JP2011182720A - 生殖系幹細胞の分化誘導および増幅方法、並びにそのための培地 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)骨形成タンパク質4(BMP4)、並びに(b)グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、上皮細胞成長因子(EGF)および幹細胞因子(SCF)から選ばれる1以上の成長因子の存在下で多能性幹細胞を培養することを含む、Oct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞(GR細胞)の製造方法。GDNF、EGF、SCFおよび塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)の存在下で、GR細胞を培養することを含む、GR細胞の増幅方法。
【選択図】なし
Description
遺伝子組換えで抗がん剤による副作用を緩和する医薬品が次々と開発された。例えば、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)は骨髄抑制の副作用を防ぐ画期的な医薬であり、より積極的ながん化学療法を可能とした。しかしながら,抗がん剤あるいは放射線療法の副作用に基づく精巣障害を予防・治療するための有効な薬剤は未だ見出されていない。
しかしながら、既に精巣障害を発症し精子形成が不可能な患者については、GS細胞を誘導するための精子幹細胞を十分に採取できない可能性があり、多数箇所生検が必要となる場合があるが、大量の精巣組織標本の採取は精巣萎縮をもたらすリスクがある。
(1)(a)骨形成タンパク質4(BMP4)、並びに(b)グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、上皮細胞成長因子(EGF)および幹細胞因子(SCF)から選ばれる1以上の成長因子の存在下で多能性幹細胞を培養することを含む、Oct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞の製造方法。
(2)BMP4、GDNF、EGFおよびSCFの存在下で多能性幹細胞を培養することを含む、上記(1)記載の方法。
(3)フィーダー細胞の存在下で多能性幹細胞を培養することを特徴とする、上記(1)または(2)記載の方法。
(4)前記成長因子がフィーダー細胞から提供されることを特徴とする、上記(3)記載の方法。
(5)多能性幹細胞がiPS細胞またはES細胞である、上記(1)〜(4)のいずれかに記載に方法。
(6)多能性幹細胞がヒトまたはマウス由来である、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)上記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法により得られた、iPS細胞由来のOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞。
(8)(a)BMP4、並びに(b)GDNF、EGFおよびSCFから選ばれる1以上の成長因子を組み合わせてなる、多能性幹細胞からOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞への分化誘導剤。
(9)BMP4、GDNF、EGFおよびSCFを組み合わせてなる、多能性幹細胞からOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞への分化誘導剤。
(10)前記成長因子を産生する細胞を含有してなる、上記(8)または(9)記載の剤。
(11)上記(8)または(9)記載の剤が添加されてなる、多能性幹細胞からOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞への分化誘導用培地。
(11b)基本培地および表1から選ばれる1以上の成分を含有する培地と、上記(8)〜(10)のいずれかに記載の剤とを含んでなる、多能性幹細胞からOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞への分化誘導キット。
(12)Oct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞の増幅方法であって、GDNF、EGF、SCFおよび塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)の存在下で、該生殖系幹細胞を培養することを含む、方法。
(13)肝細胞成長因子(HGF)、インターロイキン-2(IL-2)および線維芽細胞成長因子9(FGF9)から選ばされる1以上の因子がさらに存在する条件下で、前記生殖系幹細胞を培養することを含む、上記(12)記載の方法。
(14)前記生殖系幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することを特徴とする、上記(12)または(13)記載の方法。
(15)前記生殖系幹細胞が多能性幹細胞から分化誘導されたものである、上記(12)〜(14)のいずれかに記載の方法。
(16)GDNF、EGF、SCFおよびbFGFを組み合わせてなる、Oct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞の増幅支持剤。
(17)HGF、IL-2およびFGF9から選ばされる1以上の因子をさらに組み合わせてなる、上記(16)記載の剤。
(18)上記(16)または(17)記載の剤が添加されてなる、Oct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞の増幅用培地。
(18b)基本培地および任意で、表1から選ばれる1以上の成分を含有する培地に、表2から選ばれる1以上の成分が添加されてなる、Oct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞の増幅用培地。
(19)上記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法により得られたOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞、上記(7)記載のOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞、または上記(12)〜(15)のいずれかに記載の方法により増幅されたOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞を、該細胞と同種のレシピエント動物の精巣に移植することを含む、該不妊動物に精子を形成させる方法。
(20)生殖系幹細胞が不妊動物の体細胞から作製したiPS細胞由来である、上記(19)記載の方法。
(21)レシピエント動物がヒトまたはマウスである、上記(19)または(20)記載の方法。
(22)上記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法により得られたOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞、上記(7)記載のOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞、または上記(12)〜(15)のいずれかに記載の方法により増幅されたOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞を含有してなる、雄性不妊治療剤。
(23)精子幹細胞の採取が困難な個体を投与対象とする、上記(22)記載の剤。
後述の実施例における種々の特性解析の結果から示されるように、本発明の生殖系幹細胞(GR細胞ともいう)は、移動後期(胎仔生殖原基に進入する直前もしくは直後)の始原生殖細胞(PGC)の特性を反映したPGC様細胞である。該生殖系幹細胞は、本発明の維持培養条件下で維持増幅可能な(即ち、自己再生能を有する)幹細胞であり、しかも精巣に移植した場合に腫瘍を形成せず、かつ排除されることなく長期生着することから生殖系細胞として運命決定されている。
本発明において出発材料となる多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であれば特に制限されず、例えば、iPS細胞、ES細胞の他、始原生殖細胞に由来する胚性生殖(EG)細胞、精巣組織からのGS細胞の樹立培養過程で単離されるmutipotent germline stem(mGS)細胞、骨髄から単離されるmultipotent adult progenitor cell(MAPC)等が挙げられる。ES細胞は体細胞から核初期化されて生じたES細胞であってもよい。好ましくはiPS細胞またES細胞であるが、出生後の個体から取得できる点でmGS細胞やMAPCもまた好ましい。本発明の方法は、いずれかの多能性幹細胞が樹立されているか、樹立可能である、任意の哺乳動物において適用することができ、例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット、イヌ等が挙げられるが、好ましくはヒトまたはマウスである。
本発明における多能性幹細胞として好適なiPS細胞の製造例を以下に示すが、これらに限定されない。
(A) 体細胞ソース
iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等)由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞(例、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例、線維芽細胞)、収縮性細胞(例、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例、桿細胞)、自律神経系ニューロン(例、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例、星状グリア細胞)、色素細胞(例、網膜色素上皮細胞)、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができるタンパク性因子(群)またはそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)でありうる。本発明に用いられる核初期化物質は、WO 2007/069666に記載の遺伝子であってもよい。より詳細には、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, EsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよく、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。具体的には、以下の組み合わせが例示される(以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する)。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。また、c-MycはL-MycまたはN-Mycで置換可能である。)
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, TERT, SV40 Large T antigen(以下、SV40LT)
(3) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, TERT, HPV16 E6
(4) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, TERT, HPV16 E7
(5) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, TERT, Bmi1
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28
(8) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, SV40LT
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, TERT, SV40LT
(10) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, SV40LT
(11) Oct3/4, Esrrb, Sox2, c-Myc (EsrrbはEsrrgで置換可能である。)
(12) Oct3/4, Klf4, Sox2
(13) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT
(14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6
(15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7
(16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
(17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmi1
(18) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28
(19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT
(20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT
(21) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT
(22) Oct3/4, Esrrb, Sox2 (EsrrbはEsrrgで置換可能である。)
上記において、c-Mycに代えてL-Mycを、Lin28に代えてLin28bを用いることもできる。
遺伝子名 マウス ヒト
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
L-Myc NM_008506 NM_001033081
核初期化物質としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター等に挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
核初期化物質の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン(PTD)もしくは細胞透過性ペプチド(CPP)融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent(Gene Therapy Systmes)、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent(PIERCE)及びProVectin(IMGENEX)、脂質をベースとしたProfect-1(Targeting Systems)、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide(Q biogene)及びChariot Kit(Active Motif)、HVJエンベロープ(不活化センダイウイルス)を利用したGenomONE(石原産業)等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒(例えば、PBS、HEPES等の緩衝液)に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で1ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT (Frankel, A. et al, Cell 55, 1189-93 (1988); Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynBl (Rousselle, C. et al. MoI. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPとしては、11R (Cell Stem Cell, 4:381-384(2009)) や9R (Cell Stem Cell, 4:472-476(2009))等のポリアルギニンが挙げられる。
核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド(例、pA1-11,pXT1,pRc/CMV,pRc/RSV,pcDNAI/Neo)などが用いられ得る。
別の好ましい非組込み型ベクターとして、染色体外で自律複製可能なエピソーマルベクターが挙げられる。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009)に開示されている。
本発明は、上記の核初期化物質に加えて、p53の機能阻害物質を接触させることがより好ましい。本明細書において「p53の機能阻害物質」とは、(a)p53タンパク質の機能もしくは(b)p53遺伝子の発現を阻害し得る限り、いかなる物質であってもよい。すなわち、p53タンパク質に直接作用してその機能を阻害する物質や、p53遺伝子に直接作用してその発現を阻害する物質のみならず、p53のシグナル伝達に関与する因子に作用することにより、結果的にp53タンパク質の機能やp53遺伝子の発現を阻害する物質も、本明細書における「p53の機能阻害物質」に含まれる。好ましくは、p53の機能阻害物質は、p53遺伝子の発現を阻害する物質であり、より好ましくはp53に対するsiRNAやshRNAをコードする発現ベクターである。
p53の化学的阻害物質としては、例えば、WO 00/44364に開示されるpifithrin(PFT)-α及び-βに代表されるp53阻害剤、Stormら(Nat. Chem. Biol. 2, 474 (2006))に開示されるPFT-μ、それらの類縁体及びそれらの塩(例えば、塩酸酸、臭素酸塩等の酸付加塩など)等が挙げられるが、これらに限定されない。これらのうち、PFT-α及びその類縁体[2-(2-Imino-4,5,6,7-tetrahydrobenzothiazol-3-yl)-1-p-tolylethanone, HBr (製品名:Pifithrin-α)及び1-(4-Nitrophenyl)-2-(4,5,6,7-tetrahydro-2-imino-3(2H)-benzothiazolyl)ethanone, HBr(製品名:Pifithrin-α, p-Nitro)]、PFT-β及びその類縁体[2-(4-Methylphenyl)imidazo[2,1-b]-5,6,7,8-tetrahydrobenzothiazole, HBr(製品名:Pifithrin-α, Cyclic)及び2-(4-Nitrophenyl)imidazo[2,1-b]-5,6,7,8-tetrahydrobenzothiazole(製品名:Pifithrin-α, p-Nitro, Cyclic)]、PFT-μ[Phenylacetylenylsulfonamide(製品名:Pifithrin-μ)]は、Merck社より市販されている。
p53のドミナントネガティブ変異体としては、体細胞に内在する野生型p53タンパク質と競合的に作用して、その機能を阻害し得る限り特に制限はないが、例えば、マウスp53のDNA結合領域に位置する275位(ヒトの場合は278位)のプロリンをセリンに点変異させたp53P275S(de Vries, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 2948-2953 (2002))、マウスp53の14-301位(ヒトp53では11-304位に対応)のアミノ酸を欠失させたp53DD(Bowman, T., Genes Develop., 10, 826-835 (1996))などが挙げられる。その他にも、例えば、マウスp53の58位(ヒトの場合は61位)のセリンをアラニンに点変異させたp53S58A、ヒトp53の135位(マウスの場合は132位)のシステインをチロシンに点変異させたp53C135Y、マウスp53の135位(ヒトの場合は138位)のアラニンをバリンに点変異させたp53A135V、172位(ヒトの場合は175位)のアルギニンをヒスチジンに点変異させたp53R172H、270位(ヒトの場合は273位)のアルギニンをヒスチジンに点変異させたp53R270H、マウスp53の278位(ヒトの場合は281位)のアスパラギン酸をアスパラギンに点変異させたp53D278Nなどが知られており、同様に使用することができる。
本発明の別の好ましい実施態様において、p53機能阻害物質は、p53のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸である。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。p53のドミナントネガティブ変異体をコードするcDNAは、該変異体タンパク質の作製について上記した手法によりクローニングすることができる。
単離されたcDNAは、前記核初期化物質である核酸(初期化遺伝子)の場合と同様に、適当な発現ベクターに挿入され、体細胞に導入され得る。
ここでp53経路とは、p53を活性化し得るあらゆる上流のシグナルカスケードおよび活性化p53によって媒介されるあらゆる下流のシグナルカスケードを包含する意味で用いられる。したがって、p53経路阻害物質には、上記シグナル伝達経路のいずれかを阻害するいかなる物質も含まれるが、好ましい一実施態様においては、p53経路阻害物質はp53によりその転写が活性化されるp21の発現もしくは機能(Myc阻害活性)を阻害する物質であり、例えば、p21に対するsiRNA、shRNA、アンチセンス核酸、リボザイム等が挙げられる。p21の発現を阻害するこれらの核酸は、後記p53に対するsiRNA、shRNA、アンチセンス核酸、リボザイムと同様の方法により設計・合成し、体細胞に導入することができる。当該核酸は、それらを発現するベクターの形態で提供されてもよく、該ベクターは、後記p53に対するsiRNA、shRNA、アンチセンス核酸、リボザイムを発現するベクターと同様の方法により構築し、体細胞に導入することができる。
p53タンパク質の機能を阻害するその他の物質として、例えば、抗p53アンタゴニスト抗体もしくはそれをコードする核酸が挙げられる。抗p53アンタゴニスト抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール(PEG)等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。抗p53アンタゴニスト抗体は、p53またはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。また、公知の抗p53アンタゴニスト抗体として、例えば、PAb1801(Oncogene Science Ab-2)及びDO-1(Oncogene Science Ab-6)(Gire and Wynford-Thomas, Mol. Cell. Biol., 18, 1611-1621 (1998))等が挙げられる。抗p53アンタゴニスト抗体をコードする核酸は、抗p53モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから常法により単離することができる。得られるH鎖及びL鎖遺伝子を連結して単鎖抗体をコードする核酸を作製することもできる。
p53タンパク質の機能を阻害するさらに別の物質は、p53応答エレメントのコンセンサス配列(例、Pu-Pu-Pu-G-A/T-T/A-C-Py-Py-Py (Pu: プリン塩基, Py: ピリミジン塩基))を含むデコイ核酸である。このような核酸は上記塩基配列情報に基づいてDNA/RNA自動合成機で合成することができる。あるいはそのようなデコイ核酸は市販されている(例、p53 transcription factor decoy (GeneDetect.com))。
抗p53アンタゴニスト抗体及び抗p21アンタゴニスト抗体はp53のドミナントネガティブ変異体と同様に、また、該抗体をコードする核酸は該変異体をコードする核酸と同様にして、それぞれ細胞に導入することができる。また、上記デコイ核酸は、リポフェクション法などにより細胞に導入することができる。
p53に対するsiRNAは、マウスまたはヒトのp53 cDNA配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら(Genes Dev., 15, 188-200 (2001))の提唱する規則に従って設計することができる。siRNAの標的配列としては、原則的にはAA+(N)19であるが、AA+(N)21もしくはNA+(N)21であってもよい。また、センス鎖の5’末端がAAである必要はない。標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。標的配列のGC含量も特に制限はないが、約30-約50%が好ましく、GC分布に偏りがなく繰り返しが少ない配列が望ましい。尚、下記(b2)のsiRNAもしくはshRNAを発現するベクターの設計において、プロモーターとしてpolIII系プロモーターを使用する場合、ポリメラーゼの転写が停止しないように、4塩基以上TまたはAが連続する配列は選択しないようにすべきである。
上述の規則に基づいて選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認する。特異性の確認された標的配列について、AA(もしくはNA)以降の19-21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19-21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計する。また、shRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列(例えば、8-25塩基程度)を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
但し、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。
また、ヒトp53に対するsiRNAおよびshRNAも、上記のいずれかの検索ソフトを用いて、ヒトp53 cDNAの配列情報(例、Refseq. No. NM_000546)等をクエリーとして入力することにより設計し、合成することができ、あるいはAmbion等から購入することもできる。具体的には、Science, 296, 550-553 (2002) に記載されるp53に対するshRNAなどが例示される。
siRNAを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ(ヘアピン)タイプとがある。前者はsiRNAのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより2本鎖のsiRNA(dsRNA)を形成するというものである。一方、後者はshRNAの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でshRNAが発現しdicerによるプロセシングを受けてdsRNAを形成するというものである。プロモーターとしては、polII系プロモーター(例えば、CMV前初期プロモーター)を使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用するのが一般的である。polIII系プロモーターとしては、マウスおよびヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上Tが連続した配列が用いられる。
p53遺伝子の発現を阻害する他の物質として、p53に対するアンチセンス核酸やリボザイムが挙げられる。
アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、p53 mRNA中の配列だけでなく、p53遺伝子の初期転写産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてp53蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、p53 mRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約15塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約15〜約40塩基、特に約18〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。標的配列の位置としては、5’-及び3’-UTR、開始コドン近傍などが挙げられるが、それらに限定されない。
リボザイムとは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ(合わせて約10塩基程度)をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。
あるいは、アンチセンス核酸やリボザイムは、siRNAの場合と同様に、それらをコードする核酸の形態で使用することもできる。
上記の初期化因子やp53機能阻害物質に加え、公知の他のiPS細胞樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をさらに高めることが期待できる。そのようなiPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤[例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標)(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等)等の核酸性発現阻害剤など]、L-calcium channel agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling(例えばsoluble Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008))、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、ES細胞特異的miRNA(例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08、WO2009/075119)、miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10)、miR-291-3p, miR-294およびmiR-295 (以上、Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009)))等が挙げられるが、それらに限定されない。前記において核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
他のiPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよく、該物質の物性に応じて、p53の機能阻害物質について上記したと同様のタイミングで体細胞と接触させることができる。
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下(例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など)、10%以下(例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など)、または5%以下(例、4%以下、3%以下、2%以下など)である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上(例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など)、0.5%以上(例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など)、または1%以上(例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など)である。
さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期および好ましい培養期間は、用いられる核初期化物質の種類、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率などによっても変動する。
また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞の共存下で培養される。マウス胎仔由来の線維芽細胞としては、通常STO細胞株(ATCC CRL-1503)等がフィーダーとしてよく使われるが、iPS細胞の誘導には、STO細胞にネオマイシン耐性遺伝子とLIF遺伝子を安定に組み込んだSNL細胞(SNL76/7 STO細胞; ECACC 07032801)(McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990))等がよく使われている。しかしながら、マウス胎仔由来の初代線維芽細胞(MEF)を用いた方がヒトiPS細胞の樹立効率がより改善される場合もあるので、MEFの使用もまた好ましい。マイトマイシンC処理済のMEFは、ミリポア社やリプロセル社から市販されている。これらのフィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後(例えば1-10日後)から開始してもよい。
iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子(例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4)の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び/又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び/又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo(β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする)遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF(Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006))、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF(Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007))等が挙げられる。本発明のGR細胞はOct3/4遺伝子を高発現する(Oct4陽性)ことを特徴とするので、レポーター活性を指標とする方法においては、Oct3/4遺伝子座にGFPやRFP等の可視化タンパク質をコードするレポーター遺伝子をノックインした細胞を用いることがより好ましい。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞から分化誘導されるGR細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。
ES細胞の作製方法としては、例えば、哺乳動物の胚盤胞ステージにおける内部細胞塊を培養する方法(例えば、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) を参照)、体細胞核移植によって作製された初期胚を培養する方法(Wilmut et al., Nature, 385, 810 (1997); Cibelli et al., Science, 280, 1256 (1998); 入谷明ら, 蛋白質核酸酵素, 44, 892 (1999); Baguisi et al., Nature Biotechnology,17, 456 (1999); Wakayama et al., Nature, 394, 369 (1998); Wakayama et al., Nature Genetics, 22, 127 (1999); Wakayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999); RideoutIII et al., Nature Genetics, 24, 109 (2000))などが挙げられるが、これらに限定されない。また、ES細胞は、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。例えば、ヒトES細胞であるKhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
体細胞核移植による場合、体細胞の種類や体細胞を採取するソースは上記iPS細胞の場合に準ずる。
EG細胞は、常法に従って始原生殖細胞を単離し、これをLIF、bFGFおよびSCFの存在下で培養することにより誘導することができる。また、mGS細胞はWO 2005/100548に記載される方法に従って、精巣細胞から作製することができる。多能性成体前駆細胞(MAPC)はJ. Clin. Invest. 109:337-346 (2002) に記載される方法に従って、骨髄から単離することができる。
GR細胞の分化誘導用の基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS-A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。より好ましくは、Neurobasal培地である。これらの培地は、血清(例えば、胎仔ウシ血清(FCS)、ヒト血清等)を含有してもしなくてもよい。あるいは、血清の代替添加物(例えばKnockout Serum Replacement (KSR)(Invitrogen社製) 等)を用いてもよい。血清の添加濃度としては0〜20%の範囲で適宜選択することができるが、好ましくは無血清もしくは低血清(例えば、0〜5%、好ましくは0〜2%)の培地が使用され得る。
好ましい一実施態様においては、表1に記載される培地添加物から選ばれる1以上の因子が、上記いずれかの基本培地に添加されて用いられる。当業者はこれらの因子を適当な濃度で基本培地に添加することができるが、例えば、図27の「Medium component」に記載された濃度(最終濃度)を選択することができる。
遺伝子名 ヒト マウス
BMP4 NM_001202 NM_007554
GDNF NM_000514 NM_010275
EGF NM_001963 NM_010113
SCF NM_000899 NM_013598
得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞(例えば、動物細胞、昆虫細胞、枯草菌、酵母、大腸菌など)に導入し、得られた形質転換体を培養して、その培養上清から、上記のタンパク質分離精製技術を適宜組み合わせて目的の組換えタンパク質を単離・精製することができる。また、BMP4、GDNF、EGFおよびSCFの組換えタンパク質は市販されている。
(a) 上記NCBI accession numbersに示されるcDNA配列によりコードされるアミノ酸配列と約90%以上の相同性を有するアミノ酸配列;
(b) 上記NCBI accession numbersに示されるcDNA配列によりコードされるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換および/または欠失および/または挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
(c) 上記NCBI accession numbersに示されるcDNA配列によりコードされるアミノ酸配列からなるヒトもしくはマウスタンパク質の他の哺乳動物におけるオルソログのアミノ酸配列;
(d) 上記NCBI accession numbersに示されるcDNA配列によりコードされるアミノ酸配列からなるヒトもしくはマウスタンパク質または上記(c)のオルソログのスプライスバリアント、アレル変異体もしくは多型(例、SNPなど)におけるアミノ酸配列;あるいは
(e) 上記(a)〜(d)のアミノ酸配列の一部(フラグメント)
を含み、かつ他の因子と組み合わせることにより、多能性幹細胞からGR細胞を分化誘導する能力を保持するタンパク質を意味する。
ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント(好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである)における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合(%)を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族アミノ酸(Ala、Leu、Ile、Val)、極性アミノ酸(Gln、Asn)、塩基性アミノ酸(Lys、Arg、His)、酸性アミノ酸(Glu、Asp)、水酸基を有するアミノ酸(Ser、Thr)、側鎖の小さいアミノ酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない(即ち、保存的アミノ酸置換である)ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている(例えば、Bowieら,Science, 247:1306-1310 (1990)を参照)。本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、GR細胞の分化誘導活性が保持される限り特に限定されない。
本分化誘導工程に用いられる培養器は、細胞培養用であれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。培養器は、培養法(浮遊培養法もしくは接着培養法)に応じて、細胞非接着性(低接着性)または細胞接着性とすることができる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面が、細胞(多能性幹細胞またはフィーダー細胞)との接着性を向上させる目的で、細胞支持用基質でコーティングされたものであり、そのような細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。
一方、ヒトの治療用途を念頭においた場合、Oct4およびVasa遺伝子座にレポーター遺伝子がノックインした多能性幹細胞の使用は望ましくないので、Oct4遺伝子およびVasa遺伝子自体の発現を検出する必要がある。この場合、Oct4発現に対応する未分化細胞表面マーカーおよびVasaタンパク質もしくはVasa発現に対応する生殖系細胞表面マーカーに対する各抗体とセルソータを用いて、細胞の表面抗原の表現型を解析することにより行うことができる。例えば、未分化細胞表面マーカーとしてはSSEA-1、フォルスマン抗原、β1-およびα6-インテグリン等が、生殖系細胞表面マーカーとしてはEpCAM、CD9、EE2、c-kit等が挙げられる。必要に応じて、Oct4や他の転写因子の発現についても調べることができる。
本発明のGR細胞の分化誘導剤は、さらに生理学的に許容される担体、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤などを含むこともできる。
上記のようにして得られるOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞(GR細胞)を、GDNF、EGF、SCFおよび塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)の存在下で培養することにより、Oct4陽性かつVasa陽性の性質を維持したまま、長期培養可能である。したがって、本発明はまた、GDNF、EGF、SCFおよびbFGFの存在下でGR細胞を培養することを含む、GR細胞の増幅方法を提供する。
好ましい一実施態様においては、表1に記載される培地添加物から選ばれる1以上の因子が、基本培地に添加されて用いられる。当業者はこれらの因子を適当な濃度で基本培地に添加することができるが、例えば、図27の「Medium component」に記載された濃度(最終濃度)を選択することができる。
(a) 上記NCBI accession numbersに示されるcDNA配列によりコードされるアミノ酸配列と約90%以上の相同性を有するアミノ酸配列;
(b) 上記NCBI accession numbersに示されるcDNA配列によりコードされるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換および/または欠失および/または挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
(c) 上記NCBI accession numbersに示されるcDNA配列によりコードされるアミノ酸配列からなるヒトもしくはマウスタンパク質の他の哺乳動物におけるオルソログのアミノ酸配列;
(d) 上記NCBI accession numbersに示されるcDNA配列によりコードされるアミノ酸配列からなるヒトもしくはマウスタンパク質または上記(c)のオルソログのスプライスバリアント、アレル変異体もしくは多型(例、SNPなど)におけるアミノ酸配列;あるいは
(e) 上記(a)〜(d)のアミノ酸配列の一部(フラグメント)
を含み、かつ他の因子と組み合わせることにより、GR細胞がその分化状態を維持したまま自己複製する能力を支持するタンパク質を意味する。
ここで「相同性」とは、GR細胞の分化誘導に用いられるBMP4などについて上記したのと同義である。上記(a)において、GR細胞の維持増幅に用いられるGDNF、EGF、SCFまたはbFGFは、より好ましくは、上記NCBI accession numbersに示されるcDNA配列によりコードされるアミノ酸配列と約95%以上、より好ましくは約97%以上、特に好ましくは約98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、GR細胞の維持増幅活性が保持される限り特に限定されない。
HGFやFGF9などの成長因子はそれぞれ、例えば約0.1 ng/ml以上、好ましくは約0.5 ng/ml以上、より好ましくは約1 ng/ml以上、特に好ましくは約5 ng/ml以上で、例えば約100 ng/ml以下、好ましくは約50 ng/ml以下、より好ましくは約30 ng/ml以下、特に好ましくは約20 ng/ml以下の濃度で、培地に添加することができる。また、IL-2等のインターロイキン類は、例えば約0.01 ng/ml以上、好ましくは約0.1 ng/ml以上、より好ましくは約0.5 ng/ml以上、特に好ましくは約1 ng/ml以上で、例えば約100 ng/ml以下、好ましくは約50 ng/ml以下、より好ましくは約30 ng/ml以下、特に好ましくは約20 ng/ml以下の濃度で、培地に添加することができる。
本培養工程に用いられる培養器は、細胞培養用であれば特に限定されず、GR細胞の分化誘導工程で用いられるものと同様の培養器が例示される。培養器は、培養法(浮遊培養法もしくは接着培養法)に応じて、細胞非接着性(低接着性)または細胞接着性とすることができる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面が、細胞(多能性幹細胞またはフィーダー細胞)との接着性を向上させる目的で、細胞支持用基質でコーティングされたものであり、そのような細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。
本発明のGR細胞の増幅支持剤は、さらに生理学的に許容される担体、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤などを含むこともできる。
本発明のGR細胞は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど)などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の剤は、例えば、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤、酸化防止剤などと配合しても良い。もちろん、GR細胞は、上記のGR細胞の維持増幅用培地に懸濁したものをそのまま製剤として用いてもよい。本発明の不妊治療剤を水性懸濁液剤として製剤化する場合、上記水性液に約1×106〜約1×108細胞/mLとなるように、GR細胞を懸濁させればよい。
本発明の雄性不妊治療剤は、幹細胞の凍結保存に通常使用される条件で凍結保存された状態で提供され、用時融解して用いることもできる。その場合、血清もしくはその代替物、有機溶剤(例、DMSO)等をさらに含んでいてもよい。この場合、血清もしくはその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが約1〜約30% (v/v)、好ましくは約5〜約20% (v/v) であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが0〜約50% (v/v)、好ましくは約5〜約20% (v/v) であり得る。
実験系として、レポーター遺伝子であるOct4-GFPとMvh (mouse vasa homolog)-RFPの導入により未分化細胞と生殖細胞がそれぞれ可視化されたトランスジェニックマウス(Oct4-GFP/Mvh-RFP Tgマウス)を使用した。Oct3/4(Oct4)は未分化細胞特異的発現遺伝子であり、マウスvasaは生殖細胞系譜特異的発現遺伝子であることが知られている。このマウス系統は、マウスOct4遺伝子の発現制御領域にGFP遺伝子を連結したレポータープラスミドDNAを受精卵に顕微注入して作製されたTgマウス (Oct4-GFP)、およびマウスMvhゲノム遺伝子にRFP遺伝子を挿入したBACクローンDNAを顕微注入したTgマウス (Mvh-RFP) の両者を自然交配することによって作製した。
初期化に使用するレトロウイルスは、前日に6 well培養プレート (Falcon) に1 well当り0.6 x 106で播種したPlat-E細胞(Morita, S. et al., Gene Ther. 7, 1063-1066)にレトロウイルス発現ベクター (pMXs-Oct3/4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4, pMXs-Nanog) を個々に導入して作製した。培養液はDMEM/10% FCS (DMEM (Nacalai tesque) にウシ胎仔血清を10%加えたもの) を使用し、37℃、5% CO2で培養した。ベクターの導入のためにFuGene6 transfection reagent (Roche) 4.5 μLをOpti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen) 100 μLに入れ、室温で5分間静置した。その後、各発現ベクターを1.5 μg加え、さらに室温で15分静置してからPlat-E細胞の培養液に加えた。2日目にPlat-E細胞の培養上清を新しい培地に換え、3日目に培養上清を回収して0.45 μm sterile filter (Whatman) で濾過し、polybrene (Nacalai) を4 μg/mLとなるように加えてウイルス液とした。
前述のOct4-GFP/Mvh-RFP Tgマウスの胎仔(受精後13.5日)から、線維芽細胞(MEF)を単離した。このMEFを0.1% ゼラチン (Sigma) でコートした6 well培養プレート (Falcon) に1 well当り1 x 105で播種した。培養液はDMEM/10% FCSを使用し、37℃、5% CO2で培養した。翌日、レトロウイルス液を加え、一晩感染させて遺伝子を導入した。遺伝子導入は、Oct3/4, Sox2, Klf4およびNanogの4種の遺伝子導入と、Oct3/4, Sox2およびKlf4の3種の遺伝子導入を行った。
ウイルス感染後3日目からLIFを加えたES細胞用培地(DMEM (Nacarai tesque) に15% ウシ胎仔血清、2 mM L-グルタミン (Invitrogen)、100 μM 非必須アミノ酸(Invitrogen)、100 μM 2-メルカプトエタノール (Invitrogen)、50 U/mL ペニシリン (Invitrogen) と50 μg/mL ストレプトマイシン (Invitrogen) を加えたもの)を用いて培養した。感染後5日目にMEFの培地を除き、PBS 1 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらES細胞用培地を加えて懸濁し、5 x 103個の細胞を、あらかじめフィーダー細胞を蒔いておいた100 mm dishに蒔いた。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞(McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990))を用いた。以後コロニーが観察できるようになるまで2日ごとにES細胞用培地の交換を行った。感染から17日目のiPS細胞コロニーの写真を図1に示す。4遺伝子導入、3遺伝子導入いずれの場合も、Oct3/4-GFP陽性で、かつMvh-RFP陰性のiPS細胞コロニーが樹立できた。
これらのiPSクローンについて常法によりGenomic PCR解析を行った結果、いずれのクローンにおいても導入した外来遺伝子の組み込みが確認された(図2)。
また、各iPSクローンにおける未分化マーカーの発現を、Rever Tra Ace kit(Takara)を使用してRT-PCR解析を行うことにより調べた。結果を図3に示す。各iPSクローンは、ES細胞やNanog-iPS(Nature, 448, 313-317 (2007))と同等の未分化マーカーの発現を示した。
次に、Cell, 126, 663-676 (2006) に記載の方法に従ってテラトーマを形成させた。具体的には、1 x 106個のiPS細胞を免疫不全マウスの皮下に注射し、4週間後にテラトーマを単離した。テラトーマを切り刻んで4% フォルムアルデヒドを含有するPBS(-)で固定した。パラフィン包埋組織をスライスし、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。結果を図4に示す。組織学的に見ると、腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、神経組織、表皮組織、筋肉組織、軟骨組織、脂肪組織、および腸管様上皮組織が認められたことから、樹立したiPS細胞の多能性が証明された。
樹立したiPS細胞の分化誘導を行うために、DMEM/10% FCSを使用して胚様体 (EB) 形成を行った。具体的には、培養液1 mL当り5 x 105個のiPS細胞を6 wellの低細胞接着性培養プレート (Nunc) に播種し、2日毎に培地交換を行った。培養14日目の写真を図5に示す。同じOct4-GFP/Mvh-RFP TgのES細胞由来のEB中には部分的にMvh-RFP陽性の生殖細胞の分化が認められたが、iPS細胞由来のEB中にはMvh-RFP陽性の細胞は確認されなかった。
そこで、iPS細胞の生殖細胞分化を誘導する培養条件を確立するために、分化支持細胞としてPNAS, 100, 11457-11462 (2003) で使用されたM15-BMP4細胞の改良を行った。前述の方法でPlat-E細胞にグリア細胞由来神経栄養因子 (GDNF)、細胞膜結合型幹細胞因子 (mSCF)、上皮細胞成長因子 (EGF)の レトロウイルス発現ベクター (pMXs-GDNF-IP, pMXs-mSCF-IP, pMXs-EGF-IP) を導入し、得られたウイルス液をM15-BMP4細胞に感染させた。ウイルス感染細胞を選択するために0.2 mg/mL ネオマイシンおよび2.5 μg/mL ピューロマイシン存在下で培養を行い、増殖し続ける細胞を新たにM15-4GFと命名した。M15-4GFの形態とRT-PCRの結果を図6に示す。RT-PCRによって、M15-4GFではBMP4に加えて遺伝子導入したGDNF、mSCF、EGFが高発現していることを確認した。
さらに、生殖細胞の分化誘導に適した培地作製を行った。組成を図27に示す。
Neurobasal medium (Invitrogen) を基礎培地として、最終濃度で1x B-27 Supplement (Invitrogen)、1 x Penicillin-Streptomycin-Glutamine (Invitrogen)、5 mg/mL Bovine Albumin (MP Biomedicals)、0.1 mM Non-Essential Amino Acids (Invitrogen)、1 mM Sodium Pyruvate (Invitrogen)、1x Vitamin Solution (Invitrogen)、1x Insulin-Transferrin-Selenium Supplement (Invitrogen)、6 mg/mL D-(+)-Glucose (Sigma)、60 ng/mL Progesteron (Sigma)、30 ng/mL β-Estradiol (Sigma)、55 μM 2-Mercaptoethanol (Invitorgen)、0.34 μL/mL Sodium DL-lactate (Sigma)、60 μg/mL Putrescine dihydrochloride (Sigma)、0.1% FCS (Invitorgen) を添加した(図中「Medium component」)。また、分化誘導後の細胞の維持培養には、上記培養液に最終濃度で15 ng/mL GDNF (R&D systems)、20 ng/mL EGF (AUSTRAL Biologicals)、12.5 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF) (Wako)、10 ng/mL SCF (R&D systems)、10 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) (PEPROTECH)、5 ng/mL interleukin-2 (IL2) (Roche)、12.5 ng/mL fibroblast growth factor 9 (R&D systems)、10 μM Forskolin (Sigma)、0.1 μM Testosterone (Sigma)、0.4x StemPro Supplement (Invitrogen)(図中「Supplement」)を添加した。
生殖細胞分化誘導を行うために、iPS細胞とM15-4GF細胞を培養液1 mL当り各々5×105個となるように増殖因子(Supplement)無添加の上記培養液中で混合し、6 wellの低細胞接着性培養プレートに播種した。2日毎に培地交換を行いながら浮遊培養を行ったところ、細胞塊中にMvh-RFP陽性細胞の分化が確認された。培養28日目に浮遊細胞塊を15 mLチューブに回収し、PBSで洗浄後に0.25% Trypsin/1 mM EDTAと0.2 mg/mL collagenase IV (Invitrogen) を加えて、37℃で15分間程度反応させた。DMEM/10% FCSを加えて懸濁後に遠心 (1000 rpm) し、維持培養用の増殖因子(Supplement)添加培養液に置換した。M15-4GF細胞を除去するために、細胞懸濁液をゲラチンコートした培養プレート上に播種して30分から1時間程度静置した後に浮遊細胞を回収し、マイトマイシンC処理したMEF feeder細胞 (Millipore) 上に播種して培養を行った。その結果、Oct4-GFP陽性/Mvh-RFP陽性のコロニーの形成が観察された(図7)。
Oct4-GFP陽性/Mvh-RFP陽性のコロニーを形成する細胞は上記培養条件下で安定に増殖し、未分化iPS細胞とは異なる形態を示した(図8)。また、未分化細胞と生殖細胞に共通する細胞表面マーカーであるalkaline phosphataseの活性が認められた(図9)。
このOct4-GFP陽性/Mvh-RFP陽性コロニーを、iPS細胞用の培養条件(DMEM/10% FCS)やBiol. Reprod, 69, 612-616 (2003) に記載されているGS細胞用の培養条件(GDNF、LIF、EGFおよびbFGF添加)で培養した場合、上記培養条件下に比べて増殖速度は低下し、部分的な細胞死やMvh-RFP蛍光強度の低下が認められた (図10)。また、未分化iPS細胞を分化誘導過程を経ずに直接上記維持培養条件下で培養した場合には、体細胞分化に伴うOct4-GFPの縮退や細胞死は観察されるものの、Mvh-RFPの誘導は認められなかった (図11)。
上記培養条件で浮遊細胞塊を解離、培養した際に、Oct4-GFP陽性/Mvh-RFP陽性の生殖細胞様細胞に加えて、Oct4-GFP陽性/Mvh-RFP陰性の未分化様の細胞も分離、安定増殖することが出来た(図12)。以降、Oct4-GFP陽性/Mvh-RFP陽性細胞を「GR細胞」と称し、Oct4-GFP陽性/Mvh-RFP陰性細胞を「Gsp細胞」と称することとした。
GR細胞とGsp細胞に対してGenomic PCR解析を行ったところ、iPS細胞作製時に導入した外来遺伝子の組み込みが確認された。過去にES細胞から分化誘導、樹立されたOct4-GFP陰性/Mvh-RFP陽性の生殖細胞様細胞株であるEK細胞では外来遺伝子は認められなかったのに対して、GR細胞とGsp細胞はiPS細胞由来であることが示された (図13)。また、サザンブロット解析が示す外来遺伝子のバンドパターンから、GR細胞とGsp細胞がiPS細胞と同一クローン由来であることも確認された (図14)。しかし、GR細胞ではSox2の外来遺伝子が一つ欠損していることが明らかとなった。
24 well培養プレートにあらかじめ播種したマイトマイシンC処理MEF feeder細胞上に1 well当たり2.5×103個となるように未分化iPS細胞とGR細胞をそれぞれ播種し、2日毎に総細胞数を測定した結果、GR細胞はiPS細胞に比べて増殖速度が1/2程度であることが分った (図15)。また、GR細胞の増殖におけるfeeder細胞依存性を調べる為に、6 well培養プレートをゲラチン、ラミニン、またはファイブロネクチンでコーティングし、1 well当たり1×104個となるようにGR細胞を播種した。その結果、MEF feeder細胞上に播種した際にはGR細胞はコロニーを形成しながら増殖するのに対し、feeder freeの条件ではどの細胞外マトリックスを用いた場合においても細胞がほとんど接着することがなく、コロニー形成も認められなかった (図16)。
腫瘍細胞や未分化なiPS細胞を免疫不全のnu/nuマウス皮下に移植すると、移植部位において腫瘍を形成する。一方、精子幹細胞株であるGS細胞の移植においては腫瘍の形成は認められないことが知られている。そこでGR細胞およびGsp細胞を免疫不全マウスに移植し、腫瘍形成の有無を調べた。その結果、Gsp細胞を移植した場合、iPS細胞に比べてサイズは小さいが腫瘍化することが分かった。一方、GR細胞を移植した場合には、ES細胞由来のEK細胞と同様に腫瘍形成は認められず、GR細胞は胚性腫瘍 (EC) 細胞のように腫瘍化した細胞ではないことが示された (図17)。
分化誘導に使用したiPS細胞はレトロウイルスによって外来遺伝子を導入していることから、レトロウイルスの再活性化によって不死化した細胞が得られた可能性も考えられる。そこで、RT-PCRによって導入した外来遺伝子とそれに対応する内在性遺伝子の発現を解析した。その結果、導入した外来遺伝子の異常な遺伝子発現の向上は認められなかった (図18)。また、リアルタイムPCRによって遺伝子発現を定量化したところ、GR細胞における外来遺伝子の発現は未分化iPS細胞と比較してむしろ低下していることが分かった (図19)。
続いて、GR細胞における生殖細胞マーカー遺伝子の発現をRT-PCRで調べた。BMC Dev. Biol., 6, 34 (2006) にあるように、GS細胞ではECAT1やFgf4の発現が抑制されていることが判明しているが、GR細胞ではそれらの遺伝子発現はまだ抑制されていなかった。また、生体内の細胞では発現が認められないERasが発現しており、GR細胞が株化された培養細胞であることが示された。GR細胞ではPrdm14、Mvh、Plzf、c-Retなどの発現が上昇している一方で、Stra8、Ngn3などの発現は低下していた。結果を図20、21に示す。
また、DNAマイクロアレイを用いてiPS細胞とGR細胞の網羅的な遺伝子発現の比較を行ったところ、マトリックスメタロプロテアーゼやケモカイン関連の遺伝子の発現が上昇し、細胞外マトリックスであるケラチンや細胞接着因子のクローディンなどの発現が低下していることが分かった。この結果から、GR細胞では移動期の始原生殖細胞のように細胞の移動活性が高まっていることが示唆された (図22)。
また、生殖細胞マーカー遺伝子のタンパク質発現をウエスタンブロットによって解析した。結果を図23に示す。GR細胞はOct4-GFP陽性であり、RT-PCRによって内在性Oct4遺伝子の転写も確認されていたにも関わらず、タンパク質レベルでは抑制を受けていることが分かった。また、GR細胞ではNanog、ECAT1、Mvh、Dnmt3Lのタンパク質発現が上昇していた。
続いて、Bisulphite genomic sequencingによってDNAのメチル化状態を解析した。結果を図24に示す。EK細胞では雌性インプリント遺伝子であるIgf2r、SNRPN、Lit1のメチル化制御領域が脱メチル化状態であり、雄性インプリント遺伝子であるH19は高メチル化状態であることから、雄型のインプリント状態を獲得していることが分かった。一方、GR細胞では雌性インプリント遺伝子のメチル化制御領域は体細胞パターンを示しており、胎仔生殖原基において誘導されるゲノムインプリントの消去が未だ行われていないことが分かった。以上の遺伝子発現とDNAのメチル化状態を総合的に解釈すると、GR細胞は移動後期(胎仔生殖原基に進入直前、または直後)の始原生殖細胞の特性を反映した細胞株であることが推測された。
GR細胞の精子形成能の有無を調べるために、Biol. Reprod, 69, 612-616 (2003) に記載されている方法に従って、c-kit遺伝子の変異によって生殖細胞を欠損した不妊モデルマウスであるW/Wvマウスの精巣へのGR細胞の移植を行った(京都大学医学部・篠原隆司教授の協力による)。具体的には、GR細胞を3×107個/mLとなるようにDMEM/10% FCS中に懸濁し、W/Wvマウス新生仔の精細管内に注射した。4カ月後に移植個体から精巣を摘出し、4% フォルムアルデヒドを含有するPBS(-)で固定した。パラフィン包埋組織をスライスし、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。結果を図25に示す。細胞移植を行っていないW/Wvマウス精巣は、セルトリオンリーと呼ばれる生殖細胞を欠損した組織像を示すが、GR細胞を移植した場合には移植細胞の生着が認められた。生着した移植細胞はテラトーマ形成を示さず、また明瞭な腫瘍化も観察されなかった。
非生殖細胞を移植した場合は、精巣内環境に適応できずに死滅、あるいは排除されてしまう。一方、未分化なiPS細胞や腫瘍細胞を移植した場合には腫瘍が形成されてしまう。前記のようにGR細胞の移植においては、4ヶ月という長期に渡って細胞が精巣内に維持されており、かつ腫瘍化が認められなかったことから、GR細胞が生殖系細胞として運命決定された細胞であることが示された。しかしながら正常な精子形成像とも異なっており、TUNEL染色の結果、本来減数分裂後の成熟した精子細胞が存在する管腔において、アポトーシスによる細胞死が誘導されていることが明らかとなった。
本培養条件を用いて、これまでにiPS細胞から計5株のGR細胞を独立した実験から樹立することに成功している。また、本条件はiPS細胞に対してだけではなくES細胞にも適用可能であり、ES細胞を用いて同様に分化誘導を行った場合においてもOct4-GFP陽性/Mvh-RFP陽性細胞を樹立することが出来た(図26)。
Claims (23)
- (a)骨形成タンパク質4(BMP4)、並びに(b)グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、上皮細胞成長因子(EGF)および幹細胞因子(SCF)から選ばれる1以上の成長因子の存在下で多能性幹細胞を培養することを含む、Oct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞の製造方法。
- BMP4、GDNF、EGFおよびSCFの存在下で多能性幹細胞を培養することを含む、請求項1記載の方法。
- フィーダー細胞の存在下で多能性幹細胞を培養することを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- 前記成長因子がフィーダー細胞から提供されることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 多能性幹細胞がiPS細胞またはES細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載に方法。
- 多能性幹細胞がヒトまたはマウス由来である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法により得られた、iPS細胞由来のOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞。
- (a)BMP4、並びに(b)GDNF、EGFおよびSCFから選ばれる1以上の成長因子を組み合わせてなる、多能性幹細胞からOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞への分化誘導剤。
- BMP4、GDNF、EGFおよびSCFを組み合わせてなる、多能性幹細胞からOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞への分化誘導剤。
- 前記成長因子を産生する細胞を含有してなる、請求項8または9記載の剤。
- 請求項8または9記載の剤が添加されてなる、多能性幹細胞からOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞への分化誘導用培地。
- Oct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞の増幅方法であって、GDNF、EGF、SCFおよび塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)の存在下で、該生殖系幹細胞を培養することを含む、方法。
- 肝細胞成長因子(HGF)、インターロイキン-2(IL-2)および線維芽細胞成長因子9(FGF9)から選ばされる1以上の因子がさらに存在する条件下で、前記生殖系幹細胞を培養することを含む、請求項12記載の方法。
- 前記生殖系幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することを特徴とする、請求項12または13記載の方法。
- 前記生殖系幹細胞が多能性幹細胞から分化誘導されたものである、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- GDNF、EGF、SCFおよびbFGFを組み合わせてなる、Oct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞の増幅支持剤。
- HGF、IL-2およびFGF9から選ばされる1以上の因子をさらに組み合わせてなる、請求項16記載の剤。
- 請求項16または17記載の剤が添加されてなる、Oct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞の増幅用培地。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法により得られたOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞、請求項7記載のOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞、または請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法により増幅されたOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞を、該細胞と同種の不妊動物の精巣に移植することを含む、該不妊動物に精子を形成させる方法。
- 生殖系幹細胞が不妊動物の体細胞から作製したiPS細胞由来である、請求項19記載の方法。
- 不妊動物がヒトまたはマウスである、請求項19または20記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法により得られたOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞、請求項7記載のOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞、または請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法により増幅されたOct4陽性かつVasa陽性の生殖系幹細胞を含有してなる、雄性不妊治療剤。
- 精子幹細胞の採取が困難な個体を投与対象とする、請求項22記載の剤。
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