WO2018225802A1 - 多能性幹細胞から生殖系列幹細胞様細胞への分化誘導方法 - Google Patents

多能性幹細胞から生殖系列幹細胞様細胞への分化誘導方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018225802A1
WO2018225802A1 PCT/JP2018/021775 JP2018021775W WO2018225802A1 WO 2018225802 A1 WO2018225802 A1 WO 2018225802A1 JP 2018021775 W JP2018021775 W JP 2018021775W WO 2018225802 A1 WO2018225802 A1 WO 2018225802A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
testis
gsclc
gsc
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/021775
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
通紀 斎藤
友紀子 石藏
Original Assignee
国立大学法人京都大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人京都大学 filed Critical 国立大学法人京都大学
Priority to JP2019523955A priority Critical patent/JP7079017B2/ja
Priority to US16/619,361 priority patent/US20200248138A1/en
Publication of WO2018225802A1 publication Critical patent/WO2018225802A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0611—Primordial germ cells, e.g. embryonic germ cells [EG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/32—Polylysine, polyornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing germline stem cell-like cells in vitro from pluripotent stem cells via epiblast-like cells and primordial germ cell-like cells, and from the germline stem cell-like cells in the testes of adult animals
  • the present invention relates to a method for inducing normal sperm.
  • ES cells embryonic stem cells
  • PSC primary germ cells
  • ES cells / induced pluripotent stem cells (“iPS cells”, “iPSCs”) using cytokines including activin A and basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • EpiLC epiblast-like cells
  • PSC-like cells primordial germ cell-like cells
  • PGCLC pluripotent stem cells
  • sperm stem cells are cells in the previous stage of sperm, from pluripotent stem cells via PGC.
  • sperm stem cells are the cells that produce sperm throughout their life, are few in the adult testis, and are said to be the only stem cells in the germline. So far, methods for establishing long-term sperm stem cell cultures (germline stem cells; GSC) have been studied, but there are many unclear points about the mechanism by which sperm stem cells are induced to differentiate from PGCs. Thus, establishment of a culture system for inducing GSC-like cells in vitro is desired.
  • an object of the present invention is to provide a method for inducing GSC-like cells in vitro from PGCLC derived from pluripotent stem cells. This GSC-like cell is differentiated into sperm, and PSC contributes efficiently. It is to provide a method for producing offspring.
  • mice PGC is surrounded by gonad somatic cells that will be the source of the testis in the future by 12.5 days of gestation (E12.5), and is called pre-spermatogonial cells, and then around 5 days of birth, Differentiate into spermatogonia and sperm stem cells. Therefore, the present inventors focused on the cell environment at the time when PGC became pre-spermatogonial cells, and aggregated PGCLC derived from mouse ESC by suspension culture with embryonic somatic cells of mouse embryo (E12.5). Thus, a “reconstructed testis” was prepared, and the culture conditions under which differentiation into sperm stem cells was induced were examined.
  • GSCLC germline stem cell-like cells
  • the present invention relates to: [1] A method of producing sperm stem cell-like cells in vitro from isolated pluripotent stem cells (PSC) -derived primordial germ cell-like cells (PGCLC), (1) co-culturing PGCLC with gonad somatic cells in suspension culture to obtain a reconstituted testis; and (2) A method comprising a step of subjecting the obtained reconstituted testis to gas-liquid interface culture to induce DDX4-positive and PLZF-positive cells in the reconstituted testis.
  • PSC pluripotent stem cells
  • PGCLCLC primordial germ cell-like cells
  • GSC-like comprising dissociating sperm stem cell-like cells obtained by the method according to [1] from reconstituted testis and culturing germline stem cells (GSC) from sperm stem cells Method for producing cells (GSCLC).
  • An isolated GSCLC characterized by having the following properties: (a) derived from isolated PSC (b) (i) a gene selected from the group consisting of Ddx4, Daz1, Gfra1, Ret, Piwil2, Itga6, Kit, Plzf, Piwil4 and Id4, (ii) The expression level of a surface marker selected from the group consisting of CD9, SSEA1, INTEGRIN ⁇ 1, INTEGRIN ⁇ 6, KIT and GFR ⁇ 1, and (iii) a transcription factor selected from the group consisting of PLZF and ID4 is equivalent to GSC (c) Can be maintained and amplified at the same growth rate as GSC (d) When the GSCLC is transplanted into an adult testis, (i) the proportion of seminiferous tubules with GFR ⁇ 1-positive cells in the seminiferous tubules in which the transplanted cells are established is equivalent to that in the case of transplanting GSC; and (ii) SCP3-positive cells in the se,
  • GSCLC obtained by the method according to [2] or GSCLC according to [3] A method for producing fertile sperm cells, which comprises transplanting a sperm into a testis of a mammal.
  • FIG. 1 shows the development of reconstituted testis in vitro.
  • A Scheme for generation and culture of reconstituted testis under two conditions.
  • B Representative images of reconstructed testis development over 3 weeks (condition 2). Illustrated are bright field images (BF), AAG fluorescence, and their merge. Bar: 200 ⁇ m.
  • C Expression of GATA4 and SOX9 (left) or DDX4 and PLZF (right) in reconstituted testes at d14 and d21 (condition 2) or E13.5 and P3 testis. Bar: 50 ⁇ m.
  • PGCLC-derived cells and endogenous germ cells are identified by GFP and DDX4 (second row), respectively. DAPI staining and merging are also shown.
  • A Representative image of reconstructed testis development for 3 weeks under condition 1.
  • a bright field image (BF, top), GFP fluorescence by AAG (middle), and their merge (bottom) are shown. Bar: 200 ⁇ m.
  • B Expression of GATA4 and SOX9 (left) or DDX4 and PLZF (right) in reconstructed testes at d14 and d21 (condition 1), or at reconstructed testes at E13.5 and postnatal days (P) 3 IF analysis. Bar: 50 ⁇ m.
  • PGCLC-derived cells and endogenous germ cells were identified by GFP and DDX4, respectively (second row).
  • DAPI staining and merging are shown in the top and bottom columns, respectively.
  • (C) IF analysis of DDX4 and PLZF expression in reconstructed testis (condition 1 (left) and 2 (right)) at d21. Endogenous germ cells were identified as GFP ( ⁇ ) / DDX4 (+) cells. DAPI staining and merging are shown in the top and bottom columns, respectively. Bar: 50 ⁇ m.
  • (D) Long-term culture of reconstituted testis with AAG (+) PGC in vivo (condition 1).
  • (Left) Form of reconstructed testis cultured for 49 days. A bright field image (BF), GFP fluorescence by AAG, and their merge (bottom) are shown. Bar: 200 ⁇ m.
  • FIG. 3 shows the induction from reconstituted testis to germline stem cell-like cells.
  • A Scheme of GSCLC induction from reconstructed testis.
  • B (Top) Representative image of AAG (+) cell colonies during induction of GSCLC. BF images, AAG fluorescence, and their merge are shown.
  • GSCLC1 GSCLC1
  • FIG. 4 shows germline stem cell-like cells (GSCLC) derived from reconstituted testis and is related to FIG.
  • GSCLC germline stem cell-like cells
  • A Karyotype analysis of GSC1, GSCLC1, and GSCLC4.
  • B (Left) Scheme for directly culturing d4 PGCLC under GSC induction conditions.
  • FIG. 5 shows GSCLC-derived spermatogenic and fertile offspring.
  • a and B W / W v mouse testis (A) or isolated tubule (B) representative 10 weeks after transplantation of GSC (GSC1), d4 PGCLC (A only) and GSCLC (GSCLC1, 4) BF and AAG-fluorescence images. Enlarging the enclosed area revealed that AAG (+) cells settled only in the basal region of the seminiferous tubule. The fluorescence of the dots (second from the bottom, bottom) observed with d4 PGCLC transplantation is autofluorescence. Histological sections stained with H & E are shown in (B). (A) Bar; 1 mm, (B) Bar: 100 ⁇ m (left), 50 ⁇ m (right).
  • FIG. 6 shows spermatogenesis and offspring from GSCLC and is related to FIG.
  • A Transplantation and spermatogenesis of 15 strains of GSCLC derived from reconstructed testis under conditions 1 and 2.
  • B Number of colonies with or without spermatogenesis in testis transplanted with GSCLC 1, 2 and 3.
  • C, D Body weight (C) and placental weight (D) of offspring from GSCLC1 and GSC1. The p-value was obtained by Student's t test.
  • FIG. 7 shows a culture scheme for obtaining a reconstituted testis containing sperm stem cell-like cells from cultured PGCLC in Example 2.
  • FIG. 8 shows temporal changes in the expression of various PGC markers in reconstituted testis by gas-liquid interface culture.
  • FIG. 9 shows the establishment of GSCLC from the reconstructed testis on the 14th day of gas-liquid interface culture.
  • the present invention provides a method for producing sperm stem cell-like cells in vitro from isolated pluripotent stem cell-derived PGCLC To do.
  • the method is (1) co-culturing PGCLC with gonad somatic cells in suspension culture to obtain a reconstituted testis; and (2) A step of subjecting the obtained reconstituted testis to gas-liquid interface culture to induce DDX4-positive and PLZF-positive cells in the reconstituted testis.
  • PGCLC primordial germ cell-like cells
  • PGCLC used in the present invention is derived from isolated pluripotent stem cells in vitro and has the same characteristics as PGC. Although what kind of thing may be sufficient, PGCLC described in the said patent document 1 and the nonpatent literature 1 is mentioned, for example.
  • the PGCLC can be produced from the isolated PSC via epiblast-like cells (EpiLC) by the method shown below.
  • Pluripotent stem cells used as starting materials for PGCLC production are isolated with “self-replicating ability” that can proliferate while maintaining an undifferentiated state and “differentiated pluripotency” that can differentiate into all three primary germ layers Any undifferentiated cells that have been produced may be used.
  • isolated means being placed in vivo (in vivo) to in vitro (in vitro), and need not be purified.
  • isolated pluripotent stem cells include iPS cells, ES cells, embryonic germ (EG) cells, embryonic cancer (EC) cells, etc., preferably iPS cells or ES cells.
  • the method of the present invention can be applied to any mammalian species in which any PSC is established or can be established.
  • mammals include humans, mice, rats, monkeys, dogs, pigs, cows, cats, goats, sheep, rabbits, guinea pigs, hamsters, etc., preferably humans, mice, rats, monkeys, A dog or the like, more preferably a human or a mouse.
  • ES cell pluripotent stem cells can be obtained by a method known per se.
  • a method for preparing ES cells a method of culturing an inner cell mass in a mammalian blastocyst stage (see, for example, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)) ), Methods of culturing early embryos produced by somatic cell nuclear transfer (Wilmut et al., Nature, 385, 810 (1997); Cibelli et al., Science, 280, 1256 (1998); Akira Iriya et al., Protein Nucleic Acids Enzymes, 44, 892 (1999); Baguisi et al., Nature Biotechnology, 17, 456 (1999); Wakayama et al., Nature, 394, 369 (1998); Wakayama et al., Nature Genetics, 22, 127 ( 1999); Wakayama et
  • ES cells can be obtained from a predetermined institution, and further commercially available products can be purchased.
  • human ES cell lines H1 and H9 are available from the WiCell Institute at the University of Wisconsin, and KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from the Institute for Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from the Institute for Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • iPS cells can be prepared by introducing a nuclear reprogramming substance into somatic cells.
  • Somatic cell source A somatic cell that can be used as a starting material for preparing an iPS cell may be any cell other than a germ cell derived from a mammal (eg, mouse or human).
  • keratinized epithelial cells eg, keratinized epidermal cells
  • mucosal epithelial cells eg, epithelial cells of the tongue surface
  • exocrine glandular epithelial cells eg, mammary cells
  • hormone secreting cells eg, adrenal medullary cells
  • Cells for metabolism / storage eg, hepatocytes
  • luminal epithelial cells that make up the interface eg, type I alveolar cells
  • luminal epithelial cells in the inner chain eg, vascular endothelial cells
  • transport Ciliated cells eg, airway epithelial cells
  • extracellular matrix secreting cells eg, fibroblasts
  • contractile cells eg, smooth muscle cells
  • somatic stem cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as adipose-derived stromal (stem) cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • somatic cells are collected from another patient who is the patient's own cells or who has an HLA type that is the same or substantially the same as the patient's HLA type.
  • substantially the same HLA type means that the transplanted cells are transplanted when cells obtained by inducing differentiation from iPS cells derived from donor somatic cells are transplanted into a patient by using an immunosuppressant or the like. This means that the HLA types match to the extent that they can be engrafted.
  • the main HLA (the main 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci further including HLA-Cw) is the same (hereinafter the same).
  • PGC-like cells are not administered (transplanted) to humans, for example, when used as a source of cells for screening to evaluate the drug sensitivity and side effects of patients, the patient itself or drug sensitivity and side effects are similarly used. It is necessary to collect somatic cells from others who have the same genetic polymorphism that correlates with.
  • Somatic cells isolated from mammals can be pre-cultured in a medium known per se suitable for the culture depending on the cell type.
  • a medium known per se suitable for the culture depending on the cell type.
  • a medium include a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal calf serum, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, and F12 medium. It is not limited to.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI1640 medium fetal calf serum
  • 199 medium fetal calf serum
  • F12 medium F12 medium. It is not limited to.
  • an introduction reagent such as a cationic liposome when contacting the cell with the nuclear reprogramming substance and the substance that improves the establishment efficiency of iPS cells, for example, replace it with a serum-free medium in advance to prevent a reduction in the introduction efficiency. It may be preferable.
  • the “nuclear reprogramming substance” is a substance (group) capable of inducing iPS cells from somatic cells. (Including incorporated forms), or any substance such as a low molecular weight compound.
  • the nuclear reprogramming substance is a protein factor or a nucleic acid encoding the same, the following combinations are preferably exemplified (in the following, only the name of the protein factor is described). (1) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc (2) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2 (where Sox2 can be replaced with Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 or Sox18.
  • Klf4 can be replaced with Klf1, Klf2 or Klf5. Further, c-Myc can be replaced with T58A (active mutant), N-Myc or L-Myc.) (3) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, ⁇ -catenin (active mutant S33Y) (4) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen (hereinafter SV40LT) (5) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6 (6) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7 (7) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7 (8) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT
  • Oct family members such as Oct1A and Oct6 can be used instead of Oct3 / 4.
  • Sox2 or Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18
  • Sox7 can be used.
  • Lin28 other members of the Lin family such as Lin28b can be used.
  • a combination that does not fall under the above (1) to (24) but includes all of the components in any of them and further includes any other substance is also included in the category of “nuclear reprogramming substance” in the present invention. Can be included.
  • a condition in which a somatic cell subject to nuclear reprogramming endogenously expresses some of the components in any of (1) to (24) above at a level sufficient for nuclear reprogramming in this case, a combination of only the remaining components excluding the component can also be included in the category of “nuclear reprogramming substance” in the present invention.
  • At least one selected from Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28 and SV40LT, preferably two or more, more preferably three or more are preferable nuclear reprogramming It is a substance.
  • a combination of three factors Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 is preferable when the obtained iPS cells are used for therapeutic purposes.
  • iPS cells are not used for therapeutic purposes (for example, when used as a research tool for drug discovery screening)
  • in addition to the four factors Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc, 5 factors of Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2 and Lin28 or 6 factors with Nanog added to it (ie (12) above), and 7 factors with SV40 Large T added (ie (24) above) Is preferred.
  • a combination in which c-Myc is changed to L-Myc in the above is also an example of a preferable nuclear reprogramming substance.
  • Mouse and human cDNA sequence information of each nuclear reprogramming substance can be obtained by referring to NCBI accession numbers described in WO2007 / 069666 (Nanog is described as “ECAT4” in the publication) Note that the mouse and human cDNA sequence information of Lin28, Lin28b, Esrrb, Esrrg, and L-Myc can be obtained by referring to the following NCBI accession numbers, respectively, and those skilled in the art can easily obtain these cDNAs. It can be isolated.
  • a protein factor As a nuclear reprogramming substance, insert the obtained cDNA into an appropriate expression vector, introduce it into a host cell, and recover the recombinant protein factor from the cultured cell or its conditioned medium. Can be prepared.
  • the obtained cDNA is inserted into a viral vector, plasmid vector, episomal vector or the like to construct an expression vector, which is then used for the nuclear reprogramming step. Is done.
  • Protein introduction reagents include cationic lipid-based BioPOTER Protein Delivery Reagent (Gene Therapy Systmes), Pro-Ject TM Protein Transfection Reagent (PIERCE) and ProVectin (IMGENEX), and lipid-based Profect-1 (Targeting Systems) ), Penetrain Peptide (Q biogene) and Chariot Kit (Active Motif) based on membrane-permeable peptides, GenomONE (Ishihara Sangyo) using HVJ envelope (inactivated Sendai virus), and the like are commercially available.
  • the introduction can be carried out according to the protocol attached to these reagents, but the general procedure is as follows. Dilute the nuclear reprogramming substance in an appropriate solvent (for example, buffer solution such as PBS, HEPES, etc.), add the introduction reagent, and incubate at room temperature for about 5 to 15 minutes to form a complex. Incubate at 37 ° C for 1 to several hours. Thereafter, the medium is removed and replaced with a serum-containing medium.
  • an appropriate solvent for example, buffer solution such as PBS, HEPES, etc.
  • PTD includes Drosophila-derived AntP, HIV-derived TAT (Frankel, A. et al, Cell55, 1189-93 (1988); Green, M. & Loewenstein, PM Cell 55, 1179-88 (1988)), Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994)), Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 ( 2000)), Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998)), MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al.
  • CPP derived from PTD include polyarginine such as 11R (Cell Stem Cell, 4: 381-384 (2009)) and 9R (Cell Stem Cell, 4: 472-476 (2009)).
  • a fusion protein expression vector incorporating a nuclear reprogramming substance cDNA and a PTD or CPP sequence is prepared and recombinantly expressed using the vector.
  • the fusion protein is recovered and used for introduction. Introduction can be performed in the same manner as described above except that no protein introduction reagent is added.
  • Microinjection is a method in which a protein solution is put into a glass needle having a tip diameter of about 1 ⁇ m and puncture is introduced into a cell, and the protein can be reliably introduced into the cell.
  • the nuclear reprogramming substance in the form of a nucleic acid that encodes it rather than as a protein factor itself.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera, and the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded.
  • the nucleic acid is double stranded DNA, in particular cDNA.
  • the cDNA of the nuclear reprogramming substance is inserted into an appropriate expression vector containing a promoter that can function in somatic cells as a host.
  • expression vectors include retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, Sendai virus and other viral vectors, animal cell expression plasmids (eg, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV). , PcDNAI / Neo) and the like can be used.
  • the type of vector to be used can be appropriately selected according to the intended use of the iPS cells obtained.
  • adenovirus vectors plasmid vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, Sendai virus vectors, episomal vectors and the like can be used.
  • Examples of the promoter used in the expression vector include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Moloney murine leukemia virus). LTR, HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter, etc. are used. Of these, EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, MoMuLV LTR, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the promoter, an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene, an SV40 replication origin, and the like as desired.
  • the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene, a neomycin resistance gene, a puromycin resistance gene, and the like.
  • Nucleic acid that is a nuclear reprogramming substance may be incorporated on separate expression vectors, or two or more, preferably 2-3 types of genes may be incorporated into one expression vector. It is preferable to select the former when using a retrovirus or lentiviral vector with high gene transfer efficiency, and the latter when using a plasmid, adenovirus, episomal vector, or the like. Furthermore, an expression vector incorporating two or more types of genes and another expression vector incorporating only one gene can be used in combination.
  • sequences enabling polycistronic expression include 2A sequences of foot-and-mouth disease virus (PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007), IRES sequences (US Patent No. 4,937,190), preferably A 2A sequence can be used.
  • An expression vector containing a nucleic acid that is a nuclear reprogramming substance can be introduced into a cell by a method known per se according to the type of the vector.
  • a virus produced in the culture supernatant by introducing a plasmid containing the nucleic acid into an appropriate packaging cell (eg, Plat-E cell) or a complementary cell line (eg, 293 cell) The vector is collected and cells are infected with the vector by an appropriate method according to each viral vector.
  • an appropriate packaging cell eg, Plat-E cell
  • a complementary cell line eg, 293 cell
  • the vector is collected and cells are infected with the vector by an appropriate method according to each viral vector.
  • specific means using a retroviral vector as a vector are disclosed in WO2007 / 69666, Cell, 126, 663-676 (2006) and Cell, 131, 861-872 (2007).
  • a lentiviral vector as a vector is disclosed in Science, 318, 1917-1920 (2007).
  • PGC-like cells derived from iPS cells are used as regenerative medicine such as infertility treatment or germ cell gene therapy, the expression (reactivation) of reprogramming genes was regenerated from iPS cell-derived PGC-like cells. Since it may increase the risk of carcinogenesis in germ cells or germ tissues, it is preferable that the nucleic acid encoding the nuclear reprogramming substance is not integrated into the cell chromosome and is transiently expressed. From this point of view, it is preferable to use an adenovirus vector that is rarely incorporated into a chromosome.
  • adeno-associated virus vectors are also preferred as other preferred vectors because they are less frequently incorporated into chromosomes and have lower cytotoxicity and inflammation-inducing action than adenovirus vectors.
  • the Sendai virus vector can exist stably outside the chromosome, and can be preferably used in the same manner because it can be decomposed and removed by siRNA as necessary.
  • the Sendai virus vector those described in J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007) and Japanese Patent No. 3602058 can be used.
  • loxP sequences are arranged at both ends of the nucleic acid, and after iPS cells are induced, Cre recombinase is allowed to act on the cells using a plasmid vector or an adenovirus vector to cut out the region sandwiched between the loxP sequences. be able to.
  • the enhancer-promoter sequence in the LTR ⁇ U3 region may up-regulate nearby host genes by insertion mutation. Therefore, the 3′-self is deleted or replaced with a polyadenylation sequence such as SV40. More preferably, an inactivated (SIN) LTR is used to avoid expression control of the endogenous gene by an LTR outside the loxP sequence that is not excised and remains in the genome.
  • SIN inactivated
  • plasmid vector which is a non-viral vector
  • the vector is transferred to cells using lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method, etc.
  • lipofection method liposome method
  • electroporation method calcium phosphate coprecipitation method
  • DEAE dextran method microinjection method
  • gene gun method etc.
  • Specific means using a plasmid as a vector are described in, for example, Science, 322, 949-953 (2008).
  • gene transfer can be performed any number of times of 1 or more (for example, 1 to 10 times, or 1 to 5 times).
  • gene transfer can be performed any number of times of 1 or more (for example, 1 to 10 times, or 1 to 5 times).
  • the number of times (for example, 1 to 10 times, or 1 to 5 times, etc.) can be performed, and preferably the introduction operation can be repeated 2 times or more (for example, 3 times or 4 times).
  • transgene may be integrated into the chromosome, it is necessary to finally confirm that there is no gene insertion into the chromosome by Southern blotting or PCR. Therefore, it may be advantageous to use a means for removing the gene after the transgene has been once integrated into the chromosome, as in the Cre-loxP system.
  • there is a method for completely removing a transgene from a chromosome by incorporating a transgene into a chromosome using a transposon and then allowing a transferase to act on the cell using a plasmid vector or an adenovirus vector. Can be used.
  • Preferred transposons include, for example, piggyBac, which is a transposon derived from a lepidopteran insect. Specific means using the piggyBac transposon are disclosed in Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009), Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009).
  • Another preferred non-integrated vector is an episomal vector capable of autonomous replication outside the chromosome. Specific means using an episomal vector is disclosed in Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009). If necessary, construct an expression vector in which the reprogramming gene is inserted into the episomal vector in which the loxP sequences are arranged in the same direction on the 5 'and 3' sides of the vector elements required for episomal vector replication. It can also be introduced into somatic cells.
  • the episomal vector examples include a vector containing a sequence necessary for autonomous replication derived from EBV, SV40 or the like as a vector element.
  • vector elements necessary for autonomous replication include a replication origin and a gene encoding a protein that binds to the replication origin and controls replication.
  • EBV the replication origin oriP And the EBNA-1 gene
  • SV40 the origin of replication ori and the SV40 large T antigen gene.
  • the episomal expression vector also contains a promoter that controls transcription of the reprogramming gene.
  • a promoter the same promoter as described above can be used.
  • the episomal expression vector may further contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene, and the like as desired, as described above.
  • the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene and a neomycin resistance gene.
  • Episomal vectors can be introduced into cells using, for example, lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method and the like. Specifically, for example, the method described in Science, 324: 797-801 (2009) can be used.
  • Whether or not the vector elements necessary for replication of the reprogramming gene have been removed from the iPS cells can be determined by using a part of the vector as a probe or primer and a Southern blot using the episomal fraction isolated from the iPS cells as a template. Analysis or PCR analysis is performed, and the presence or absence of a band or the length of a detection band can be examined.
  • the episomal fraction may be prepared by a method well known in the art. For example, the method described in Science, 324: 797-801 (2009) can be used.
  • nuclear reprogramming substance When the nuclear reprogramming substance is a low molecular weight compound, introduction of the substance into somatic cells can be achieved by dissolving the substance in an aqueous or non-aqueous solvent at an appropriate concentration and culturing somatic cells isolated from humans or mice.
  • Nuclear reprogramming substance concentration in a suitable medium eg, minimal essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 medium, etc., containing about 5-20% fetal calf serum
  • MEM minimal essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI1640 medium e.g, fetal calf serum
  • the concentration of the nuclear reprogramming substance varies depending on the type of the nuclear reprogramming substance used, but is appropriately selected within the range of about 0.1 to about 100 nM.
  • the contact period is not particularly limited as long as it is a time sufficient for the nuclear reprogramming of the cells to be achieved, but it is usually sufficient that the contact period coexists in the medium until a positive colony appears.
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • trichostatin Nucleic acids such as A, sodium butyrate
  • small molecule inhibitors such as MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg, HDAC1 siRNA Smartpool (registered trademark) (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)) Expression inhibitors etc.]
  • DNA methyltransferase inhibitors eg 5'-azacytidine
  • G9a histone methyltransferase inhibitors [eg BIX-01294 ( Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)) and other small molecule inhibitors, nucleic acid expression inhibitors such as siRNA and shRNA against G9a (eg, G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology), etc.)] L-channel calcium agonist (eg Bayk8644) Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)), p53 inhibitors (eg siRNA and shRNA against p53 (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), UTF1 (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), Wnt Signaling (eg soluble Wnt3a) (Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)), 2i / LIF (2i is an inhibitor of mitogen-activated protein kinase signalling and glycogen synthase kinase-3, PloS Biology, 6 (10), 22
  • SV40 large T is not an essential factor for somatic cell nuclear reprogramming, but is an auxiliary factor. It can also be included in a category.
  • auxiliary factors other than those essential for nuclear reprogramming are positioned as nuclear reprogramming substances or substances that improve the establishment efficiency of iPS cells. It may be convenient.
  • the somatic cell nuclear reprogramming process is regarded as an overall event caused by the contact of the somatic cell with the nuclear reprogramming substance and the iPS cell establishment efficiency improving substance. There will be no gender.
  • Contact of the iPS cell establishment efficiency improving substance with the somatic cell may be carried out when the substance is (a) a protein factor, (b) a nucleic acid encoding the protein factor, or (c) a low molecular weight compound.
  • the substance is (a) a protein factor, (b) a nucleic acid encoding the protein factor, or (c) a low molecular weight compound.
  • the iPS cell establishment efficiency improving substance may be brought into contact with the somatic cells simultaneously with the nuclear reprogramming substance. Alternatively, either one may be contacted first.
  • the nuclear reprogramming substance is a nucleic acid encoding a proteinous factor
  • the substance that improves the establishment efficiency of iPS cells is a chemical inhibitor
  • the former removes the proteinous factor from the gene transfer treatment.
  • a substance that improves the establishment efficiency of iPS cells is added to the medium can do.
  • both a nuclear reprogramming substance and an iPS cell establishment efficiency improving substance are used in the form of a viral vector or a plasmid vector, both may be introduced into a cell simultaneously.
  • the iPS cell establishment efficiency can be further improved by culturing cells under hypoxic conditions in the somatic cell nuclear reprogramming step.
  • the “hypoxic condition” means that the oxygen concentration in the atmosphere when cells are cultured is significantly lower than that in the air.
  • the conditions of low oxygen concentration than the oxygen concentration in the atmosphere of 5 ⁇ 10% CO 2/95 ⁇ 90% air used are exemplified by conventional cell culture, for example, oxygen in the atmosphere This applies to conditions with a concentration of 18% or less.
  • the oxygen concentration in the atmosphere is 15% or less (eg, 14% or less, 13% or less, 12% or less, 11% or less, etc.), 10% or less (eg, 9% or less, 8% or less, 7% or less) 6% or less), or 5% or less (eg, 4% or less, 3% or less, 2% or less, etc.).
  • the oxygen concentration in the atmosphere is preferably 0.1% or more (eg, 0.2% or more, 0.3% or more, 0.4% or more), 0.5% or more (eg, 0.6% or more, 0.7% or more, 0.8% or more, 0.9 % Or more), or 1% or more (eg, 1.1% or more, 1.2% or more, 1.3% or more, 1.4% or more, etc.).
  • a method for creating a hypoxic state in the cell environment is not particularly limited, but a method of culturing the cells in a CO 2 incubator in which the oxygen concentration can be adjusted is the easiest and is a preferable example.
  • CO 2 incubators with adjustable oxygen concentration are sold by various equipment manufacturers (for example, CO for low oxygen culture by manufacturers such as Thermo scientific, Ikemoto Rika Kogyo, Toji Field, and Waken Pharmaceutical Co., Ltd.) 2 incubators can be used).
  • the time when cell culture is started under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the iPS cell establishment efficiency from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%).
  • the start time may be before or after the contact of the nuclear reprogramming substance with the somatic cell, or at the same time as the contact. For example, immediately after contacting a nuclear reprogramming substance with a somatic cell, or after a period of contact (for example, 1 to 10 (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9) days) It is preferable to culture under hypoxic conditions later.
  • the period for culturing cells under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the establishment efficiency of iPS cells from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%). Examples include, but are not limited to, a period of not less than 7 days, not less than 10 days, not more than 50 days, not more than 40 days, not more than 35 days, or not more than 30 days.
  • a preferable culture period under low oxygen conditions varies depending on the oxygen concentration in the atmosphere, and those skilled in the art can appropriately adjust the culture period according to the oxygen concentration used. In one embodiment, when selection of iPS cell candidate colonies is performed using drug resistance as an index, it is preferable to return from a low oxygen condition to a normal oxygen concentration before drug selection is started.
  • the preferred timing and preferred culture period for starting cell culture under hypoxic conditions vary depending on the type of nuclear reprogramming substance used, iPS cell establishment efficiency under normoxic conditions, and the like.
  • the cells After contacting with a nuclear reprogramming substance (and a substance that improves iPS cell establishment efficiency), the cells can be cultured under conditions suitable for culturing ES cells, for example.
  • Leukemia® Inhibitory® Factor LIF
  • LIF Leukemia® Inhibitory® Factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • SCF stem cell factor
  • STO cells are usually used as MEFs, but SNL cells (McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) are often used to induce iPS cells. ing. Co-culture with feeder cells may be started before the contact with the nuclear reprogramming substance, or may be started at the time of the contact or after the contact (for example, after 1 to 10 days).
  • the selection of iPS cell candidate colonies includes a method using drug resistance and reporter activity as indicators and a method using visual morphological observation.
  • the former includes, for example, a drug resistance gene and / or a gene locus that is specifically highly expressed in differentiated pluripotent cells (eg, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, etc., preferably Nanog or Oct3 / 4).
  • a recombinant cell targeted with a reporter gene is used to select colonies that are drug resistant and / or reporter activity positive.
  • Such recombinant cells include, for example, MEF (Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, ⁇ ⁇ ⁇ 663) derived from a mouse in which a ⁇ geo (encoding a fusion protein of ⁇ -galactosidase and neomycin phosphotransferase) gene is knocked in at the Fbx15 locus. -676 (2006)), or MEFs derived from transgenic mice incorporating the green fluorescent protein (GFP) gene and puromycin resistance gene at the Nanog locus (Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)) Etc.
  • MEF green fluorescent protein
  • examples of the method for selecting candidate colonies by visual morphological observation include the methods described in Takahashihet al., Cell, 131, 861-872 (2007).
  • a method using a reporter cell is simple and efficient, when iPS cells are produced for the purpose of human therapeutic use, visual colony selection is desirable from the viewpoint of safety.
  • three factors, Oct3 / 4, Klf4, and Sox2 are used as nuclear reprogramming substances, the number of established clones is reduced, but most of the resulting colonies are high-quality iPS cells that are comparable to ES cells. It is possible to establish iPS cells efficiently without using reporter cells.
  • iPS cells can be performed by the above-mentioned Nanog (or Oct3 / 4) reporter positive (puromycin resistance, GFP positive, etc.) and visual formation of ES cell-like colonies.
  • Nanog or Oct3 / 4
  • reporter positive puromycin resistance, GFP positive, etc.
  • visual formation of ES cell-like colonies In order to obtain more accuracy, it is possible to analyze the expression of various ES cell-specific genes, or to carry out tests such as confirming teratoma formation by transplanting selected cells into mice.
  • Murine pluripotent stem cells can exist in two functionally distinct states: LIF-dependent ES cells and bFGF-dependent epiblast stem cells (EpiSC). Molecular analysis suggests that the pluripotent state of human ES cells is similar to that of mouse EpiSC, rather than that of mouse ES cells.
  • CMRL 1066 minimum essential medium (MEM), Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, DMEM / F12 medium, Ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium , And a mixed medium thereof, but are not limited thereto.
  • the medium can be a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • a serum-free medium can be used.
  • a serum-free medium means a medium that does not contain any untreated or unpurified serum, and thus includes media containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components (such as growth factors). Can be.
  • the concentration of serum eg, fetal bovine serum (FBS), human serum, etc.
  • FBS fetal bovine serum
  • human serum etc.
  • the concentration of serum is 0-20%, preferably 0-5%, more preferably 0-2%, most preferably 0% (ie serum free) It can be.
  • the SFM may or may not contain any serum replacement.
  • serum substitutes examples include albumin (eg, albumin substitutes such as lipid-rich albumin and recombinant albumin, plant starch, dextran and protein hydrolysates), transferrin (or other iron transporter), fatty acids, insulin And a substance containing a collagen precursor, a trace element, 2-mercaptoethanol, 3′-thioglycerol or an equivalent thereof as appropriate.
  • albumin eg, albumin substitutes such as lipid-rich albumin and recombinant albumin, plant starch, dextran and protein hydrolysates
  • transferrin or other iron transporter
  • fatty acids insulin
  • insulin And a substance containing a collagen precursor a trace element
  • 2-mercaptoethanol 2-mercaptoethanol
  • 3′-thioglycerol or an equivalent thereof as appropriate.
  • Such a serum substitute can be prepared, for example, by the method described in WO 98/30679.
  • Such commercially available materials include Knockout TM Serum Replacement (KSR), Chemically-
  • the medium may contain other additives known per se.
  • the additive is not particularly limited.
  • growth factors eg, insulin
  • polyamines eg, putrescine
  • minerals eg sodium selenate etc.
  • sugars eg glucose etc.
  • organic acids eg pyruvic acid, lactic acid etc.
  • amino acids eg nonessential amino acids (NEAA), L-glutamine etc.
  • Reducing agents eg, 2-mercaptoethanol, etc.
  • vitamins eg, ascorbic acid, d-biotin, etc.
  • steroids eg, [beta] -estradiol, progesterone, etc.
  • antibiotics eg, streptomycin, penicillin, gentamicin
  • buffer eg HEPES
  • nutritional additives eg B27 ⁇ ⁇ ⁇ supple
  • pluripotent stem cells may be cultured in the presence or absence of feeder cells.
  • the feeder cells are not particularly limited as long as EpiLC can be produced by the method of the present invention; feeder cells known per se for use in culturing pluripotent stem cells such as ESC and iPSC can be used; Fibroblasts (mouse embryonic fibroblasts, mouse fibroblast cell line STO, etc.) can be mentioned.
  • the feeder cells are preferably inactivated by a method known per se, for example, treatment with radiation (such as gamma rays) or an anticancer agent (such as mitomycin C).
  • pluripotent stem cells are cultured under feeder-free conditions.
  • the medium for inducing differentiation from pluripotent stem cells to EpiLC contains activin A as an essential additive in the basic medium.
  • the concentration of activin A is, for example, about 5 ng / ml or more, preferably about 10 ng / ml or more, more preferably about 15 ng / ml or more, and for example, about 40 ng / ml or less, preferably about 30 ng / ml. ml or less, more preferably 25 ng / ml or less.
  • the medium A further contains bFGF and / or KSR.
  • Basic FGF and KSR significantly increase the efficiency of EpiLC induction when present in the effective concentration range.
  • the concentration of bFGF is, for example, about 5 ng / ml or more, preferably about 7.5 ng / ml or more, more preferably about 10 ng / ml or more, and for example, about 30 ng / ml or less, preferably about 20 ng / ml or less, more preferably about 15 ng / ml or less.
  • the concentration of KSR is, for example, about 0.1 w / w% or more, preferably about 0.3 w / w% or more, more preferably about 0.5 w / w% or more, for example, about 5 w / w% or less, Preferably, it is about 3% w / w% or less, more preferably about 2% w / w% or less.
  • the medium A contains activin A, bFGF and KSR in addition to the basic medium. Suitable concentrations of these components are about 10 to about 30 ng / ml, preferably about 15 to about 25 ng / ml for activin A, and about 7.5 to about 20 ng / ml, preferably about 10 to about bFGF. It can be selected over a range of about 15 ng / ml, KSR about 0.3 to about 3 w / w%, preferably about 0.5 to about 2 / w / w%.
  • Activin A and bFGF contained in the medium A are not limited in terms of their sources, and may be isolated and purified from cells of any mammal (eg, human, mouse, monkey, pig, rat, dog, etc.). It is preferable to use activin A and bFGF that are the same type as the pluripotent stem cells subjected to culture. Activin A and bFGF may be chemically synthesized, may be biochemically synthesized using a cell-free translation system, or may be produced from a transformant having a nucleic acid encoding each protein. . The recombinant products of activin A and bFGF are commercially available.
  • the incubator used to induce pluripotent stem cells into EpiLC is not particularly limited, but includes flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi dishes, microplates, microwell plates, Multiplates, multiwell plates, microslides, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles may be mentioned.
  • the incubator can be cell adherent.
  • the cell-adhesive incubator may be coated with any cell adhesion substrate such as an extracellular matrix (ECM) for the purpose of improving the adhesion of the surface of the incubator to cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the substrate for cell adhesion can be any substance intended for adhesion of pluripotent stem cells or feeder cells (if used).
  • Cell adhesion substrates include collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-L-ornithine, laminin, and fibronectin and mixtures thereof such as matrigel and lysed cell membrane membranes. preparations) (Klimanskaya I et al 2005. Lancet 365: p1636-1641).
  • pluripotent stem cells are seeded on the above incubator, for example, a cell density of about 10 4 to 10 5 cells / cm 2 , preferably about 2 to 8 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , and 1 to 10 % CO 2 / 99-90% in an air atmosphere in an incubator at about 30-40 ° C., preferably at about 37 ° C., for less than 3 days, preferably about 2 days (eg 48 ⁇ 12 hours, preferably 48 ⁇ 6 hours) Incubate.
  • a flat epiblast-like structure appear uniformly.
  • EpiLC of the present invention means a cell in an epiblast-like state (Epiblast-like gastrulation-like epiblast) state of E5.5 to E6.0. More specifically, EpiLC is defined as a cell that has either or both of the following properties: (1) Increase in expression of at least one gene selected from Fgf5, Wnt3, and Dnmt3b, compared to pluripotent stem cells before differentiation induction, (2) A decrease in the expression of at least one gene selected from Gata4, Gata6, Sox17 and Blimp1 as compared to pluripotent stem cells before differentiation induction.
  • the fact of differentiation into EpiLC is that at least one expression level selected from Fgf5, Wnt3 and Dnmt3b and / or at least one expression level selected from Gata4, Gata6, Sox17 and Blimp1 in cells obtained by culture Can be confirmed by comparing the expression level with that of pluripotent stem cells before differentiation induction.
  • the EpiLC of the present invention has the following properties: (1) sustained gene expression of Oct3 / 4; (2) decreased gene expression of Sox2 and Nanog compared to pluripotent stem cells before differentiation induction; (3) Increased gene expression of Fgf5, Wnt3 and Dnmt3b compared to pluripotent stem cells before differentiation induction; and (4) Gata4, Gata6, Sox17 and Reduced Blimp1 gene expression.
  • the medium A of the present invention contains activin A, bFGF and KSR. Therefore, the present invention also provides a reagent kit for inducing differentiation from pluripotent stem cells to EpiLC, comprising activin A, bFGF and KSR.
  • a reagent kit for inducing differentiation from pluripotent stem cells to EpiLC comprising activin A, bFGF and KSR.
  • These components may be provided in a form dissolved in water or a suitable buffer, or may be provided as a lyophilized powder, and may be used after being dissolved in a suitable solvent at the time of use.
  • these components may be kited as individual reagents, or two or more of them may be mixed and provided as one reagent as long as they do not adversely affect each other.
  • EpiLC which is transient but has the same characteristics as epiblast cells before gastrulation.
  • Epiblast is also a progenitor cell of somatic cell line other than germ line, so EpiLC obtained in this way is a starting cell material for inducing not only germ line but also various other cell lines. Can be used. They can also be useful in investigating the genetic and epigenetic mechanisms underlying the epiblast differentiation of ICM, an important but little-understood subject in pluripotent cell biology.
  • EpiLC derivation from ESC or iPSC is a very straightforward process, a novel for reconstructing lineage specification in vitro Provide a strategy.
  • the second aspect of the present invention relates to a method for producing PGC-like cells from pluripotent stem cells via EpiLC obtained by the method (2). That is, the method I) producing EpiLC from pluripotent stem cells according to any one of the methods described in (2) above; and II) A step of culturing EpiLC obtained in step I) in the presence of BMP4 and LIF.
  • the basic medium for inducing differentiation in step II the basic medium exemplified for use in step I) is also preferably used.
  • the medium may contain the same additives as exemplified for use in step I).
  • the medium can be a serum-containing medium or a serum-free medium (SFM).
  • a serum-free medium can be used.
  • concentration of serum eg, fetal bovine serum (FBS), human serum, etc.
  • FBS fetal bovine serum
  • human serum etc.
  • concentration of serum is 0-20%, preferably 0-5%, more preferably 0-2%, most preferably 0% (ie serum free). possible.
  • the SFM may or may not include any serum replacement such as KSR.
  • Culture medium for induction of differentiation from EpiLC to PGC-like cells is an essential additive of the basic medium, bone morphogenetic protein 4 (BMP4) and leukemia protein inhibitor (LIF) Containing.
  • BMP4 bone morphogenetic protein 4
  • LIF leukemia protein inhibitor
  • the concentration of BMP4 is, for example, about 100 ng / ml or more, preferably about 200 ng / ml or more, more preferably about 300 ng / ml or more.
  • the concentration of BMP4 is, for example, about 1,000 ng / ml or less, preferably about 800 ng / ml or less, more preferably 600 ng / ml or less.
  • the concentration of LIF is, for example, about 300 ⁇ U / ml or more, preferably about 500 U / ml or more, more preferably about 800 U / ml or more. Further, the concentration of LIF is, for example, about 2,000 U / ml or less, preferably about 1,500 U / ml or less, more preferably 1,200 U / ml or less.
  • Medium B preferably further contains at least one additive selected from stem cell factor (SCF), bone morphogenetic protein 8b (BMP8b) and epidermal growth factor (EGF).
  • SCF, BMP8b and EGF significantly prolong the period during which PGC-like cells are maintained in Blimp1- and Stella-positive states when present in an effective concentration range.
  • the concentration of SCF is, for example, about 30 ng / ml or more, preferably about 50 ng / ml or more, more preferably about 80 ng / ml or more.
  • the concentration of SCF is, for example, about 200 ng / ml or less, preferably about 150 ng / ml or less, more preferably about 120 ng / ml or less.
  • the concentration of BMP8b is, for example, about 100 ng / ml or more, preferably about 200 ng / ml or more, more preferably about 300 ng / ml or more.
  • the concentration of BMP8b is, for example, about 1,000 ng / ml or less, preferably about 800 ng / ml or less, more preferably 600 ng / ml or less.
  • the concentration of EGF is, for example, about 10 ng / ml or more, preferably about 20 ng / ml or more, more preferably about 30 ng / ml or more.
  • the concentration of EGF is, for example, about 100 ng / ml or less, preferably about 80 ng / ml or less, more preferably about 60 ng / ml or less.
  • the culture medium B contains BMP, LIF, SCF, BMP8b and EGF in addition to the basic culture medium. Concentrations of these components are about 200 to 800 ng / ml, preferably about 300 to 600 ng / ml for BMP4, about 500 to 1500 U / ml for LIF, preferably about 800 to 1,200 mlU / ml, about SCF Is about 50-150 ng / ml, preferably about 80-120 ng / ml, BMP8b is about 200-800 ng / ml, preferably about 300-600 ng / ml, EGF is about 20-80 ng / ml Preferably, it can be appropriately selected over a range of about 30 to 60 ng / ml.
  • BMP4, LIF, SCF, BMP8b and EGF contained in medium B are not particularly limited with respect to their sources, and are isolated from cells of any mammal (eg, human, mouse, monkey, pig, rat, dog, etc.) And may be purified. It is preferable to use BMP4, LIF, SCF, BMP8b and EGF of the same type as EpiLC used for culture. BMP4, LIF, SCF, BMP8b and EGF may be chemically synthesized, biochemically synthesized using a cell-free translation system, or from a transformant having a nucleic acid encoding each protein. May be manufactured. Recombinant products of BMP4, LIF, SCF, BMP8b and EGF are commercially available.
  • EpiLC is seeded in a cell non-adhesive or low adhesion incubator known per se, for example, about 3 to 10 ⁇ 10 4 cells / mL, preferably about 4 to 8 ⁇ 10 4 cells / mL. Density, 1-10% CO 2 / 99-90% in an air atmosphere, in an incubator at about 30-40 ° C., preferably at about 37 ° C., for about 4-10 days, preferably about 4-8 days, and more The culture is preferably performed for about 4 to 6 days, more preferably for about 4 days.
  • the fact of differentiation into PGC-like cells can be confirmed, for example, by analyzing Blimp1 expression by RT-PCR or the like. Furthermore, the expression of other genes and cell surface antigens can be examined as necessary. Examples of other genes include Stella. When pluripotent stem cells having a fluorescent protein gene under the control of Blimp1- and / or Stella-promoter are used as starting materials, the fact of differentiation into PGC-like cells can be confirmed by FACS analysis. If pluripotent stem cells do not have an appropriate transgenic reporter, such as ESC or iPSC derived from a human or other non-mouse mammal, the differentiation fact of PGC-like cells is specific to PGC-like cells. It is preferable to confirm by one or more cell surface antigens to be expressed by FACS analysis or the like. Preferred cell surface antigens include SSEA-1 and integrin- ⁇ 3.
  • the cell population containing PGC-like cells derived from pluripotent stem cells produced by the above steps I) and II) may be a purified population of PGC-like cells. Cells may coexist.
  • PGC-like cells show an increase in Blimp1 and / or Stella expression compared to EpiLC before induction of differentiation, can contribute to normal spermatogenesis, and have teratomas when transplanted into immunodeficient mice. Defined as cells that do not form.
  • the above-mentioned step II) is performed using a cell sorter.
  • Blimp1- and / or Stella-positive PGC-like cells can be easily isolated and purified.
  • PGC-like cells can also be isolated and purified by FACS using a reporter under the control of a gene (eg Nanog) whose expression increases with Blimp1 and Stella as markers.
  • PGC-like cells obtained as described above can be amplified prior to differentiation into sperm stem cell-like cells.
  • Forskolin and retinoic acid (RA) signaling agonists are known as drugs that support PGC amplification.
  • Forskolin activates adenylate cyclase and increases intracellular cAMP levels.
  • PDE4 inhibitors support the amplification of PGC-like cells. PDE4 inhibitors increase intracellular cAMP levels by a mechanism different from forskolin (inhibiting cAMP hydrolysis).
  • the present inventors succeeded in synergistically (up to about 50 times) promoting PGC-like cell amplification by using a PDE4 inhibitor in combination with forskolin (EMBO J., 36 (13 ): 1888-1907 (2017)).
  • the maintenance amplification of PGC-like cells can be performed by, for example, d4 to d10, preferably d4 to d8, more preferably d4 to d6, and more preferably about d4 PGC-like cells, where d0 is the initiation date of differentiation induction from EpiLC.
  • a PDE4 inhibitor preferably in the presence of forskolin
  • the basic medium the medium exemplified for inducing differentiation from PSC to EpiLC can be similarly used. It is preferable to add serum or serum replacement to the medium.
  • serum or serum substitute used here those exemplified for the differentiation induction from PSC to EpiLC can be used as well.
  • the medium may contain other additives known per se.
  • Such an additive is not particularly limited as long as it can support the maintenance amplification of PGC-like cells, and those exemplified with respect to induction of differentiation from PSC to EpiLC can be used as well.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • FCS fetal calf serum
  • NEAA 0.1 mM NEAA
  • 1 mM sodium pyruvate 0.1 mM 2-mercaptoethanol
  • 100 U / ml penicillin 0.1 mg / ml streptomycin
  • GMEM medium containing 2 mM L-glutamine, and the like, but are not limited thereto.
  • the PDE4 inhibitor added to the medium is not particularly limited as long as it is a substance that can inhibit the enzyme activity of PDE4, that is, the hydrolysis activity of cAMP, but is preferably a selective inhibitor of PDE4 (phosphodiesterase (PDE It does not inhibit not only enzymes other than) but also PDEs other than PDE4).
  • PDE4 phosphodiesterase (PDE It does not inhibit not only enzymes other than) but also PDEs other than PDE4
  • Examples include, but are not limited to, ibudilast, S-(+)-rolipram, rolipram, GSK256066, siromilast, and the like.
  • the concentration of the PDE4 inhibitor is, for example, about 0.1 ⁇ M or higher, preferably about 0.5 ⁇ M or higher, more preferably about 1 ⁇ M or higher.
  • the concentration of the PDE4 inhibitor is, for example, about 100 ⁇ M or less, preferably about 50 ⁇ M or less, more preferably 30 ⁇ M or less.
  • the concentration of the PDE4 inhibitor can be appropriately selected within the range of about 0.5 to 50 ⁇ M, preferably about 1 to 30 ⁇ M.
  • the concentration of forskolin added to the medium is, for example, about 0.1 ⁇ M or higher, preferably about 0.5 ⁇ M or higher, more preferably about 1 ⁇ M or higher, and the concentration of forskolin is, for example, about 100 ⁇ M or lower. , Preferably about 50 ⁇ M or less, more preferably 30 ⁇ M or less. In a preferred embodiment, the concentration of forskolin can be appropriately selected within the range of about 0.5 to 50 ⁇ M, preferably about 1 to 30 ⁇ M.
  • the medium for maintaining and amplifying PGC-like cells preferably further contains SCF.
  • the concentration of SCF is, for example, about 30 ng / ml or more, preferably about 50 ng / ml or more, more preferably about 80 ng / ml or more.
  • the concentration of SCF is, for example, about 200 ng / ml or less, preferably about 150 ng / ml or less, more preferably about 120 ng / ml or less.
  • the concentration of SCF may be appropriately selected within the range of about 50 to 150 ng / ml, preferably about 80 to 120 ng / ml.
  • the medium for maintaining and amplifying PGC-like cells contains 10 ⁇ M PDE4 inhibitor, 10 ⁇ M forskolin and 100 ⁇ ng / ml SCF. Note that it may be preferable not to add LIF to the PGC-like cell maintenance amplification medium because it may promote dedifferentiation of PGC-like cells into EGC when used in combination with other PGC growth stimulating factors.
  • the PGC-like cells may be cultured in the presence or absence of feeder cells.
  • a feeder cell known per se can be used.
  • fibroblasts mouse embryonic fibroblasts, mouse fibroblast cell line STO, etc.
  • the feeder cells are preferably inactivated by a method known per se, for example, treatment with radiation (such as gamma rays) or an anticancer agent (such as mitomycin C). If the feeder cells are vulnerable to PDE4 inhibitors and / or forskolin, subculture several generations of feeder cells in the presence of these additives in order to acclimate to the additives. Is desirable.
  • the incubator used for maintaining and amplifying PGC-like cells is not particularly limited, and those exemplified in the differentiation induction from PSC to EpiLC can be used in the same manner.
  • PGC-like cells are seeded on an incubator (pre-seeded with feeder cells) and, for example, about 10 4 to 10 5 cells / cm 2 , preferably about 2 to 8 ⁇ 10 4 cells / cm 2 . and cell density under an atmosphere of 1 ⁇ 10% CO 2/99 ⁇ 90% air, about 30 ⁇ 40 ° C. in an incubator, preferably at about 37 ° C., 3 ⁇ 9 days, preferably 4 to 8 days, more preferably Incubate for 5-7 days.
  • an incubator pre-seeded with feeder cells
  • PGCLC primordial germ cell-like cells
  • Process (1) Formation of reconstructed testis (process (1))
  • PGCLC primordial germ cell-like cells
  • process (1) Formation of reconstructed testis (process (1))
  • PGCLC obtained by the above method is co-cultured with gonad somatic cells in suspension culture to obtain a reconstituted testis.
  • PGCLC to be used is a heterogeneous cell population, it is preferable to isolate and use SSEA-1-positive and integrin- ⁇ 3-positive cell fractions using, for example, FACS.
  • cells with d4 to d10, preferably d4 to d8, more preferably d4 to d6, and even more preferably about d4, where d0 is the differentiation induction start date from EpiLC can be used.
  • PGCLC the above 2.
  • PGCLC that has been maintained and amplified for 3 to 9 days, preferably 4 to 8 days, more preferably 5 to 7 days by the method described in detail above may be used.
  • gonad refers to a structure composed of germ cells and somatic cells that support them. It is formed by the time of male and female sex differentiation in the primordial germ cells (PGC) of fetuses (pups) (12.5 days after fertilization (E12.5) in mice). PGCs are differentiated into gametes (sperms and eggs) while being wrapped in somatic cells of the gonad characteristic of males and females.
  • PGC primordial germ cells
  • E12.5 fetuses
  • the gonad can be collected by a method known per se from a mammal of the same kind as PGCLC to be co-cultured.
  • a method for isolating somatic cells from the gonad for example, the gonad is dissociated into single cells by trypsin treatment or the like, and resuspended in a medium or an isotonic buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • FACS or MACS cell surface marker positive cells of PGC, for example, SSEA-1 positive cells, etc. using FACS or MACS can be mentioned, but it is not limited thereto.
  • floating culture means culturing the target cell or cell mass without adhering to the bottom surface of the incubator. Even if the cell or cell mass touches the bottom surface, Cultivation in a state where cells and cell masses float in the culture solution is also included in suspension culture.
  • a plastic dish with an untreated bottom surface or an adhesion-preventing coating agent (poly (2-hydroxyethyl methacrylate), etc.) to prevent cell adhesion to the substrate. It is preferable to use a coated one.
  • it can be added to the medium at a ratio of about 1: 4 and cultured statically.
  • the medium used in this step the medium exemplified for induction of differentiation from pluripotent stem cells to EpiLC can be used as the basic medium. It is preferable to add serum or serum replacement to the medium.
  • the medium used in this reconstituted testis formation step includes, but is not limited to, an ⁇ MEM medium containing 10% Knockout Serum Replacement (KSR).
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • Suspension culture in this step (1) is, for example, in an atmosphere of 1 ⁇ 10% CO 2/99 ⁇ 90% air, about 30 ⁇ 40 ° C. in an incubator, preferably at about 37 ° C., for about 1-5 days, Preferably, it is carried out for about 1 to 3 days, more preferably about 2 to 3 days, even more preferably about 2 days.
  • step (2) Induction of sperm stem cell-like cells (step (2))
  • spermatogonial stem cell-like cells are induced in the reconstituted testis by subjecting the reconstituted testis obtained in step (1) to gas-liquid interface culture.
  • Gas-liquid interface culture refers to a culture method in which cells are seeded on a porous membrane of a cell culture insert, the upper side is in a gas phase, and a medium is supplied from the lower side through the membrane.
  • the reconstituted testis obtained in step (1) is transferred onto the porous membrane of the cell culture insert inserted in the culture vessel (eg, 24-well plate), and the medium is added to the lower side of the membrane for gas-liquid interface culture. carry out.
  • the medium to be used may be the same as in step (1).
  • the culture period of this step can be, for example, about 1 to 2 weeks, preferably about 10 to 14 days.
  • the culture temperature is about 34 ° C. throughout the process.
  • a method of culturing at 34 ° C. after culturing at about 37 ° C. for the first 2 weeks can also be used.
  • the seminiferous tube-like structure begins to appear around the 4th day, and around 7th they gather to form a network.
  • PGCLC-derived cells outside the seminiferous tubule structure disappear, and the majority of PGCLC-derived cells become localized inside the seminiferous tubule network.
  • the reconstituted testis is then kept stable while further developing the seminiferous network, and the number of PGCLC-derived cells inside the network further increases.
  • most PGCLC-derived cells are present in the lumen compartment of the seminiferous tubule, and on day 21, many of them become found in the basal compartment.
  • PGCLC-derived cells are positive for DDX4 (MVH), a germ cell marker that begins to express in gonad PGCs, but are sperm stem cell markers that begin to express in the perinatal period in prespermatogonial cells PLZF (ZBTB16) is negative.
  • MMVH DDX4
  • ZBTB16 sperm stem cell markers that begin to express in the perinatal period in prespermatogonial cells PLZF
  • SCP3 an important marker of meiosis initiation, but under the conditions of this process, meiosis is not completed.
  • the present invention also provides long-term sperm stem cells from reconstituted testis containing sperm stem cell-like cells obtained as described above.
  • the method is performed by using, for example, enzyme treatment (eg, dispase, hyaluronidase, trypsin) and pipetting operation from a reconstituted testis containing sperm stem cell-like cells obtained by the above steps (1) and (2).
  • sperm stem cell-like cells for example, cell surface markers such as CD9, SSEA1, INTEGRIN ⁇ 1, INTEGRIN ⁇ 6, KIT, GFR ⁇ 1, etc.
  • PGCLC is a reporter cell, the reporter is used as an indicator, and FACS etc.
  • the cells can be separated from the cells, but can be enriched easily by performing several passages using the difference in the adhesion of somatic cells and sperm stem cell-like cells to the culture vessel.
  • dissociated cells from the reconstituted testis are disseminated, for example, every 6 to 24 hours, preferably about every 12 hours.
  • somatic cells with high adhesion remain on the surface of the culture vessel and are gradually removed to enrich sperm stem cell-like cells.
  • the medium used in this step is not particularly limited as long as it can support the induction of GSC from sperm stem cells.
  • glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) and leukemia inhibitory factor (LIF) preferably Further includes a medium containing epidermal growth factor (EGF) and / or basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • EGF epidermal growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the sperm stem cell-like cells enriched as described above are preferably cultured in the presence of feeder cells.
  • feeder cells For example, mouse fetal fibroblast (MEF) is preferably used as the feeder cell.
  • MEF mouse fetal fibroblast
  • enriched sperm stem cell-like cells are seeded in a culture vessel pre-seeded with feeder cells as PGCLC-derived cells at a cell density of about 10 3 cells or more, GSC-like colonies will appear in the first two weeks. Is amplified. If the colony diameter is about 500 ⁇ m or more, it can be passaged to a new culture vessel.
  • Culture of enriched sperm stem cell-like cells can be performed, for example, in an incubator at about 30-40 ° C., preferably about 37 ° C. for about 2 weeks in an atmosphere of 1-10% CO 2 / 99-90% As described above, it is preferably carried out for about 2 months or more.
  • the GSC-like cells (GSCLC) obtained as described above are characterized by the following properties.
  • (a) derived from isolated PSC (b) (i) a gene selected from the group consisting of Ddx4, Daz1, Gfra1, Ret, Piwil2, Itga6, Kit, Plzf, Piwil4 and Id4, (ii) The expression level of a surface marker selected from the group consisting of CD9, SSEA1, INTEGRIN ⁇ 1, INTEGRIN ⁇ 6, KIT and GFR ⁇ 1, and (iii) a transcription factor selected from the group consisting of PLZF and ID4 is equivalent to GSC (c) Can be maintained and amplified at the same growth rate as GSC (d) When the GSCLC is transplanted into an adult testis, (i) the proportion of seminiferous tubules with GFR ⁇ 1-positive cells in the seminiferous tubules in which the transplanted cells are established is equivalent to that in the case of transplanting GSC; and (ii
  • the GSCLC of the present invention has an expression level of a key gene, a cell surface marker, and a transcription factor.
  • GFR ⁇ 1 spermatogonia / sperm stem cell marker
  • GSCLC of the Present Invention
  • the GSCLC derived from pluripotent stem cells established in this way can be used for various purposes.
  • GSCLC transplanted into the testes of recipient animals can reliably contribute to spermatogenesis and the creation of healthy offspring in the testes, especially adult testes, and can therefore be used to treat infertility or genetic diseases of the reproductive tissue .
  • GSCLC sperm or round sperm cells
  • sperm or round sperm cells differentiated from GSCLC can be fertilized with egg cells by the known ICSI or ROSI method, and the resulting embryo (eg, 2-cell embryo) is pseudopregnant Offspring can be obtained by transplanting into the uterus or fallopian tube of the surrogate parent.
  • the GSCLC of the present invention (including a cell population containing GSCLC; hereinafter the same) is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier according to a conventional means, etc., such as a parenteral preparation, preferably an injection, suspension or infusion Manufactured as.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a parenteral preparation, preferably an injection, suspension or infusion Manufactured as.
  • pharmaceutically acceptable carriers include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose, and other adjuvants.
  • An aqueous liquid for injection can be mentioned.
  • the agent of the present invention includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin, Polyethylene glycol, etc.), preservatives, antioxidants and the like.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • a soothing agent eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, Polyethylene glycol, etc.
  • GSCLC is suspended in one of the above aqueous solutions to a cell density of about 1.0 ⁇ 10 6 to about 1.0 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the agent of the present invention can be cryopreserved under conditions normally used for cryopreservation of stem cells and can be thawed immediately before use.
  • the preparation Since the thus obtained preparation is stable and has low toxicity, it can be safely administered to mammals such as humans.
  • the administration method is not particularly limited, but the preparation is preferably administered to the seminiferous tubule by injection or infusion.
  • the preparation For male infertile patients, for example, it is usual to administer an agent with a GSCLC amount of about 1.0 ⁇ 10 5 to about 1 ⁇ 10 7 cells at one or two or ten times at intervals of about 1 to 2 weeks. Convenient.
  • the present invention demonstrates for the first time in vitro reconstruction of the male germ cell differentiation pathway from the inner cell mass to the sperm stem cells.
  • Such an invitro system that reflects the developmental process will not only facilitate the elucidation of the detailed developmental mechanisms of germ cells, but will also facilitate the elucidation of the mechanisms of infertility and genetic disease development.
  • Example 1 (Overview of method) Incubation of ESC and induction of PGCLC On wells coated with poly-L-ornithine and laminin (20 ng / mL) (Hayashi et al., 2011; Hayashi and Saitou, 2013; Ying et al., 2008), 2i ( PD0325901: 0.4 ⁇ M [Stemgent]; CHIR99021: Embryonic stem cells (ESC) with AAG transgene (C57BL / 6 x 129 /) using N2B27 medium containing 3 ⁇ M (Stemgent)) and LIF (1,000 U / ml) SvJcl) (Ohta et al., 2000) was cultured.
  • ESC Embryonic stem cells
  • EpiLC Epiblast-like cell
  • Activin A 20 ng / mL
  • bFGF 12 ng / mL
  • knockout serum replacement [KSR] knockout serum replacement
  • PGCLC is a GMEM containing PGCLC medium (15% KSR, 0.1 mM NEAA, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 100 U / mL penicillin, 0.1 mg / mL streptomycin, and 2 mM L-glutamine [100 ng / mL] [Invitrogen], BMP4 [500 ng / mL] [R & D Systems], LIF [1,000 U / mL] [Invitrogen], SCF [100 ng / mL] [R & D Systems], and EGF [50 ng / mL] [R & D Systems (4-6 days)) was used to induce from 2.0 x 10 3 EpiLCs under floating conditions in low cell binding U-bottom 96-well lipid-coated plates.
  • ⁇ -minimum essential medium ( ⁇ -MEM) (Invitrogen) containing 10% KSR, in low cell binding U-bottom 96-well lipid-coated plates under floating conditions by FACS Aggregate collected d4 PGCLC (10,000 cells / reconstituted testis) and E12.5 gonad (ICR) somatic cells (40,000 cells / reconstituted testis) collected by MACS (see Magnetically Activated Cell Sorting) (37 ° C., 5% CO 2 ). After 2 days of suspension culture, the aggregates were transferred using a glass capillary to the wells of a falcon permeable support for a 24-well plate with a 0.4 ⁇ m transparent PET membrane (Corning). Each well was supplemented with 350 ⁇ L ⁇ -MEM-10% KSR for gas-liquid interface culture (Sato et al., 2011) (Sato et al., 2011). The medium was changed weekly.
  • ⁇ -MEM ⁇ -minimum essential medium
  • GSCLC colonies with diameters greater than about 500 ⁇ m were generated, they were passaged to new wells, and GSCLC cell lines were established after about 2 months.
  • Control GSC cell lines were derived from the testes of neonates at P7 (129 / Sv x C57BL / 6 with AAG) by using essentially the same procedure.
  • the medium for GSC / GSCLC culture was partially modified from that described in Kanatsu-Shinohara et al.
  • Acro / Act-EGFP (AAG) transgenic mice (donated by M. Okabe) (Nakanishi et al., 1999; Okabe et al., 1997) maintained a large C57BL / 6 background.
  • W / W v (WB ⁇ C57BL / 6), BDF1 (C57BL / 6 ⁇ DBA / 2), ICR and 129 / SvJcl mice were purchased from SLC (Hamamatsu, Japan).
  • the noon on the day when the spigot was confirmed was defined as embryonic period (E) 0.5.
  • Fluorescent labeled cell sorting Aggregates containing d4 PGCLC were washed with PBS, dissociated into single cells by treatment with 0.05% trypsin-0.53 mM EDTA for 7 minutes, quenched with DMEM containing 10% FBS, and then pipetted. The cell suspension was passed through a nylon cell strainer (diameter 40 ⁇ m) to remove cell clumps. The flow-through cells were centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes and the supernatant was removed.
  • FACS Fluorescent labeled cell sorting
  • the cell pellet was suspended in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA) (Thermo Fisher Scientific, San Diego, Calif.), And anti-integrin ⁇ 3 antibody (BioLegend) and anti-SSEA1 antibody (PES and Alexa Fluor 647 conjugated, respectively) eBioscience) and incubated on ice for 15 minutes. After washing with PBS-0.1% BSA, the cells were suspended in the same buffer (1 ⁇ 10 6 cells / ml) and selected with a flow cytometer (AriaIII: BD Biosciences).
  • BSA bovine serum albumin
  • GSCLC / GSC was single cell treated by treatment with 0.05% trypsin-0.53mM EDTA for 4 minutes, quenched with DMEM containing 10% FBS, and then pipetting Was dissociated. The cell suspension was centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes and the supernatant was removed. The cell pellet was suspended in PBS containing 0.1% BSA (approximately 1 ⁇ 10 6 cells were suspended in 200 ⁇ l of PBS-0.1% BSA). Half of the suspension was stained with primary antibody (Antibodies) on ice for 15 minutes. The other half was used to establish an unstained control.
  • BSA primary antibody
  • Magnetic activated cell sorting E12.5 male gonads were isolated in DMEM containing 10% FBS, washed with PBS, and dissociated into single cells with 0.05% trypsin-0.53 mM EDTA. The cell suspension was passed through a nylon cell strainer (70 ⁇ m diameter) (Falcon) to remove the cell mass. The flow-through cells were centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes and the supernatant was removed. The cell pellet was suspended in PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA and incubated for 15 min on ice with anti-SSEA1 antibody conjugated with magnetic beads (Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Germany) (Antibodies).
  • MCS Magnetic activated cell sorting
  • the cell suspension was washed with PBS-0.5% BSA-0.2 mM EDTA and then applied to an MS column (Miltenyi Biotec). Flow-through cells from which most SSEA-1-positive PGCs have been removed are washed with PBS-0.5% BSA-0.2 mM EDTA, suspended in ⁇ MEM-10% KSR, and aggregated with PGCLC for the preparation of reconstituted testis I let you.
  • GSC and GSCLC were dissociated into single cells by incubating with 0.05% trypsin-0.53 mM EDTA for 4 min, which was quenched with DMEM containing 10% FBS.
  • the cell suspension is passed through a nylon cell strainer (diameter 40 ⁇ m) (Falcon) to remove the cell mass, the flow-through cells are centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, the supernatant is removed, and the pellet is 2.5 ⁇ 10 7 cells Suspended in GSC / GSCLC medium without growth factors at a concentration of / ml.
  • Intracytoplasmic sperm injection ICSI
  • ROSI round sperm cell injection
  • oocytes that received round sperm cells were cultured for 1 hour in KSOM medium containing 5 mM SrCl2 and 2 mM EGTA (Kishigami and Wakayama, 2007). Two-cell stage embryos after ICSI or ROSI were transferred to a 0.5 dpc pseudopregnant ICR female oviduct by standard procedures.
  • testis with transplanted cells were fixed with Bouin fixative solution for 48 hours, washed 3 times with 70% ethanol, dehydrated with continuous ethanol concentration, paraffin Embedded in. The tissue was cut to a thickness of 7 ⁇ m. After deparaffinization with xylene (3 times) and graded sequential ethanol, sections were stained with hematoxylin and eosin.
  • testis was fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) on ice for 2 hours, washed 3 times with PBS, and replaced with a continuous concentration of sucrose solution (15%, 30%), It was embedded in an OCT compound (Sakura, Tokyo, Japan), frozen, and then cut to a thickness of 10 ⁇ m at ⁇ 20 ° C. After air drying, the sections are washed 3 times with PBS, incubated in blocking buffer (PBS containing 5% BSA and 0.1% Triton X-100) for 30 minutes, then staining buffer containing primary antibody (Antibodies) (PBS containing 1% BSA and 0.1% Triton X-100) was reacted at 4 ° C. for 2 hours.
  • PFA paraformaldehyde
  • D4 PGCLC cultured directly under alkaline phosphatase (AP) -stained GSC culture conditions was washed twice with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde on ice for 1 hour. After washing with PBS containing 0.1% Tween20 (PBST), d4 PGCLC-derived colonies were incubated in AP buffer at room temperature.
  • AP buffer was prepared by sequentially dissolving 5 mg of naphthol AS-MX disodium phosphate (Sigma) and 10 mg of Fast Red TR salt (Sigma) in 0.5 ml of N, N-dimethylformamide (Sigma) and then filtering. . The reaction was stopped with PBST at appropriate time points.
  • GSCs / GSCLC were dissociated into single cells by culturing for 6 hours in medium containing 60ng / ml demecorsin (Sigma) and incubating for 4 minutes in 0.05% trypsin-0.53mM EDTA and DMEM containing 10% FBS Quenched with. Cells were then swollen with hypotonic solution (75 mM KCL) and fixed by repeated treatment (3 times) with Carnoy fixative. The fixed cells were then spread on a glass slide (Matsunami) washed with ethanol and stained with DAPI. Karyotype images were obtained by analysis with a confocal microscope (Olympus FV1000), and the number of chromosomes was counted.
  • a confocal microscope Olympus FV1000
  • qPCR GSC / GSCLC RNA collected by FACS against AAG fluorescence was extracted and purified using the RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • the purified total RNA was reverse transcribed with Superscript III (Invitrogen) to generate first-strand cDNA, which was used for qPCR analysis with Power SYBER Green (ABI, Foster City, CA).
  • the primer sequences used are shown in Table 2.
  • COBRA Combined Bisulfite Restriction Analysis
  • the amplified DNA is digested with the appropriate restriction enzyme (New England BioLabs) -PhuI-HF (H19), HhaI (Peg10), Taq ⁇ I (Igf2r), AciI (Meg3 IG and Snrpn) and 2% or Separation through electrophoresis in a 3% agarose gel.
  • the appropriate restriction enzyme New England BioLabs
  • H19 H19
  • HhaI Peg10
  • Taq ⁇ I Igf2r
  • AciI Meg3 IG and Snrpn
  • Embryonic stem cells with Acro / Act-EGFP (AAG) transgene (129 / SvJcl x C57BL / 6 background) (Ohta et al., 2000) are induced into PGCLC and fluorescence labeled cell sorting (FACS) Used to isolate PGCLC on day 4 (d4) or day 6 (d6) based on high levels of SSEA1 and INTEGRIN ⁇ 3. Aggregates between PGCLC and embryonic testis cells at embryonic stage (E) 12.5 depleted of PGC by magnetic cell separation (MACS) were created (FIG. 1A).
  • AAG Act-EGFP
  • FACS fluorescence labeled cell sorting
  • AAG positive (+) cells showed a random distribution throughout the reconstituted testis forming several aggregates (FIGS. 1B and 2A). From about d4, the seminiferous tube-like structure began to become clear, and d7 showed extensive development and constructed an anastomosis network (FIGS. 1B and 2A). By d7, AAG (+) cells containing aggregates outside the seminiferous tubule structure had disappeared, and most of the AAG (+) cells were inside the seminiferous tubule network (FIGS. 1B and 2A). Later, with further development of seminiferous network, the reconstructed testis was stably maintained, and an increase in the number of AAG (+) cells in the network was observed (FIGS. 1B and 2A).
  • DDX4 (Fujiwara et al., 1994), a germ cell marker that many AAG (+) cells begin to express in gonad PGCs, was positive (+), but pre-spermatogonia (pro-spermatogonia) ) Was negative for PLZF (ZBTB16) (Buaas et al, 2004; Costoya et al, 2004), an SSC marker whose expression begins in the perinatal period (FIGS. 1C and 2B). At d21, some AAG (+) cells had both (+) DDX4 and PLZF (FIGS. 1C and 2B).
  • GSCs germline stem cells
  • GSC germline stem cell
  • GSCLC GSC-like cells
  • Such colonies then showed slow growth and, after several passages, grew as a stable cell line with a normal karyotype and a vine-like colony morphology indistinguishable from GSC (conditions 1 and 9 and 6 strains from 2 respectively) had high efficiency for cryopreservation / reexpansion and subsequent thawing (FIGS. 3B and 4A).
  • Such cell lines could be established in a consistent manner when the initial colony count was 10 or more and proliferated in the same manner as GSCs (129 / SvJcl x C57BL / 6) ( Figure 3C) (Kanatsu-Shinohara et al., 2003).
  • Important genes Ddx4, Daz1, Gfra1, Ret, Piwil2, Itga6, Kit, Plzf, Piwil4 and Id4
  • surface markers CD9, SSEA1, INTEGRIN ⁇ 1, INTEGRIN ⁇ 6, KIT and GFR ⁇ 1 in cell lines derived from reconstituted testis and Comparison of the expression of transcription factors (PLZF and ID4) (Kanatsu-Shinohara and Shinohara, 2013; Yang and Oatley, 2014) with those in GSC reveals that the cell line shows the same gene expression as GSC (Figure 3D-3F). Therefore, these cell lines were named GSCLC.
  • GSCLC-derived fertile progenitor cells / SSCs can settle in adult testes (over 8 weeks) for spermatogenesis (Brinster and Zimmermann, 1994), but PGCs Is established only in newborn testes ( ⁇ 5-10 days) and undergoes spermatogenesis (Chuma et al., 2005; Ohta et al., 2004). This may be due to differences in either the homing ability for spermatogenesis or the intrinsic / epigenetic ability between these cell types. To examine whether GSCLC acquires the characteristics of mature stem cells, they were transplanted into adult testes (8-10 weeks) in W / W v mice.
  • GSC AAG (+); 129 / SvJcl x C57BL / 6) (GSC1) was established in the adult testis and undergoes spermatogenesis (Figure 5A).
  • PGCLC showed such activity in neonates (Hayashi et al., 2011) but not in adults (FIG. 5A).
  • GSCLC all GSCLC cell lines established in adult testes (FIGS. 5A, 6A, and 6B).
  • a small number of them underwent spermatogenesis in established tubule fractions (FIGS. 5A, 6A, and 6B).
  • GFR ⁇ 1 (+) spermatogonia / SSC-like cells are present in similar proportions in tubules with established GSC ( ⁇ 33.9%) and GSCLC (GSCLC1: ⁇ 36.6%; 4: ⁇ 32.4%) Became clear (Figure 5C).
  • GSCLC1 ⁇ 36.6%; 4: ⁇ 32.4%)
  • Became clear Figure 5C.
  • almost all tubules with established GSC showed SCP3 (+) meiotic cells ( ⁇ 99.3%), but less than half of those with established GSCLC (GSCLC1: 44.4%; 4: 39.1%) (Figure 5C).
  • GSCLC spermatogonia / SSC characteristics
  • ICSI sperm injection into the cytoplasm
  • ROSI Circular sperm cell injection
  • Example 2 Induction of differentiation from ES cells to PGCLC and culture of PGCLC Day 4 (d4) PGCLC induced in the same manner as in Example 1 was sorted using a cell sorter, and a population of cells positive for Blimp1 as an initial PGC marker was collected. The cells were seeded on feeder cells (m220 cells; Nature, 352: 809-811 (1991), J. Biol. Chem., 269: 1237-1242 (1994)) and GMEM-10% KSR-2.5% FBS -The cells were cultured for 5, 7, and 9 days under medium conditions with Forskolin-Rolipram-SCF added (GK10FR) (Fig. 7).
  • feeder cells m220 cells; Nature, 352: 809-811 (1991), J. Biol. Chem., 269: 1237-1242 (1994)
  • GMEM-10% KSR-2.5% FBS The cells were cultured for 5, 7, and 9 days under medium conditions with Forskolin-Rolipram-SCF added (
  • testicular cultured PGCLCs and male gonad somatic cells at 12.5 days of age were mixed at a ratio of 5,000 cells: 70,000 cells, and suspended aggregate culture in GK10FR for 2 days (FIG. 7). After that, the aggregate was transferred onto a culture insert and subjected to gas-liquid interface culture for 2 weeks (FIG. 7).
  • the medium used was DMEM / F12-10% FBS.
  • GSCLC spermatogonia-like cell line
  • cultured PGCLC differentiates into late PGCs.
  • the cultured PGCLC proliferated until the 3rd day from the start of gas-liquid interface culture, and the reconstructed testicular fold structure was clarified by the 4th to 5th days.
  • Blimp1 which is an early PGC marker, and subsequently Stella
  • MVH a late PGC marker
  • FIG. 8 The expression of MVH increased toward the 10th day of gas-liquid interface culture, and then attenuated a little on the 14th day.
  • GSCLC can be established from the reconstructed testis on the 10th and 14th day.
  • the reconstructed testis cultured for 10 days or 14 days is dissociated into single cells, and the late PGC marker MVH positive cells collected by the cell sorter are used.
  • MVH positive cells collected by the cell sorter are used.
  • a cell line capable of being passaged for a long time could be induced.
  • a total of 4 strains, 3 strains from the 10th day reconstituted testis and 1 strain from the 14th day reconstituted testis (FIG. 9), could be established.
  • Germline stem cell-like cells obtained by the method of the present invention can be maintained and cultured for a long period of time and can form fertile spermatozoa even when transplanted to adult testes as well as newborns. Therefore, it can greatly contribute to the elucidation of the detailed mechanism of germ cell development and the elucidation of the mechanism of infertility and genetic disease development.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、単離された多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞からインビトロで精子幹細胞様の細胞を製造する方法であって、 (1) 始原生殖細胞様細胞を生殖巣体細胞と浮遊培養にて共培養し、再構成精巣を得る工程、及び (2) 得られた再構成精巣を気液界面培養して、該再構成精巣中でDDX4陽性かつPLZF陽性細胞を誘導する工程 を含む、方法；及び　当該方法により得られる精子幹細胞様の細胞を再構成精巣から解離し、精子幹細胞から生殖系列幹細胞を誘導し得る条件下で培養することを含む、生殖系列幹細胞様細胞の製造方法 を提供する。

Description

多能性幹細胞から生殖系列幹細胞様細胞への分化誘導方法
　本発明は、多能性幹細胞から、エピブラスト様細胞、始原生殖細胞様細胞を介して、インビトロで生殖系列幹細胞様細胞を誘導する方法、及び該生殖系列幹細胞様細胞から成体動物の精巣内で正常な精子を誘導する方法に関する。
　発生生物学における主要な課題は、必須の発生経路をインビトロで再構成することであり、これは、新たな実験の機会を提供するだけでなく医学的応用の基礎としても役立つものである。多細胞生物において、生殖細胞系列には新たな生物の創出を確保する必須の機能が与えられており、それにより世代を超えて遺伝情報及びエピジェネティック情報が継承される。従って、生殖細胞系列の発生をインビトロで再構成することは、通常、ライフサイエンスにおける本来的意義である。マウス及びヒトの胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹細胞（「ES細胞」、「ESC」と略記する場合がある）から、インビトロで配偶子又はその前駆細胞（始原生殖細胞;「PGC」と略記する場合がある）を作り出す試みがいくつかなされてきたが、これらの試みは全て、化学的に定義されていない条件下、胚様体としてESCのランダムな分化を伴い、1種以上のマーカー遺伝子の自発的な発現に依存していた。結果として、これらの試みは目的の細胞を得るには非効率的であった。さらに、作製された細胞が健常な子孫の創出に寄与することは何ら実証されていなかった。
　本発明者らは以前、アクチビンA及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むサイトカインを用いて、ES細胞/人工多能性幹細胞(「iPS細胞」、「iPSC」と略記する場合がある)をエピブラスト様細胞(「EpiLC」と略記する場合がある)へ誘導し、その後、BMP4を含むサイトカインを用いて、始原生殖細胞様細胞（「PGC様細胞」、「PGCLC」と略記する場合がある)へと誘導する培養系を確立した(特許文献１、非特許文献１及び２)。さらに、該PGCLCを新生仔マウスの精巣内又は卵嚢下に移植して、精子又は卵子に分化させ、そこから正常な子孫を得ることに成功した(特許文献１、非特許文献１及び２)。また、多能性幹細胞（「PSC」と略記する場合がある）からPGCLCを経て卵子をインビトロで誘導することにも成功している。
　一方オスについては、多能性幹細胞からPGCを経て、精子の前段階の細胞である、精子幹細胞を誘導することが目標の一つとされてきた。精子幹細胞は、生涯にわたり精子を産出する細胞で、成体の精巣内にわずかしか存在せず、生殖細胞系列で唯一の幹細胞といわれている。これまで、精子幹細胞の長期培養株（生殖系列幹細胞；GSC）の樹立方法は研究されていたが、精子幹細胞がPGCから分化誘導されるメカニズムには不明な点が多く、多能性幹細胞からPGCLCを経て、GSC様の細胞をインビトロで誘導する培養系の確立が望まれている。
国際公開第2012/020687号
Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S. & Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell146, 519-532 (2011). Hayashi, K.et al. Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ cell-like cells in mice. Science 338, 971-975 (2012).
　従って、本発明の目的は、多能性幹細胞由来のPGCLCからインビトロでGSC様の細胞を誘導する方法を提供することであり、このGSC様の細胞を精子に分化させ、効率よくPSCが寄与する子孫を作製する方法を提供することである。
　マウスの場合、PGCは胎齢12.5日齢（E12.5）までに将来精巣の元となる生殖巣体細胞に囲まれ、前精原細胞と呼ばれるようになり、その後、出生5日齢頃に、精原細胞及び精子幹細胞へと分化する。そこで、本発明者らは、PGCが前精原細胞となる時点の細胞環境に注目し、マウスESCから誘導したPGCLCを、マウス胎仔（E12.5）の生殖巣体細胞とともに浮遊培養して凝集させて「再構成精巣」を作製し、精子幹細胞への分化が誘導される培養条件を検討した。その結果、PGCLCが、精子幹細胞と同等の特性を示す細胞に分化する培養条件を決定することができた。この細胞をさらに培養したところ、生体由来のGS細胞と同様に増殖し、4ヶ月以上の長期培養が可能であることが確認された。本発明者らは、この細胞株を生殖系列幹細胞様細胞（GSCLC）と命名した。さらに、本発明者らは、GSCLCを生殖細胞欠損マウスの新生仔（生後7日齢）及び成体（生後8週齢）の精巣に移植した結果、一部が精子まで分化し、得られた精子を卵子と顕微授精させると健常な産仔が得られることを確認し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下に関する：
［1］単離された多能性幹細胞（PSC）由来の始原生殖細胞様細胞（PGCLC）からインビトロで精子幹細胞様の細胞を製造する方法であって、
(1) PGCLCを生殖巣体細胞と浮遊培養にて共培養し、再構成精巣を得る工程、及び
(2) 得られた再構成精巣を気液界面培養して、該再構成精巣中でDDX4陽性かつPLZF陽性細胞を誘導する工程
を含む、方法。
［2］［1］に記載の方法により得られる精子幹細胞様の細胞を再構成精巣から解離し、精子幹細胞から生殖系列幹細胞（GSC）を誘導し得る条件下で培養することを含む、GSC様細胞（GSCLC）の製造方法。
［3］以下の性質を有することを特徴とする、単離されたGSCLC。
(a) 単離されたPSC由来である
(b) (i) Ddx4、Daz1、Gfra1、Ret、Piwil2、Itga6、Kit、Plzf、Piwil4及びId4からなる群より選択される遺伝子、
　　(ii) CD9、SSEA1、INTEGRINβ1、INTEGRINα6、KIT及びGFRα1からなる群より選択される表面マーカー、並びに
　　(iii) PLZF及びID4からなる群より選択される転写因子
の発現レベルが、GSCと同等である
(c) GSCと同等の増殖速度で維持・増幅可能である
(d) 該GSCLCを成体精巣内に移植した場合、
　　(i) 移植細胞が定着した精細管に占めるGFRα1陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれと同等である、及び
　　(ii) 移植細胞が定着した精細管に占めるSCP3陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれよりも低い
(e) 該GSCLCを成体精巣内に移植して得られる精細胞を顕微授精した場合、正常な子孫を生じる
［4］［2］に記載の方法により得られるGSCLC又は［3］に記載のGSCLCを哺乳動物の精巣内に移植することを含む、稔性のある精細胞の製造方法。
［5］［4］に記載の方法により得られる精細胞と卵細胞とを受精させることを含む、単離されたPSCが全身に寄与した子孫の製造方法。
　本発明によれば、従来のPGCLCが抱える2つの課題、即ち、(1) 長期維持培養ができないこと、及び(2) 新生児精巣内でしか精子に分化しないこと、を解決することができる。
図１は、インビトロでの再構成精巣の発展を示す。（A）2つの条件下での再構成精巣の作製および培養のためのスキーム。（B）3週間にわたる再構成精巣の発展の代表的な画像（条件2）。明視野画像（BF）、AAG蛍光、およびそれらのマージを示す。バー：200μm。（C）d14およびd21での再構成精巣（条件2）またはE13.5およびP3の精巣におけるGATA4およびSOX9（左）またはDDX4およびPLZF（右）の発現。バー：50μm。PGCLC由来の細胞および内在性の生殖細胞は、それぞれGFPおよびDDX4（第2列）によって同定する。DAPI染色およびマージも示す。（D）再構成精巣におけるd4 PGCLCまたはE12.5 PGCのDDX4（+）/ PLZF（-）およびDDX4（+）/ PLZF（+）細胞への分化の割合。（E）再構成精巣の長期培養（条件1）。（左）28日間培養した再構成精巣の形態。バー：200μm。（右）30日間培養した再構成精巣の切片におけるDDX4（ii）、SCP3（iii）、およびGFP（iv）の発現。（i）はDAPI。バー：10μm。図２も参照のこと。 図２は、インビトロでの再構成精巣を示し、図１に関連する。（A）条件1下で3週間の再構成精巣の発展の代表的な画像。明視野画像（BF、上）、AAGによるGFP蛍光（中）、およびそれらのマージ（下）を示す。バー：200μm。（B）d14およびd21での再構成精巣（条件１）、またはE13.5および出生後日数（P）3での再構成精巣における、GATA4およびSOX9（左）もしくはDDX4およびPLZF（右）の発現のIF分析。バー：50μm。PGCLC由来の細胞および内在性の生殖細胞は、それぞれGFPおよびDDX4によって同定した（第2列）。DAPI染色およびマージを、それぞれ上および下の列に示す。（C）d21での再構成精巣（条件1（左）および2（右））におけるDDX4およびPLZFの発現のIF分析。内在性の生殖細胞を、GFP（-）/ DDX4（+）細胞として同定した。DAPI染色およびマージを、それぞれ上および下の列に示す。バー：50μm。（D）インビボでAAG（+）PGCを有する再構成精巣の長期培養（条件1）。（左）49日間培養した再構成精巣の形態。明視野画像（BF）、AAGによるGFP蛍光、およびそれらのマージ（下）を示す。バー：200μm。（右）54日間培養した再構成精巣の切片におけるDDX4（ii）、SCP3（iii）、およびGFP（iv）の発現のIF分析を（i）DAPIと共に示す。バー：10μm。 図３は、再構成精巣から生殖系列幹細胞様細胞への誘導を示す。（A）再構成精巣からのGSCLC誘導のスキーム。（B）（上）GSCLCの誘導中のAAG（+）細胞のコロニーの代表的な画像。BF画像、AAG蛍光、およびそれらのマージを示す。（下）9継代でのGSCLC細胞株（GSCLC1）の画像。バー：100 μm。（C）GSCLC（GSCLC1,2）およびGSC（GSC1）の増殖。2 x 105のGSCLC/GSCを播種し、その増殖を6日または7日ごとに評価した。（D）GSCLC（GSCLC1,4）およびGSC（GSC1,2）における、qPCRにより測定することで示した遺伝子の発現レベル。各遺伝子について、2つのハウスキーピング遺伝子ArbpおよびPpiaの平均Ct値（0と設定）からのDCt（閾値サイクル[Ct]値の差）をプロットした。赤い点線は、GSCの平均CtsのCt値±1を示す。（E）GSCLC（GSCLC1,4）およびGSC（GSC1）におけるFACS分析により測定することで示した表面マーカーの発現レベル（赤色プロット）。青色のプロットは、アイソタイプが適合した対照の抗体による蛍光強度を示す。（F）GSCLC（GSCLC1）およびGSC（GSC1）のコロニーにおける、GFP、ID4、およびPLZFの発現（DAPIと共に示す）ならびにそれらのマージ。バー：50μm。図４も参照のこと。 図４は、再構成精巣由来の生殖系列幹細胞様細胞(GSCLC)を示し、図３に関連する。（A）GSC1、GSCLC1、およびGSCLC4の核型分析。（B）（左）GSC誘導条件下で直接d4 PGCLCを培養するためのスキーム。 （中）1,2及び4日間GSC誘導条件下でのd4 PGCLC培養の明視野（上）またはGFP（AAG）蛍光（下）の画像。バー：100μm。代表的な24ウェルのアルカリホスファターゼ（AP）染色の画像を右側に示す。バー：1 mm。（右）GSC誘導条件下で培養したd4またはd6 PGCLCから、AP陽性コロニーを誘導する効率。平均値はバーとして示す。各ウェルに1,000個～3,000個ののPGCLCを播種し、d7でAP陽性コロニーの数を数えた。 図５は、GSCLC由来の精子形成と繁殖力のある子孫を示す。（AおよびB）GSC（GSC1）、d4 PGCLC（Aのみ）およびGSCLC（GSCLC1, 4）の移植10週間後のW/Wv マウスの精巣（A）または単離した精細管（B）の代表的なBFおよびAAG-蛍光画像。囲んだ領域を拡大し、AAG（+）細胞が精細管の基底領域にのみ定着したことが明らかになった。d4 PGCLC移植で認められるドットの蛍光（左から二番目、下）は、自己蛍光である。H＆Eにより染色した組織学的切片を（B）に示す。（A）のバー；1mm、（B）のバー：100 μm（左）、50 μm（右）。（C）GSCLC（GSCLC1）またはGSC（GSC1）の移植後10週目のW / Wvマウスの精細管切片における、GFP、GFRa1およびPLZF（左）またはGFP、SCPおよびPLZF（右）の発現（DAPIと共に示す）。バー：50μm。（下）GSC（GSC1）またはGSCLC（GSCLC1, 4）を移植することにより定着された細管の間における、GFRa1（+）（左）またはSCP3（+）（右）細胞を有する精細管の代表的な割合。（D）GSCLC1（i-iv）またはGSCLC3 (v, vi)由来の精子（I、ii、v、vi）および精細胞（iii、iv）のBF（i、iii、v）およびAAG-蛍光（ii、iv、vi）の画像。（ii、vi）のバー：10 μm。（iv）のバー：50 μm。（E）GSCLC由来精子のICSIによって産生された、前核段階での接合子（i）、2細胞胚（ii）、子孫（iii、iv）、および胎盤（iii）。（F）GSCLC1由来の精子由来の繁殖力のあるオスの子孫（アグーチ）。（G）GSCLCおよびGSC由来の精子を注入した卵母細胞の発生。図６も参照のこと。 図６は、GSCLC由来の精子形成と子孫を示し、図５に関連する。（A）条件1及び2下での再構成精巣に由来するGSCLCの15株の生体精巣への移植及び精子形成。（B）GSCLC1,2および3を移植した精巣における精子形成を伴うまたは伴わないコロニーの数。（C、D）GSCLC1およびGSC1由来の子孫の体重（C）および胎盤重量（D）。スチューデントt検定によりp値を得た。（E）GSCLC1および3由来の精子由来の子孫のインプリントの複合重亜硫酸制限分析(Combined bisulfite restriction analysis；COBRA）。以前に報告されたように（Lee et al.、 2009）、H19、Peg10、Igf2r、Meg3IG、およびSnrpnの主要なCpGのメチル化状態を分析した。 U：消化されていない。 D：それぞれの酵素で消化した。消化されていない（黒い三角形）および消化された（白い三角形）断片の長さを示す。GSCLC1および3由来の精子由来の子孫はすべて、明らかに正常なインプリンティングパターンを示した。 図７は、実施例２の、培養PGCLCから精子幹細胞様の細胞を含む再構成精巣を得るまでの培養スキームを示す。 図８は、気液界面培養による再構成精巣における各種PGCマーカーの発現の経時的変化を示す。 図９は、気液界面培養14日目の再構成精巣からのGSCLCの樹立を示す。
［Ｉ］始原生殖細胞様細胞（PGCLC）から精子幹細胞様の細胞を製造する方法
　本発明は、単離された多能性幹細胞由来のPGCLCからインビトロで精子幹細胞様の細胞を製造する方法を提供する。当該方法は、
(1) PGCLCを生殖巣体細胞と浮遊培養にて共培養し、再構成精巣を得る工程、及び
(2) 得られた再構成精巣を気液界面培養して、該再構成精巣中でDDX4陽性かつPLZF陽性細胞を誘導する工程
を含む。
１．多能性幹細胞からの始原生殖細胞様細胞（PGCLC）の製造
　本発明で用いられるPGCLCは、単離された多能性幹細胞からインビトロで誘導され、かつPGCと同等の特性を有するものであればいかなるものであってもよいが、例えば、前記特許文献１及び非特許文献１に記載されるPGCLCが挙げられる。該PGCLCは、単離されたPSCから、以下に示す方法により、エピブラスト様細胞（EpiLC）を経由して製造することができる。
　PGCLC製造の出発材料として使用する多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己複製能」と、三つの一次胚葉すべてに分化できる「分化多能性」とを有する、単離された未分化細胞であればいずれでもよい。ここで「単離された」とは、生体内（インビボ）から生体外（インビトロ）の状態におかれたことを意味し、必ずしも純化されている必要はない。例えば、単離された多能性幹細胞として、iPS細胞、ES細胞、胚性生殖（EG）細胞、胚性癌（EC）細胞などが挙げられるが、好ましくはiPS細胞又はES細胞である。
　本発明の方法は、いずれかのPSCが樹立されているか、樹立可能である、任意の哺乳動物種において適用することができる。このような哺乳動物の例として、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター等が挙げられるが、好ましくはヒト、マウス、ラット、サル、イヌ等、より好ましくはヒト又はマウスである。
（1）多能性幹細胞の作製
（i）ES細胞
　多能性幹細胞は自体公知の方法により取得することができる。例えば、ES細胞の作製方法としては、哺乳動物の胚盤胞ステージにおける内部細胞塊を培養する方法（例えば、Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994）を参照）、体細胞核移植によって作製された初期胚を培養する方法（Wilmut et al., Nature， 385, 810（1997）；Cibelli et al.,Science, 280, 1256（1998）；入谷明ら, 蛋白質核酸酵素, 44, 892（1999）；Baguisi et al., Nature Biotechnology， 17, 456（1999）；Wakayama et al., Nature, 394, 369（1998）；Wakayama et al., Nature Genetics, 22, 127（1999）；Wakayama et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984（1999）；RideoutIII et al., Nature Genetics, 24,109（2000））などが挙げられるが、これらに限定されない。また、ES細胞は、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。例えば、ヒトES細胞株であるH1及びH9は、ウィスコンシン大学のWiCell Instituteより入手可能であり、KhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ES細胞を体細胞核移植により作製する場合、体細胞の種類や体細胞を採取するソースは下記iPS細胞作製の場合に準ずる。
（ii）iPS細胞
　iPS細胞は、体細胞に核初期化物質を導入することにより作製することができる。
（a）体細胞ソース
　iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、マウス又はヒト）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよい。例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、及びそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、例えば、脂肪由来間質（幹）細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
　体細胞を採取するソースとなる哺乳動物個体の選択は特に制限されないが、最終産物としてGSCLCがヒト不妊などの疾患の治療に使用される場合には、移植片拒絶及び／又はGvHDを予防するという観点から、患者本人の細胞であるか、又は患者のHLA型と同一若しくは実質的に同一であるHLA型を有する他人から体細胞を採取することが好ましい。ここで「実質的に同一であるHLA型」とは、免疫抑制剤などの使用により、ドナー体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。例えば、主たるHLA（HLA－A、HLA－B及びHLA－DRの主要な3遺伝子座、又はさらにHLA－Cwを含む4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。PGC様細胞をヒトに投与（移植）しないが、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとして使用する場合には、同様に患者本人又は薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取する必要がある。
　哺乳動物から分離した体細胞は、細胞の種類に応じて、その培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5～20％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。核初期化物質及びiPS細胞の樹立効率改善物質と細胞との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、予め無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。
（b）核初期化物質
　本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子又はそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
（1）Oct3／4、Klf4、c-Myc
（2）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2（ここで、Sox2はSox1、Sox3、Sox15、Sox17又はSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1、Klf2又はKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）、N-Myc又はL-Mycで置換可能である。）
（3）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、Fbx15、Nanog、Eras、ECAT15-2、TclI、β-catenin（活性型変異体S33Y）
（4）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、SV40 Large T antigen（以下、SV40LT）
（5）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16 E6
（6）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16 E7
（7）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV6 E6、HPV16 E7
（8）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、Bmil
（上記因子のさらなる情報については、WO2007／069666を参照（但し、上記（2）の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1若しくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101－106（2008）を参照）。「Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2」の組み合わせについては、Cell,126, 663-676（2006）、Cell, 131, 861-872（2007）等も参照。「Oct3／4、Klf2（又はKlf5）、c-Myc、Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197－203（2009）も参照。「Oct3／4、Klf4、c－Myc、Sox2、hTERT、SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141－146（2008）も参照）
（9）Oct3／4、Klf4、Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106（2008）を参照）
（10）Oct3／4、Sox2、Nanog、Lin28（Science, 318, 1917-1920（2007）を参照）
（11）Oct3／4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005（2008）を参照）
（12）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28（Cell Research（2008）600-603を参照）
（13）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005（2008）も参照）
（14）Oct3／4、Klf4（Nature 454:646-650（2008）、Cell Stem Cell, 2:525-528（2008）を参照）
（15）Oct3／4、c-Myc（Nature 454:646-650（2008）を参照）
（16）Oct3／4、Sox2（Nature, 451, 141-146（2008）、WO2008／118820を参照）
（17）Oct3／4、Sox2、Nanog（WO2008／118820を参照）
（18）Oct3／4、Sox2、Lin28（WO2008／118820を参照）
（19）Oct3／4、Sox2、c-Myc、Esrrb（ここで、EssrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203（2009）を参照）
（20）Oct3／4、Sox2、Esrrb（Nat. Cell Biol., 11, 197-203（2009）を参照）
（21）Oct3／4、Klf4、L-Myc
（22）Oct3／4、Nanog
（23）Oct3／4
（24）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT（Science, 324：797-801（2009）を参照）
　上記（1）～（24）において、Oct3／4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。また、Sox2（又はSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。さらにLin28に代えて他のLinファミリーのメンバー、例えばLin28bなどを用いることもできる。
　また、上記（1）～（24）には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記（1）～（24）のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
　これらの組み合わせの中で、Oct3／4、Sox2、Klf4、c－Myc、Nanog、Lin28及びSV40LTから選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質である。
　とりわけ、得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3／4、Sox2及びKlf4の3因子の組み合わせ（即ち、上記（9））が好ましい。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など）は、Oct3／4、Sox2、Klf4及びc－Mycの4因子のほか、Oct3／4、Klf4、c－Myc、Sox2及びLin28の5因子か、それにNanogを加えた6因子（即ち、上記（12））、さらにSV40 Large T加えた7因子（即ち、上記（24））が好ましい。
　さらに、上記におけるc-MycをL-Mycに変更した組み合わせも、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。
　上記の各核初期化物質のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO2007／069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg及びL－Mycのマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
遺伝子名　 マウス　　　　　ヒト
Lin28　　　NM_145833　　　 NM_024674
Lin28b　　 NM_001031772　　NM_001004317
Esrrb　　　NM_011934　　　 NM_004452
Esrrg　　　NM_011935 　　　NM_001438
L-Myc　　　NM_008506 　　　NM_001033081
　核初期化物質としてタンパク性因子を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該培養細胞又はその馴化培地から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター等に挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
（c）核初期化物質の体細胞への導入方法
　核初期化物質の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。ヒトへの臨床応用を念頭におく場合、その出発材料たるiPS細胞も遺伝子操作なしに作製されたものであることが好ましい。
　そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）若しくは細胞透過性ペプチド（CPP）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro－JectTMProtein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect－1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrainPeptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で約5～15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で1ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
　PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT（Frankel, A. et al, Cell55, 1189-93（1988）；Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179-88（1988））、Penetratin（Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50（1994））、Buforin II（Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245－50（2000））、Transportan（Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67－77（1998））、MAP（model amphipathic peptide）（Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39（1998））、K－FGF（Lin, Y. Z. etal. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258（1995））、Ku70（Sawada, M. et al. Nature CellBiol. 5, 352-7（2003））、Prion（Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90（2002））、pVEC（Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44（2001））、Pep-1（Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6（2001））、Pep-7（Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65（2002））、SynBl（Rousselle, C. et al. MoI. Pharmacol. 57, 679-86（2000））、HN-I（Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6（2000））、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPとしては、11R（Cell Stem Cell, 4:381-384（2009））や9R（Cell Stem Cell, 4:472-476（2009））等のポリアルギニンが挙げられる。
　核初期化物質のcDNAとPTD若しくはCPP配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して、ベクターを用いて組換え発現させる。融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
　マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
　iPS細胞の樹立効率を重視するのであれば、核初期化物質を、タンパク性因子自体としてではなく、それをコードする核酸の形態で用いることも好ましい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA／RNAキメラであってもよく、また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
　核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1－11、pXT1、pRc／CMV、pRc／RSV、pcDNAI／Neo）などが用いられ得る。
　用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エピソーマルベクターなどが使用され得る。
　発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えば、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV－TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
　発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリA付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　核初期化物質である核酸（初期化遺伝子）は、各々別個の発現ベクター上に組み込んでもよいし、1つの発現ベクターに2種類以上、好ましくは2～3種類の遺伝子を組み込んでもよい。遺伝子導入効率の高いレトロウイルスやレンチウイルスベクターを用いる場合は前者が、プラスミド、アデノウイルス、エピソーマルベクターなどを用いる場合は後者を選択することが好ましい。さらに、2種類以上の遺伝子を組み込んだ発現ベクターと、1遺伝子のみを組み込んだ別の発現ベクターとを併用することもできる。
　上記において複数の初期化遺伝子を1つの発現ベクターに組み込む場合、これら複数の遺伝子は、好ましくはポリシストロニック発現を可能にする配列を介して発現ベクターに組み込むことができる。ポリシストロニック発現を可能にする配列を用いることにより、1種類の発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする配列としては、例えば、口蹄疫ウイルスの2A配列（PLoS ONE 3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007）、IRES配列（U.S. Patent No. 4,937,190）など、好ましくは2A配列を用いることができる。
　核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat－E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段がWO2007／69666、Cell, 126, 663－676（2006）及び Cell, 131, 861－872（2007）に開示されている。ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917－1920（2007）に開示がある。iPS細胞から誘導されるPGC様細胞を不妊治療や生殖細胞の遺伝子治療などの再生医療として利用する場合、初期化遺伝子の発現（再活性化）は、iPS細胞由来のPGC様細胞から再生された生殖細胞又は生殖組織における発癌リスクを高める可能性があるので、核初期化物質をコードする核酸は細胞の染色体に組み込まれず、一過的に発現することが好ましい。かかる観点からは、染色体への取込みが稀なアデノウイルスベクターの使用が好ましい。アデノウイルスベクターを用いる具体的手段は、Science, 322, 945－949（2008）に開示されている。また、アデノ随伴ウイルスベクターも染色体への取込み頻度が低く、アデノウイルスベクターと比べて細胞毒性や炎症惹起作用が低いので、別の好ましいベクターとして挙げられる。センダイウイルスベクターは染色体外で安定に存在することができ、必要に応じてsiRNAにより分解除去することができるので、同様に好ましく利用され得る。センダイウイルスベクターについては、J. Biol. Chem., 282, 27383－27391（2007）や特許第3602058号に記載のものを用いることができる。
　レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを用いる場合は、いったん導入遺伝子のサイレンシングが起こったとしても、後に再活性化される可能性があるので、例えば、Cre／loxPシステムを用いて、不要となった時点で核初期化物質をコードする核酸を切り出す方法が好ましく用いられ得る。即ち、該核酸の両端にloxP配列を配置しておき、iPS細胞が誘導された後で、プラスミドベクター若しくはアデノウイルスベクターを用いて細胞にCreリコンビナーゼを作用させ、loxP配列に挟まれた領域を切り出すことができる。また、LTR U3領域のエンハンサー－プロモーター配列は、挿入突然変異によって近傍の宿主遺伝子を上方制御する可能性があるので、当該配列を欠失、若しくはSV40などのポリアデニル化配列で置換した3’－自己不活性化（SIN）LTRを使用して、切り出されずゲノム中に残存するloxP配列より外側のLTRによる内因性遺伝子の発現制御を回避することがより好ましい。Cre-loxPシステム及びSIN LTRを用いる具体的手段は、Chang et al., Stem Cells, 27：1042-1049（2009）に開示されている。
　一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949－953（2008）等に記載されている。
　プラスミドベクターやアデノウイルスベクター等を用いる場合、遺伝子導入は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができる。2種以上の発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、導入操作は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上（たとえば3回又は4回）繰り返して行うことができる。
　尚、アデノウイルスやプラスミドを用いる場合でも、導入遺伝子が染色体に組み込まれることがあるので、結局はサザンブロットやPCRにより染色体への遺伝子挿入がないことを確認する必要がある。そのため、上記Cre－loxPシステムのように、いったん染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、該遺伝子を除去する手段を用いることは好都合であり得る。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクター若しくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature, 458：771－775（2009）、Woltjen et al., Nature, 458：766－770（2009）に開示されている。
　別の好ましい非組込み型ベクターとして、染色体外で自律複製可能なエピソーマルベクターが挙げられる。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797－801（2009）に開示されている。必要に応じて、エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素の5’側及び3’側にloxP配列を同方向に配置したエピソーマルベクターに初期化遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、これを体細胞に導入することもできる。
　該エピソーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA－1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。
　また、エピソーマル発現ベクターは、初期化遺伝子の転写を制御するプロモーターを含む。該プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが用いられ得る。また、エピソーマル発現ベクターは、前記と同様に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子などをさらに含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　エピソーマルベクターは、例えばリポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。具体的には、例えばScience, 324: 797－801 (2009)に記載される方法を用いることができる。
　iPS細胞から初期化遺伝子の複製に必要なベクター要素が除去されたか否かの確認は、該ベクターの一部をプローブ又はプライマーとして用い、該iPS細胞から単離したエピソーム画分を鋳型としてサザンブロット分析又はPCR分析を行い、バンドの有無又は検出バンドの長さを調べることにより実施することができる。エピソーム画分の調製は当該分野で周知の方法を用いて行えばよく、例えば、Science, 324: 797－801 (2009)に記載される方法を用いることができる。
　核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への導入は、該物質を適当な濃度で水性若しくは非水性溶媒に溶解し、ヒト又はマウスより単離した体細胞の培養に適した培地（例えば、約5～20％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約0.1 nM～約100 nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
（d）iPS細胞の樹立効率改善物質
　従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化物質に加え、これら樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
　iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸（VPA）（Nat. Biotechnol., 26（7）：795-797（2008））、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNA及びshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標）（Millipore）、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1（OriGene）等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’－azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26（7）：795-797（2008））、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294（Cell Stem Cell,2：525-528（2008））等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNA及びshRNA（例、G9a siRNA（human）（Santa Cruz Biotechnology）等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist（例えばBayk8644）（Cell Stem Cell, 3, 568-574（2008））、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNA及びshRNA（Cell Stem Cell, 3, 475-479（2008））、UTF1（Cell Stem Cell, 3, 475-479（2008））、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135（2008））、2i／LIF（2iはmitogen-activated protein kinase signalling及びglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6（10）, 2237-2247（2008））等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNA又はshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
　尚、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質及びiPS細胞の樹立効率改善物質の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。
　iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が（a）タンパク性因子である場合、（b）該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは（c）低分子化合物である場合に応じて、それぞれ上記したように実施することができる。
　iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化物質がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
（e）培養条件による樹立効率の改善
　体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5～10％ CO2／95～90％大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18％以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15％以下（例、14％以下、13％以下、12％以下、11％以下など）、10％以下（例、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下など）、又は5％以下（例、4％以下、3％以下、2％以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1％以上（例、0.2％以上、0.3％以上、0.4％以上など）、0.5％以上（例、0.6％以上、0.7％以上、0.8％以上、0.9％以上など）、又は1％以上（例、1.1％以上、1.2％以上、1.3％以上、1.4％以上など）である。
　細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Thermo scientific社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用CO2インキュベーターを用いることができる）。
　低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されない。開始時期は、体細胞への核初期化物質の接触より前であっても、後であってもよく、該接触と同時であってもよい。例えば、体細胞に核初期化物質を接触させた直後から、あるいは接触後一定期間（例えば、1ないし10（例、2、3、4、5、6、7、8又は9）日）おいた後に低酸素条件下で培養することが好ましい。
　低酸素条件下で細胞を培養する期間も、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、例えば3日以上、5日以上、7日以上又は10日以上で、50日以下、40日以下、35日以下又は30日以下の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。低酸素条件下での好ましい培養期間は、雰囲気中の酸素濃度によっても変動し、当業者は用いる酸素濃度に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。また、一実施態様において、iPS細胞の候補コロニーの選択を、薬剤耐性を指標にして行う場合には、薬剤選択を開始する迄に低酸素条件から正常酸素濃度に戻すことが好ましい。
　さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期及び好ましい培養期間は、用いられる核初期化物質の種類、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率などによっても変動する。
　核初期化物質（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）及び／又は幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073－1085（1990））等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1～10日後）から開始してもよい。
　iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3／4など、好ましくはNanog又はOct3／4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β－ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676（2006））、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita et al., Nature, 448, 313-317（2007））等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872（2007）に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。核初期化物質としてOct3／4、Klf4及びSox2の3因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがES細胞と比較して遜色のない高品質のiPS細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくiPS細胞を樹立することが可能である。
　選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（若しくはOct3／4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）及び目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確性を期すために、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
（iii）ナイーヴヒトES及びiPS細胞
　胚盤胞期胚から誘導される従来のヒトES細胞は、マウスES細胞と非常に異なる生物学的（形態的、分子的及び機能的）特性を有する。マウス多能性幹細胞は、2つの機能的に区別される状態、即ちLIF依存的なES細胞と、bFGF依存的なエピブラスト幹細胞（EpiSC）とで存在し得る。分子学的解析から、ヒトES細胞の多能性状態は、マウスES細胞のそれではなく、むしろマウスEpiSCのそれに類似していることが示唆されている。最近、LIFの存在下にOct3／4、Sox2、Klf4、c－Myc及びNanogを異所的に誘導するか（Cell Stem Cells, 6：535－546, 2010参照）、LIF並びにGSK3β及びERK1／2経路阻害剤と組み合わせて、Oct3／4、Klf4及びKlf2を異所的に誘導する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, オンライン公開doi／10.1073／pnas.1004584107参照）ことにより、マウスES細胞様の多能性状態にあるヒトES及びiPS細胞（ナイーヴヒトES及びiPS細胞とも呼ばれる）が樹立されている。これらのナイーヴヒトES及びiPS細胞は、それらの多能性が従来のヒトES及びiPS細胞に比べてより未熟であるため、本発明のための出発材料として好適であり得る。
（2）多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導
　分化誘導用の基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS-A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、最小必須培地（MEM）、Eagle MEM培地、αMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、DMEM／F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
　培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。無血清培地（SFM）とは、未処理又は未精製の血清をいずれも含まない培地を意味し、従って、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する培地が挙げられ得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、ヒト血清など）の濃度は、0～20％、好ましくは0～5％、より好ましくは0～2％、最も好ましくは0％（すなわち、無血清）であり得る。SFMは任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物等）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2－メルカプトエタノール、3’－チオグリセロールあるいはこれらの均等物などを適宜含有する物質が挙げられ得る。かかる血清代替物は、例えば、WO 98／30679に記載の方法により調製できる。また、より簡便にするため、市販のものを利用できる。かかる市販の物質としては、Knockout（商標）Serum Replacement（KSR）、Chemically－defined Lipid concentrated、及びGlutamax（Invitorogen）が挙げられる。
　培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。本発明の方法により、原腸陥入前のエピブラスト細胞と同等のEpiLCが製造される限り、添加物は特に限定されないが、例えば、成長因子（例えば、インスリンなど）、ポリアミン類（例えば、プトレシンなど）、ミネラル（例えば、セレン酸ナトリウムなど）、糖類（例えば、グルコースなど）、有機酸（例えば、ピルビン酸、乳酸など）、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸（NEAA）、L－グルタミンなど）、還元剤（例えば、2－メルカプトエタノールなど）、ビタミン類（例えば、アスコルビン酸、d－ビオチンなど）、ステロイド（例えば、［ベータ］－エストラジオール、プロゲステロンなど）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシンなど）、緩衝剤（例えば、HEPESなど）、栄養添加物（例えば、B27 supplement、N2 supplement、StemPro－Nutrient Supplementなど）を挙げることができる。各添加物は自体公知の濃度範囲で含まれることが好ましい。
　本発明のEpiLCの製造方法において、多能性幹細胞は、フィーダー細胞の存在下又は不在下にて培養されてよい。フィーダー細胞は、本発明の方法によりEpiLCが製造され得る限り、特に限定されない；ESC、iPSCなどの多能性幹細胞の培養に使用するために自体公知のフィーダー細胞を使用することができる；例えば、線維芽細胞（マウス胚性線維芽細胞、マウス線維芽細胞株STOなど）が挙げられ得る。フィーダー細胞は、自体公知の方法、例えば、放射線（ガンマ線など）、抗癌剤（マイトマイシンCなど）での処理などにより不活性化されていることが好ましい。しかし、本発明の好ましい実施態様において、多能性幹細胞は、無フィーダー条件下で培養される。
　多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導用培地（培地A）は、基本培地にアクチビンAを必須の添加物として含有する。アクチビンAの濃度は、例えば、約5 ng／ml以上、好ましくは約10 ng／ml以上、より好ましくは約15 ng／ml以上、また、例えば、約40ng／ml以下、好ましくは約30 ng／ml以下、より好ましくは25 ng／ml以下である。
　培地Aには、bFGF及び／又はKSRがさらに含有されていることが好ましい。塩基性FGF及びKSRは、有効濃度範囲で存在する場合にEpiLCの誘導効率を顕著に増大させる。bFGFの濃度は、例えば、約5 ng／ml以上、好ましくは約7.5 ng／ml以上、より好ましくは約10 ng／ml以上であり、また、例えば、約30 ng／ml以下、好ましくは約20 ng／ml以下、より好ましくは約15 ng／ml以下である。KSRの濃度は、例えば、約0.1 w／w％以上、好ましくは約0.3 w／w％以上、より好ましくは約0.5 w／w％以上であり、また、例えば、約5 w／w％以下、好ましくは約3 w／w％以下、より好ましくは約2 w／w％以下である。
　特に好ましい態様においては、培地Aは基本培地に加えて、アクチビンA、bFGF及びKSRを含有する。これらの成分の適切な濃度は、アクチビンAについては約10～約30 ng／ml、好ましくは約15～約25 ng／ml、bFGFについては約7.5～約20 ng／ml、好ましくは約10～約15 ng／ml、KSRについては約0.3～約3 w／w％、好ましくは約0.5～約2 w／w％の範囲に亘って選択することができる。
　培地Aに含まれるアクチビンA及びbFGFは、そのソースに関して限定を受けず、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット、イヌなど）の細胞から単離及び精製されてよい。培養に供する多能性幹細胞と同種のアクチビンA及びbFGFを使用することが好ましい。アクチビンA及びbFGFは、化学的に合成されてもよく、無細胞翻訳系を用いて生化学的に合成されてもよく、或いは各タンパク質をコードする核酸を有する形質転換体から製造されてもよい。アクチビンA及びbFGFの組換え産物は市販されている。
　多能性幹細胞をEpiLCに誘導するために使用される培養器は、特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられ得る。培養器は細胞接着性であり得る。細胞接着性の培養器は、培養器表面の細胞への接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ECM）などの任意の細胞接着用基質でコートされたものであり得る。細胞接着用基質は、多能性幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。細胞接着用基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－L－リジン、ポリ-D-リジン、ポリ-L-オルニチン、ラミニン、及びフィブロネクチン並びにそれらの混合物、例えばマトリゲル、並びに溶解細胞膜調製物（lysed cell membrane preparations）が挙げられる（Klimanskaya I et al 2005. Lancet 365：p1636-1641）。
　この培養において、多能性幹細胞を上記培養器上に播き、例えば、約104～105細胞／cm2、好ましくは約2～8×104細胞／cm2の細胞密度とし、1～10％ CO2／99～90％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約30～40℃、好ましくは約37℃で、3日未満、好ましくは約2日間（例えば、48±12時間、好ましくは48±6時間）培養する。培養の結果、扁平なエピブラスト様構造を有する細胞が一様に現れる。
　EpiLCへの分化の事実は、例えば、EpiLC及び／又は多能性幹細胞のマーカー遺伝子の発現レベルをRT－PCRにより分析することにより確認できる。本発明のEpiLCは、E5.5～E6.0のエピブラスト様（原腸陥入前エピブラスト様）状態にある細胞を意味する。より詳細には、EpiLCは、以下の特性のいずれか又は両方を有する細胞として定義される：
（1）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つの遺伝子発現の上昇、
（2）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの遺伝子発現の低下。
　従って、EpiLCへの分化の事実は、培養により得られた細胞中、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つ、並びに／又はGata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの発現レベルを測定し、分化誘導前の多能性幹細胞のものと発現レベルを比較することにより確認できる。
　より好ましくは、本発明のEpiLCは、以下の特性を有する：
（1）Oct3／4の持続的な遺伝子発現;
（2）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Sox2及びNanogの遺伝子発現の低下;
（3）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bの遺伝子発現の上昇;及び
（4）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1の遺伝子発現の低下。
　上述のとおり、好ましい態様において、本発明の培地Aは、アクチビンA、bFGF及びKSRを含有する。従って、本発明はまた、アクチビンA、bFGF及びKSRを含む、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導用試薬キットも提供する。これらの成分は、水又は適当な緩衝液中に溶解した形態で提供されてもよく、凍結乾燥粉末として提供され、用時適当な溶媒に溶解して用いることもできる。また、これらの成分はそれぞれ単独の試薬としてキット化されていてもよいし、互いに悪影響を与えない限り、2種以上を混合して1つの試薬として提供することもできる。
　本発明者らは、一過性ではあるが、原腸陥入前エピブラスト細胞と同等の特性を有するEpiLCを製造することに初めて成功した。エピブラストは、生殖細胞系列以外の体細胞系列の前駆細胞でもあるので、このようにして得られたEpiLCは、生殖細胞系列だけでなく、他の種々の細胞系列を誘導するための出発細胞物質して使用できる。それらは、多能性細胞生物学において、重要であるが殆ど理解されていない主題である、ICMのエピブラスト分化の基礎となる遺伝的及びエピジェネティックなメカニズムの調査にも有用であり得る。特定の系統のための中間体として、ESC又はiPSCからのEpiLCの派生（derivation）は、非常に直接的なプロセスであり、系統の分化決定（lineage specification）をin vitroで再構成するための新規ストラテジーを提供する。
（3）EpiLCからPGC様細胞への分化誘導
　このようにして得られたEpiLCをBMP4及びLIFの存在下で培養することにより、PGC様細胞へと分化誘導することができる（Cell, 137, 571－584（2009））。従って、本発明の第二の側面は、上記（2）の方法により得られたEpiLCを介して、多能性幹細胞からPGC様細胞を製造する方法に関する。すなわち、該方法は、
I）上記（2）に記載のいずれかの方法に従って多能性幹細胞からEpiLCを製造する工程；及び
II）工程I）で得られたEpiLCをBMP4及びLIFの存在下で培養する工程
を含む。
　工程II）での分化誘導用基本培地としては、工程I）で使用するために例示した基本培地が同様に好ましく使用される。正常な精子形成に貢献できるPGC様細胞が本発明の方法により製造できる限り、培地は、工程I）で使用するために例示した添加物と同じ添加物を含有してよい。
　培地は、血清含有培地又は無血清培地（SFM）であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、ヒト血清など）の濃度は、0～20％、好ましくは0～5％、より好ましくは0～2％、最も好ましくは0％（すなわち無血清）であり得る。SFMは、KSRなど任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくともよい。
　EpiLCからPGC様細胞への分化誘導用培地（培地B）は、基本培地の必須添加物として、骨形成タンパク質4（bone morphogenetic protein 4）（BMP4）及び白血病阻止因子（leukemia inhibitory factor）（LIF）を含有する。BMP4の濃度は、例えば、約100 ng／ml以上、好ましくは約200 ng／ml以上、より好ましくは約300 ng／ml以上である。また、BMP4の濃度は、例えば、約1,000 ng／ml以下、好ましくは約800 ng／ml以下、より好ましくは600 ng／ml以下である。LIFの濃度は、例えば、約300 U／ml以上、好ましくは約500 U／ml以上、より好ましくは約800 U／ml以上である。また、LIFの濃度は、例えば、約2,000 U／ml以下、好ましくは約1,500 U／ml以下、より好ましくは1,200 U／ml以下である。
　培地Bは、幹細胞因子（SCF）、骨形成タンパク質8b（BMP8b）及び上皮成長因子（EGF）から選択される少なくとも1つの添加物をさらに含有することが好ましい。SCF、BMP8b及びEGFは、有効濃度範囲で存在した場合に、PGC様細胞がBlimp1－及びStella－陽性状態で維持される期間を著しく延長する。SCFの濃度は、例えば、約30 ng／ml以上、好ましくは約50 ng／ml以上、より好ましくは約80 ng／ml以上である。また、SCFの濃度は、例えば、約200 ng／ml以下、好ましくは約150 ng／ml以下、より好ましくは約120 ng／ml以下である。BMP8bの濃度は、例えば、約100 ng／ml以上、好ましくは約200 ng／ml以上、より好ましくは約300 ng／ml以上である。また、BMP8bの濃度は、例えば、約1,000 ng／ml以下、好ましくは約800 ng／ml以下、より好ましくは600 ng／ml以下である。EGFの濃度は、例えば、約10 ng／ml以上、好ましくは約20 ng／ml以上、より好ましくは約30 ng／ml以上である。また、EGFの濃度は、例えば、約100 ng／ml以下、好ましくは約80 ng／ml以下、より好ましくは約60 ng／ml以下である。
　特に好ましい実施態様において、培地Bは、基本培地に加えてBMP、LIF、SCF、BMP8b及びEGFを含有する。これら成分の濃度は、BMP4については約200～800 ng／ml、好ましくは約300～600 ng／ml、LIFについては約500～1500 U／ml、好ましくは約800～1,200 U／ml、SCFについては約50～150 ng／ml、好ましくは約80～120 ng／ml、BMP8bについては約200～800 ng／ml、好ましくは約300～600 ng／ml、EGFについては約20～80 ng／ml、好ましくは約30～60 ng／mlの範囲に亘って適宜選択され得る。
　培地Bに含有されるBMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFは、そのソースに関して特に限定されず、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット、イヌなど）の細胞から単離及び精製されてよい。培養に供するEpiLCと同種のBMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFを使用することが好ましい。BMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFは、化学的に合成されてもよく、無細胞翻訳系を用いて生化学的に合成されてもよく、或いは各タンパク質をコードする核酸を有する形質転換体から製造されてもよい。BMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFの組換え産物は市販されている。
　この培養において、自体公知の細胞非接着性又は低接着性培養器にEpiLCを播種し、例えば、約3～10×104細胞／mL、好ましくは約4～8×104細胞／mLの細胞密度とし、1～10％CO2／99～90％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約30～40℃、好ましくは約37℃で、約4～10日間、好ましくは約4～8日間、より好ましくは約4～6日間、さらに好ましくは約4日間培養する。
　PGC様細胞への分化の事実は、例えば、RT－PCRなどによりBlimp1の発現を分析することによって確認できる。さらに必要に応じて、他の遺伝子や細胞表面抗原の発現を調べることもできる。他の遺伝子の例にはStellaが挙げられる。Blimp1-及び／又はStella-プロモーターの制御下にある蛍光タンパク質遺伝子を有する多能性幹細胞を出発物質として使用する場合には、PGC様細胞への分化の事実はFACS分析により確認できる。ヒト又は他の非マウス哺乳動物に由来するESC又はiPSCなど、多能性幹細胞が適切なトランスジェニックレポーターを有さない場合には、PGC様細胞の分化の事実は、PGC様細胞に特異的に発現する1種以上の細胞表面抗原を用いて、FACS分析などにより確認することが好ましい。細胞表面抗原として、好ましくはSSEA-1及びインテグリン-β3が例示される。
　前記工程I）及びII）により製造される、多能性幹細胞に由来するPGC様細胞を含む細胞集団は、PGC様細胞の精製された集団であってよく、PGC様細胞以外に1種以上の細胞が共存してもよい。ここで、「PGC様細胞」は、分化誘導前のEpiLCに比してBlimp1及び／又はStellaの発現の上昇を示し、正常な精子形成に貢献でき、免疫不全マウスに移植された場合にテラトーマを形成しない細胞として定義される。上述のとおり、Blimp1-及び／又はStella-プロモーターの制御下にある蛍光タンパク質遺伝子を有する多能性幹細胞を出発物質として使用してPGC様細胞を誘導する場合、セルソーターを用いて、前記工程II）で得られた細胞集団をソーティングすることにより、Blimp1-及び／又はStella-陽性PGC様細胞を容易に単離し精製できる。PGC様細胞は、マーカーとして、Blimp1及びStellaとともに発現が増加する遺伝子（例、Nanog）の制御下にあるレポーターを用いてFACSにより単離し精製することもできる。
２．PGC様細胞の維持増幅
　上記のようにして得られるPGC様細胞は、精子幹細胞様の細胞への分化に先立って、増幅させることができる。PGCの増幅を支持する薬剤として、フォルスコリンやレチノイン酸（RA）シグナリングアゴニストが知られている。フォルスコリンは、アデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞内cAMPレベルを上昇させる。本発明者らは以前、ホスホジエステラーゼ4（PDE4）阻害薬がPGC様細胞の増幅を支持することを見出した。PDE4阻害薬はフォルスコリンとは異なる機序（cAMPの加水分解を阻害すること）で細胞内cAMPレベルを上昇させる。そこで、本発明者らは、PDE4阻害薬とフォルスコリンとを併用することにより、相乗的に（約50倍まで）PGC様細胞の増幅を促進させることに成功した（EMBO J., 36(13): 1888-1907 (2017)）。
　従って、PGC様細胞の維持増幅は、例えば、EpiLCからの分化誘導開始日をd0として、d4～d10、好ましくはd4～d8、より好ましくはd4～d6、さらに好ましくは約d4のPGC様細胞を、PDE4阻害薬の存在下、好ましくは、さらにフォルスコリンの存在下で培養することにより実施することができる。基本培地としては、PSCからEpiLCへの分化誘導に関して例示した培地を、同様に使用することができる。培地には、血清又は血清代替物を添加することが好ましい。ここで用いられる血清又は血清代替物の種類及び添加濃度は、PSCからEpiLCへの分化誘導に関して例示されたものが、同様に使用可能である。また、培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。そのような添加物としては、PGC様細胞の維持増幅を支持し得る限り、特に制限されず、PSCからEpiLCへの分化誘導に関して例示されたものが、同様に使用可能である。例えば、本工程に使用される培地として、10% Knockout Serum Replacement（KSR）、2.5% 胎仔ウシ血清（FCS）、0.1 mM NEAA、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1 mM 2-メルカプトエタノール、100 U/ml ペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン、2mM L-グルタミンを含むGMEM培地等が挙げられるが、これに限定されない。
　上記培地に添加されるPDE4阻害薬としては、PDE4の酵素活性、即ち、cAMPの加水分解活性を阻害し得る物質であれば特に制限はないが、好ましくはPDE4の選択的阻害薬（ホスホジエステラーゼ（PDE）以外の酵素だけでなく、PDE4以外のPDEsも阻害しない）である。例えば、イブジラスト、S-(+)-ロリプラム、ロリプラム、GSK256066、シロミラスト等が挙げられるがこれに限定されない。
　PDE4阻害薬の濃度は、例えば、約0.1 μM以上、好ましくは約0.5 μM以上、より好ましくは約1 μM以上である。また、PDE4阻害薬の濃度は、例えば、約100 μM以下、好ましくは約50 μM以下、より好ましくは30 μM以下である。好ましい実施態様において、PDE4阻害薬の濃度は、約0.5～50 μM、好ましくは約1～30 μM範囲内で適宜選択され得る。
　上記培地に添加されるフォルスコリンの濃度は、例えば、約0.1 μM以上、好ましくは約0.5 μM以上、より好ましくは約1 μM以上である、また、フォルスコリンの濃度は、例えば、約100 μM以下、好ましくは約50 μM以下、より好ましくは30 μM以下である。好ましい実施態様において、フォルスコリンの濃度は、約0.5～50 μM、好ましくは約1～30 μM範囲内で適宜選択され得る。
　PGC様細胞の維持増幅用培地には、SCFがさらに含有されていることが好ましい。SCFの濃度は、例えば、約30 ng／ml以上、好ましくは約50 ng／ml以上、より好ましくは約80 ng／ml以上である。また、SCFの濃度は、例えば、約200 ng／ml以下、好ましくは約150 ng／ml以下、より好ましくは約120 ng／ml以下である。好ましい実施態様において、SCFの濃度は、約50～150 ng／ml、好ましくは約80～120 ng／mlの範囲内で適宜選択され得る。
　特に好ましい実施態様においては、PGC様細胞の維持増幅用培地は、10 μM PDE4阻害薬、10 μM フォルスコリン及び100 ng/ml SCFを含有する。尚、他のPGC増殖刺激因子と併用するとPGC様細胞のEGCへの脱分化を促進する可能性があるため、PGC様細胞の維持増幅用培地にはLIFを添加しないことが好ましい場合がある。
　PGC様細胞の維持増幅方法において、PGC様細胞は、フィーダー細胞の存在下又は非在下にて培養されてよい。フィーダー細胞の種類は特に限定されないが、自体公知のフィーダー細胞を使用することができる。例えば、線維芽細胞（マウス胚性線維芽細胞、マウス線維芽細胞株STOなど）が挙げられ得る。フィーダー細胞は、自体公知の方法、例えば、放射線（ガンマ線など）、抗癌剤（マイトマイシンCなど）での処理などにより不活性化されていることが好ましい。フィーダー細胞がPDE4阻害薬及び／又はフォルスコリンに対して脆弱である場合には、予めこれらの添加物の存在下で数世代フィーダー細胞を継代培養して、該添加物に馴化させておくことが望ましい。
　PGC様細胞の維持増幅のために使用される培養器は特に限定されず、例えばPSCからEpiLCへの分化誘導において例示されたものが、同様に使用可能である。
　この培養において、PGC様細胞を（フィーダー細胞が予め播種された）培養器上に播き、例えば、約104～105細胞／cm2、好ましくは約2～8×104細胞／cm2の細胞密度とし、1～10％ CO2／99～90％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約30～40℃、好ましくは約37℃で、3～9日間、好ましくは4～8日間、より好ましくは5～7日間培養する。培養の結果、扁平なコロニーが形成され、Blimp1及びStellaを強発現し続け、糸状及び葉状仮足を伴う運動性細胞の特徴を示し、移動期のPGCの特性を維持する。
３．始原生殖細胞様細胞（PGCLC）からの精子幹細胞様の細胞の製造
(1) 再構成精巣の形成（工程(1)）
　本工程では、例えば、上記の方法により得られたPGCLCを、生殖巣体細胞と浮遊培養にて共培養し、再構成精巣を得る。用いるPGCLCが不均一な細胞集団である場合、例えば、FACSを用いて、SSEA-1陽性及びインテグリン-β3陽性の細胞分画を単離して用いることが好ましい。PGCLCとしては、EpiLCからの分化誘導開始日をd0として、d4～d10、好ましくはd4～d8、より好ましくはd4～d6、さらに好ましくは約d4の細胞が用いられ得る。また、PGCLCとして、上記２．で詳述した方法により、3～9日間、好ましくは4～8日間、より好ましくは5～7日間維持増幅したPGCLCを用いてもよい。
　ここで「生殖巣」とは、生殖細胞とそれらを支持する体細胞からなる構造体をいう。母胎で、胎児（仔）の始原生殖細胞（PGC）におけるオス、メスの性分化が始まる頃（マウスでは受精後12.5日齢（E12.5））までに形成される。PGCはオス、メス各々に特徴的な生殖巣の体細胞に包まれながら、配偶子（精子や卵子）へと分化する。本発明では、PGCが前精原細胞となる時点の細胞環境を模倣すべく、この時期の生殖巣（例えば、マウスの場合、E12.0～E13.0、好ましくは約E12.5）が用いられる。生殖巣は、共培養するPGCLCと同種の哺乳動物から自体公知の方法により採取することができる。生殖巣から体細胞を単離する手法としては、例えば、生殖巣をトリプシン処理等により単一細胞に解離し、培地又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）等の等張緩衝液に再懸濁した後、FACSやMACSを用いて、PGCの細胞表面マーカー陽性細胞、例えば、SSEA-1陽性細胞を除去する方法等が挙げられるが、これに限定されない。
　次いで、PGCLCと生殖巣体細胞とを浮遊培養にて共培養する。ここで「浮遊培養」とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させずに培養することを意味し、細胞や細胞塊が底面に触れていても、培養液を軽く揺らすと細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでくるような状態で培養することも、浮遊培養に包含される。浮遊培養の際は、培養容器として、例えば、底表面が未処理のプラスティックディッシュや、細胞の基質への接着を阻止するための接着阻止用コーティング剤（ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）等）でコートしたものを用いることが好ましい。例えば、1個の再構成精巣あたり、103～105個、好ましくは約104個のPGCLCと、2×103～1×106個、好ましくは2～10×104個、さらに好ましくは約4×104個の生殖巣体細胞とを、例えばPGCLC:生殖巣体細胞=1:2～1:15、1:2～1:10、好ましくは1:3～1:5、より好ましくは約1:4の割合で培地に添加し、静置培養することができる。本工程に使用される培地は、基本培地として、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導に関して例示した培地を、同様に使用することができる。培地には、血清又は血清代替物を添加することが好ましい。ここで用いられる血清又は血清代替物の種類及び添加濃度は、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導に関して例示されたものが、同様に使用可能である。また、培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。そのような添加物としては、PGCLCと生殖巣体細胞とが自己組織化して精巣を模倣した凝集塊（再構成精巣）を形成し得る限り、特に制限されず、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導に関して例示されたものが、同様に使用可能である。例えば、この再構成精巣形成工程（本工程(1)）に使用される培地として、10% Knockout Serum Replacement（KSR）を含むαMEM培地等が挙げられるが、これに限定されない。本工程に先立ってPGCLCの維持増幅培養を行った場合には、当該維持増幅培養に使用した培地と同一組成の培地を用いることもできる。
　本工程(1)の浮遊培養は、例えば、1～10％CO2／99～90％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約30～40℃、好ましくは約37℃で、約1～5日間、好ましくは約1～3日間、より好ましくは約2～3日間、さらに好ましくは約2日間実施される。
(2) 精子幹細胞様の細胞の誘導（工程(2)）
　本工程では、工程(1)で得られた再構成精巣を気液界面培養することにより、該再構成精巣中に精子幹細胞様の細胞を誘導する。「気液界面培養」とは、セルカルチャーインサートの多孔膜上に細胞を播種し、上側を気相とし、下側から膜を介して培地を供給する培養法をいう。工程(1)で得られた再構成精巣を、培養容器（例、24ウェルプレート）に挿入したセルカルチャーインサートの多孔膜上に移し、膜の下側に培地を添加して気液界面培養を実施する。用いる培地は、工程(1)と同じものであってよい。培養は、1～10％CO2／99～90％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約30～40℃、好ましくは約34～37℃で、約1～8週間、好ましくは約2～8週間、より好ましくは約2～4週間、さらに好ましくは約3週間実施される。精子幹細胞様の細胞の誘導に先立ってPGCLCの維持増幅を行った場合には、本工程の培養期間を、例えば約1～2週間、好ましくは約10～14日間とすることもできる。好ましい一実施態様においては、培養温度は本工程を通じて約34℃である。別の実施態様として、最初の2週間約37℃で培養した後、34℃で培養する方法も用いることができる。
　本工程の間、再構成精巣では、4日目頃から精細管様の構造が出現し始め、7日目頃にはそれらが集合してネットワークを形成するようになる。精細管様構造の外側のPGCLC由来細胞は消失し、大多数のPGCLC由来細胞は精細管様ネットワークの内側に局在するようになる。その後、再構成精巣は、精細管様ネットワークをさらに発達させながら安定に維持され、該ネットワークの内側のPGCLC由来細胞の数はさらに増加する。14日目には、ほとんどのPGCLC由来細胞は精細管の内腔区画内に存在し、21日目には、それらの多くは基底区画に見られるようになる。
　14日目には、PGCLC由来細胞の多くは、生殖腺PGCにおいて発現し始める生殖細胞マーカーであるDDX4（MVH）陽性となるが、前精原細胞において周産期に発現が始まる精子幹細胞マーカーであるPLZF（ZBTB16）は陰性である。21日目になると、PGCLC由来細胞の大部分がDDX4陽性となり、その一部はDDX4／PLZF二重陽性となる。さらに長期間培養を続けると、PGCLC由来細胞の一部は、減数分裂開始の重要なマーカーであるSCP3陽性となるが、本工程の条件下では、減数分裂を完了するまでには至らない。
４．精子幹細胞様の細胞を含む再構成精巣からの生殖系列幹細胞様細胞（GSCLC）の製造
　本発明はまた、上記のようにして得られる精子幹細胞様の細胞を含む再構成精巣から、精子幹細胞の長期培養細胞株である生殖系列幹細胞（GSC）と同等の特性を有する細胞、即ち、生殖系列幹細胞様細胞（GSCLC）の製造方法を提供する。当該方法は、上記工程(1)及び(2)により得られる精子幹細胞様の細胞を含む再構成精巣から、例えば、酵素処理（例、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、トリプシン）及びピペッティング操作により精子幹細胞様の細胞を単一細胞に解離させ、精子幹細胞からGSCを誘導し得る条件下で培養することを含む。精子幹細胞様の細胞は、例えば、CD9、SSEA1、INTEGRINβ1、INTEGRINα6、KIT、GFRα1等の細胞表面マーカーや、PGCLCがレポーター細胞の場合は、該レポーターを指標として、FACS等により生殖巣体細胞由来の細胞と分離することもできるが、体細胞と精子幹細胞様の細胞との培養容器への接着性の差を利用して数度の継代を行うことにより、簡便に富化することができる。例えば、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル、ラミニン等でコーティングした培養容器を用いて、解離した再構成精巣由来の細胞を播種し、例えば6～24時間毎、好ましくは約12時間毎に、新しい培養容器に浮遊細胞を継代することにより、接着性の高い体細胞は培養容器表面に残存するため徐々に除去され、精子幹細胞様の細胞が富化される。
　本工程で使用される培地は、精子幹細胞からのGSCの誘導を支持し得るものであれば特に制限はないが、例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）及び白血病抑制因子（LIF）、好ましくはさらに上皮細胞成長因子（EGF）及び／又は塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含有する培地が挙げられる。当該培地のより詳細な組成については、WO2004/092357やKanatsu-Shinohara, M. et al., Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003) の記載を参照することができる。より具体的には、好ましい一実施態様として、後述の実施例に記載されるGSC/GSCLC培地を挙げることができる。
　上記のようにして富化された精子幹細胞様の細胞は、好ましくは、本工程の培養は、フィーダー細胞の存在下で培養される。フィーダー細胞としては、例えば、例えばマウス胎児線維芽細胞（MEF）等が好適に用いられる。富化された精子幹細胞様の細胞を、予めフィーダー細胞を播種した培養容器に、PGCLC由来細胞として、約103細胞以上の細胞密度で播種すれば、最初の2週間の間にGSC様のコロニーが増幅する。コロニーの直径が約500μm以上になれば、新しい培養容器に継代することができる。
　富化された精子幹細胞様の細胞の培養は、例えば、1～10％CO2／99～90％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約30～40℃、好ましくは約37℃で、約2週間以上、好ましくは約2か月以上実施される。
　以上のようにして得られるGSC様の細胞（GSCLC）は、以下の性質を有することを特徴とする。
(a) 単離されたPSC由来である
(b) (i) Ddx4、Daz1、Gfra1、Ret、Piwil2、Itga6、Kit、Plzf、Piwil4及びId4からなる群より選択される遺伝子、
　　(ii) CD9、SSEA1、INTEGRINβ1、INTEGRINα6、KIT及びGFRα1からなる群より選択される表面マーカー、並びに
　　(iii) PLZF及びID4からなる群より選択される転写因子
の発現レベルが、GSCと同等である
(c) GSCと同等の増殖速度で維持・増幅可能である
(d) 該GSCLCを成体精巣内に移植した場合、
　　(i) 移植細胞が定着した精細管に占めるGFRα1陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれと同等である、及び
　　(ii) 移植細胞が定着した精細管に占めるSCP3陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれよりも低い
(e) 該GSCLCを成体精巣内に移植して得られる精細胞を顕微授精した場合、正常な子孫を生じる
　このように、本発明のGSCLCは、鍵遺伝子、細胞表面マーカー及び転写因子の発現レベル、細胞の増殖速度、成体精巣内に移植した場合の精原細胞／精子幹細胞マーカー（GFRα1）陽性の精細管の出現率、正常な子孫を生じる能力において、従来公知のGSCと同等であるが、単離されたPSC由来である点、及び成体精巣内に移植した場合の減数母細胞（SCP3陽性）の出現率がGSCと比較して低い点において、生体内から採取した精子幹細胞から誘導されるGSCと相違する。
５．本発明のGSCLCの使用
　このようにして樹立された、多能性幹細胞に由来するGSCLCは種々の目的で使用することができる。例えば、レシピエント動物の精巣に移植されたGSCLCは、精巣、特に成体精巣での精子形成及び健常な子孫の創出に確実に貢献できるので、不妊、又は生殖組織の遺伝性疾患の治療に使用できる。
　GSCLCの精巣への移植は、WO 2004/092357及びBiol. Reprod., 69：612-616（2003）に記載の方法において、GSCの代わりにGSCLCを使用することにより実施できる。移植の結果、GSCLCから分化した精細胞（精子又は円形精細胞）は、自体公知のICSI又はROSI法により卵細胞と受精させることができ、得られた胚（例、2細胞期胚）を偽妊娠させた仮親の子宮又は卵管に移植することにより子孫を得ることができる。
　本発明のGSCLC（GSCLCを含む細胞集団を含む；以下同じ）は、常套手段に従って医薬上許容される担体と混合するなどして、非経口製剤、好ましくは、注射剤、懸濁剤又は点滴剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D－マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合しても良い。
　本発明の剤を水性懸濁剤として調製する場合、上記水性液の1つにGSCLCを約1.0×106～約1.0×107細胞／mLの細胞密度となるように懸濁させる。
　本発明の剤は、幹細胞の低温保存に通常使用される条件下で低温保存し、使用直前に融解することができる。
　このようにして得られる製剤は、安定で低毒性であるので、ヒトなどの哺乳動物に対して安全に投与することができる。投与方法は特に限定されないが、製剤は、精細管へと、注射又は点滴により投与されることが好ましい。男性不妊患者については、例えば、1回につきGSCLC量として約1.0×105～約1×107細胞量の剤を、約1～2週間隔で、1又は2～10回投与するのが通常、好都合である。
　本発明は、内部細胞塊から精子幹細胞までの雄性生殖細胞分化決定経路のin vitroでの再構成を初めて実証する。発生過程を反映するこのようなin vitro系は、生殖細胞の詳細な発生メカニズムの解明を促進するだけでなく、不妊及び遺伝性疾患発症のメカニズムの解明も促進するであろう。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
［実施例１］
（方法の概要）
ESCの培養とPGCLCの誘導
　ポリ-L-オルニチンおよびラミニン（20 ng / mL）でコーティングしたウェル（Hayashi et al., 2011; Hayashi and Saitou, 2013; Ying et al., 2008）上で、2i （PD0325901：0.4μM [Stemgent]; CHIR99021：3 μM（Stemgent））及びLIF（1,000 U/ml）を含むN2B27培地を用いて、AAGトランスジーンを有する胚性幹細胞（ESC）（C57BL/6 x 129/SvJcl）（Ohta et al., 2000）を培養した。ヒト血漿フィブロネクチン（16.7g / mL）でコーティングした12ウェルプレートのウェル上で、エピブラスト様細胞（EpiLC）培地（アクチビンA [20ng / mL]、bFGF [12 ng/mL]及びknockout serum replacement [KSR] [1％] [Thermo Fisher Scientific]を含むN2B27）を用いて、EpiLCを1.0 x 105 ESCから誘導した。EpiLC培地を毎日交換した。PGCLCは、PGCLC培地（15％KSR、0.1mM NEAA、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM 2-メルカプトエタノール、100U / mLペニシリン、0.1mg / mLストレプトマイシン、及び2mM L-グルタミン[100ng / mL]を含むGMEM[Invitrogen]、、BMP4 [500ng / mL] [R＆D Systems]、LIF [1,000U / mL] [Invitrogen]、SCF[100 ng/mL] [R&D Systems]、及びEGF [50 ng/mL] [R&D Systems]を用いた(4～6日間)）を用いて、低細胞結合U底96ウェルのリピジュア-コートプレート中、浮遊条件下で2.0 x 103 EpiLCから誘導した。
再構成精巣の作製と培養
　10% KSRを含むα-最小必須培地（α-MEM）(Invitrogen)を用いて、低細胞結合U底96ウェルのリピジュア-コートプレート中、浮遊条件下で、FACSにより収集したd4 PGCLC (10,000 細胞/再構成精巣)と、MACS（磁気活性化細胞分取を参照）により収集したE12.5生殖腺（ICR）の体細胞（40,000細胞/再構成精巣）とを凝集させた（37℃、5%CO2）。2日間の浮遊培養の後、ガラス毛細管を用いて0.4 μm 透明PET膜（Corning）を有する24ウェルプレート用のファルコン透過性支持体のウェルに凝集物を移した。気液界面培養（Sato et al., 2011）のため、各ウェルに350μLのα-MEM-10％KSRを補充した（Satoら、2011）。培地を毎週交換した。
再構成精巣からのGSCLCの誘導及び新生仔精巣からのGSCの誘導
　再構成精巣を、10分間、解離緩衝液（ディスパーゼ[1mg / mL] [Invitrogen]及びヒアルロニダーゼ [1 mg / mL] [Sigma、H3506]を含有するDMEM）に浸し、次いで周期的に（5分ごと）ピペッティングしながら、0.05％トリプシン-0.53 mM EDTAで15分間インキュベートし、これを10％FBSを含むDMEM中でクエンチし、続いて正確なピペッティングにより単一細胞に解離した。細胞懸濁液を1,200rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。増殖因子（下記参照）を含むGSC/GSCLC培養培地に細胞ペレットを懸濁し、細胞を0.1％（w / v）ゼラチンでコーティングした培養プレート上に播種した（細胞/再構成精巣を24ウェルプレートに移した）。体細胞はより容易に培養プレートに結合するので、体細胞を12時間毎に繰り返し継代することによりできるだけ除去した。2回または3回の継代後、残りのAAG（+）細胞を、増殖因子を含むGSC / GSCLC培地（下記参照）中のMEFを有するプレート上に移した。約1 × 103個以上のAAG（+）細胞/ウェルが播種された場合、最初の2週間にGSCLCコロニーが拡大した。直径が約500μmを超えるGSCLCコロニーが発生すると、それらを新しいウェルに継代し、約2ヶ月後にGSCLC細胞株を樹立した。対照GSC細胞株は、本質的に同じ手順を用いることにより、P7での新生仔（AAGを有する129/Sv x C57BL/6）の精巣から誘導した。GSC / GSCLC培養のための培地は、Kanatsu-Shinohara et al. (2003)に記載されたものを一部改変した： StemPro-34 SFM（Invitrogen）に、Stem Pro サプリメント、1％FBS、1 x Gluta-MAX-1（Invitrogen）、1 x 最小必須培地（MEM）ビタミン溶液（Sigma）、5 mg/mL AlbuMAX-II（Invitrogen）、5 × 10-5 M 2-メルカプトエタノール、1 x MEM非必須アミノ酸溶液（Invitrogen）、30 μg / mLピルビン酸、1 x ITS-G（Invitrogen）、100U/mLのペニシリン、0.1 mg/mL ストレプトマイシン、および増殖因子（組換えラットGDNF [10ng / mL] [R＆D Systems]、ヒトbFGF [10 ng/mL] [Invitrogen]、LIF/ESGRO [103U / mL] [Invitrogen]、及びマウスEGF [20ng] [Invitrogen]）を補充した。
ACCESSION NUMBER
　本明細書で報告したGSC1、2及びGSCLC1-4のRNA-seqデータ、GSC1、2、GSCLC1及び4のSC3-seqデータ、GSC1及びGSCLC1-3のWGBSデータ、並びにGSC2及びGSCLC4のWGBSデータのためのaccession numberは、それぞれNCBI GEO: GSE76245、GSE87341、 DDBJ: DRA004241 及びDRA005141である。
動物
　すべての動物実験は、京都大学の倫理ガイドラインに基づいて行った。Acro/Act-EGFP（AAG）トランスジェニックマウス（M. Okabeの贈与）(Nakanishi et al., 1999; Okabe et al., 1997)は、C57BL/6のバックグラウンドを大きく維持していた。SLC（Hamamatsu、Japan）から、W/Wv（WB×C57BL/6）、BDF1（C57BL/6×DBA/2）、ICRおよび129/SvJclマウスを購入した。腟栓を確認した日の正午を胎生期（E）0.5とした。
蛍光標識細胞分取（FACS）
　d4 PGCLCを含有する凝集物をPBSで洗浄し、0.05％トリプシン-0.53mM EDTAで7分間処理することにより単細胞に解離させ、10％FBSを含むDMEMでクエンチし、続いてピペッティングした。細胞懸濁液をナイロンセルストレーナ（直径40μm）に通して細胞塊を除去した。フロースルー細胞を1200rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）（Thermo Fisher Scientific、San Diego、CA）を含むPBSで懸濁し、それぞれPE及びAlexa Fluor 647をコンジュゲートした抗インテグリンβ3抗体（BioLegend）および抗SSEA1抗体（eBioscience）と氷上で15分間インキュベートした。PBS-0.1％BSAで洗浄した後、細胞を同じ緩衝液（1×106細胞/ ml）で懸濁し、フローサイトメーター（AriaIII：BD Biosciences）で選別した。
　GSCLC/GSCの表面マーカーの発現解析のために、0.05％トリプシン-0.53mM EDTAで4分間処理し、10％FBSを含むDMEMでクエンチし、その後ピペッティングすることにより、GSCLC/ GSCを単一細胞に解離させた。細胞懸濁液を1,200rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを0.1％BSAを含むPBSに懸濁させた（約1×106細胞を200 μlのPBS-0.1％BSAに懸濁した）。半量の懸濁液を一次抗体(Antibodies)で氷上で15分間染色した。残りの半分は、染色されていない対照を確立するために用いた。PBS-0.1％BSAで洗浄した後、各懸濁液を二次抗体(Antibodies)で氷上で15分間染色した。次いで、細胞をPBS-0.1％BSAで懸濁し、フローサイトメーター（AriaIII; BD Biosciences）で分析した。すべての分析において、AAG（+）細胞を使用前に選別した。
磁気活性化細胞分取(MACS)
　E12.5の雄性生殖腺を10％FBSを含むDMEM中で単離し、PBSで洗浄し、0.05％トリプシン-0.53mM EDTAにより単一細胞に解離した。細胞懸濁液をナイロンセルストレーナ（直径70μm）（Falcon）に通して細胞塊を除去した。フロースルー細胞を1200rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを0.5％BSAおよび2mM EDTAを含有するPBSに懸濁し、磁気ビーズ（Miltenyi Biotec、Bergisch、Gladbach、Germany）(Antibodies)をコンジュゲートした抗SSEA1抗体と氷上で15分間インキュベートした。細胞懸濁液をPBS-0.5％BSA-0.2mM EDTAで洗浄し、次いでMSカラム（Miltenyi Biotec）にアプライした。大部分のSSEA-1陽性PGCが除去されたフロースルー細胞を、PBS-0.5％BSA-0.2mM EDTAで洗浄し、αMEM-10％KSRで懸濁し、再構成精巣の作製のためにPGCLCと凝集させた。
PGCLC及びGSCLCの精巣への移植
　GSCおよびGSCLCを、0.05％トリプシン-0.53mM EDTAと4分間インキュベートすることにより単一細胞に解離させ、これを10％FBSを含むDMEMでクエンチした。細胞懸濁液をナイロンセルストレーナ（直径40μm）（Falcon）に通して細胞塊を除去し、フロースルー細胞を1,200rpmで5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを2.5×107細胞/ mlの濃度で、増殖因子を含まないGSC / GSCLC培地に懸濁した。PGCLCの移植のために、FACSにより収集したd4 PGCLCの10,000細胞を、5μlのGSC/GSCLC培地に懸濁させた。以前に記載されているように(Brinster and Avarbock, 1994; Brinster and Zimmermann, 1994)、約5μlの各ドナー細胞懸濁液を、成体WBB6F1 W/Wv（8週齢）レシピエントの精巣網内にシリンジを備えたピペットでを注入した。移植後8-10週間で移植された精巣を分析した。
細胞質内の精子注入（ICSI）および円形精細胞注入（ROSI）
　5IUのウマ絨毛性ゴナドトロピンを注入し、その後48時間後に5IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を2回注入することにより、BDF1メスで過剰排卵を誘導した。hCG注入の12時間後、卵管から卵丘 - 卵母細胞複合体を収集し、卵母細胞を0.1％ヒアルロニダーゼで処理することにより卵丘細胞から遊離させた。ICSIでは、ピエゾ駆動式マイクロマニピュレーター（Piezo-actuated micromanipulator）（Kimura and Yanagimachi、1995）を用いて精子をMII卵母細胞の細胞質に注入した。ROSIのために、丸い精細胞を受け取った卵母細胞を、5mMのSrCl2および2mMのEGTAを含むKSOM培地中で1時間培養した（Kishigami and Wakayama、2007）。ICSIまたはROSI後の2細胞期胚を、標準的な手順で0.5dpc偽妊娠ICRメスの卵管に移した。
組織学および免疫蛍光（IF）分析
　組織学的分析のために、移植細胞を有する精巣をBouin固定液で48時間固定し、70％エタノールで3回洗浄し、連続濃度のエタノールで脱水し、パラフィンに包埋した。組織を7μmの厚さに切断した。キシレン（3回）および段階的な連続のエタノールで脱パラフィンした後、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
　IF分析のために、再構成精巣を4％パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて氷上で2時間固定し、PBSで3回洗浄し、スクロース溶液の連続濃度（15％、30％）で置換し、OCT化合物(Sakura, Tokyo, Japan)中に埋め込み、凍結した後、-20℃で10μmの厚さに切断した。空気乾燥後、切片をPBSで3回洗浄し、ブロッキング緩衝液（5％BSAおよび0.1％Triton X-100を含有するPBS）中で30分間インキュベートし、次いで一次抗体(Antibodies)を含む染色緩衝液（1％BSAおよび0.1％Triton X-100を含有するPBS）で4℃、2時間反応させた。PBSで3回洗浄した後、サンプルを二次抗体(Antibodies)および1μg/ mlのDAPIを含有する染色緩衝液中で1時間インキュベートした。切片をPBSで3回洗浄し、Vectashieldマウンティング培地（Vector Laboratories）にマウントした。全ての試料を共焦点顕微鏡（Olympus FV1000）で分析した。
　GSC/GSCLCのIF分析のために、カバースリップ上で培養したGSC/GSCLCを室温で10分間3％PFAで固定し、次いでPBSで3回洗浄し、続いてメタノールで-30℃で2分間浸透させた。次いで、サンプルをPBSで2回洗浄し、室温で30分間10％BSAを含むPBSでブロックし、一次抗体（抗体）の組合せを含有する溶液（0.1％BSA含有PBS）と共に室温で2時間インキュベートした。次いで、サンプルをPBSで3回洗浄し、1次抗体(Antibodies)と1μg/ mlのDAPIとの組み合わせを含む溶液（0.1％BSAを含むPBS）と共に1時間インキュベートした。切片をPBSで3回洗浄し、Vectashieldマウンティング培地（Vector Laboratories）にマウントした。全ての試料を共焦点顕微鏡（Zeiss LSM780）で分析した。本実験で用いた抗体を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
アルカリホスファターゼ（AP）染色
　GSC培養条件下で直接培養したd4 PGCLCをPBSで2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで氷上で1時間固定した。0.1％Tween20（PBST）を含有するPBSで洗浄した後、d4 PGCLC由来のコロニーを室温でAP緩衝液中でインキュベートした。AP緩衝液は、N、N-ジメチルホルムアミド（Sigma）0.5mlにナフトールAS-MXリン酸二ナトリウム塩（Sigma）5mgとFast Red TR salt（Sigma）10mgを逐次溶解した後、濾過して調製した。適切な時点でPBSTにより反応を停止させた。
核型分析
　GSCs / GSCLCを60ng/ mlのデメコルシン（Sigma）を含む培地で6時間培養し、0.05％トリプシン-0.53mM EDTA中で4分間インキュベートすることにより単細胞に解離させ、10％FBSを含むDMEMでクエンチした。次いで、細胞を低張溶液（75mM KCL）で膨潤させ、Carnoy固定液で繰り返し処理（3回）することにより固定した。次いで、固定した細胞をエタノールで洗浄したガラススライド(Matsunami)に広げ、DAPIで染色した。核型イメージは、共焦点顕微鏡（Olympus FV1000）で分析することで得られ、染色体の数を数えた。
qPCR
　AAG蛍光に対するFACSによって収集したGSC / GSCLCのRNAを抽出し、メーカーの指示に従い、RNeasy Micro Kit（Qiagen、Hilden、Germany）を用いて精製した。精製した全RNAをSuperscriptIII（Invitrogen）により逆転写して、first-strand cDNAを生成し、これをPower SYBER Green（ABI、Foster City、CA）でqPCR分析に使用した。使用したプライマー配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA)
　COBRAは以前に報告されているように行った（Lee et al．，2009）。GSCs / GSCLCをAAG蛍光に対するFACSにより収集し、それらのゲノムDNAならびに野生型マウスのテールゲノムDNAを抽出し、各サンプルから精製した2μgのDNAを重亜硫酸塩処理に供した後、メーカーの指示に従い、Epitect Plus Bisulfite Kit（Qiagen）を用いて、精製した。ExTaq（TakaRa）を用いて、96℃30秒間、60℃1分間、72℃1分間の40サイクルのプロトコールで精製したDNAをPCRにより増幅した。使用したPCRプライマー配列は表２に示されている。増幅したDNAを、適切な制限酵素（New England BioLabs）-PhuI-HF（H19）、HhaI（Peg10）、TaqαI（Igf2r）、AciI（Meg3 IGおよびSnrpn）で消化し、消化した試料を2％または3％アガロースゲル中で電気泳動を通じて分離した。
（結果）
PGCLCは、再構成精巣(reconstituted testes)において、雄性の分化を受ける
　生殖細胞と精巣の体細胞、特にセルトリ細胞との密接な相互作用は、雄性生殖細胞の分化に必須である（Svingen and Koopman、2013）。PGCLCがインビトロで精子形成の分化を受けるかどうかを調べるために、再構成精巣を用いた培養系の開発を試みた（図1A）。Acro/Act-EGFP（AAG）トランスジーンを有する胚性幹細胞（ESC）（129/SvJcl x C57BL/6バックグラウンド）（Ohtaら、2000）をPGCLCに誘導し、蛍光標識細胞分取（FACS）を用いて、高レベルのSSEA1およびINTEGRINβ3に基づいて、4日目(d4)または6日目(d6)にPGCLCを単離した。PGCLCと、磁気細胞分離(MACS)によりPGCを枯渇させた胎生期（E）12.5での胎生の精巣細胞との凝集体を作成した（図1A）。浮遊条件下で2日間培養した後、34℃で培養する条件（条件1）、または37℃で2週間培養し、次いで34℃で残りの期間培養する条件（条件２）のいずれかで、再構成精巣を気液界面培養用の透過性膜上（Steinberger et al, 1964）にプレイスした（図1A）。理由は不明だが、d6 PGCLCは再構成精巣に十分に組み込まれなかったため（データは示さず）、出発物質としてd4 PGCLCを使用した。条件1及び2のいずれの条件下でも同様の結果が得られたため、いずれかの条件からの代表的な結果を示す。
　気液界面培養のd0では、再構成精巣は明瞭な基礎構造を持たない平らで丸い形を示した（図1B及び2A）。AAG陽性（+）細胞は、いくつかの凝集塊を形成する再構成精巣全体にランダムな分布を示した（図1Bおよび2A）。約d4から、精細管様構造が明らかになり始め、d7では広範な発展を示し、吻合ネットワークを構築した（図1B及び2A）。d7までに、精細管様構造の外側の、凝集塊を含むAAG（+）細胞は消失し、AAG（+）細胞の大部分は精細管様ネットワークの内側に存在した（図1B及び2A）。その後、精細管様ネットワークのさらなる発展と共に再構成精巣が安定に維持され、ネットワーク内のAAG（+）細胞の数の増加が見られた（図1B及び2A）。
　d14およびd21における再構成精巣の免疫蛍光（IF）分析により、セルトリ細胞の重要な転写因子であるGATA4およびSOX9（Vidal et al., 2001; Viger et al., 1998）陽性細胞により描写された強固な精細管様構造が明らかとなったが、これは扁平上皮細胞、最も可能性が高いのは筋様細胞、の層の下にあった（図1Cおよび2B）。特徴的な核構造を有するAAG（+）細胞は、d14でほとんど独占的に細管の内腔区画内に存在し、それらの多くは、d21で基底区画に見られた（図1C及び2B）。d14では、多くのAAG(+)細胞が生殖腺のPGCにおいて発現し始める生殖細胞マーカーであるDDX4（Fujiwara et al., 1994）は陽性(+)となったが、前精原細胞(pro-spermatogonia)において、周産期に発現が始まるSSCマーカーであるPLZF（ZBTB16）（Buaas et al, 2004; Costoya et al, 2004）は陰性であった（図1C及び2B）。d21では、AAG（+）細胞のいくつかは、DDX4及びPLZFが両方（+）となった（図1C及び2B）。各条件下で、d21での再構成精巣全体の切片を試験した：AAG（+）細胞の大部分はDDX4（+）となり（条件1では～92％、条件2では～75％）、DDX4（+）細胞のわずか一部はPLZF(+)となった（条件1では～6.3％、条件2では～18％）（図1D）。興味深いことに、MACS（AAG（-）/DDX4（+））により枯渇したままの内在性のPGCsが、d4 PGCLCよりも高い頻度でPLZFを獲得した（条件1では～56％、条件2では～54％（図1D及び2C）。
　再構成精巣のより長期間の培養を行った（d54まで）。少数のAAG（+）細胞または内在性の生殖細胞は、減数分裂の開始の重要なマーカーであるSCP3（Yuan et al., 2000）が陽性であったが（図1E及び2D）、本実験の条件下で減数分裂を完了した細胞は見出されなかった。まとめると、これらのデータは、再構成精巣がインビトロで精巣発生を再現し、再構成精巣内でPGCLCが分化して精原細胞様細胞を形成することを示している。このような細胞型へのPGCLCの分化の動態は、インビボでのPGCのものと比較して長引いた。
PGCLCからの精原細胞様の状態のインビトロ伝播
　PGCではなく、周産期の前精原細胞、精原細胞又はSSCは、生殖細胞系幹細胞（GSC）と呼ばれる、自己再生能及び精子形成能を有する初代細胞株としてインビトロで増殖させることができ、生殖系列幹細胞（GSC）と呼ばれる(Kanatsu-Shinohara et al., 2003; Kubota et al., 2004)。新生仔の精巣は、GSCの誘導のための頑強な供給源である(Kanatsu-Shinohara et al., 2003)。従って、PGCLC由来の精原細胞様細胞を有し、新生仔精巣に類似し得るd21 再構成精巣からGSC様細胞（GSCLC）を得ることができるかどうかを試験した。d21 再構成精巣を単細胞に解離し、AAG（+）細胞を濃縮し、GSC誘導条件下で培養した（図3A）。培養のd3では、AAG（+）細胞を単一または対の細胞（単一の再構成精巣からの数千の細胞）としてマウス胚性フィーダー（MEF）上に散在させ、そのうちのいくつかは、d8で小さなコロニーを形成した（多くとも数十のコロニー）（図3B）。その後、このようなコロニーは緩徐な増殖を示し、数回の継代で、正常な核型を有し、GSCと区別できないブドウ房様コロニー形態を有する安定な細胞株として増殖し（条件1及び2からそれぞれ、9および6株）、凍結保存/再拡大とそれに続く解凍に対して高い効率を有した（図3B及び4A）。最初のコロニー数が10以上の場合に、一貫した様式でこのような細胞株を樹立することができ、GSCs（129/SvJcl x C57BL/6）と同様に増殖した（図3C）（Kanatsu-Shinohara et al., 2003）。
　再構成精巣由来の細胞株における重要な遺伝子（Ddx4、Daz1、Gfra1、Ret、Piwil2、Itga6、Kit、Plzf、Piwil4、及びId4）、表面マーカー（CD9、SSEA1、INTEGRINβ1、INTEGRINα6、KIT及びGFRα1）並びに転写因子（PLZF及びID4）（Kanatsu-Shinohara and Shinohara、2013; Yang and Oatley、2014）の発現を、GSCにおけるそれらと比較することで、前記細胞株がGSCと同様の遺伝子発現を示すことを明らかにした（図3D-3F）。従って、これらの細胞株をGSCLCと命名した。再構成精巣の形成なしにPGCLCからGSCLCを得ることができるかどうかを調べるために、SSEA1及びINTEGRINβ3によりソートしたd4又はd6 PGCLCをGSC誘導条件下で直接培養した。しかし、これは、PGC由来の胚性生殖細胞（EGC）誘導の効率（～5％）と同様の効率を有する、強くアルカリホスファターゼが陽性で、ドーム型ESC様コロニーの急速な拡大（数日以内）をもたらし（図4B）（Matsui et al., 1992; Resnick et al., 1992）、このような培養物からGSC様コロニーを単離/検出することができなかった。本発明者らは、PGCLCの雄性生殖細胞経路への分化は、GSCLCの誘導に必須であると結論付けた。
成体精巣における精子形成とGSCLC由来の繁殖力のある子孫
　精原細胞/SSCは、精子形成のために成体精巣（約8週間超）に定着することができるが（Brinster and Zimmermann, 1994）、PGCは新生仔精巣（～5-10日）においてのみ定着し、精子形成を受ける（Chuma et al., 2005; Ohta et al., 2004）。これは、これらの細胞型間の精子形成のためのホーミング能力又は本来備わっている/後成的な能力のいずれかの違いによるものであろう。
　GSCLCが成熟した幹細胞の特性を獲得するかどうかを調べるために、それらをW/Wvマウスの成体精巣（8-10週）に移植した。GSC（AAG（+）; 129/SvJcl x C57BL/6）（GSC1）は、成体精巣に定着し、精子形成を受けた（図5A）。一方でPGCLCは、新生仔ではそのような活性を示したが(Hayashi et al., 2011)、成体では示さなかった（図5A）。注目すべきは、PGCLCとは異なり、すべてのGSCLC細胞株が成体精巣に定着したことである（図5A、6A、及び6B）。しかし、予期せぬことに、それらのうちの少数（GSCLC 1, 2, 3： 3/15）は、定着した細管の分画において精子形成を受けた（図5A、6A、および6B）。組織学的分析により、GSCLC由来のAAG（+）細胞が完全に占める細管において適切な精子形成が起こることを確認したが（図5B）、精原細胞又は初回の減数分裂期の細胞のみが、基底区画の周りにのみ整列したひと続きのAAG(+)細胞を保持する細管に存在した（図5B）。GSCLC細胞株は、移植後少なくとも16週間まで、移植された精巣で奇形腫を形成しなかった。
　IF分析により、GFRα1（+）精原細胞/SSC様細胞は、GSC（～33.9％）およびGSCLC（GSCLC1：～36.6％; 4：～32.4％）が定着した細管において同様の比率で存在することが明らかになった（図5C）。対照的に、GSCが定着したほとんどすべての細管はSCP3（+）減数母細胞（～99.3％）を示したが、GSCLCが定着した細管では半分以下（GSCLC1：44.4％; 4：39.1％）であった（図5C）。従って、GSCLCは成体精細管に定着し、精原細胞/ SSCの特徴を示すが、それらは最初の減数分裂の前期の段階又は進入する段階付近で精子形成を停止させる傾向がある。
　GSCLC由来の精子又は精細胞の機能を調べた。このような細胞（GSCLC1：精子; 3：円形精細胞）を、成功した精子形成（図5D）を有する精細管から一貫して単離することができ、細胞質内への精子注入（ICSI）又は円形精細胞注入（ROSI）をそれぞれ行い、正常な割合で外観的には正常な子孫が生み出された（図5E及び図5G）。このような子孫を、Combined Bisulfite Restriction Analysis（COBRA）により調べたところ、適切なインプリントを持ち、全体的に正常な発達を示し、繁殖力があった（図5F及び6C-6E）。従って、PGCLC及び再構成精巣における雄性の経路へのそれらの分化を介して、PSCは、成体精巣における精子形成のための即時の前駆体であるSSC能力を有する安定な細胞株に誘導され得る。
［実施例２］
（方法の概要）
ES細胞からPGCLCへの分化誘導とPGCLCの培養
　実施例１と同様にして誘導した4日目（d4）のPGCLCをセルソーターにてソートし、初期PGCマーカーであるBlimp1陽性の細胞集団を回収した。該細胞をフィーダー細胞(m220細胞; Nature, 352: 809-811 (1991), J. Biol. Chem., 269: 1237-1242(1994))上に播種し、GMEM-10% KSR-2.5% FBS-Forskolin-Rolipram-SCF添加 (GK10FR) の培地条件下で5, 7, 9日間培養した（図７）。
培養PGCLCと雄性胎児生殖巣細胞の再構成精巣
　培養PGCLCsと胎齢12.5日の雄性生殖巣体細胞を5,000細胞:70,000細胞の比率で混合し、GK10FR中で2日間浮遊凝集培養した（図７）。その後、凝集塊を培養膜 (culture insert) 上に移し、2週間気液界面培養を行った（図７）。培地はDMEM/F12-10% FBSを用いた。
再構成精巣から精原細胞様細胞株(GSCLC)の樹立
　培養膜上で気液界面培養を開始後10日目、14日目の再構成精巣からGSCLCsを樹立した。再構成精巣は、0.05% Trypsin溶液中、37℃で10分間反応させ、ピペッティングにて単一細胞まで解離を行った。その後、セルソーターにて後期PGCマーカーであるDDX4（MVH）陽性の細胞集団をソートして、フィーダー細胞(MEF)上に播種し、実施例１と同様、StemPro34を基礎培地とし、GDNF、FGF2、EGF、LIFを添加した条件下で培養を行った。
（結果）
再構成精巣において培養PGCLCは後期PGCへと分化する
　気液界面培養開始3日目まで培養PGCLCは増殖し、4～5日目までに再構成精巣の菅構造が明確となった。また、その間、初期PGCマーカーであるBlimp1と、それに続いてStellaの発現が減弱し、後期PGCマーカーであるMVHの発現が上昇した（図８）。MVHの発現は気液界面培養10日目に向けて上昇していき、その後14日目にかけて少し減弱した。
10日目・14日目の再構成精巣からGSCLCを樹立することができる
　10日間又は14日間培養した再構成精巣を単一細胞に解離し、セルソーターにて採取した後期PGCマーカーMVH陽性細胞を、精原幹細胞培養条件下で培養したところ、長期間継代可能な細胞株を誘導することが出来た。10日目再構成精巣から3株、14日目再構成精巣から1株（図９）の計4株を樹立し得た。
　本発明の方法により得られる生殖系列幹細胞様細胞（GSCLC）は、長期間維持増幅培養が可能であり、かつ新生仔のみならず成体精巣に移植した場合でも稔性のある精子形成が可能であることから、生殖細胞の詳細な発生メカニズムの解明、不妊及び遺伝性疾患発症のメカニズムの解明の促進に大いに寄与し得る。
（関連出願の表示）
　本出願は、2017年6月7日付で日本国に出願された特願2017-113054を基礎としており、ここで言及することによりそれらの内容は全て本明細書に包含される。

Claims (5)

  1. 　単離された多能性幹細胞（PSC）由来の始原生殖細胞様細胞（PGCLC）からインビトロで精子幹細胞様の細胞を製造する方法であって、
    (1) PGCLCを生殖巣体細胞と浮遊培養にて共培養し、再構成精巣を得る工程、及び
    (2) 得られた再構成精巣を気液界面培養して、該再構成精巣中でDDX4陽性かつPLZF陽性細胞を誘導する工程
    を含む、方法。
  2. 　請求項１に記載の方法により得られる精子幹細胞様の細胞を再構成精巣から解離し、精子幹細胞から生殖系列幹細胞（GSC）を誘導し得る条件下で培養することを含む、GSC様細胞（GSCLC）の製造方法。
  3. 　以下の性質を有することを特徴とする、単離されたGSCLC。
    (a) 単離されたPSC由来である
    (b) (i) Ddx4、Daz1、Gfra1、Ret、Piwil2、Itga6、Kit、Plzf、Piwil4及びId4からなる群より選択される遺伝子、
    　　(ii) CD9、SSEA1、INTEGRINβ1、INTEGRINα6、KIT及びGFRα1からなる群より選択される表面マーカー、並びに
    　　(iii) PLZF及びID4からなる群より選択される転写因子
    の発現レベルが、GSCと同等である
    (c) GSCと同等の増殖速度で維持・増幅可能である
    (d) 該GSCLCを成体精巣内に移植した場合、
    　　(i) 移植細胞が定着した精細管に占めるGFRα1陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれと同等である、及び
    　　(ii) 移植細胞が定着した精細管に占めるSCP3陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれよりも低い
    (e) 該GSCLCを成体精巣内に移植して得られる精細胞を顕微授精した場合、正常な子孫を生じる
  4. 　請求項２に記載の方法により得られるGSCLC又は請求項３に記載のGSCLCを哺乳動物の精巣内に移植することを含む、稔性のある精細胞の製造方法。
  5. 　請求項４に記載の方法により得られる精細胞と卵細胞とを受精させることを含む、単離されたPSCが全身に寄与した子孫の製造方法。
PCT/JP2018/021775 2017-06-07 2018-06-06 多能性幹細胞から生殖系列幹細胞様細胞への分化誘導方法 WO2018225802A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019523955A JP7079017B2 (ja) 2017-06-07 2018-06-06 多能性幹細胞から生殖系列幹細胞様細胞への分化誘導方法
US16/619,361 US20200248138A1 (en) 2017-06-07 2018-06-06 Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into germline stem cell-like cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017113054 2017-06-07
JP2017-113054 2017-06-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018225802A1 true WO2018225802A1 (ja) 2018-12-13

Family

ID=64566306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/021775 WO2018225802A1 (ja) 2017-06-07 2018-06-06 多能性幹細胞から生殖系列幹細胞様細胞への分化誘導方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20200248138A1 (ja)
JP (1) JP7079017B2 (ja)
WO (1) WO2018225802A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113215088A (zh) * 2021-05-31 2021-08-06 华中科技大学 体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法
WO2023027148A1 (ja) * 2021-08-26 2023-03-02 国立大学法人京都大学 精子幹細胞様細胞の製造方法及び精子幹細胞様細胞株

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540280B (zh) * 2022-03-16 2023-03-31 南京医科大学 一种体外诱导人类原始生殖细胞培养液以及定向诱导方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013538038A (ja) * 2010-08-13 2013-10-10 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から生殖細胞への分化誘導方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013538038A (ja) * 2010-08-13 2013-10-10 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から生殖細胞への分化誘導方法

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
""Origin of sperm" by ES cells", KAHOKU SHIMPO, 7 December 2016 (2016-12-07) *
"First production of ES cell -sperm stem cell", KYOTO UNIVERSITY TEAM USING MOUSE EXPERIMENT, THE MAINICHI NEWSPAPERS, 7 December 2016 (2016-12-07), Retrieved from the Internet <URL:https://mainichi.jp/articles/20161207/dde/041/040/059000c> *
"In Vitro Derivation and Propagation of Spermatogone Stem Cell Activity from Mouse Pluripotent Stem Cells", KYOTO UNIVERSITY JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY, 7 December 2016 (2016-12-07), Retrieved from the Internet <URL:http://www.jst.go.jp/pr/announce/20161207/index.html> *
"In vitro derivation of sperm stem cell from mouse pluripotent stem cells - Establishment of basis of in vitro derivation for entire processes of sperm formation", KYOTO UNIVERSITY, 7 December 2016 (2016-12-07), Retrieved from the Internet <URL:http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research/research_results/2016/161207_1.html> *
"Origin of sperm from ES cells", NIHON GEIZAI SHIMBUN: EVENING PAPER, 13 December 2016 (2016-12-13), pages 14 *
"Origin of sperm from ES cells", THE MAINICHI NEWSPAPERS: EVENING PAPER 4TH EDITION, 7 December 2016 (2016-12-07), pages 10 *
"Preparation of sperm stem cell from mouse ES cell", KYOTO UNIVERSITY GROUP - THE ASAHI SHIMBUN DIGITAL, 7 December 2016 (2016-12-07), Retrieved from the Internet <URL:http://www.asahi.com/articles/ASJD72C5GJD7UBQU008.html> *
"Production of origin of ES cell sperm and prospect of infertility treatment", KYOTO UNIVERSITY, THE MAINICHI NEWSPAPERS, 7 December 2016 (2016-12-07), Retrieved from the Internet <URL:https://mainichi.jp/articles/20161207/ddf/041/040/009000c> *
"Production of origin of ES cell sperm", KYOTO UNIVERSITY USING MOUSE, NIHON GEIZAI SHIMBUN, 13 December 2016 (2016-12-13), Retrieved from the Internet <URL:http://www.nikkei.com/article/DGXLASDG06HBR_T11C16A2CR0000> *
"Production of origin of sperm from ES cell", THE SANKEI SHIMBUN: MORNING PAPER 15TH EDITION, 7 December 2016 (2016-12-07), pages 26 *
"Sperm stem cell from ES cell", THE ASAHI SHIMBUN: MORNING PAPER OF OSAKA HEAD OFFICE, 7 December 2016 (2016-12-07), pages 33 *
"Sperm stem cell from ES cell", THE YOMIURI SHIMBUN: MORNING PAPER, 7 December 2016 (2016-12-07), pages 2 *
"Sperm stem cell in vitro culture from ES", THE KYOTO SHIMBUN UNIVERSITY GROUP -EXPECTATION OF INFERTILITY TREATMENT, THE KYOTO SHIMBUN, 7 December 2016 (2016-12-07), Retrieved from the Internet <URL:http://www.kyoto-np.co.jp/environment/article/20161207000016> *
"Sperm stem cell in vitro from ES", THE KYOTO SHIMBUN: MORNING PAPER 15TH EDITION, 7 December 2016 (2016-12-07), pages 25 *
"Successful production of origin of ES cell sperm", KYOTO UNIVERSITY USING MOUSE, THE MAINICHI NEWSPAPERS, 7 December 2016 (2016-12-07), Retrieved from the Internet <URL:https://mainichi.jp/articles/20161207/k00/00e/040/178000c> *
"World first successful production of origin of sperm from ES cell", KYOTO UNIVERSITY TEAM -"EXPECTATION OF INFERTILITY TREATMENT", THE SANKEI WEST, 7 December 2016 (2016-12-07), Retrieved from the Internet <URL:URL:https://www.sankei.com/west/news/161207/wst1612070010-nl.html> *
ISHIKURA, Y. ET AL.: "In Vitro Derivation and Propagation of Spermatogonial Stem Cell Activity from Mouse Pluripotent Stem Cells", CELL REPORTS, vol. 17, no. 10, 6 December 2016 (2016-12-06), XP055538225, Retrieved from the Internet <URL:https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(16)31584-4> *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113215088A (zh) * 2021-05-31 2021-08-06 华中科技大学 体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法
CN113215088B (zh) * 2021-05-31 2023-03-10 华中科技大学 体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法
WO2023027148A1 (ja) * 2021-08-26 2023-03-02 国立大学法人京都大学 精子幹細胞様細胞の製造方法及び精子幹細胞様細胞株

Also Published As

Publication number Publication date
JP7079017B2 (ja) 2022-06-01
US20200248138A1 (en) 2020-08-06
JPWO2018225802A1 (ja) 2020-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220033770A1 (en) Macs-based purification of stem cell-derived retinal pigment epithelium
US20210139847A1 (en) Method for reproducible differentiation of clinical-grade retinal pigment epithelium cells
JP5562231B2 (ja) 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
JP7089298B2 (ja) 多能性幹細胞から生殖細胞への分化誘導方法
JP5846558B2 (ja) 多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞への分化誘導方法
JP5892661B2 (ja) 多能性幹細胞から生殖細胞への分化誘導方法
US10072242B2 (en) Cell sorting method
WO2013062140A1 (en) Method for efficiently inducing differentiation of pluripotent stem cells into hepatic lineage cells
JP6460482B2 (ja) 多能性幹細胞から生殖細胞への分化誘導方法
JP7307481B2 (ja) 始原生殖細胞／始原生殖細胞様細胞の維持増幅及び分化誘導方法
JP7079017B2 (ja) 多能性幹細胞から生殖系列幹細胞様細胞への分化誘導方法
Moraveji et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 promotes efficient derivation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis
JP2011182720A (ja) 生殖系幹細胞の分化誘導および増幅方法、並びにそのための培地
Rasmussen et al. Embryonic stem cells in the pig: characterization and differentiation into neural cells
Beteramia Pluripotent adult stem cells from the mouse testis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18812832

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019523955

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18812832

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1