WO2023027148A1 - 精子幹細胞様細胞の製造方法及び精子幹細胞様細胞株 - Google Patents
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- step (c1) of obtaining a cell-like cell and the primordial germ cell-like cell obtained in the step (c1) in which the epigenomic state has reached a basal state is mixed with a living body-derived male testicular somatic cell and cultured in suspension, and the cell is and a step (c2) of obtaining a lump.
- the concentration of cyclosporin A in the medium is preferably 1-100 ⁇ M, more preferably about 5 ⁇ M.
- the method of the present embodiment enables stable and efficient production of functional spermatogonial stem cell-like cells from pluripotent stem cells.
- mPGCLC-derived spermatogonia-like cells present per reconstructed testis were cultured with 0.1% gelatin-phosphate-buffered saline (PBS) for 30 min followed by mouse embryonic fibroblasts ( MEFs) were seeded and cultured on a 24-well plate (Falcon) after 6 hours or more.
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Abstract
精子幹細胞様細胞の製造方法であって、哺乳動物由来の多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＦＧＦ２の存在下で培養してエピブラスト様細胞を得る工程（ａ）と、エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で培養して始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｂ）と、始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ）と、細胞塊を気液平衡培養して再構成精巣を得る工程（ｄ）と、再構成精巣を更に気液平衡培養し精子幹細胞様細胞を得る工程（ｅ）と、を含み、工程（ｃ）が、工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を培養し、エピゲノム状態を基底状態にする工程（ｃ１）と、始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ２）とを含む、製造方法。
Description
本発明は、精子幹細胞様細胞の製造方法及び精子幹細胞様細胞株に関する。本願は、２０２１年８月２６日に、米国に仮出願されたＵＳ６３／２３７，１３９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
マウスの場合、生殖細胞は、胚齢６日目に胚体外外胚葉から分泌されるＢＭＰ４により、エピブラストから誘導され、胚齢７日目までにはその運命を決定する。生殖細胞は、後腸を移動し、将来の精巣となる生殖巣へ移動し、その後雄性分化をした生殖巣である精巣の管構造内にて、雄性生殖細胞である前精原細胞へと分化する。胚齢２０日に相当する出生後、前精原細胞は管腔から基底膜へと移動し精原細胞へと分化する。生後１週間のうちに精原細胞の一部は、自己複製能力と精子分化能をもつ精子幹細胞となり、生涯にわたる精子産生の根源となる。
非特許文献１には、多能性幹細胞から得た始原生殖細胞様細胞を再構成精巣培養することで精原細胞にまで分化誘導し、そこから機能的な精子幹細胞様細胞株を樹立したことが記載されている。
非特許文献２には、多能性幹細胞から得た始原生殖細胞様細胞を平面培養にて精子まで誘導したことが記載されている。
Ishikura Y., et al., In Vitro Derivation and Propagation of Spermatogonial Stem Cell Activity from Mouse Pluripotent Stem Cells, Cell Rep, 17 (10), 2789-2804, 2016.
Zhou Q., et al., Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells In Vitro, Cell Stem Cell, 18, 330-340, 2016.
しかしながら、非特許文献１に記載の方法では、再構成精巣培養中の始原生殖細胞様細胞の生存能が低く、得られる細胞が少ないため、機能解析が困難であった。また、樹立した精子幹細胞様細胞株は、精子形成能率が低く、１５株中３株のみで精子形成に成功したことが報告されている。また、樹立した精子幹細胞様細胞株は、再構成精巣培養後の不均一な細胞に由来するものであったため、機能解析が困難であった。
また、非特許文献２に記載された系は、生体における雄性生殖細胞の分化過程を再現していないだけでなく、複数の論文において再現性がないことが明らかにされている。
本発明は、機能的な精子幹細胞様細胞を製造する技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］精子幹細胞様細胞の製造方法であって、哺乳動物由来の多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＦＧＦ２の存在下で培養してエピブラスト様細胞を得る工程（ａ）と、前記工程（ａ）で得た前記エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で培養して始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｂ）と、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ）と、前記工程（ｃ）で得た前記細胞塊を気液平衡培養して再構成精巣を得る工程（ｄ）と、前記工程（ｄ）で得た前記再構成精巣を更に気液平衡培養し、その結果、前記再構成精巣内の前記始原生殖細胞様細胞が精子幹細胞様細胞に分化する工程（ｅ）と、を含み、前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を培養し、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｃ１）と、前記工程（ｃ１）で得た、前記エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ２）とを含む、製造方法。
［２］前記工程（ｃ１）を、フォルスコリン及びロリプラムを含む培地中で行う、［１］に記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［３］前記工程（ｃ１）を、フォルスコリン、ロリプラム及びシクロスポリンＡを含む培地中で行う、［１］に記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［４］前記工程（ｄ）及び（ｅ）を、ウシ胎児血清を含む培地中で行う、［１］～［３］のいずれかに記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［５］前記工程（ｃ２）を、フォルスコリン及びロリプラムを含む培地中で行う、［１］～［４］のいずれかに記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［６］前記多能性幹細胞は、マウス由来である、［１］～［５］のいずれかに記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［７］前記工程（ｃ１）において、前記始原生殖細胞様細胞を４～７日間培養する、［１］～［６］のいずれかに記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法により製造された精子幹細胞様細胞株。
［９］クローニングされた、［８］に記載の精子幹細胞様細胞株。
［１］精子幹細胞様細胞の製造方法であって、哺乳動物由来の多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＦＧＦ２の存在下で培養してエピブラスト様細胞を得る工程（ａ）と、前記工程（ａ）で得た前記エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で培養して始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｂ）と、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ）と、前記工程（ｃ）で得た前記細胞塊を気液平衡培養して再構成精巣を得る工程（ｄ）と、前記工程（ｄ）で得た前記再構成精巣を更に気液平衡培養し、その結果、前記再構成精巣内の前記始原生殖細胞様細胞が精子幹細胞様細胞に分化する工程（ｅ）と、を含み、前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を培養し、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｃ１）と、前記工程（ｃ１）で得た、前記エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ２）とを含む、製造方法。
［２］前記工程（ｃ１）を、フォルスコリン及びロリプラムを含む培地中で行う、［１］に記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［３］前記工程（ｃ１）を、フォルスコリン、ロリプラム及びシクロスポリンＡを含む培地中で行う、［１］に記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［４］前記工程（ｄ）及び（ｅ）を、ウシ胎児血清を含む培地中で行う、［１］～［３］のいずれかに記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［５］前記工程（ｃ２）を、フォルスコリン及びロリプラムを含む培地中で行う、［１］～［４］のいずれかに記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［６］前記多能性幹細胞は、マウス由来である、［１］～［５］のいずれかに記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［７］前記工程（ｃ１）において、前記始原生殖細胞様細胞を４～７日間培養する、［１］～［６］のいずれかに記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法により製造された精子幹細胞様細胞株。
［９］クローニングされた、［８］に記載の精子幹細胞様細胞株。
本発明によれば、機能的な精子幹細胞様細胞を製造する技術を提供することができる。
［精子幹細胞様細胞の製造方法］
一実施形態において、本発明は、精子幹細胞様細胞の製造方法であって、哺乳動物由来の多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＦＧＦ２の存在下で培養してエピブラスト様細胞を得る工程（ａ）と、前記工程（ａ）で得た前記エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で培養して始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｂ）と、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ）と、前記工程（ｃ）で得た前記細胞塊を気液平衡培養して再構成精巣を得る工程（ｄ）と、前記工程（ｄ）で得た前記再構成精巣を更に気液平衡培養し、その結果、前記再構成精巣内の前記始原生殖細胞様細胞が精子幹細胞様細胞に分化する工程（ｅ）と、を含み、前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を培養し、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｃ１）と、前記工程（ｃ１）で得た、前記エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ２）とを含む、製造方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、精子幹細胞様細胞の製造方法であって、哺乳動物由来の多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＦＧＦ２の存在下で培養してエピブラスト様細胞を得る工程（ａ）と、前記工程（ａ）で得た前記エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で培養して始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｂ）と、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ）と、前記工程（ｃ）で得た前記細胞塊を気液平衡培養して再構成精巣を得る工程（ｄ）と、前記工程（ｄ）で得た前記再構成精巣を更に気液平衡培養し、その結果、前記再構成精巣内の前記始原生殖細胞様細胞が精子幹細胞様細胞に分化する工程（ｅ）と、を含み、前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を培養し、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｃ１）と、前記工程（ｃ１）で得た、前記エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ２）とを含む、製造方法を提供する。
図１は、本実施形態の製造方法の概要を説明する模式図である。図１上段は、ヒトの雄性生殖細胞の分化過程を示す。図１中段は、マウスの雄性生殖細胞の分化過程を示す。図１下段は、本実施形態の製造方法を示す。図１上段と図１中段との間の点線は、対応する分化段階を示す。図１下段に示すように、本実施形態の製造方法では、多能性幹細胞からエピブラスト様細胞を経て始原生殖細胞様細胞を得る。続いて、始原生殖細胞様細胞を培養し、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を得る。続いて、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る。続いて、細胞塊を気液平衡培養して再構成精巣を得る。続いて、再構成精巣を更に気液平衡培養し、その結果、再構成精巣内の始原生殖細胞様細胞が精子幹細胞様細胞に分化する。
実施例において後述するように、本実施形態の方法により、多能性幹細胞から機能的な精子幹細胞様細胞を安定的に効率よく製造することができる。
精子幹細胞様細胞とは、多能性幹細胞から分化誘導した精子幹細胞であり、インビボにおける精子幹細胞と同等な細胞を意味する。精子幹細胞様細胞は精子幹細胞といいかえてもよい。
機能的な精子幹細胞様細胞とは、子孫に寄与可能な精子を形成する機能を有する精子幹細胞様細胞を意味する。精子幹細胞様細胞は、内因性精子形成を欠く成体マウス（Ｗ／Ｗｖマウス、６～８週齢）の精巣に移植して８～１０週間後に形成された精子幹細胞様細胞のコロニーのうち、精子形成を伴うコロニーの割合が３０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。
本実施形態の製造方法では、工程（ａ）において、哺乳動物由来の多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＦＧＦ２の存在下で培養してエピブラスト様細胞を得る。エピブラスト様細胞とは、多能性幹細胞から分化誘導したエピブラストであり、インビボにおけるエピブラストと同等な細胞を意味する。エピブラスト様細胞はエピブラストといいかえてもよい。
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等の食肉類；ヒト、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等が挙げられる。
工程（ａ）において、培地としては、アクチビンＡ及びＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－２（ＦＧＦ２）を添加した基本培地を用いることができる。工程（ａ）における培地は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を更に含むことが好ましい。多能性幹細胞を約２日間培養すると、エピブラスト様細胞が得られる。多能性幹細胞としては雄性の細胞を用いることが好ましい。
基本培地としては、特に限定されず、あらゆる無血清の細胞培養用基本培地を用いることができる。例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ａｌｐｈａ－Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、アドバンスト－ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ－１２混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＲＰＭＩ１６４０培地、アドバンストＲＰＭＩ培地、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ Ｐｌｕｓ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地（ステムセルテクノロジーズ）等が挙げられる。
培地中のアクチビンＡの濃度は１０～１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、約２０ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。
また、培地中のＦＧＦ２の濃度は５～１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、約１２ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。
培地には、アクチビンＡ及びＦＧＦ２以外の添加物を添加してもよい。このような添加物としては、例えば、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、Ｎｏｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（ＮＥＡＡ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ピルビン酸ナトリウム、２－メルカプトエタノール、抗生物質、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）等が挙げられる。
続いて、工程（ｂ）において、工程（ａ）で得たエピブラスト様細胞をＢｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＢＭＰ４）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）及びＥｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）の存在下で培養して始原生殖細胞様細胞を得る。始原生殖細胞様細胞とは、多能性幹細胞から分化誘導した始原生殖細胞であり、インビボにおける始原生殖細胞と同等な細胞を意味する。始原生殖細胞様細胞は始原生殖細胞といいかえてもよい。
工程（ｂ）において、培地としては、ＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦを添加した基本培地を用いることができる。基本培地については上述したものと同様である。エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で約４～６日間培養すると、始原生殖細胞様細胞が得られる。Ｕ底又はＶ底の細胞低接着ウェルプレートを用いて、エピブラスト様細胞を浮遊培養することが好ましい。
培地中のＢＭＰ４の濃度は１００～１，０００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、約５００ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。
また、培地中のＬＩＦの濃度は１００～２，０００Ｕ／ｍＬであることが好ましく、約１，０００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。
培地中のＳＣＦの濃度は１０～１，０００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、約１００ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。
また、培地中のＥＧＦの濃度は１０～１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、約５０ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。
続いて、工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得た始原生殖細胞様細胞を、生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る。
図２は、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を説明する模式図である。工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得た始原生殖細胞様細胞を培養し、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｃ１）と、工程（ｃ１）で得た、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ２）とを含む。
実施例において後述するように、工程（ｃ１）を行うことにより、安定的に高い効率で機能的な精子幹細胞様細胞を得ることができる。
工程（ｃ１）において、培地としては、フォルスコリン（ＣＡＳ番号：６６４２８－８９－５）及びロリプラム（ＣＡＳ番号：６１４１３－５４－５）を添加した基本培地を用いることができる。基本培地については上述したものと同様である。
実施例において後述するように、工程（ｂ）で得た始原生殖細胞様細胞をフォルスコリン及びロリプラムの存在下で培養すると、ゲノムＤＮＡが脱メチル化され、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を得ることができる。ここで、フォルスコリン、ロリプラムに加えてシクロスポリンＡ（ＣＡＳ番号：５９８６５－１３－３）を更に添加してもよい。また、工程（ｃ１）において、工程（ｂ）で得た始原生殖細胞様細胞を４～７日間、例えば５日間培養することが好ましい。
「エピゲノム状態が基底状態になった」とは、「エピゲノム状態が基底状態に近づいた」、「エピゲノム状態がインビボのマウスの胎生１０．５日～１６．５日の雄性生殖細胞に近い状態になった」等といいかえることができる。
工程（ｃ１）では、フィーダー細胞上で始原生殖細胞様細胞を培養することが好ましい。フィーダー細胞としては、例えば、マイトマイシンＣ処理したｍ２２０－５細胞を用いることができる。
培地中のフォルスコリンの濃度は１～１００μＭであることが好ましく、約１０μＭであることがより好ましい。
また、培地中のロリプラムの濃度は１～１００μＭであることが好ましく、約１０μＭであることがより好ましい。
培地中のシクロスポリンＡの濃度は１～１００μＭであることが好ましく、約５μＭであることがより好ましい。
続いて、工程（ｃ２）において、工程（ｃ１）で得た、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る。浮遊培養は、Ｕ底又はＶ底の細胞低接着ウェルプレートを用いて行うことが好ましい。
生体由来の雄性精巣体細胞としては、例えば、胎生１２．５日目のマウスの胚の精巣を摘出し、単一細胞に解離し、未分化細胞を除去した細胞を用いることができる。未分化細胞の除去は、例えば、ＳＳＥＡ１陽性の未分化細胞を除去することにより行うことができる。ＳＳＥＡ１陽性細胞の除去は、例えば、ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）、セルソーター等を用いて行うことができる。
始原生殖細胞様細胞と、生体由来の雄性精巣体細胞との混合割合は１：２～２：１程度が好ましく、約１：２が好ましい。例えば、始原生殖細胞様細胞１０，０００個／ウェル及び生体由来の雄性精巣体細胞２０，０００個／ウェルを混合し、約２日間浮遊培養するとよい。
工程（ｃ２）において、培地としては、フォルスコリン及びロリプラムを添加した基本培地を用いることができる。基本培地については上述したものと同様である。工程（ｃ２）で用いる培地には、更にシクロスポリンＡを添加してもよい。
続いて、工程（ｄ）において、工程（ｃ２）で得た細胞塊を気液平衡培養して再構成精巣を得る。再構成精巣とは、インビボにおける精巣を再構成した精巣である。気液平衡培養は、セルカルチャーインサートを装着したウェルプレートを用いて行うことができる。工程（ｃ２）で得た細胞塊をセルカルチャーインサート上に移して気液平衡培養を行うことにより、再構成精巣が得られる。
工程（ｄ）を、ウシ胎児血清を含む培地中で行うことが好ましい。実施例において後述するように、工程（ｄ）を、ウシ胎児血清を含む培地中で行うことにより、始原生殖細胞様細胞が後期生殖細胞に分化する割合が格段に向上する。
続いて、工程（ｅ）において、工程（ｄ）で得た再構成精巣を更に気液平衡培養する。工程（ｅ）を、ウシ胎児血清を含む培地中で行うことが好ましい。実施例において後述するように、工程（ｅ）を、ウシ胎児血清を含む培地中で行うことにより、始原生殖細胞様細胞が後期生殖細胞に分化する割合が格段に向上する。
再構成精巣の気液平衡培養を続けることにより、再構成精巣内の始原生殖細胞様細胞が精子幹細胞様細胞に分化する。精子幹細胞様細胞は、精原細胞と同等の細胞性質を有し、自己複製すると共に、減数分裂を経て精子細胞に分化する能力を持つ。実施例において後述するように、精原細胞マーカーであるＺＢＴＢ１６陽性の細胞は、気液平衡培養の開始から７日目以降に認められ、１４日目には、始原生殖細胞様細胞に由来する細胞の９０％以上がＺＢＴＢ１６陽性となる。
一実施形態において、本発明は、精子幹細胞様細胞の製造方法であって、哺乳動物由来の多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＦＧＦ２の存在下で培養してエピブラスト様細胞を得る工程（ａ）と、前記工程（ａ）で得た前記エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で培養して始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｂ）と、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ）と、前記工程（ｃ）で得た前記細胞塊を、ウシ胎児血清を含む培地中で気液平衡培養して再構成精巣を得る工程（ｄ’）と、前記工程（ｄ）で得た前記再構成精巣を、ウシ胎児血清を含む培地中で更に気液平衡培養し、その結果、前記再構成精巣内の前記始原生殖細胞様細胞が精子幹細胞様細胞に分化する工程（ｅ’）と、を含み、前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を４～７日間、フォルスコリン、ロリプラム及びシクロスポリンＡの存在下で培養し、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｃ１）と、前記工程（ｃ１）で得た、前記エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合してフォルスコリン及びロリプラムを含む培地中で浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ２’）とを含む、製造方法を提供する。
実施例において後述するように、本実施形態の方法により、多能性幹細胞から機能的な精子幹細胞様細胞を安定的に効率よく製造することができる。
［精子幹細胞様細胞株］
一実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された精子幹細胞様細胞株を提供する。
一実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された精子幹細胞様細胞株を提供する。
実施例において後述するように、本実施形態の精子幹細胞様細胞株は、従来法により多能性幹細胞から製造された精子幹細胞様細胞株と比較して、マウスの精巣に移植した場合に精子形成に寄与する効率が格段に高い。
したがって、従来法により多能性幹細胞から製造された精子幹細胞様細胞株とは、エピゲノム状態、遺伝子発現プロファイル等が相違していると考えられる。しかしながら、そのような相違を特定することは困難であり、製造方法で特定することが現実的である。
また、本実施形態の精子幹細胞様細胞株は、多能性幹細胞から分化して得られたものであるため、インビボの精子幹細胞とはエピゲノム状態、遺伝子発現プロファイル等が相違していると考えられる。しかしながら、そのような相違を特定することは困難であり、製造方法で特定することが現実的である。
本実施形態の精子幹細胞様細胞株はマルチクローナルであってもよいし、クローニングされたモノクローナルな細胞株であってもよいが、クローニングされていることが好ましい。精子幹細胞様細胞株がモノクローナルであると、均一であるため、機能解析が容易になる。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（再構成精巣培養の最適化）
図１に示すように、マウスＥＳ細胞（ｍＥＳＣ）をアクチビンＡ及びＦＧＦ２の存在下で約２日間培養することにより、エピブラスト様細胞（ＥｐｉＬＣｓ）を得ることができる。続いて、エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で約４日間培養することにより（ｄ４）、始原生殖細胞様細胞（ｍＰＧＣＬＣｓ）を得ることができる。以下、エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で約４日間培養して得た始原生殖細胞様細胞を「ｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓ」という場合がある。
（再構成精巣培養の最適化）
図１に示すように、マウスＥＳ細胞（ｍＥＳＣ）をアクチビンＡ及びＦＧＦ２の存在下で約２日間培養することにより、エピブラスト様細胞（ＥｐｉＬＣｓ）を得ることができる。続いて、エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で約４日間培養することにより（ｄ４）、始原生殖細胞様細胞（ｍＰＧＣＬＣｓ）を得ることができる。以下、エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で約４日間培養して得た始原生殖細胞様細胞を「ｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓ」という場合がある。
非特許文献１では、図２に示すように、ｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓを、胎生１２．５日目のマウス由来の雄性精巣体細胞と混合して約２日間浮遊培養して細胞塊を得て、この細胞塊を気液平衡培養し、再構成精巣を形成した。この場合、再構成精巣培養を３週間行った後に、精原細胞マーカーであるＺＢＴＢ１６（ＰＬＺＦ）陽性の細胞の出現が認められたが、その出現効率は１０％以下であった。これに対し、本実験例では、様々な条件下で再構成精巣を形成し、再構成精巣培養の最適化を行った。図３は、本実験例の概要を説明する図である。
図３に示すように、本実験例では、ｍＰＧＣＬＣｓとして、（１）ｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓ、又は、（２）ｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓを５日間、フォルスコリン１０μＭ、ロリプラム１０μＭ及びシクロスポリンＡ５μＭの存在下、ｍ２２０フィーダー細胞上で培養した始原生殖細胞様細胞（ｄ４ｃ５ ｍＰＧＣＬＣｓ）を用いて再構成精巣培養を行い、その影響を検討した。後述するように、ｄ４ｃ５ ｍＰＧＣＬＣｓは、エピゲノム状態が基底状態になったことが明らかとなった。
また、ｍＰＧＣＬＣｓを雄性精巣体細胞と混合して約２日間浮遊培養する培地として、（１）１５％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加したＧｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）（以下、「ＧＭＥＭ－ＫＳＲ１５％」という場合がある。）、又は、（２）１０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ Ｎｏｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（ＮＥＡＡ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン，０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、２．５％ＦＣＳ（ハイクローン）を添加したＧＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）（以下、「ＧＫ１０」という場合がある。）に、フォルスコリン１０μＭ及びロリプラム１０μＭを含む培地（以下、「ＧＫ１０＋ＦＲ１０」という場合がある。）を用いてその影響を検討した。
また、細胞塊を気液平衡培養し、再構成精巣を形成する培地として、（１）１０％ＫＳＲ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加したａｌｐｈａ－Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）（以下、「αＭＥＭ－ＫＳＲ１０％」という場合がある。）、又は、（２）１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ハイクローン）を添加したαＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）（以下、「αＭＥＭ－ＦＢＳ１０％」という場合がある。）を用いてその影響を検討した。
図３上段は、ｍＰＧＣＬＣｓとして、ｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓを用いた場合の実験スケジュールを示す図である。図３中段は、ｍＰＧＣＬＣｓとして、ｄ４ｃ５ ｍＰＧＣＬＣｓを用いた場合の実験スケジュールを示す図である。
図３下段は、浮遊培養時及び気液平衡培養（気相液相培養）時の培地の組み合わせを示す図である。条件Ａでは、浮遊培養の培地にＧＭＥＭ－ＫＳＲ１５％を使用し、気液平衡培養の培地にαＭＥＭ－ＫＳＲ１０％を使用した。条件Ｂでは、浮遊培養の培地にＧＭＥＭ－ＫＳＲ１５％を使用し、気液平衡培養の培地にαＭＥＭ－ＦＢＳ１０％を使用した。条件Ｃでは、浮遊培養の培地にＧＫ１０＋ＦＲ１０を使用し、気液平衡培養の培地にαＭＥＭ－ＫＳＲ１０％を使用した。条件Ｄでは、浮遊培養の培地にＧＫ１０＋ＦＲ１０を使用し、気液平衡培養の培地にαＭＥＭ－ＦＢＳ１０％を使用した。
胎生１２．５日目のマウス由来の雄性精巣体細胞としては、ＩＣＲマウスの胚の精巣を摘出し、単一細胞に解離し、ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）を用いてＳＳＥＡ１陽性の生殖細胞を除去した細胞を使用した。続いて、ｍＰＧＣＬＣｓ １０，０００個／ウェル及び雄性精巣体細胞２０，０００個／ウェルを混合し、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ ９６ウェルマイクロプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて２日間浮遊培養し、細胞塊を得た。
続いて、ガラスキャピラリーを用いて細胞塊をＴｈｉｎＣｅｒｔＴＭ２４ウェル用セルカルチャーインサート（グライナー）の上に移し、気液平衡培養を行った。
ｍＰＧＣＬＣｓへの分化に使用したｍＥＳＣは、Ｂｌｉｍｐ１（Ｐｒｄｍ１としても知られる）制御下のｍｅｍｂｒａｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｖｅｎｕｓ（ｍＶｅｎｕｓ）、Ｓｔｅｌｌａ（Ｄｐｐａ３としても知られる）制御下のＥＣＦＰ、Ｄｄｘ４（Ｍｖｈとしても知られる）制御下のＲＦＰのトランスジーン［Ｂｌｉｍｐ１－ｍＶｅｎｕｓ；Ｓｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰ；Ｍｖｈ－ＲＦＰ：以下「ＢＶＳＣＶＲ」という場合がある。］を有していた。雄性生殖細胞の分化において、Ｂｌｉｍｐ１及びＳｔｅｌｌａは始原生殖細胞マーカーであり、Ｍｖｈは後期生殖細胞マーカーである。生殖細胞は、オスになるためのシグナルを受けるとＭｖｈを発現する。その後、オスとしての形質が獲得されると、Ｂｌｉｍｐ１、Ｓｔｅｌｌａの順に発現が低下する。したがって、ＢＶＳＣＶＲトランスジーンは雄性生殖細胞の発達の進行をモニターするのに効果的なマーカーである。
図４は、各条件下で再構成精巣培養を行い、気液平衡培養の開始から７日目に後期生殖細胞に分化した細胞であるＶＲ陽性細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。図４中、縦軸はｍＰＧＣＬＣｓ由来細胞に対するＶＲ陽性細胞の割合（％）を示す。また、横軸のＡ～Ｄは、図３に示す条件Ａ～Ｄを示す。
その結果、ｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓを培養した場合と比較して、ｄ４ｃ５ ｍＰＧＣＬＣｓを培養した場合に格段にＶＲ陽性細胞の形成割合が上昇したことが明らかとなった。更に、図３に示す条件Ｂ又は条件Ｄにより、格段にＶＲ陽性細胞の形成割合が上昇したことが明らかとなった。すなわち、細胞塊を気液平衡培養する培地として、αＭＥＭ－ＦＢＳ１０％を用いることが好ましいことが明らかとなった。また、ｍＰＧＣＬＣｓを雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養する培地として、ＧＭＥＭ－ＫＳＲ１５％又はＧＫ１０＋ＦＲ１０が好ましく、ＧＫ１０＋ＦＲ１０が特に好ましいことが明らかとなった。
［実験例２］
（雄性生殖細胞の試験管内再構成１）
ｍＰＧＣＬＣｓとしてｄ４ｃ５ ｍＰＧＣＬＣｓを用い、ｄ４ｃ５ ｍＰＧＣＬＣｓを雄性精巣体細胞と混合して約２日間浮遊培養する培地としてＧＫ１０＋ＦＲ１０を用い、細胞塊を気液平衡培養し、再構成精巣を形成する培地として、αＭＥＭ－ＦＢＳ１０％を用いて再構成精巣培養を行った。
（雄性生殖細胞の試験管内再構成１）
ｍＰＧＣＬＣｓとしてｄ４ｃ５ ｍＰＧＣＬＣｓを用い、ｄ４ｃ５ ｍＰＧＣＬＣｓを雄性精巣体細胞と混合して約２日間浮遊培養する培地としてＧＫ１０＋ＦＲ１０を用い、細胞塊を気液平衡培養し、再構成精巣を形成する培地として、αＭＥＭ－ＦＢＳ１０％を用いて再構成精巣培養を行った。
図５は、経時的に細胞を観察した結果を示す明視野画像及びＶＲ、ＳＣ、ＢＶの蛍光顕微鏡画像である。スケールバーは１００μｍである。図５中、ｍ０～ｍ１４は、それぞれ、気液平衡培養開始から０～１４日目であることを示す。
図６下段は、図５に基づいて、再構成精巣培養におけるｍＰＧＣＬＣ由来細胞のＶＲ、ＳＣ、ＢＶの蛍光強度（相対値）の経時変化を示すグラフである。図６上段は、インビボでの雄性生殖細胞の分化において、ＶＲ、ＳＣ、ＢＶの蛍光強度（相対値）の経時変化を示すグラフである。
その結果、１４日間の再構成精巣培養におけるＶＲ、ＳＣ、ＢＶの蛍光強度の変化は、生体内での胎生１１．５日から出生後５～７日の精原細胞の分化におけるＶＲ、ＳＣ、ＢＶの蛍光強度の変化とよく一致していることが示された。
精原細胞マーカーであるＺＢＴＢ１６陽性の細胞はｍ７以降に認められ、ｍ１４では、ＢＶ陽性ＳＣ陽性ＶＲ陽性細胞の９０％以上がＺＢＴＢ１６陽性であった。
［実験例３］
（雄性生殖細胞の試験管内再構成２）
実験例２と同様にして再構成精巣培養を行った。続いて、ＲＮＡシーケンス解析により、再構成精巣中のｍＰＧＣＬＣ由来細胞のトランスクリプトームを、インビボにおけるマウスの雄性生殖細胞のトランスクリプトームと比較した。
（雄性生殖細胞の試験管内再構成２）
実験例２と同様にして再構成精巣培養を行った。続いて、ＲＮＡシーケンス解析により、再構成精巣中のｍＰＧＣＬＣ由来細胞のトランスクリプトームを、インビボにおけるマウスの雄性生殖細胞のトランスクリプトームと比較した。
図７はｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）エンリッチメント解析の結果を示すヒートマップである。その結果、再構成精巣中のｍＰＧＣＬＣ由来細胞のトランスクリプトームの経時変化は、インビボにおけるマウスの雄性生殖細胞のトランスクリプトームの経時変化と非常に類似していることが明らかとなった。
図８は内在性レトロトランスポゾンの発現を示すヒートマップである。レトロトランスポゾンの発現は、ＤＮＡが脱メチル化されてエピゲノム状態が基底状態になったことを示す。その結果、再構成精巣中のｍＰＧＣＬＣ由来細胞におけるレトロトランスポゾンの発現の経時変化は、インビボのマウスの雄性生殖細胞におけるレトロトランスポゾンの発現の経時変化と類似していることが明らかとなった。
図９は、全ゲノムバイサルファイト解析（ＷＧＢＳ）により、ＤＮＡのメチル化（エピゲノム）状態を解析し、主成分分析した結果を示すグラフである。図９中、「ｄ４ＰＧＣＬＣ」はｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓを示し、「ｄ４ｃ３」、「ｄ４ｃ７」は、それぞれ、ｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓをフォルスコリン、ロリプラムの存在下で３日間及び７日間培養したｍＰＧＣＬＣｓを示し、「ｄ４ｃ７ＣｓＡ」は、ｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓをフォルスコリン、ロリプラム、シクロスポリンＡの存在下で７日間培養したｍＰＧＣＬＣｓを示し、「Ｅ１０．５」、「Ｅ１３．５」、「Ｅ１６．５」は生体由来の雄性生殖細胞を示す。
その結果、ｄ４ ｍＰＧＣＬＣｓをフォルスコリン及びロリプラムの存在下で数日間培養すると、エピゲノム状態が基底状態になり、インビボのマウスの胎生１０．５日～１３．５日の雄性生殖細胞に近い状態になることが明らかとなった。
図１０は、再構成精巣中のｍＰＧＣＬＣ由来細胞の細胞周期の状態と、インビボにおけるマウスの雄性生殖細胞の細胞周期の状態を解析した結果を示すグラフである。その結果、再構成精巣中のｍＰＧＣＬＣ由来細胞は、インビボにおけるマウスの雄性生殖細胞と同様に、一度細胞周期が停止した後再開することが明らかとなった。
以上の結果は、実験例２と同様の再構成精巣培養におけるｍＰＧＣＬＣ由来細胞の分化過程が、インビボにおける雄性生殖細胞の分化過程と類似していることを示す。
［実験例４］
（精子幹細胞様細胞株の樹立）
実験例２と同様にして再構成精巣培養を行った。気液平衡培養開始から１４日目（ｍ１４）に、再構成精巣１つあたりに存在する、全てのｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞（３００～１，０００個）又は１個のｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞を培養し、精子幹細胞様細胞（ＧＳＣＬＣ）株を樹立した。
（精子幹細胞様細胞株の樹立）
実験例２と同様にして再構成精巣培養を行った。気液平衡培養開始から１４日目（ｍ１４）に、再構成精巣１つあたりに存在する、全てのｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞（３００～１，０００個）又は１個のｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞を培養し、精子幹細胞様細胞（ＧＳＣＬＣ）株を樹立した。
ｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞としては、再構成精巣を、精原細胞マーカーである、ＡＰＣ標識抗ＣＤ９抗体で染色し、ＶＲ陽性ＣＤ９陽性細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ、ＢＤバイオサイエンス）でソーティングして回収したものを使用した。
再構成精巣１つあたりに存在する、全てのｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞は、０．１％ゼラチン－リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分間コートした後、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を播種し６時間以上経過した２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種して培養した。
１個のｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞は、０．１％ゼラチン－リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分間コートした後、マイトマイシンＣ処理したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を播種し６時間以上経過した９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種して培養した。
ｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞の培地には、ＳｔｅｍＰｒｏサプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１％ＦＣＳ（ハイクローン）、１×ＭＥＭビタミン溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、５ｍｇ／ｍＬ ＡｌｂｕＭＡＸＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン，０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１×Ｉｎｓｕｌｉｎ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－Ｓｅｌｅｎｉｕｍ（ＩＴＳ－Ｇ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトｂＦＧＦ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、２０ｎｇ／ｍＬ 組換えラットＧＤＮＦ（ＲＳＤ）、２０ｎｇ／ｍＬマウス組換えＥＧＦキャリアフリー（ＲＳＤ）、１，０００Ｕ／ｍＬ ＬＩＦを添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４ＳＦＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用した。
その結果、全てのｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞を培養した１６個の細胞培養の全てにおいて、精子幹細胞様細胞（ＧＳＣＬＣ）株を樹立することができた。以下、樹立したマルチクローナルなＧＳＣＬＣ株を、それぞれ、「ＧＳＣＬＣ＿Ｗ１」～「ＧＳＣＬＣ＿Ｗ１６」という。
また、特筆すべきことに、１個のｍＰＧＣＬＣ由来細胞を培養した１９２個の細胞培養のうちの１５個から、ＧＳＣＬＣ株を樹立することができた。以下、樹立したモノクローナルなＧＳＣＬＣ株を、それぞれ、「ＧＳＣＬＣ＿Ｓ１」～「ＧＳＣＬＣ＿Ｓ１５」という。
図１１に、代表的なＧＳＣＬＣ株の顕微鏡画像を示す。スケールバーは１００μｍである。また、下記表１に、ＧＳＣＬＣ株の樹立の結果を示す。
［実験例５］
（精子幹細胞様細胞株の精子形成能の検討）
実験例４で樹立したＧＳＣＬＣ株が精子形成能を示すかどうかを検討した。精子幹細胞様細胞株を、内因性精子形成を欠く成体マウス（Ｗ／Ｗｖマウス、６～８週齢）の精巣に移植し、移植後８～１０週間後に分析した。
（精子幹細胞様細胞株の精子形成能の検討）
実験例４で樹立したＧＳＣＬＣ株が精子形成能を示すかどうかを検討した。精子幹細胞様細胞株を、内因性精子形成を欠く成体マウス（Ｗ／Ｗｖマウス、６～８週齢）の精巣に移植し、移植後８～１０週間後に分析した。
非特許文献１の結果では、再構成精巣１つあたりに存在する、全てのｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞から樹立したＧＳＣＬＣ株（ＧＳＣＬＣ１６＿Ｗ１～ＧＳＣＬＣ１６＿Ｗ１５、おそらく、マルチクローナル）は、限定的な効率で精子形成に寄与した。具体的には、１５株のうち３株のみが精子形成に寄与した。また、精子形成に寄与した３株においても、精子形成を示すコロニーの割合は２０％以下であった。すなわち、ＧＳＣＬＣ株がコロニーを形成した精細管の２０％以下で精子形成が認められた。
これに対し、実験例４において、再構成精巣１つあたりに存在する、全てのｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞から樹立したＧＳＣＬＣ株（ＧＳＣＬＣ＿Ｗ１～ＧＳＣＬＣ＿Ｗ１６）は、安定的に精子形成に寄与し、これらの細胞株の大部分（１５／１６、～９４％）において、精子形成を伴うコロニーの割合は８０％以上であった。
また、実験例４において、１個のｍＰＧＣＬＣ由来の精原細胞様細胞から樹立したＧＳＣＬＣ株は、６株のうち５株が精子形成に寄与した。また、これらの細胞株の大部分（４／５、～８０％）において、精子形成を伴うコロニーの割合は８０％以上であった。
図１２は、ＧＳＣＬＣ株をＷ／Ｗｖマウスの精巣に移植した後に観察された、精子形成を伴うコロニーの割合を示すグラフである。図１２中、「１６＿Ｗ１－１５」は、非特許文献１で樹立したＧＳＣＬＣ株「ＧＳＣＬＣ１６＿Ｗ１」～「ＧＳＣＬＣ１６＿Ｗ１５」を示し、「Ｗ１－１６」は、実験例４で樹立したＧＳＣＬＣ株「ＧＳＣＬＣ＿Ｗ１」～「ＧＳＣＬＣ＿Ｗ１６」を示し、「Ｓ１－６」は、実験例４で樹立したＧＳＣＬＣ株「ＧＳＣＬＣ＿Ｓ１」～「ＧＳＣＬＣ＿Ｓ６」を示す。
図１３左は、ＧＳＣＬＣ＿Ｗ９株を移植してから８週間後のＷ／Ｗｖマウスの精巣から採取した精細管の明視野画像である。スケールバーは１００μｍである。図１３中央は、図１３左と同視野における蛍光画像であり、ＶＲの蛍光を撮影したものである。図１３右は、ＧＳＣＬＣ＿Ｗ１株を移植してから８週間後のＷ／Ｗｖマウスの精細管から採取した精子（矢印で示す）の明視野画像である。スケールバーは１０μｍである。
続いて、４つの独立したＧＳＣＬＣ株（ＧＳＣＬＣ＿Ｗ１～ＧＳＣＬＣ＿Ｗ３、ＧＳＣＬＣ＿Ｓ１）に由来する精子の卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）を実施した。これらの注入はすべて、接合子と２細胞期胚の生成をもたらし、代理母に移植した結果、明らかに健康な子孫に寄与した。
図１４左上は、ＧＳＣＬＣ＿Ｗ１株に由来する前核期胚の顕微鏡画像である。図１４右上は、ＧＳＣＬＣ＿Ｗ１株に由来する２細胞期胚の顕微鏡画像である。図１４左下及び右下は、これらの胚から得られた子孫の写真である。下記表２に、卵細胞質内精子注入法の結果を示す。
子孫へのＧＳＣＬＣ由来精子細胞の寄与の効率は、生殖幹細胞（ＧＳＣ）由来精子又はインビボ精子の効率と類似していた。これらの結果は、多能性幹細胞から精原細胞／精子幹細胞（ＳＳＣ）を安定的に再構成できることを示す。
本発明によれば、機能的な精子幹細胞様細胞を製造する技術を提供することができる。
Claims (9)
- 精子幹細胞様細胞の製造方法であって、
哺乳動物由来の多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＦＧＦ２の存在下で培養してエピブラスト様細胞を得る工程（ａ）と、
前記工程（ａ）で得た前記エピブラスト様細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ及びＥＧＦの存在下で培養して始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｂ）と、
前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ）と、
前記工程（ｃ）で得た前記細胞塊を気液平衡培養して再構成精巣を得る工程（ｄ）と、
前記工程（ｄ）で得た前記再構成精巣を更に気液平衡培養し、その結果、前記再構成精巣内の前記始原生殖細胞様細胞が精子幹細胞様細胞に分化する工程（ｅ）と、を含み、
前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）で得た前記始原生殖細胞様細胞を培養し、エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を得る工程（ｃ１）と、前記工程（ｃ１）で得た、前記エピゲノム状態が基底状態になった始原生殖細胞様細胞を生体由来の雄性精巣体細胞と混合して浮遊培養し、細胞塊を得る工程（ｃ２）とを含む、製造方法。 - 前記工程（ｃ１）を、フォルスコリン及びロリプラムを含む培地中で行う、請求項１に記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
- 前記工程（ｃ１）を、フォルスコリン、ロリプラム及びシクロスポリンＡを含む培地中で行う、請求項１に記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
- 前記工程（ｄ）及び（ｅ）を、ウシ胎児血清を含む培地中で行う、請求項１～３のいずれか一項に記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
- 前記工程（ｃ２）を、フォルスコリン及びロリプラムを含む培地中で行う、請求項１～４のいずれか一項に記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
- 前記多能性幹細胞は、マウス由来である、請求項１～５のいずれか一項に記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
- 前記工程（ｃ１）において、前記始原生殖細胞様細胞を４～７日間培養する、請求項１～６のいずれか一項に記載の精子幹細胞様細胞の製造方法。
- 請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法により製造された精子幹細胞様細胞株。
- クローニングされた、請求項８に記載の精子幹細胞様細胞株。
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|---|---|---|---|
| US202163237139P | 2021-08-26 | 2021-08-26 | |
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- 2022-08-25 WO PCT/JP2022/032055 patent/WO2023027148A1/ja unknown
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