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１２４：７６５−７７４を参照できる）。例えば羊膜は、凍結／解凍、酵素的消化及び機械的掻き取り、そしてその後の成長因子、細胞外マトリックス化合物及び／又は接着増強分子による表面の処理により、内因性羊膜上皮細胞を摘出することにより輪部幹細胞の生育を増強するために調整してよい。羊膜はそれがＵＳＣの生存性及び生育を促進する天然の基材であることから組織系の形成のための好ましい基材である。１つの実施形態において、羊膜は基底膜又は間質の側を上にしてＵＳＣ培養用の培養プレート上に平滑になるように固定する。細胞外マトリックス物質又は生体コーティング表面を使用する好ましい方法は後述する実施例に記載する。

輪部組織生検試料を培養する好ましい方法は体外移植組織を細胞外マトリックス又は生体コーティング組織培養プレート上に置く前又は後に数分間体外移植組織を乾燥インキュベーションに付することである。次に少量の培地を体外移植組織に添加することにより、それが細胞外マトリックス又は生体コーティング組織培養表面に付着させる。数時間〜１日の後、更に培地を穏やかに添加し、一日おきに培地を交換しながらＣＯ_２インキュベーター中３７℃で数日間体外移植組織をインキュベートする。好ましくは、幹細胞が培地中で増殖を開始した後に元の輪部組織生検試料の小片を培地から取り出す。別の実施形態においては、輪部組織生検試料は単細胞懸濁液の形成のために使用してよく、これを後に培養して本明細書に開示する組織系を形成する。例えば、輪部組織生検試料を洗浄し、次に、酵素的に、例えばトリプシン−ＥＤＴＡを用いて処理する（例えば０．２５％、２０〜３０分）か、又は分散（例えば４℃一夜）させてＵＳＣを含む単細胞懸濁液を形成する。酵素的処理は上皮の分離を可能にし、これにより単細胞懸濁液中の間質又は間葉細胞を低減又は非存在とすることができる。

輪部組織の培養のために使用する好ましい培地は好ましくは栄養血清、例えば細胞の成育及び生存性を維持するために有効な栄養を補給する血清又は血清系（例えばノックアウト血清、熱不活性化ヒト血清又はヒト臍帯血血清）の溶液を添加したＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）培地である。培地には成長因子も添加してよい。本明細書においては、「成長因子」という用語は細胞の増殖及び分化を活性化するという一次的結果を有する細胞表面上の受容体に結合する蛋白を指す。輪部組織を培養するために使用する成長因子は好ましくは上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒトトランスフェリン又はヒト白血病抑制因子（ｈＬＩＦ）並びにこれらの組み合わせから選択する。しかしながら、当該分野で知られている何れかの適当な培地を使用してよい。特定の実施形態においては輪部細胞には培地中でＵＳＣを好ましく増殖させるサイトカイン又は他の成長因子が投与される。

輪部組織を数日間、例えば細胞がコンフルエントとなるまで培養した後、ＵＳＣを培養物から単離することができる。好ましくは、輪部組織培養物は少なくとも約約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％コンフルエントとなるまで生育させる。好ましい実施形態においては、輪部細胞をまず、好ましくは酵素的消化を介して、例えばトリプシン−ＥＤＴＡ又はヂスパーゼ溶液を用いて、細胞外マトリックス又は生体コーティング組織培養プレートから解離させる。ＵＳＣは当該分野で知られた種々の方法、例えば免疫標識及び蛍光分類、例えば固相吸着、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、磁気親和性細胞分類（ＭＡＣＳ）等を用いて培地中の他の輪部細胞から単離することができる。好ましい実施形態においては、ＵＳＣは分類、例えば特定の細胞表面マーカーの免疫蛍光分類を解して単離する。当該分野でよく知られている分類の２つの好ましい方法はＭＡＣＳ及びＦＡＣＳである。

免疫蛍光染色法のような分類技術では、培養物中の他の細胞からＵＳＣを分離するために適切な幹細胞マーカーを使用する。培養輪部細胞からＵＳＣを単離するために使用してよい適切な幹細胞特異的表面マーカーの例は、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ５４及びＣＤ１１７を包含する（ただし、これらに限定されない）。好ましい実施形態においては、ＵＳＣはＳＳＥＡ−４のような細胞表面マーカーの使用を介してＭＡＣＳにより単離する。この手段により、輪部組織生検試料から培養された細胞の混合集団から細胞表面マーカー陽性ＵＳＣのリッチ化された集団が得られる。あるいは、細胞はＵＳＣ上に存在しない細胞表面マーカーに関して選択することにより望ましくない細胞を除去するべく分類することもできる。輪部組織から単離したＵＳＣの場合は、ＵＳＣは以下の細胞表面マーカー、即ちＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１３３、ＣＤ１０６、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに関して陰性となる。

分類により得られるリッチ化された輪部細胞培養物は少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％、ＵＳＣを有する。好ましい実施形態においては、単離された細胞は少なくとも約５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％ＳＳＥＡ−４陽性ＵＳＣである。別の実施形態においては、輪部細胞を含有する混合細胞培養は特定の遺伝子マーカーの発現に関してスクリーニングすることによりＵＳＣの存在に関してスクリーニングされる。混合輪部細胞培養物の場合は、ＵＳＣ集団はＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、ＴＤＧＦ、ＵＴＸ−１、ＦＧＦ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１並びに他の未分化細胞遺伝子マーカー又はこれ等の組み合わせのような遺伝子マーカーの発現により発見することができる。

ＵＳＣに関してリッチ化された輪部細胞集団を上記した方法の１つにより単離した後、単離された細胞は好ましくはコンディショニング下に、そして、ＵＳＣの生育及び損傷又は疾患を有する目に対する移植、インプラント処置又はグラフト処置のための組織系の形成を支援する培地中で培養する。好ましくは、これ等の条件下に培養される組織系は少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％ＵＳＣを含む。好ましい実施形態においては、単離されたＵＳＣはＵＳＣを有する組織系の形成のためのリッチ化された培地の存在下に組織基材上で培養する。好ましくは組織基材は天然の眼表面を模倣した特性、例えば透明で薄く可撓性があり生体適合性の非血管化及び非抗原性であるという特性を有し、そして、ＵＳＣの生育並びに移植、インプラント処置又はグラフト処置後の正常な分化を支援することができる。

好ましい実施形態においては組織基材は哺乳類羊膜、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）及びその等価物、ラミニン、テナシン、エンタクチン、ヒアルロン、フィブリノーゲン、トロンビン、コラーゲン−ＩＶ、コラーゲン−ＩＶシート、ポリ−Ｌ−リジン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−オルニチン、フィブロネクチン、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンビンシート（フィブリンシーラント、Ｒｅｌｉｓｅａｌ（商標）、Ｒｅｌｉｓｅａｌ Ｌｉｆｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）等又はこれ等の組み合わせから選択する。別の実施形態においては、組織基材はコラーゲンゲル又はフィブリンゲルであり、ゲルは更に組織系を形成するための他の望ましい細胞型、例えば線維芽細胞、例えば角膜間質線維芽細胞、間葉組織の誘導体、及び上皮細胞、例えば角膜上皮細胞を含んでよい（ただし、これらに限定されない）。さらに別の実施形態においては、組織基材はヒドロゲル、例えば合成ヒドロゲル、軟質ヒドロゲルコンタクトレンズ又はポリ−ＨＥＭＡマトリックスである。好ましい実施形態においては、組織基材は組織系の移植、インプラント処置又はグラフト処置の後にインビボで徐々に再吸収される。更に、組織基材は好ましくは非抗原性であり、多大な線維血管生育を伴うことなく上皮形成を促進する。

本明細書に開示した組織系を形成する場合に使用するための好ましい組織基材はヒト羊膜であり、これは当該分野でよく知られている方法を用いて製造してよい。ヒト羊膜は上皮表面を伴ったまま未損傷で、又は、上皮細胞を剥離して使用してよい。ヒト羊膜を製造するための好ましい方法は後述する実施例に開示する。他の好ましい実施形態においては、組織基材は別の支持体物質、例えば組織基材へのＵＳＣの結合を促進する物質で生体コーティングされる。使用してよい別の支持体物質は好ましくはフィブリノーゲン、ラミニン、コラーゲンＩＶ、テナシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ウシ下垂体抽出物、ＥＧＦ、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、ヒドロコルチゾン又はこれ等の組み合わせから選択される。

輪部細胞を培養し組織系を形成するために使用する好ましいリッチ化培地は好ましくは栄養血清、例えばＵＳＣの成育及び生存性を維持するために有効な栄養を補給する血清又は血清系（例えばノックアウト血清、熱不活性化ヒト血清又はヒト臍帯血血清）の溶液を添加したＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）培地である。培地には成長因子も添加してよい。培地はまた不活性化ヒト胚性線維芽細胞培養用培地（例えば３０〜５０％）から得られたコンディショニングされた培地、又は、ｈＬＩＦ（例えば４〜１２ｎｇ／ｍｌ）又はＵＳＣの生育を促進する他の成長因子を添加した培地を用いてリッチ化してよい。輪部細胞を培養するために使用される他の因子は好ましくはＤＭＳＯ、ヒドロコルチゾン、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒロトランスフェリン、ラミニン、フィブロネクチン等並びにこれ等の組み合わせから選択する。好ましくは何れかの段階の輪部細胞を培養するために使用される生育促進剤はヒト組み換え起源のものである。リッチ化培地はまた移植、インプラント処置又はグラフト処置の前に組織系を輸送するためにも使用してよい。

他の好ましい実施形態においては、組織系を製造するために使用する培地、例えば輪部組織生検試料を輸送するために使用する培地、生検試料を培養するために使用する培地、輪部幹細胞を培養するために使用するリッチ化培地、及び、組織系を輸送するために使用する培地は、如何なる血清又は他の動物起源の因子も含有しない。これにより異種の成分による組織系の汚染の危険性を最小限とし、これにより、組織系をヒトへの投与のために安全なものとする。

ＵＳＣを培養するために適用することができる細胞培養に関する一般的な手法及びＥＳ細胞の培養については、実行者は標準的なテキストブック及び論文、例えば各々が参照により本明細書に組み込まれるＥ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，“Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ” ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．１９８７；Ｈｕ ａｎｄ Ａｕｎｉｎｓ （１９９７），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：１４８−１５３；Ｋｉｔａｎｏ （１９９１），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：７３−１０６；Ｓｐｉｅｒ（１９９１），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：３７５−７９；Ｂｉｒｃｈ ａｎｄ Ａｒａｔｈｏｏｎ（１９９０），Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２５１−７０；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１０）：９７１−４；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．７ Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ８３−９３を参照することができる。

ＵＳＣを含む輪部細胞はＵＳＣが実質的に未分化の状態に維持されるような適切な培地中で培養又は継代する。集団内のＵＳＣのコロニーは分化した近隣の細胞に隣接してもよいが、しかしなお、ＵＳＣの培養は、適切な条件下に集団を培養又は継代すれば実質的に未分化のまま残存し、そして個々のＵＳＣは細胞集団のかなりの比率を構成する。実質的に未分化である未分化幹細胞培養物は、少なくとも約２０％の未分化ＵＳＣを含有し、そして少なくとも約４０％、６０％、８０％又は９０％ＵＳＣを含有してよい。例えば培地中のＵＳＣは適切な細胞密度において維持され、そして分化を防止するために培地を頻繁に交換しながら継代される。長期の培養において、細胞を継代する場合は、それらを分散させて小クラスター又は単細胞懸濁液としてよい。典型的には、細胞の単細胞懸濁液を作成し、次に別の組織培養等級のプラスチック皿に播種する。

培養はＵＳＣを実質的に分化させることなく少なくとも２０、４０、６０、８０、１００継代以上に連続的に継代することができる。ＵＳＣを含有する輪部細胞培養物は好ましくはヒト臍帯血から採取した１０〜９０％熱不活性化血清及び５〜１０％ＤＭＳＯを含有する培地を含む凍結培地中で、分化能を失うことなく種々の時点において将来使用するために低温保存することができる。好ましくはＵＳＣを含む輪部細胞培養物は各継代の後に例えば低温保存により保存され、これにより更に別の、又は複数の組織系が単一の輪部組織生検試料から形成できるようにする。これ等の低温保存培養物は、何れの所定の時点において将来使用するために、未分化の自己再生性で生存性の輪部幹細胞のプールとして機能する。例えば、これ等の低温保存された培養物は、免疫抑制、過去の手術の合併症、感染症等に起因するレシピエントにおける組織系の不具合が生じた場合の自系の使用のための別の組織系を形成するために使用してよい。これ等の低温保存された培養物はまた、生体適合性の患者のための別の組織系を形成するために使用してよい。これ等の保存された培養物の利用可能性はまた、組織系に不具合があった場合にドナーから別の輪部組織を摘出する必要をなくし、これにより、将来の自系輪部幹細胞の原料の枯渇の危険性を防止する。

本明細書に開示した組織系における細胞はＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、ＴＤＧＦ、ＵＴＸ−１、ＦＧＦ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１並びに他の未分化細胞遺伝子マーカー又はこれ等の組み合わせのような特定の幹細胞特異的マーカーの発現に関してスクリーニングすることにより、ＵＳＣの存在についてスクリーニングしてよい。これらの幹細胞特異的マーカー、特にＥＳ細胞特異的マーカーの陽性発現は、組織系がＥＳ細胞様の特性及び特徴を示すＵＳＣを含むことを示す。組織系の細胞はまた、例えばｐ６３、Ｋ３、Ｋ１２、Ｋ１９等又はこれ等の組み合わせのような組織系における細胞の角膜の性質を示す特定のマーカーの発現に関してスクリーニングすることにより、ケラチノサイトの存在について特性化してよい。組織系の形態学的特徴及び表現型は例えば免疫蛍光又はイムノパーオキシダーゼ試験により分析してよい。本明細書に開示した組織系はまた、眼の損傷を修復するために良好な移植片、インプラント又はグラフトとして組織系が使用されるために必要な分化の水準があればそれを測定するための別のマーカーに関してスクリーニングしてもよい。

本明細書に開示した組織系を形成した後、これは移植片、インプラント又はグラフトに対応したレシピエントの位置に輸送しなければならない。好ましくは、組織系を輸送するために使用する手段は、輸送後もそれが移植片、インプラント又はグラフトとして有用であるために十分な組織系の生存性を維持する。好ましい実施形態においては、組織系は、好ましくはＵＳＣを含む組織系を培養するために使用されるリッチ化培地である輸送用培地の入った特別に設計された受容器中で輸送する。特別に設計された輸送用受容器は好ましくは培養インサート上に締結された組織系を支持するためのハウジングベースの上端内に位置する平行手段を伴った組織系を受容するために上端において開口し、下端において閉鎖している携帯用の円筒形のハウジングベース、及び、ハウジングベースの上端の開口部を閉鎖するためのキャップを含む。輸送用受容器は特殊な組織培養等級のプラスチック−１、医療用等級のステンレス、例えばＳＳ３１６Ｌ又は何れかの他の適当な等級、医療用等級のシリコン、又は何れかの他の適当な組織培養等級の物質から構築してよい。好ましくは、輸送用の受容器は安全な状態で組織系を保持するものであり、これにより組織系が輸送中に損傷を受ける機会を最小限にする。

本明細書に開示したＵＳＣを含む組織系は、例えば一方又は他方の目における輪部幹細胞不全を有する対象のための移植片、インプラント又はグラフトとして、治療用途のために利用できる。本開示の組織系は治療の必要ないずれかの対象、例えばヒト、霊長類及び家畜、牧畜動物、愛玩動物又は競技動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラット、マウス等を治療するために使用できる（ただし、これらに限定されない）。本明細書においては、「治療用」、「治療的に」、「治療するため」、「治療」又は「療法」という用語は治療的な施療及び予防的又は防御的な施療の両方を指すものとする。治療的な施療とは例えば特定の疾患、状態、傷害又は障害の症状を低減又は排除すること、又は、既存の疾患又は障害の進行を緩徐化又は減衰するか、又は治癒させることを包含する（ただし、これらに限定されない）。このような治療の必要な対象は機能を回復又は再生するための組織系の治療有効量により治療される。本明細書においては、組織系の「治療有効量」とは、輪部幹細胞の損失、損傷、誤機能又は変性により生じた対象における生理学的作用を停止又は軽減するために十分な量である。使用される細胞又は組織の治療有効量は対象の必要性、対象の年齢、生理学的状態及び健康、所望の治療効果、治療のためのターゲティングされる組織の領域の大きさ、インプラント処置の部位、病変の範囲、選択された送達経路及び治療手法により異なる。これ等の組織系は好ましくは意図する部位に組織系がグラフティングされ、機能的不全の領域を再構成又は再生できるような態様において患者に対して投与される。

好ましい実施形態においては本開示の組織系は眼の損傷又は疾患、特に眼表面の障害を有する対象を治療するために使用される。或いは、開示された組織系は輪部組織に由来する未分化幹細胞の原料から治療上の利益を被る他の疾患又は損傷を治療するため、例えば熱傷皮膚領域を修復するために使用してよい。開示された組織系は、無虹彩症、多発性内分泌機能低下関連角膜炎、輪部炎及び特発性疾患のような遺伝的状態により誘発される場合がある一次輪部幹細胞不全、又は、スティーブン・ジョンソン症候群、感染症（例えば重度の細菌性角膜炎）、眼表面の腫瘍、化学的又は熱的な傷害又は紫外線照射へのばく露により誘発される輪部幹細胞の外傷性破壊、複数の手術又は寒冷療法、角膜の上皮内の新生物、末梢潰瘍性及び炎症性の角膜炎、虚血性角膜炎、角膜症、コンタクトレンズ又はレンズ洗浄液により誘導される毒性作用、免疫学的状態、眼の瘢痕性類天疱瘡、翼状片症、擬似翼状片症等のような後天性の状態から生じる場合がある二次的な輪部幹細胞の損失を有する対象を治療するために特に適している。好ましくは、組織系は対象に対して移植、インプラント処置又はグラフト処置され、そして好ましくは対象の損傷又は疾患を有する目に安定な輪部幹細胞集団を提供することにより、対象における眼の損傷又は疾患を修復することができる。好ましい実施形態においては、組織系の移植、インプラント処置又はグラフト処置は上皮化を促進し、正常な上皮の表現型を維持し、炎症を低減し、瘢痕形成を低減し、組織接着を低減し、血管化を低減し、そして目の視力を向上させる。

例えば、組織系は損傷を受けた角膜を修復するために移植、インプラント処置又はグラフト処置できる。多くのこのような方法が当該分野でよく知られているが、１つのそのような方法では輪部において周囲摘出した後に、輪部周囲の結膜下の瘢痕及び炎症組織を除去して露出した強膜とする。角膜の線維血管組織は層状角膜切除術により除去してよい。組織系はレシピエントの目の大きさに従って採寸し、相当するレシピエントの輪部領域に移植又はグラフト処置する。或いは、組織系は全層状角膜組織として使用してよく、そして全体の領域を被覆するための層状角膜移植として移植又はグラフト処置してよい。移植、インプラント処置又はグラフト処置された組織系はその後、例えば縫合又は当該分野でよく知られている他の手段により損傷部位に固定される。

以下の実施例は本開示の好ましい実施形態を明らかにするものである。当業者の知るとおり以下に記載する実施例に開示されている手法は本発明の実施において良好に機能することを本発明者等が発見した手法を示すものであり、従ってその実施のための好ましい様式を構成していると見なされるものである。しかしながら、本発明の開示に鑑みて、当業者等は、多くの変更を開示された特定の実施形態に対して行うことができ、本発明の精神及び範囲を外れることなく同様の結果を得ることができることを認識すべきである。

（実施例１）
１）輪部組織生検試料の収集
ヒト患者からの輪部組織生検試料の収集を開始する前に、治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）の認可を得た。インフォームドコンセントを各患者及びドナーより入手し、そして全てのヒト試験対象はヘルシンキ条約に従って取り扱った。０．８ｍｍ^２〜２ｍｍ^２の輪部生検試料を、層状角膜切除術により角膜表面の上方又は側方の四分円からドナーの目より外科的に摘出した。これ等の領域は輪部幹細胞が特にリッチ化されている。切除の後、生検試料は即座に輸送用培地の入った２ｍｌ輸送用バイアルに入れた。輸送用培地は５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又は５％ヒト臍帯血清、０．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、２ｎｇ／ｍｌ組み換えヒト表皮成長因子（ｒｈＥＧＦ）、５μｇ／ｍｌインスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５μｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、０．１ｎｍｏｌ／ｌコレラ毒Ａ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びＨａｍのＦ−１２（ＤＭＥＭ：Ｆ−１２；１：１）よりなるものとした。血液試料は各ドナーからも収集し、各輪部組織生検試料とともに中央に位置するｃＧＭＰ施設に輸送した。血液試料は感染性疾患、例えばＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、梅毒及びＣＭＶについて即座に試験した。

２）輪部幹細胞培養物の作成のための輪部生検試料の培養
輪部生検試料から得た輪部組織をまずリンゲル液（ペニシリン、ストレプトマイシン及びゲンタマイシン添加ＰＢＳ）で数回洗浄し、切断して小片とした。これ等の輪部組織小片を２〜５分間乾燥インキュベートし、次に環状のインサート中の生体コーティングした羊膜上においた。１０％ノックアウト血清添加ＤＭＥＭ培地少量（１５０〜２００μｌ）を各プレートに添加し、生体コーティング組織培養表面への生検小片の付着を促進した。翌日、同じ培地２ｍｌをプレートに添加し、ＣＯ_２インキュベーター中３７℃で４〜５日間インキュベートした。４〜５日後、培地中の輪部幹細胞は増殖を開始した。この時点において、滅菌ピンセットを用いて培地から穏やかに慎重に生検試料を取り出し、輪部幹細胞を培地中に残存させるように、増殖を継続させた。この方法は培地中の間葉又は線維芽細胞の生育を回避させるものであった。輪部幹細胞を約８０％コンフルエントとなるまで、典型的には培養７〜２１日後まで生育させた。

３）培養された輪部幹細胞からの未分化幹細胞の単離及び組織系の形成
輪部細胞培養物が所望の水準までコンフルエントとなった後、培養細胞を磁気親和性細胞分類（ＭＡＣＳ）に付すことによりＵＳＣである多能輪部幹細胞を単離した。培養細胞をまず０．０５％トリプシンＥＤＴＡを用いて分散させた。トリプシンはトリプシン阻害剤又はウシ胎児血清を含有する等量の培地を添加することにより中和した。その後細胞をピペット処理により単細胞懸濁液とし、血球計を用いて計数した。次に細胞を遠心分離してリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００μｌあたり１０^７個の濃度に再懸濁した。細胞を１μｌの一次抗体ＳＳＥＡ−４（１：６０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。ＳＳＥＡ−４一次抗体とともにインキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、未結合の抗体を除去した。ＳＳＥＡ−４一次抗体に結合するヤギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート二次抗体ビーズ（１：１０、Ｍｅｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の２０μｌ懸濁液を細胞懸濁液２００μｌに添加し、十分に混合し、２０分間４℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、未結合の二次抗体を除去した。

次に細胞懸濁液を製造元（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の取扱説明書に従ってＭＡＣＳ磁気カラムに通し、ＳＳＥＡ−４陽性細胞を単離した。陰性画分をまず収集し、カラムをＰＢＳで２回洗浄した。次にカラムを磁石からはずし、ＳＳＥＡ−４陽性細胞を有する陽性画分を収集した。

４）組織系のための組織基材としての羊膜の調製
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、フィブリノーゲン、ＰＤＧＦ，ラミニン、ＥＧＦ又はコラーゲンＶのような数種類の適当な細胞外マトリックス担体が輪部幹細胞培養用の組織基材として使用するために入手可能であるが、ヒト羊膜を用いて輪部幹細胞を培養した。これ等の羊膜培養物の製造はヒト胎盤膜の収集により開始した。胎盤膜は選択的帝王切開手術から採取し、５０単位／ｍｌペニシリン、５０単位／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌネオマイシン及び２．５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸塩緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）よりなる輸送用培地中で実験施設に輸送した。胎盤膜は手術後３時間以内に実験室に輸送した。血液試料は各ドナーからも採取し、上記した通り感染症診断試験に付した。

受領後、胎盤は洗浄培地で洗浄することにより粘液及び血液凝固塊を除去した。洗浄培地は５０単位／ｍｌペニシリン、５０単位／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌネオマイシン及び２．５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを添加したＤＰＢＳよりなるものとした。胎盤組織は滅菌鋏を用いて羊膜から除去し、羊膜は少なくとも７回十分に洗浄することにより実質的に全ての血液凝固塊を除去した。次に絨毛膜を平坦ピンセットで羊膜から剥離し、羊膜の上皮側を洗浄培地で５回洗浄した。次に羊膜を滅菌ニトロセルロースメンブレン上に置き、その際、膜の上皮側が上面となるようにした。膜を５ｃｍｘ５ｃｍの小片に裁断し、各々の小片をＤＭＥＭ中５０％グリセロールよりなる凍結培地を充填した低温バイアル中に入れた。処理した羊膜の各バッチは滅菌性並びにマイコプラズマ又は内毒素の汚染がないことを確認した後に使用に付した。羊膜の小片は−８０℃で各々保存した。

輪部幹細胞を培養するための羊膜の培養物はまず２０分間室温で小片を解凍することにより上記羊膜小片から調製した。次に各羊膜を平坦ピンセットを用いて、好ましくは表面を引き裂くことなくニトロセルロースメンブレンから慎重に取り外し、１００ｍｍのペトリプレート中の滅菌スライドガラス上に置いた。次に小容量の０．２５％トリプシン（１．０〜１．５ｍｌ）を添加して羊膜を被覆し、そして膜を３０分間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、羊膜の上皮層を滅菌無菌条件下に細胞スクレーパーで掻き取った。次に羊膜を洗浄液で３回洗浄した。培養における細胞外担体マトリックス又は組織基材として機能する加工処理済みの羊膜を０．４μＭトラックエッチドポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）メンブレンインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有する培養プレート上においた。羊膜は例えば１０番のＥｔｈｉｌｏｎ非吸着縫合糸を用いるか、又は医療用等級のシリコンＯリングを用いることにより、ＰＥＴインサートに締結した。

手段に関わらず、羊膜は膜の露出した上皮側がインサートの内側に向き、そして、膜の間質側がインサートから外向きとなるようにメンブレンインサート上に展開しなければならない。羊膜はインサートに固定する前に、例えば羊膜の底部内にシリコンＯリングを挿入するか、又は、インサートの基底膜に羊膜を縫合することにより、均一に伸展させた。全体の組み立て物を少なくとも２時間培地を充填した６穴のディッシュ中でインキュベートした。この後、培地を除去し、羊膜をラミニン、フィブリノーゲン又はコラーゲンＩＶの単独又は組み合わせにより予備コーティングした。羊膜は培地で２回洗浄し、再度３０分間培地中でインキュベートした後、羊膜は輪部幹細胞の培養に使用可能となった。

５）ＵＳＣを含む単離された輪部幹細胞の培養および組織系の形成
ＵＳＣを含有するＳＳＥＡ−４陽性細胞を２回洗浄し、そして培地中のヒト羊膜組織基材上に播種した。羊膜はラミニンで生体コーティングすることによりリッチ化された培地の存在下の羊膜へのＵＳＣの接着を促進した。好ましくは培地は２日齢の不活性化ヒト胚性線維芽細胞より得た３０％コンディショニング培地でリッチ化したＤＭＥＭ及びＦ−１２（ＤＭＥＭ：Ｆ−１２；１：１）とした。培地には好ましくは更に１０％ノックアウト血清又は臍帯血から採取した１０％熱不活性化ヒト血清、ＤＭＳＯ（０．５％）、ｒｈＥＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びアンホテリシンＢ（１．２５μｇ／ｍｌ）を添加した。ＵＳＣを、この培地中で、ＵＳＣの大集団を有する多層組織系が得られるまで、ＣＯ_２インキュベーター中３７℃において１０〜１５日間の期間培養した。図１は培養終了時におけるヒト羊膜上の多層組織系のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。ヘマトキシリンは核及びリボソームのような負荷電の核酸は青色に染色し、エオシンは蛋白をピンクに染色する。培養１０〜１５日後、組織系は移植可能となった。

或いは、細胞懸濁液を上記した通りＭＡＣＳ磁気カラムに通してＳＳＥＡ−４陽性細胞を単離した後、細胞を培地と共にＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティングプレートに播種した。培地は１０％ノックアウト血清又は臍帯血から採取した１０％熱不活性化ヒト血清、ＤＭＳＯ（０．５％）、ｒｈＥＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（４ηｇ／ｍｌ）、ｈＬＩＦ（１０ηｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びアンホテリシンＢ（１．２５μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ及びＦ−１２（ＤＭＥＭ：Ｆ−１２；１：１）とした。単離した細胞はＣＯ_２インキュベーター中３７℃において８〜１０日間、又は、ＵＳＣの大集団を有する多層組織系が得られるまで培養した。組織培養物はその後実質的に移植できるものとなった。

分類され単離された細胞が培養物中コンフルエントとなった後、ＵＳＣの特定の培養物を解離させ、新しい生体コーティング組織培養ディッシュ上に１：３の比で再プレーティングした。次にＵＳＣを増殖させ、少なくとも４０集団倍増となるまで、又は約１３継代まで、順次継代した。

（実施例２）
未分化幹細胞を含有する組織系の分析及び特性化
実施例１に記載した通り、ＵＳＣを含有する組織系を輪部組織生検試料から得た。輪部組織に由来する組織系の細胞集団の理解を容易にするために、組織系の細胞をフローサイトメトリー、免疫蛍光及びイムノパーオキシダーゼ試験及び分子分析を用いて、未分化細胞の種々の細胞マーカーの存在又は非存在について分析した。

１）フローサイトメトリー分析
輪部生検試料培養物の細胞集団をフローサイトメトリー分析を用いて組織系中の細胞集団と比較することによりＳＳＥＡ−４マーカーの存在を検出した。第１に、細胞を半コンフルエントの段階の輪部生検試料から、及び、上記した通りＭＡＣＳにより分類選択した後の羊膜組織基材上に生育させた組織系から採取した。細胞の２集団を個別に分析した。採取した細胞集団は滅菌ＰＢＳ中に入れ、再懸濁して細胞懸濁液とした。次に１００μｌ分の細胞をＴｒｉｔｏｎＸ−１００の０．２％を用いて核抗原に対して透過性とした。細胞を３群に分割した。細胞の第１の集団は対照として抗体で標識しなかった。細胞の第２の集団は４℃で２０分間ＳＳＥＡ−４一次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，１：６０）と共にインキュベートした。第３の群はＳＳＥＡ−４一次抗体と共にインキュベートしなかった。次に第２及び第３の群の細胞をＰＢＳで洗浄し、暗所４℃で２０分間抗マウスＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体（Ｓｉｇｍａ，１：５００）と共にインキュベートした。

二次抗体とインキュベートした後、全３群の細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ４００〜５００μｌ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に負荷させた。細胞は光分散により発見し、そして対数値の蛍光を１０，０００ゲートイベントに基づいて評価し、対照試料を用いてバックグラウンドの蛍光を調節した。分析はＣＥＬＬ ＱＵＥＳＴソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実施した。輪部生検試料細胞に関するフローサイトメトリー分析の結果は図２に示すとおりであり、図３はＵＳＣを含む組織系中の細胞に関する同じ分析を示している。図２は培養した輪部組織生検試料中の細胞の僅か約３０％のみがＳＳＥＡ−４陽性細胞であることを示している。一方、図３はＳＳＥＡ−４陽性細胞の集団が組織系中に存在する細胞の７４％までリッチ化されていたことを示しており、組織系中の高いパーセントのＵＳＣの存在を示している。

２）免疫蛍光及びイムノパーオキシダーゼ試験
組織系の形態学的特徴及び表現型は、免疫蛍光又はイムノパーオキシダーゼ試験により分析した。第１に脱パラフィン処理した組織系の切片をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．２％トリトンＸ−１００で透過性とし、１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳでブロッキングし、室温で２時間、以下の一次抗体（抗体希釈は１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で行った）、即ち、ＳＳＥＡ−４（１：６０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、幹細胞因子（１：２５０、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、Ｔｒａ−１−６０（１：４０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、Ｏｃｔ−４（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、コネキシン４３（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ｐ６３（１：１５０、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、Ｋ３／Ｋ１２（１：２００、ＩＣＮ）及びＫ１９（１：１００、Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をインキュベートした。その後室温で１時間、切片をＦＩＴＣ標識二次抗体と共にインキュベートした（Ｓｉｇｍａ）。インキュベーションの後、切片を免疫蛍光搭載培地中に搭載し、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて撮影した。イムノパーオキシダーゼ試験については、ベクターＥｌｉｔｅキットの製造元のプロトコルに従った。イムノパーオキシダーゼ試験と共に使用した発色原は４塩酸ジアミノベンジジンであった。

多層組織系の切片についての免疫蛍光及びイムノパーオキシダーゼ試験によれば、約３０〜７０％のＳＳＥＡ−４陽性細胞（図４）、約２５〜４５％のＳＣＦ陽性細胞（図５）、約３０〜４０％のＴｒａ−１−６０陽性細胞（図６）、約４５〜５５％のＯｃｔ−４陽性細胞（図７）、約５０〜７０％のｐ６３陽性細胞（図８）が存在することがわかった。Ｋ３／Ｋ１２の陽性の存在（図９）が組織系中に検出され、Ｋ１９の基底層の発現（図１０）も観察された。組織系切片の分析はまたコネキシン４３の非存在も明らかにした（図１１）。組織系の切片中の幹細胞特異的表面マーカーの存在は組織系中の自己再生能を有するＵＳＣの存在を確認するものであった。他のマーカー、即ち、Ｋ３／Ｋ１２、Ｋ１９およびｐ６３は眼の修復のために組織系を良好に使用するために重要である組織系中の輪部幹細胞の角膜の性質を示している。

３）分子分析
組織系中に存在するＵＳＣを更に特性化するために、細胞を、以下の未分化幹細胞マーカー遺伝子、即ち、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、骨形態形成蛋白２（ＢＭＰ２）及び骨形態形成蛋白５（ＢＭＰ５）の発現についてＲＴ−ＰＣＲで分析した。Ｏｃｔ−４、ＮａｎｏｇおよびＲｅｘ１の発現は分化によりダウンレギュレートされた。ＢＭＰの発現は細胞が外胚葉起源であることを示している。全ての細胞でユビキタスに発現される「ハウスキーピング」遺伝子ＧＡＰＤＨの発現もまた陽性対照として分析した。ＲＴ−ＰＣＲ産物の同一性は配列決定により確認した。

要約すれば、実施例１において形成した組織系から単離した細胞の全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ法（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）により単離した。次にＲＮａｓｅ−ＯＵＴリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ，ＵＳＡ）で処理した全ＲＮＡ１μｇを用いて反応をプライミングするためにＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルスＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ及びオリゴｄＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ，ＵＳＡ）を用いた逆転写によりｃＤＮＡの合成を行った。各ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応につき、ｃＤＮＡ２０μｌをＡｂｇｅｎｅ ２Ｘ ＰＣＲマスターミックス及び適切なプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーは異なるエクソンに対して特異的な個々のプライマーを用いることによりｃＤＮＡとゲノムＤＮＡを区別するために選択した。Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５及びＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｏｓｙｓ）を増幅するために使用したプライマーを以下の表１に示す。ＰＣＲ産物を増幅するためにサーマルサイクラー（ＡＢＩ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９７００）において使用したＰＣＲ増幅条件は、９４℃３０秒；アニーリングＴｍ ℃（５２〜６５℃）１分、および７２℃１分を３０〜３５サイクルとした。

この実験の結果は図１２に示す通りであり、試験した全遺伝子の発現が明らかにされている。Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＲｅｘ１マーカーの発現は組織系中に存在するＵＳＣが未分化であることを示している。

（実施例３）
未分化幹細胞を含む組織系の生存性の試験
輪部組織生検試料がＵＳＣを有する生存性組織系のインビトロの培養よりも前の輸送中においてどの程度の期間に亘り存続できるかどうかについて、生検試料を評価した。輪部組織の生検試料を４℃において外科処置後１２、２４、４８及び７２時間に亘り以下の培地中、即ち、ヒト臍帯血清（３〜５％）、ＤＭＳＯ（０．５％）、ｒｈＥＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、コレラ毒Ａ（０．１ナノモル／ｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びアンホテリシンＢ（１．２５μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ及びＨａｍのＦ−１２（比率１：１）中で輸送又は保存した。その後、生検試料を培養して実施例１に記載するとおりＵＳＣを有する組織系を形成した。図１３は対象から外科的に採取後約１２、２４、４８及び７２時間の培養生検試料から組織系を形成する場合の成功率を示している。図１３に示される通り、体外移植組織は好ましくは生検試料採取後約２４時間以内に培養され、最も良好な組織系の形成は採取後約１２時間以内に培養された生検試料で達成された。しかしながら、外科的採取後約７２時間までであっても培養物中で組織系を形成するかなりの能力を生検試料は保持していた。

輸送中の実施例１で形成した組織系の生存性を評価することにより、培養物から摘出後どの程度の期間培養組織系が組織移植片として使用するための生存性を維持できるかを測定した。組織系を輸送用培地を含有する特殊設計の受容器に入れ、室温又は４℃で輸送した。輸送培地は２日齢の不活性化ヒト胚性線維芽細胞より得た３０％コンディショニング培地でリッチ化し、更に１０％ノックアウト血清又は臍帯血から採取した１０％熱不活性化ヒト血清、ＤＭＳＯ（０．５％）、ｒｈＥＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びアンホテリシンＢ（１．２５μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ及びＦ−１２（ＤＭＥＭ：Ｆ−１２；１：１）よりなるものとした。組織系の生存性は６、１２、２４及び４８時間の間隔で確認した。輸送用培地中の組織系の生存性は、培地のｐＨ、細胞の生存性、死滅細胞の比率及び組織系構造の一体性（例えば平面搭載を介して評価）のようなパラメーターに基づいて評価した。

図１４は組織系が輸送される温度に応じた培養後の種々の時間における組織系の生存性を示している。組織系を４℃で輸送した場合に室温で輸送した場合よりも僅かに良好な結果が得られ、輸送の最初の１２時間の優れた生存性が維持されており、４８時間後も良好な生存性が観察された。

本明細書に開示し請求項に記載した全ての組成物及び方法は本発明の開示を参照すれば不必要な実験を行うことなく作成し、実施できるものである。本発明の組成物及び方法について好ましい実施形態に関して記載したが、本発明の概念、精神及び範囲から外れることなく本明細書に記載した組成物及び／又は方法及び方法の工程又は工程の順序において種々変更できることは当業者の知るとおりである。より詳細には、化学的又は生理学的に関連する特定の薬剤を本明細書に記載した薬剤の代替としてもなお同様の結果が達成されることは明らかである。当業者に自明であるこのような同様な代替使用及び変更は全て添付の請求項に定義する本発明の精神、範囲及び概念に包含されるものとする。

培養の終点における羊膜上の多層組織系のＨ＆Ｅ染色である。 培養された輪部組織生検試料のフローサイトメトリー分析である。図２Ａは未標識の対照細胞を示す。図２Ｂは抗マウス蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗体、即ち二次抗体をＦＩＴＣ標識対照として投与した細胞を示す。図２Ｃは段階特異的胚性抗原マーカー−４（ＳＳＥＡ−４）抗体（一次抗体）及び抗マウスＦＩＴＣ（二次抗体）で標識した細胞を示す。輪部組織生検試料中の細胞の約３０％がＳＳＥＡ−４マーカーに関して陽性である。 培養された組織系試料のフローサイトメトリー分析である。図３Ａは未標識の対照細胞を示す。図３Ｂは抗マウスＦＩＴＣ抗体を二次抗体標識対照として投与した細胞を示す。図３ＣはＳＳＥＡ−４抗体（一次抗体）及び抗マウスＦＩＴＣ（二次抗体）で標識した細胞を示す。組織系試料中の細胞の約７４％がＳＳＥＡ−４マーカーに関して陽性である。 ＳＳＥＡ−４に対して陽性免疫蛍光を示す多層組織系の免疫蛍光顕微鏡写真である。 幹細胞因子（ＳＣＦ）に対して陽性免疫蛍光を示す多層組織系の免疫蛍光顕微鏡写真である。 Ｔｒａ−１−６０に対して陽性免疫蛍光を示す多層組織系の免疫蛍光顕微鏡写真である。 Ｏｃｔ−４に対して陽性免疫蛍光を示す多層組織系の免疫蛍光顕微鏡写真である。 ｐ６３に対して陽性免疫蛍光を示す多層組織系の免疫蛍光顕微鏡写真である。イムノパーオキシダーゼ試験はベクターＥｌｉｔｅキットを用いて実施した。ｐ６３は核抗原であり、茶色点は組織系における細胞の陽性核である。 組織系の表在層のＫ３／Ｋ１３陽性細胞の局所的存在を示す多層組織系の免疫蛍光顕微鏡写真である。 組織系におけるＫ１９の基底層発現を示す多層組織系の免疫蛍光顕微鏡写真である。 ベクターＥｌｉｔｅキットを用いた組織系におけるコネキシン４３発現の非存在を示す多層組織系の免疫蛍光顕微鏡写真である。コネキシン４３の発現は輪部基底上皮においては非存在であることがわかっている。 未分化幹細胞マーカーＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１並びにＢＭＰ２及びＢＭＰ５のＲＴ−ＰＣＲによる多層組織系の細胞集団の遺伝子発現プロファイリングである。ＧＡＰＤＨ発現はまた陽性対照としても分析した。試験した全細胞マーカーの発現が観察された。 術中採取１２、２４、４８及び７２時間後の輸送培地中の輪部組織生検試料の本開示に関する生存性を示す棒グラフである。生存性は輪部組織生検試料からの形成中の多層組織系のパーセント成功率により測定した。 培養６、１２、２４及び４８時間後の多層組織系の生存性を示す棒グラフである。組織系は４℃又は室温の何れかで輸送し、これはより長期間に亘る組織系の生存性に影響した。生存性は組織系中の細胞のパーセント成功率（生存）により測定した。

Claims (48)

1. 組織系の輪部幹細胞の少なくとも約３０〜９０％が未分化幹細胞である、該輪部幹細胞を含む、組織系。
2. 請求項１に記載の組織系であって、前記未分化幹細胞がＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、幹細胞因子、Ｔｒａ−１−６０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ５４およびＣＤ１１７よりなる群から選択される１種以上の幹細胞特異的マーカーを発現する、組織系。
3. 請求項１に記載の組織系であって、前記未分化幹細胞がＳＳＥＡ−４を発現する、組織系。
4. 請求項３に記載の組織系であって、ＳＳＥＡ−４を発現する前記未分化幹細胞が組織系中の前記輪部幹細胞の少なくとも約５０〜９０％を含む、組織系。
5. 請求項１に記載の組織系であって、前記輪部幹細胞が、Ｋ３／Ｋ１２、Ｋ１９およびｐ６３よりなる群から選択される１種以上の細胞表面マーカーを発現する、組織系。
6. 請求項１に記載の組織系であって、該組織系が、角強膜輪部組織に由来する、組織系。
7. 請求項６に記載の組織系であって、前記角強膜輪部組織が、ヒト組織である、組織系。
8. 請求項１に記載の組織系であって、前記組織系が、多層組織系である、組織系。
9. 請求項１に記載の組織系であって、該組織系が、レシピエントへの移植、インプラント処置又はグラフト処置に適している、組織系。
10. 輪部幹細胞を含む組織系を形成する方法であって、該方法が、以下の工程：
    （ａ）ドナーから角膜輪部組織を単離する工程；
    （ｂ）該角膜輪部組織を培養して培養物中の角膜輪部細胞を増殖させる工程；
    （ｃ）１種以上の幹細胞特異的表面マーカーを選択するために該角膜輪部細胞を分類することにより培養された角膜輪部細胞から輪部幹細胞の集団を単離する工程であって、ここで、該幹細胞特異的表面マーカーが、未分化幹細胞により発現される工程；
    （ｄ）輪部幹細胞の単離された集団を培養して、該組織系を形成する工程；
    を包含する、方法。
11. 請求項１０に記載の方法であって、前記輪部幹細胞が、未分化幹細胞を含む、方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記未分化幹細胞が、前記組織系中の前記輪部幹細胞のうちの少なくとも約７０％を含む、方法。
13. 請求項１１に記載の方法であって、前記未分化幹細胞が、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、幹細胞因子、Ｔｒａ−１−６０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ５４およびＣＤ１１７よりなる群から選択される１種以上の幹細胞特異的マーカーを発現する、方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、前記未分化幹細胞が、ＳＳＥＡ−４を発現する、方法。
15. 請求項１４に記載の方法であって、ＳＳＥＡ−４を発現する前記未分化幹細胞が、前記組織系中の前記輪部幹細胞のうちの少なくとも約５０〜９０％を含む、方法。
16. 請求項１０に記載の方法であって、前記未分化幹細胞が、Ｋ３／Ｋ１２、Ｋ１９およびｐ６３よりなる群から選択される１種以上の細胞表面マーカーを発現する、方法。
17. 請求項１０に記載の方法であって、前記角膜輪部組織が、ヒトのドナーから単離される、方法。
18. 請求項１０に記載の方法であって、前記組織系が、レシピエントへの移植、インプラント処置又はグラフト処置に適している、方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、前記レシピエントが、片方又は両方の眼において輪部幹細胞欠損を有する、方法。
20. 請求項１８に記載の方法であって、前記ドナーが、前記レシピエントと同様である、方法。
21. 請求項１８に記載の方法であって、前記ドナーが、前記レシピエントと生体適合性である、方法。
22. 請求項１０に記載の方法であって、前記角膜輪部組織が、生体コーティング表面又は細胞外マトリックス担体で培養される、方法。
23. 請求項２２に記載の方法であって、前記生体コーティング表面が、生体コーティングペトリ皿である、方法。
24. 請求項２３に記載の方法であって、前記ペトリ皿が、フィブリノーゲン、ラミニン、コラーゲンＩＶ、テナシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ウシ下垂体抽出物、ＥＧＦ、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子及びヒドロコルチゾンよりなる群から選択される１種以上の付着因子で生体コーティングされる、方法。
25. 請求項２２に記載の方法であって、前記細胞外マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、哺乳類羊膜、ラミニン、Ｒｅｌｉｓｅａｌ（商標）、トロンビン、テナシン、エンタクチン、ヒアルロン、フィブリノーゲン、コラーゲン−ＩＶ、ポリ−Ｌ−リジン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−オルニチン、フィブロネクチン及び血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）よりなる群から選択される、方法。
26. 請求項２２に記載の方法であって、前記細胞外マトリックスが、ヒト羊膜である、方法。
27. 請求項２２に記載の方法であって、前記輪部幹細胞を単離する前に培養された角膜輪部細胞を解離させる工程をさらに包含する、方法。
28. 請求項１０に記載の方法であって、ジメチルスルホキシド、組み換えヒト表皮成長因子、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、塩基性線維芽細胞成長因子及び白血病抑制因子よりなる群から選択される１種以上の可溶性因子を添加した培地中で前記角膜輪部組織を培養する、方法。
29. 請求項１０に記載の方法であって、前記角膜輪部細胞が、磁気親和性細胞分類（ＭＡＣＳ）を用いて分類される、方法。
30. 請求項１０に記載の方法であって、前記角膜輪部細胞が蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いて分類される、方法。
31. 請求項１０に記載の方法であって、前記角膜輪部細胞を単離するための１種以上の幹細胞特異的表面マーカーが、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、幹細胞因子、Ｔｒａ−１−６０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ５４及びＣＤ１１７よりなる群から選択される、方法。
32. 請求項１０に記載の方法であって、前記角膜輪部細胞を単離するための幹細胞特異的表面マーカーが、ＳＳＥＡ−４である、方法。
33. 請求項１０に記載の方法であって、前記輪部幹細胞の単離された集団が、前記組織系を形成するための組織基材上で培養される、方法。
34. 請求項３３に記載の方法であって、前記組織基材が、生体コーティング支持体物質を含む、方法。
35. 請求項３４に記載の方法であって、前記生体コーティング支持体物質が、フィブリノーゲン、ラミニン、コラーゲンＩＶ、テナシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ウシ下垂体抽出物、ＥＧＦ、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子及びヒドロコルチゾンよりなる群から選択される１種以上の付着因子である、方法。
36. 請求項３３に記載の方法であって、前記組織基材が、ヒト羊膜、ラミニン、コラーゲンＩＶ、テナシン、フィブリノーゲン、エンタクチン、ヒアルロン、Ｒｅｌｉｓｅａｌ（商標）、トロンビン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）及びフィブロネクチンよりなる群から選択される、方法。
37. 請求項３３に記載の方法であって、前記組織基材が、ヒト羊膜である、方法。
38. 請求項３５に記載の方法であって、前記ヒト羊膜が、ラミニン、コラーゲンＩＶ、テナシン、フィブリノーゲン、エンタクチン、ヒアルロン、Ｒｅｌｉｓｅａｌ（商標）、トロンビン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）及びフィブロネクチンよりなる群から選択される１種以上の付着因子で生体コーティングされる、方法。
39. 請求項１０に記載の方法であって、前記輪部幹細胞の単離された集団が、不活性化ヒト胚性線維芽細胞から得た調整された培地を用いてリッチ化された培地中で培養される、方法。
40. 請求項１０に記載の方法であって、前記輪部幹細胞の単離された集団が、ヒト白血病抑制因子でリッチ化された培地中で培養される、方法。
41. 請求項１０に記載の方法であって、前記輪部幹細胞の単離された集団が、ジメチルスルホキシド、組み換えヒト表皮成長因子、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン及びヒドロコルチゾンよりなる群から選択される１種以上の可溶性因子を添加した培地中で培養される、方法。
42. 請求項１０に記載の方法であって、前記単離された輪部幹細胞の集団を少なくとも１０、１５又は２０継代に亘り連続継代する工程をさらに包含する、方法。
43. 請求項１０に記載の方法であって、凍結培地中に輪部幹細胞の集団を低温保存する工程をさらに包含する、方法。
44. 請求項４３に記載の方法であって、前記凍結培地が、１０〜９０％熱不活性化ヒト臍帯血血清及び５〜１０％ＤＭＳＯを添加した培地を含む、方法。
45. 請求項４２に記載の方法であって、前記輪部幹細胞の集団が、好ましくは各継代後に低温保存される、方法。
46. 請求項１８に記載の方法であって、輸送培地を含む輸送用受容器中で前記レシピエントに前記組織系を輸送する工程をさらに包含する、方法。
47. 請求項４６に記載の方法であって、前記輸送用受容器が、前記組織系を支持するためのハウジングベースの上端内に位置する平行手段を伴った該組織系を受容するために上端において開口し、下端において閉鎖している携帯用の円筒形のハウジングベース、及び、ハウジングベースの上端の開口部を閉鎖するためのキャップを含む、方法。
48. 請求項４７に記載の方法であって、前記輸送用受容器が、特殊組織培養等級のプラスチック−１又は医療用等級のステンレスから構築されている、方法。

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