KR20110130622A - 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법 - Google Patents

전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20110130622A
KR20110130622A KR1020100050031A KR20100050031A KR20110130622A KR 20110130622 A KR20110130622 A KR 20110130622A KR 1020100050031 A KR1020100050031 A KR 1020100050031A KR 20100050031 A KR20100050031 A KR 20100050031A KR 20110130622 A KR20110130622 A KR 20110130622A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
stem cells
pluripotent
cells
garden
transformed
Prior art date
Application number
KR1020100050031A
Other languages
English (en)
Inventor
윤태기
이동율
임정은
Original Assignee
의료법인 성광의료재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 의료법인 성광의료재단 filed Critical 의료법인 성광의료재단
Priority to KR1020100050031A priority Critical patent/KR20110130622A/ko
Publication of KR20110130622A publication Critical patent/KR20110130622A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C12N15/8776—Primate embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 정소로부터 유래된 세포를 역분화시켜 수득한 전분화능 정원줄기세포에 유전자를 도입하고, 이를 다시 분화시키는 단계를 포함하는 형질전환된 정자의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 정자의 생산방법은 (ⅰ) 전분화능 정원줄기세포에 목적하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 도입하여 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 레티노인산(retinoic acid, RA)이 포함된 배양액에서 배양하여 생식세포로 분화시키는 단계; 및, (ⅲ) 상기 분화된 생식세포를 수컷 동물의 정소내 세정관에 이식하고, 이를 6 내지 12주동안 사육하는 단계를 포함한다. 본 발명의 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법을 이용하면, 형질전환 동물의 생산효율을 향상시킬 수 있으므로, 형질전환 동물의 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법{Method for Manufacturing Transformed Sperm Employing Pluripotent Spermatogonial Stem Cells}
본 발명은 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 정소로부터 유래된 세포를 역분화시켜 수득한 전분화능 정원줄기세포에 유전자를 도입하고, 이를 다시 분화시키는 단계를 포함하는 형질전환된 정자의 생산방법에 관한 것이다.
배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로서, 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지녔으나 아직 분화되지 않은 세포를 의미한다. 상기 배아줄기세포는 모든 조직의 세포로 분화할 수 있기 때문에, 적절한 분화환경이 주어지게 되면 생식세포인 난자유사체나 정자로 분화될 수 있는 것으로 알려져 있다(참조: Hubner, K. et al., Science, 300:1251-1256, 2003; Geijsen, N. et al., Nature, 427:148-154, 2004). 특히, 일차적으로 생식세포계통으로의 분화에 이어 정소내로 치환할 경우에는, 생식능력을 가진 정자의 생산이 가능하다(참조: Toyooka, Y. et al., PNAS, 100:11457-11462, 2003).
한편, 전분화능(pluripotent) 정원줄기세포(spermatogonial stem cells, SSCs)는 정자만을 생산할 수 있는 단분화능(unipotent) 정원줄기세포로부터 역분화된 세포로서, 기존의 전분화능 배아줄기세포와 매우 유사한 형태와 특성을 가지고 있다. 상기 전분화능 정원줄기세포주는 실험실적 조건(in vitro)에서는 3배엽성 세포로 분화시킬 수 있어, 재생의학을 위한 새로운 환자 맞춤형 세포치료제로서의 가능성을 가지고 있다고 보고되었다(참조: Kanatsu-Shinohara, M. et al., Cell, 119:1001-1012, 2004; Guan, K. et al., Nature, 440:1199-1203, 2006; Conrad, S. et al., Nature, 456:344-349, 2008).
아울러, 전분화능 정원줄기세포는 그들의 유전체의 조작이 가능하고, 배아 내에 이식되었을 때 생식계통으로 전이(germ-line transmission)시킬 수 있어, 배아줄기세포와 유사하게 형질전환동물의 생산을 비롯한 다양한 분야에 이용될 수 있을 것으로 보고되었다. 구체적으로, 전분화능 정원줄기세포에 외래 유전자를 도입하고, 이를 성체의 정소내에 도입하여 분화시킬 경우, 상기 성체에서 형질전환된 정자를 지속적으로 생산할 수 있어, 새로운 유전자 치료방법의 개발, 형질전환동물의 생산성 향상, 불임치료의 효율성 증대 등의 의료적인 효과를 얻을 수 있다고 보고되었다(참조: Takehashi, M. et al., Developmental Biology, 312:344-352, 2007).
그러나, 전분화능 정원줄기세포주는 강력한 전분화능을 가지고 있어, 성체의 정소내로 직접 도입될 경우, 생식세포로 분화되기 전에 기형종을 형성하고, 상기 기형종으로 인하여 도입된 정소가 생식세포로서의 특성을 상실하는 것이 문제점으로 지적되었다(참조: Kanatsu-Shinohara, M. et al., PNAS, 103:8018-8023, 2006).
따라서, 전분화능 정원줄기세포의 특성이 배아줄기세포와 유사하고, 이에 더불어 역분화가 일어났더라도 생식세포로서의 특성이 유지된다면 형질전환 정자의 생산효율은 더욱 높을 수 있을 것으로 예상되므로, 상기 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 상기 정원줄기세포를 형질전환시키고, 이를 레티노인산의 존재하에 체외에서 생식세포로 분화시킨 후, 웅성성체의 생식기관에 도입할 경우, 생식기관내에서 기형종이 생성되지 않고, 종래의 배아줄기세포보다도 형질전환 정자를 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법을 이용하면, 종래의 배아줄기세포를 사용할 경우보다도, 형질전환 동물을 효율적으로 생산할 수 있으므로, 형질전환 동물을 이용한 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 정원줄기세포에서 발현되는 전분화능 줄기세포 표적단백질의 발현양상을 나타내는 사진이다.
도 2a는 배아줄기세포(mESCs), 정원줄기세포(mSSCs), 생쥐 태아섬유세포(mEFs), 서르토리세포(Sertoli) 및 정원세포(sc)에서 발현되는 miR-20 계열의 miRNA(mmu-miR-20a, mmu-miR-20b, mmu-miR-18, mmu-miR-19b, mmu-miR-19a, mmu-miR-106a 및 mmu-miR-93)의 발현양상을 나타내는 그림이다.
도 2b는 배아줄기세포, 정원줄기세포, 생쥐 태아섬유세포, 서르토리세포 및 정원세포에서 발현되는 miR-290 계열의 miRNA(mmu-miR-293, mmu-miR-669p, mmu-miR-294, mmu-miR-295, mmu-miR-292, mmu-miR-291 및 mmu-miR-209)의 발현양상을 나타내는 그림이다.
도 3a는 Cs-CDF-CG-PRE의 벡터맵이다.
도 3b는 pMDLg/pRRE의 벡터맵이다.
도 3c는 pCMV-VSV-G-RSV-Rev의 벡터맵이다.
도 4a는 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포로부터 분화된 정원세포에 항-인테그린 α1 항체를 처리하여 산출한 분화효율을 나타내는 그래프이다.
도 4b는 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포로부터 분화된 정원세포에 항-Thy-1 항체를 처리하여 산출한 분화효율을 나타내는 그래프이다.
도 4c는 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포로부터 분화된 정원세포에 항-GFR-α1 항체를 처리하여 산출한 분화효율을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 SCID 생쥐의 부고환 내에서 관찰된 형질전환(GFP-발현) 정자를 나타내는 현미경사진이다.
도 5b는 SCID 생쥐의 부고환 내에서 형질전환(GFP-발현) 정자가 존재하는 부분을 확대한 현미경사진이다.
본 발명자들은 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 강력한 전분화능을 갖는 정원줄기세포를 직접 정소에 이식할 경우, 정소내에서 기형종이 형성될 수 있으나, 상기 전분화능 정원줄기세포를 일단 생식세포로 분화시키고, 정원줄기세포로부터 분화된 생식세포를 정소에 이식하면, 정소내에서 기형종이 형성되지 않을 것이라 예상하였다.
이를 확인하기 위하여, 녹색 형광단백질(green fluorescence protein, GFP)을 발현하도록 형질전환된 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포를 각각 생식세포인 정원세포로 분화시키고, 분화된 정원세포를 정소내의 세정관에 이식하여 각각의 정자를 생산한 다음, 상기 정자를 암컷에게 주입하여 각각의 수정란을 생성시키고, 상기 각 수정란으로부터 포배로 발생하는 비율을 비교하였다. 그 결과, 형질전환된 전분화능 정원줄기세포로부터 분화된 정원세포에 의하여는 정소내에서 기형종이 전혀 발생하지 않음이 확인되었고, 배아줄기세포로부터 유래된 정자에 의하여 생성된 수정란의 포배로 발생하는 비율보다, 전분화능 정원줄기세포로부터 유래된 정자에 의하여 생성된 수정란의 포배로 발생하는 비율이 높은 수준임이 확인되었는바, 형질전환된 정자를 생산할 경우에 배아줄기세포보다는 전분화능 정원줄기세포를 사용하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.
배아줄기세포와 전분화능 정원줄기세포는 모두 전분화능을 가짐에도 불구하고, 상술한 차이가 발생하는 이유는, 줄기세포의 특성만을 포함하는 배아줄기세포와는 달리, 전분화능 정원줄기세포는 줄기세포의 특성과 생식세포의 특성을 모두 포함하기 때문인 것으로 분석되었다.
결국, 본 발명의 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법은 (ⅰ) 전분화능 정원줄기세포에 목적하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 도입하여 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 레티노인산(retinoic acid, RA)이 포함된 배양액에서 배양하여 생식세포로 분화시키는 단계; 및, (ⅲ) 상기 분화된 생식세포를 수컷 동물의 정소내 세정관에 이식하고, 이를 6 내지 12주동안 사육하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 전분화능 정원줄기세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 정소내의 정원세포를 역분화시켜서 수득하는 것을 사용함이 바람직하고, 상기 레티노인산의 농도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 0.05 내지 0.2ng/ml임이 바람직하며, 상기 배양액은 특별히 이에 제한되지 않으나, EB(embryoid body) 배양액을 사용함이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 전분화능 정원줄기세포주의 수득
생후 5일령의 ICR 생쥐로부터 적출한 정소로부터 백막(albuginea testis)을 제거하고, 5mg/ml 콜라게나제(collagenase, Type IV), 10μg/ml DNase I 및 1mg/ml 히알루로니다제(hyaluronidase)를 포함하는 PBS에 37℃에서 5분간 저속으로 교반하여, 정소에 존재하는 세포를 단세포의 형태로 각각 분리하였다. 이때, 분리된 단세포는 체세포와 단분화능 정원세포(spermatogonial cell)를 포함한다.
상기 분리된 단세포들을 PBS로 세척하고 용해완충용액을 가하여 적혈구를 제거하고, GS(serum-free germ-stem cell) 배양액(6mg/ml D(+)-glucose, 5 x 10-5M β-mercaptoethanol, 1μM d(L)-lactic acid, 2mM L-glutamine, 30μM pyruvic acid, 10-4M ascorbic acid, 60ng/ml progesterone, 30ng/ml β-estradiol, 0.2% BSA, 100U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, Insulin-Transferrin-Selenium supplements, MEM vitamin solution(Invitrogen, USA), MEM non-essential amino acid(Invitrogen, USA), 20ng/ml mouse EGF, 10ng/ml human bFGF, 1% KnockOutTM serum replacement(KSR, Invitrogen, USA), 10ng/ml rat GDNF(R&D systems, Inc., USA) 및 103U/ml ESGRO(Chemicon, USA))이 포함된 0.1% 젤라틴 코팅 배양접시에 약 1.5 x 104cells/cm2의 농도로 현탁시키고 배양하였다.
상기 배양시, 상기 단세포에 포함된 체세포는 배양접시 바닥에 붙어서 성장하는 반면, 상기 단세포에 포함된 단분화능 정원세포는 상기 체세포의 상층에서 성장하여, 2주가 경과한 시점에서 특이적 형태의 세포괴(clump)를 형성함을 확인하였다.
상기 형성된 세포괴를 GS 배양액에 담긴 마우스 배아유래 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 위에 약 1.5 x 104cells/㎠의 농도로 이식하고, 배양액을 2일마다 교체하면서 5일간격으로 계대배양하며 15일동안 배양하였다. 그 결과, 세포간 경계가 뚜렷한 세포괴와는 달리, 표면이 매끈하고 세포간 경계가 뚜렷하지 않으며, 기존 정원세포의 특성과 다분화능 정원줄기세포의 특성을 동시에 나타내는 둥근 세포군집(round colony) 상태인 정원줄기세포가 발생함을 확인하였다.
상기 정원줄기세포의 발생을 확인한 후, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 부가성분(20% KnockOutTM serum replacement, 50μM β-mercaptoethanol, non-essential amino acids, 2mM L-glutamine, 100U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 및 103U/ml ESGRO)을 첨가하여 수득한 배양액으로 2일마다 교체하면서 4일간격으로 계대배양하여, 최종적으로 정원줄기세포를 수득하였다.
실시예 2: 정원줄기세포의 특성확인
상기 실시예 1에서 수득한 정원줄기세포가 전분화능을 가지는지의 여부를 확인하기 위하여, 상기 정원줄기세포에서 발현되는 정원세포의 표적 단백질(GFR-α1 및 MVH(mouse vasa homolog))과 전분화능 줄기세포의 표적 단백질(OCT-4, NANOG, SOX2, C-MYC 및 KLF4)의 발현여부를 형광 항체염색법(fluorescent antibody technique)으로 분석하였다(참조: 도 1). 도 1은 상기 정원줄기세포에서 발현되는 전분화능 줄기세포 표적단백질의 발현양상을 나타내는 사진으로서, DAPI는 정원줄기세포의 핵과 염색체를 DAPI(4',6'-diamidine-2-phenylindole dihydrochloride)로 대조염색한 결과를 나타내고, ANTIBODY는 각 표적 단백질의 항체를 이용하여 정원줄기세포를 형광염색한 결과를 나타낸다.
상기 도 1에서 보듯이, 상기 정원줄기세포에서 정원세포의 표적 단백질로 알려진 GFR-α1 및 MVH의 발현과 함께, 전분화능 줄기세포의 표적 단백질인 OCT-4, NANOG, SOX2, C-MYC 및 KLF4의 발현이 관찰되었다.
이로부터, 상기 정원줄기세포가 역분화되었음에도 불구하고, 전분화능을 갖는 줄기세포의 특성과 함께, 생식세포인 정원세포의 특성을 포함한다는 사실을 알 수 있었다.
상기 결과를 유전자 수준에서 다시 한번 확인하기 위하여, 상기 정원줄기세포에서 특이하게 발현되는 miRNA를 정원세포에서 특이적으로 발현되는 miR-20 계열의 miRNA와 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 miR-290 계열의 miRNA로 나누어 분석하였다(참조: 도 2a 및 도 2b). 도 2a는 배아줄기세포(mESCs), 정원줄기세포(mSSCs), 생쥐 태아섬유세포(mEFs), 서르토리세포(Sertoli) 및 정원세포(sc)에서 발현되는 miR-20 계열의 miRNA(mmu-miR-20a, mmu-miR-20b, mmu-miR-18, mmu-miR-19b, mmu-miR-19a, mmu-miR-106a 및 mmu-miR-93)의 발현양상을 나타내는 그림이고, 도 2b는 배아줄기세포, 정원줄기세포, 생쥐 태아섬유세포, 서르토리세포 및 정원세포에서 발현되는 miR-290 계열의 miRNA(mmu-miR-293, mmu-miR-669p, mmu-miR-294, mmu-miR-295, mmu-miR-292, mmu-miR-291 및 mmu-miR-209)의 발현양상을 나타내는 그림이다.
도 2a에서 보듯이, 정원세포에서 특이적으로 발현되는 miR-20 계열의 miRNA는 정원줄기세포(mSSCs)와 정원세포(sc)에서만 발현됨을 알 수 있고, 도 2b에서 보듯이, 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 miR-290 계열의 miRNA는 배아줄기세포(mESCs)와 정원줄기세포(mSSCs)에서만 발현됨을 알 수 있었다.
따라서, 상기 정원줄기세포는 전분화능을 갖는 줄기세포의 특성과 함께, 생식세포인 정원세포의 특성을 포함한다는 사실을 다시 한번 확인할 수 있었다.
실시예 3: 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포의 생식세포계통으로의 분화능 비교
전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포에 GFP 유전자를 도입하여, 형질전환된 각각의 줄기세포를 수득하고, 상기 각 줄기세포의 생식세포로의 분화능을 비교하였다.
실시예 3-1: 형질전환된 전분화능 정원줄기세포 및 배아줄기세포의 수득
공지된 방법으로 제조된, 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)인 CS-CDF-CG-PRE(참조: Kojiro Ishioka, et al., Retrovirology, 3:71-83, 2006), 패키징 벡터인 pMDLg/pRRE(참조: Dull T. et al., J. Virol., 72(11):8463-8471, 1998) 및 인벨럽 벡터인 pCMV-VSV-G-RSV-Rev(참조: Dai Hashimoto, et al., Vaccine, 26(40):5095-5100, 2008)를 렌티바이러스용 패키징 세포(Invitrogen, USA)의 배양물에 가하고, 인산칼슘 침전법으로 침전시킨 다음, 16시간 동안 배양하였으며, 상기 배양액을 교체하고 48시간 동안 다시 배양하였다. 도 3a는 Cs-CDF-CG-PRE의 벡터맵이고, 도 3b는 pMDLg/pRRE의 벡터맵이며, 도 3c는 pCMV-VSV-G-RSV-Rev의 벡터맵이다.
배양이 종료되면, 배양물의 배양상층액을 수득하고, 이를 0.22μm(Millipore, USA)로 여과한 후, 50,000xg 에서 150분간 원심분리하여 바이러스 펠렛을 수득하였다. 상기 수득한 펠렛을 GS 배양액에 현탁시킨 후, 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포의 배양물에 각각 가하고, 5% CO2와 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이어, 배양액을 교체하고 다시 48시간 동안 10% CO2와 37℃에서 배양한 다음, GFP의 발현을 형광현미경 하에서 관찰하여 형질전환여부를 확인한 결과, GFP를 발현하도록 형질전환된 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포가 각각 제조되었음을 알 수 있었다.
실시예 3-2: 형질전환된 전분화능 정원줄기세포 및 배아줄기세포의 분화
상기 실시예 3-1에서 제조된 GFP를 발현하도록 형질전환된 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포를 각각 3가지 배양액(I: 0.1ng/ml retinoic acid(RA) + EB 배양액; II: 10ng/ml bone morphogenetic protein(BMP) + EB 배양액; III: 0.1ng/ml RA + 10ng/ml BMP4 + EB 배양액)에서 3일동안 추가로 배양하여, 상기 각 줄기세포를 정원세포로 분화시켰다. 이때, EB(embryoid body) 배양액의 조성은 다음과 같다: Dulbecco's modified Eagle`s medium(DMEM)/F12, 20%의 FBS(fetal bovine serum), 0.1mM의 β-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 2mM의 글루타민(glutamine), 0.1mM의 비필수 아미노산, 100U/㎖의 페니실린 G, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin), 4ng/㎖의 bFGF.
그런 다음, 정원세포의 표적 단백질인 인테그린(integrin) α1, Thy-1 및 GFR-α1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체인 항-인테그린 α1 항체, 항-Thy-1 항체 또는 항-GFR-α1 항체를 각각 가하여 반응시킨 다음, 유세포분석기로 각 항체가 결합된 세포수를 계측하여, 각 줄기세포의 분화효율을 산출하였다(참조: 도 4a 내지 도 4c). 도 4a는 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포로부터 분화된 정원세포에 항-인테그린 α1 항체를 처리하여 산출한 분화효율을 나타내는 그래프이고, 도 4b는 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포로부터 분화된 정원세포에 항-Thy-1 항체를 처리하여 산출한 분화효율을 나타내는 그래프이고, 도 4c는 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포로부터 분화된 정원세포에 항-GFR-α1 항체를 처리하여 산출한 분화효율을 나타내는 그래프이다. 상기 도 4a 내지 도 4c에서, (■)는 전분화능 정원줄기세포로부터 분화된 정원세포를 나타내고, (□)는 배아줄기세포로부터 분화된 정원세포를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c에서 보듯이, 모든 경우에 배아줄기세포로부터 정원세포로 분화되는 효율보다는 전분화능 정원줄기세포로부터 정원세포로 분화되는 효율이 우수함을 확인할 수 있었다. 특히, 0.1ng/ml RA 만이 포함된 배양액을 이용할 경우, 정원세포로의 분화효율을 향상시킬 수 있었다.
실시예 4: 전분화능 정원줄기세포 및 배아줄기세포로부터 분화된 각 정원세포를 이용한 정자 및 배아의 생산
실시예 4-1: 전분화능 정원줄기세포 및 배아줄기세포로부터 분화된 각 정원세포를 이용한 정자의 생산
상기 실시예 3-1 및 3-2의 결과에 따라, GFP를 발현하도록 형질전환된 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포를 0.1ng/ml RA가 포함된 배양액에서 분화시켜 생성된, GFP를 발현하도록 형질전환된 정원세포에, 항-Thy-1 항체가 표지된 MACS(magnetic activating cell sorting)을 가하여 각 정원세포를 분리하고, 이들을 공지된 방법으로 배양하여 각 정원세포를 증식시켰다(참조: Lim J., et al., Cell Proliferation, in Press, 2010). 상기 증식된 각 정원세포 약 2 x 106개를, 부설판(busulfan)(44mg/kg)을 주사하고 5주 경과된 SCID 웅성생쥐의 세정관에 이식하여, 10주동안 사육한 다음, 생쥐의 부고환을 적출하여 형광현미경으로 상기 부고환을 관찰하여, 정소내 기형종의 발생여부와 형질전환된 정자의 생성여부를 확인하였다(참조: 도 5a 및 도 5b). 도 5a는 SCID 생쥐의 부고환 내에서 관찰된 형질전환(GFP-발현) 정자를 나타내는 현미경사진이고, 도 5b는 SCID 생쥐의 부고환 내에서 형질전환(GFP-발현) 정자가 존재하는 부분을 확대한 현미경사진이다.
도 5a 및 도 5b에서 보듯이, 정소내에서 기형종의 발생은 전혀 관찰되지 않았을 뿐만 아니라, 형질전환된 정자가 생성됨을 확인할 수 있었는 바, 형질전환된 정원세포를 생식기관에 이식할 경우, 상기 생식기관에서 상기 정원세포가 형질전환된 정자로 분화될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4-2: 형질전환된 정자를 이용한 형질전환 배아의 생산
상기 실시예 4-1에서 수득한 전분화능 정원줄기세포 및 배아줄기세포로부터 유래된 각각의 정자를 배란된 생쥐난자에 세포질 내 직접주입술을 이용하여 수정을 유도하고, 형질전환된 수정란의 난할로의 발생율 및 형질전환된 포배로의 발생률을 비교하였다(참조: 표 1). 이때, 대조군으로는 이식되지 않은 생쥐로부터 수득한 정자를 주입한 생쥐를 사용하였다.
전분화능 정원줄기세포 및 배아줄기세포로부터 유도된 수정란의 배아발생율
주입된
개체의 수		 난할 포배
갯수 비율(%) 갯수 비율(%)
대조군 421 298 70.8 91 30.5
배아줄기세포 204 107 52.5 12 11.2
정원줄기세포 201 87 43.3 19 21.8
상기 표 1에서 보듯이, 형질전환된 수정란의 난할로의 발생율의 측면에서 배아줄기세포에서 유래된 정자가 전분화능 정원줄기세포에서 유래된 정자보다 우수하였음에도 불구하고, 형질전환된 포배로의 발생률의 측면에서 보면, 배아줄기세포에서 유래된 정자보다는 전분화능 정원줄기세포에서 유래된 정자가 우수함을 알 수 있었다.
이러한 결과는 같은 전분화능을 가진 줄기세포임에도 불구하고 전분화능 정원줄기세포가 배아줄기세포에 비해 발생능력이 뛰어난 정자를 생산할 수 있으며, 이는 전분화능 정원줄기세포가 생식세포의 특성을 유지하고 있음을 시사하는 것으로 이해되었다.

Claims (4)

  1. (ⅰ) 전분화능 정원줄기세포에 목적하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 도입하여 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 수득하는 단계;
    (ⅱ) 상기 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 레티노인산(retinoic acid, RA)이 포함된 배양액에서 배양하여 생식세포로 분화시키는 단계; 및,
    (ⅲ) 상기 분화된 생식세포를 수컷 동물의 정소내 세정관에 이식하고, 이를 6 내지 12주동안 사육하는 단계를 포함하는, 형질전환 정자의 생산방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    전분화능 정원줄기세포는 정소내의 정원세포를 역분화시켜서 수득하는 것을 특징으로 하는
    형질전환 정자의 생산방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    레티노인산의 농도는 0.05 내지 0.2ng/ml인 것을 특징으로 하는
    형질전환 정자의 생산방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    배양액은 EB(embryoid body) 배양액인 것을 특징으로 하는
    형질전환 정자의 생산방법.
KR1020100050031A 2010-05-28 2010-05-28 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법 KR20110130622A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100050031A KR20110130622A (ko) 2010-05-28 2010-05-28 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100050031A KR20110130622A (ko) 2010-05-28 2010-05-28 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110130622A true KR20110130622A (ko) 2011-12-06

Family

ID=45499283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100050031A KR20110130622A (ko) 2010-05-28 2010-05-28 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20110130622A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Decembrini et al. Derivation of traceable and transplantable photoreceptors from mouse embryonic stem cells
JP5227318B2 (ja) 細胞増殖培地
JP6581655B2 (ja) 多能性幹細胞由来ケラチノサイトの生成およびケラチノサイト培養の維持
ES2525684T3 (es) Sistemas de cultivo de células madre
Hassani et al. Simultaneous suppression of TGF-β and ERK signaling contributes to the highly efficient and reproducible generation of mouse embryonic stem cells from previously considered refractory and non-permissive strains
Zhu et al. Transient in vitro epigenetic reprogramming of skin fibroblasts into multipotent cells
WO2009021151A1 (en) Isolation, characterization and propagation of germline stem cells
Choi et al. A novel feeder-free culture system for expansion of mouse spermatogonial stem cells
Mo et al. Generation and characterization of bat-induced pluripotent stem cells
Lim et al. In vitro culture-induced pluripotency of human spermatogonial stem cells
Ganjibakhsh et al. Three-dimensional decellularized amnion membrane scaffold promotes the efficiency of male germ cells generation from human induced pluripotent stem cells
CN106754657B (zh) 一种猴胚胎干细胞的无血清培养基
JP5067765B2 (ja) 卵膜由来細胞の細胞外マトリクスを用いた多能性幹細胞の培養方法
Xu et al. Fish pluripotent stem-like cell line induced by small-molecule compounds from caudal fin and its developmental potentiality
Yamasaki et al. Long-term serial cultivation of mouse induced pluripotent stem cells in serum-free and feeder-free defined medium.
US20190177690A1 (en) Method and system for culturing corneal stem cell-like cell line by inducing differentiation of induced pluripotent stem cell using protein ligand
US20230081733A1 (en) Methods for preparing keratinocytes
KR20110130622A (ko) 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법
KR100683199B1 (ko) 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 방법 및그에 사용되는 배지
KR102581040B1 (ko) 돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물
KR20110099353A (ko) 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법
CN116286612B (zh) 以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用
WO2023027148A1 (ja) 精子幹細胞様細胞の製造方法及び精子幹細胞様細胞株
WO2008018684A1 (en) Culture medium for co-culturing of human stem cells and their feeder cells
WO2013100140A1 (ja) 生殖細胞からの多能性幹細胞様細胞の誘導

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E601 Decision to refuse application