ES2525684T3 - Sistemas de cultivo de células madre - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para mantener células madre en un estado indiferenciado, comprendiendo el procedimiento incubar dichas células con un sistema de cultivo que comprende células alimentadoras, en el que las células alimentadoras en el sistema de cultivo consisten esencialmente en células alimentadoras de fibroblastos expandidas de células del cordón umbilical humano y en el que dicho sistema de cultivo no tiene agentes antibacterianos ni agentes antifúngicos, en el que: (a) las células madre no son células madre embrionarias humanas; (b) las células madre son células madre hematopoyéticas obtenidas de tejido de médula ósea de un individuo de cualquier edad o de sangre del cordón de un individuo neonato; o (c) las células madre son células germinales embrionarias obtenidas del tejido genital de un feto en cualquier momento durante la gestación.

Description

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DESCRIPCIÓN

Sistemas de cultivo de células madre

Campo de la invención

La divulgación se refiere a células madre (SC) en particular a procedimientos y sistemas para manipular células madre embrionarias humanas (hESC).

Lista de la técnica anterior

La siguiente es una lista de la técnica anterior, que se considera pertinente para describir el estado de la técnica en el campo de la invención.

(1)

Thomson, J.A. y col. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147 (1998).

(2)

Reubinoff, B.E., Pera, M.F., Fong, C.Y., Trounson, A. y Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol 18, 399-404 (2000)

(3)

Amit, M. y col. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev Biol 227, 271-278 (2000).

(4)

Xu, C. y col. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001).

(5)

Amit, M. y col. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol Reprod 68, 2150-2156 (2003).

(6)

Richards, M., Fong, C.Y., Chan, W.K., Wong, P.C. y Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat Biotechnol 20, 933-936 (2002).

(7)

Cowan, C.A. y col. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med 350, 13531356 (2004).

(8)

Amit, M., Shariki, C., Margulets, V. y Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and Serum-Free Culture of Human Embryonic Stem Cells. Biol Reprod 70(3): 837-45 (2004).

(9)

Pera, M.F. y col. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J Cell Sci 117, 1269-1280 (2004).

(10)

Documento GB2409208.

(11)

Documento WO 04/031343

(12)

Xu, R.H., y col. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 3, 164-5 (2005)

(13)

Vallier L, y col. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J Cell Sci. 118, 4495-509 (2005)

Antecedentes de la invención

Las células madre son células inmaduras, no especializadas, que se renuevan durante periodos largos mediante división celular. En ciertas condiciones, se pueden diferenciar en células maduras, funcionales. Las células madre embrionarias humanas (hESC) derivan de blastocistos humanos sobrantes tempranos1,2. Las células ES humanas son células madre únicas porque pueden auto-renovarse infinitamente en cultivo, y ya que tienen un potencial notable para desarrollarse en linajes extraembrionarios así como todas las células somáticas y tejidos del cuerpo humano1,2.

Dadas las propiedades únicas de las hESC, se espera que tengan aplicaciones de largo alcance en las áreas de la investigación científica básica, farmacología y medicina regenerativa. Las líneas celulares ES humanas pueden proporcionar un potente modelo in vitro para el estudio de la biología molecular y celular del desarrollo humano temprano, para la genómica funcional, exploración y descubrimiento de fármacos. Pueden servir para exploración de alto rendimiento de toxicología y teratogenicidad. Dado que las hESC pueden auto-renovarse indefinidamente y pueden diferenciarse en cualquier tipo celular, pueden servir como una fuente donante renovable, ilimitada, de células o tejidos diferenciados funcionalmente maduros para terapias de trasplante. Además, las hESC modificadas genéticamente trasplantadas pueden actuar como vectores para transportar y expresar genes en órganos diana en el transcurso de la terapia génica.

Aunque la promesa de las hESC para la investigación científica básica, farmacología y medicina regenerativa es notable, el aprovechamiento de las hESC para la mayoría de las aplicaciones depende de un desarrollo adicional. Se requiere un control mejorado del crecimiento de las hESC indiferenciadas, el desarrollo de cultivos sin alimentadores a granel de células indiferenciadas, el desarrollo de sistemas de cultivo sin animales, y el desarrollo de procedimientos y herramientas que dirijan la diferenciación y generen cultivos puros de células funcionales maduras de un tipo específico.

En la actualidad, pocos sistemas de cultivo se usan más habitualmente para propagar hESC indiferenciadas1-4. En el sistema de cultivo inicial que se ha desarrollado, se cultivan hESC indiferenciadas en medio que contiene suero como colonias, sobre una capa de células alimentadoras de fibroblastos (de origen de ratón1,2 o humano5,11). Es posible retirar todos los productos animales de este sistema de cultivo y reemplazarlos con los de una fuente

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humana6. Se ha descubierto que en este sistema las células se propagan como grupos a una escala baja que no permite clonación2.

Un sistema de cultivo alternativo que se ha desarrollado y se usa extensivamente es un sistema sin suero que incluye el medio de anulación (KO) complementado con reemplazo de suero de anulación (KOSR) y FGF2. Este sistema permite la clonación de hESC indiferenciadas, aunque con una baja eficacia3. Se cultivan células indiferenciadas como colonias planas y pueden propagarse como grupos pequeños o células individuales (usando tripsina7).

Otro sistema de cultivo alternativo para su uso en la proliferación de crecimiento indiferenciado de hESC comprende una matriz de cultivo que comprende matriz extracelular (ECM) preparada a partir de células alimentadoras y un medio acondicionado que se pre-acondiciona por células alimentadoras. Las células principales sugeridas en las células alimentadoras incluyen fibroblastos embrionarios de ratón primarios (PMEF), una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), fibroblastos fetales murinos (MFF), fibroblastos embrionarios humanos (HEF), músculo fetal humano (HFM), células cutáneas fetales humanas (HFS), células cutáneas adultas humanas, fibroblastos de prepucio humano (HFF)10, células epiteliales de trompas de Falopio adultas humanas (HAFT) o células del estroma de la médula ósea humana (HMSC).

Puede conseguirse propagación indiferenciada con el sistema de cultivo sin suero KO sin el uso de alimentadores sembrando en placas y cultivando colonias con matrices extracelulares (ECM) dentro de un medio KO acondicionado con alimentador complementado con KOSR y FGF24. Además se ha sugerido que el acondicionamiento de alimentador puede reemplazarse sustituyendo el medio con altas concentraciones de FGF2 y noggina12. Como alternativa, se reemplazó el acondicionamiento de alimentador por el factor de crecimiento transformante 1 y LIF humano (además de FGF2) y cultivando las células en fibronectina humana8. En una publicación reciente, se ha presentado la propagación indiferenciada de colonias de hESC, en ausencia de alimentadores con un medio químicamente definido sin reemplazo de suero, complementado con activina o nodal más FGF213.

Una limitación clave de los sistemas de cultivo del hESC es que no permite la propagación de poblaciones puras de células madre indiferenciadas y su uso siempre implica algún nivel de diferenciación de fondo. Las células madre más habitualmente siguen una ruta de diferenciación por defecto a un tipo celular epitelial que crece como una monocapa de células escamosas planas o forma estructuras quísticas. Más probablemente, esta forma de diferenciación representa la diferenciación de hESC en endodermo extraembrionario9.

La diferenciación espontánea de hESC en linajes supuestamente extraembrionarios también interfiere con la derivación de células diferenciadas somáticas. En diversas condiciones inductoras de diferenciación, tales como en cultivos en suspensión de cuerpos embrioides (EB), la diferenciación en estructuras extraembrionarias quísticas puede ser común o puede predominar y limitar la diferenciación en linajes somáticos. El control y la eliminación de la diferenciación en linajes extraembrionarios pueden, por lo tanto, ser de valor incalculable en la derivación de linajes somáticos, además de su importancia en el mantenimiento de las células madre en un estado indiferenciado. Se ha demostrado recientemente que en condiciones de cultivo inductoras de diferenciación, el antagonista de la proteína morfogenética del hueso (BMP) noggina puede prevenir la diferenciación extraembrionaria de hESC y promover su diferenciación en el linaje neural9.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un cultivo celular que comprende células obtenidas de tejido del cordón umbilical humano, siendo las células derivadas del cordón umbilical humano capaces de mantener células madre (SC) en un estado indiferenciado cuando se co-cultivan con las mismas. Las células derivadas del cordón umbilical humano se usan preferentemente como células alimentadoras en cultivos de SC.

La invención también proporciona un primer sistema de cultivo para el mantenimiento de SC en un estado indiferenciado, comprendiendo el sistema de cultivo células alimentadoras expandidas de células del cordón umbilical humano, células de fibroblastos embrionarios humanos (HEF) y una combinación de los mismos. De acuerdo con una realización preferida, el sistema de cultivo comprende las células alimentadoras derivadas del cordón umbilical humano de la invención.

La divulgación también proporciona un procedimiento para mantener SC en un estado indiferenciado, comprendiendo el procedimiento incubar dichas células con un sistema de cultivo que comprende células alimentadoras expandidas a partir de células de cordón umbilical humano, células de fibroblastos embrionarios humanos (HEF) o una combinación de los mismos.

El uso de células alimentadoras expandidas a partir de células derivadas del cordón umbilical humano, células de fibroblastos embrionarios humanos (HEF) y una combinación de los mismos para la preparación de un sistema de cultivo para el mantenimiento de SC en un estado indiferenciado también forma parte de la divulgación.

De acuerdo con un segundo aspecto, la divulgación proporciona un segundo sistema de cultivo adicional para inhibir

o prevenir la diferenciación de SC en células extraembrionarias, comprendiendo el sistema de cultivo nicotinamida

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(NA) o un derivado de NA que tiene un efecto inhibidor en la diferenciación de células madre en células extraembrionarias similar al de la NA.

De acuerdo con este segundo aspecto, también se proporciona un procedimiento para inhibir o prevenir la diferenciación de células madre en células extraembrionarias, comprendiendo el procedimiento incubar dichas células madre en un sistema de cultivo que comprende NA o un derivado de NA que tiene un efecto inhibidor en la diferenciación de células madre en células extraembrionarias similar al de la NA.

Además de acuerdo con este aspecto se proporciona el uso de NA o un derivado de NA que tiene un efecto inhibidor en la diferenciación de SC en células extraembrionarias similar al de la NA para la preparación de un sistema de cultivo para inhibir o prevenir la diferenciación de SC en células extraembrionarias.

En un tercer aspecto de la divulgación se proporciona un tercer sistema de cultivo adicional, un sistema de cultivo humanizado para el mantenimiento de SC en un estado indiferenciado, comprendiendo el sistema de cultivo un medio de cultivo de células madre básico sin animales y sustituto de reemplazo de suero humanizado.

De acuerdo con este aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento para mantener células madre en un estado indiferenciado, comprendiendo el procedimiento incubar dichas células con un sistema de cultivo que comprende medio de cultivo básico de células madre sin animales y sustituto de reemplazo de suero humanizado.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención se proporciona un sistema de cultivo para el mantenimiento de SC en un estado indiferenciado, comprendiendo el sistema de cultivo medio Neurobasal™.

De acuerdo con este aspecto de la divulgación se proporciona un procedimiento para mantener un cultivo de SC en un estado indiferenciado, comprendiendo el procedimiento incubar dichas células con un sistema de cultivo que comprende medio Neurobasal™ así como el uso de medio Neurobasal™ para la preparación de un sistema de cultivo para mantener una suspensión de células madre en un estado indiferenciado.

Las SC pueden mantenerse en el sistema de cultivo basado en Neurobasal™ en forma de una suspensión así como en una monocapa (colonias planas). Preferentemente, el medio Neurobasal™ se complementa con complemento de N2 o un complemento de tipo N2 como se define posteriormente.

Finalmente, se proporciona un procedimiento para mantener SC en un estado indiferenciado que comprende cultivar SC con células alimentadoras expandidas de células del cordón umbilical humano.

Breve descripción de los dibujos

Para entender la invención y para ver cómo puede llevarse a cabo en la práctica, se describirá ahora una realización preferida, solamente como ejemplo no limitante, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

Las Figuras 1A-1D son imágenes de contraste de fases de cultivo primario de fibroblastos del cordón (Fig. 1A), fibroblastos embrionarios humanos (Fig. 1B), fibroblastos derivados del cordón umbilical (Fig. 1C) y del prepucio (Fig. 1D).

Las Figuras 2A-2F son imágenes inmunofluorescentes de fibroblastos del cordón umbilical, prepucio y embrionarios humanos teñidos con anticuerpo anti-vimentina (Figs. 2A, 2C y 2E, respectivamente) y la contra tinción nuclear de DAPI correspondiente (Figs. 2B, 2D y 2F) que muestra que los alimentadores humanos expresan vimentina.

La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra el análisis de FACS del porcentaje de alimentadores que expresan CD44 y que son inmunorreactivos con anticuerpo anti-fibroblastos que indica que un alto porcentaje de los alimentadores que derivan de las tres fuentes expresan CD44 y son inmunorreactivos con anticuerpos antifibroblastos.

Las Figuras 4A-4B son análisis representativos de una placa de metafase de fibroblastos embrionarios humanos (Fig. 4A) y prepucio (Fig. 4B) que muestran que los alimentadores humanos tienen un cariotipo normal.

Las Figuras 5A-5C son imágenes de contraste de fases de colonias de hESC indiferenciadas que se cultivan en tres tipos de alimentadores humanos, en alimentadores derivados del cordón umbilical (Fig. 5A), fibroblastos embrionarios humanos (Fig. 5B) y en alimentadores derivados de prepucio (Fig. 5C).

Las Figuras 6A-6L son histogramas de FACS representativos de la expresión de marcadores por hESC cultivadas en los tres tipos de fibroblastos alimentadores, incluyendo expresión de SSEA4, TRA1-60, TRA1-81 y SSEA1 por hESC en alimentadores derivados del cordón (Figs. 6A-6D, respectivamente) por hESC en fibroblastos embrionarios humanos (Figs. 6E-6H, respectivamente) o por hESC en prepucio (Fig. 6I-6L, respectivamente).

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Las Figuras 7A-7C son imágenes inmunofluorescentes de colonias de hES que expresan AP, cuando se cultivan en células alimentadoras derivadas de prepucio (Fig. 7A), en células alimentadoras derivadas de cordón umbilical (Fig. 7B) y en células de fibroblastos embrionarios humanos (Fig. 7C).

Las Figuras 8A-8F son imágenes inmunofluorescentes (Figs. 8A, 8B y 8C) y la contra tinción nuclear de DAPI correspondiente (Figs. 8D, 8E y 8F) de colonias de hESC que expresan Oct4 cuando se cultivan en células de fibroblastos embrionarios humanos (Figs. 8A y 8D, cultivadas durante 6 semanas), en alimentadores derivados de prepucio (Figs. 8B y 8E, cultivados durante 1 semana) y en células alimentadoras derivadas de cordón umbilical (Figs. 8C y 8F, cultivadas durante 10 semanas).

La Figura 9 es un gráfico de barras que representa el análisis de FACS del porcentaje de hESC cultivadas en dos líneas celulares alimentadoras derivadas de cordón independientes (CORD y CORD2), y que expresan los marcadores indicados de células madres pluripotenciales indiferenciadas en niveles de pase temprano (1-5) y tardío (6-10), que muestra que el porcentaje de hESC que expresa estos marcadores es estable durante la propagación, como se determina después de 5, 8, 4 y 9 semanas de cultivo (5S, 8S, 4S y 9S).

La Figura 10 es un gráfico de barras que representa el análisis de FACS del porcentaje de hESC cultivadas en dos líneas celulares alimentadoras derivadas de prepucio independientes (OR2 y OR4), y que expresan los marcadores indicados de células madre pluripotenciales indiferenciadas en niveles de pase temprano (1-5) y tardío (6-10), que muestra que el porcentaje de hESC que expresa estos marcadores es estable durante la propagación, como se determina después de 3, 6 y 8 semanas de cultivo (3S, 6S y 8S).

La Figura 11 es un gráfico de barras que representa el análisis de FACS del porcentaje de hESC cultivadas en dos líneas celulares alimentadoras de fibroblastos embrionarios humanos independientes (HEF1 y HEF2), y que expresan los marcadores indicados de células madre pluripotenciales indiferenciadas en niveles de pase temprano (1-5) y tardío (6-10), que muestra que el porcentaje de hESC que expresa estos marcadores es estable durante la propagación, como se determina después de 2, 5 y 10 semanas (2S, 5S y 10S).

La Figura 12 es un gráfico de barras que representa el análisis del porcentaje de hESC cultivadas en dos líneas celulares alimentadoras derivadas del cordón independientes (CORD1 y CORD2), y que expresan Oct4 en niveles de pase temprano (1-5) y tardío (6-10), y que se descubrió que eran estables durante la propagación, como se determina después de 2, 3, 7 y 10 semanas (2S, 3S, 7S y 10S).

La Figura 13 es un gráfico de barras que representa el análisis del porcentaje de hESC cultivadas en dos líneas celulares alimentadoras derivadas del prepucio independientes (OR2 y OR4), y que expresan Oct4 en niveles de pase temprano (1-5) y tardío (6-10), y que se descubrió que eran estables durante la propagación, como se determina después de 1, 2, 5 y 9 semanas (1S, 2S, 5S y 9S).

La Figura 14 es un gráfico de barras que representa el análisis del porcentaje de hESC cultivadas en dos líneas celulares de fibroblastos embrionarios humanos independientes (HEFG1 y HEGF2), y que expresan Oct4 en niveles de pase temprano (1-5) y tardío (6-10), y que se descubrió que eran estables durante la propagación, como se determina después de 1 y 6 semanas (1S y 6S).

Las Figuras 15A-15I son imágenes inmunofluorescentes de células diferenciadas derivadas de EB que expresan -tubulina (Figs. 15A, 15D y 15G), AFP (Figs. 15B, 15E y 15H), desmina (Figs. 15C y 15I), o actina muscular (m-actina, Fig. 15F) cuando se cultivan en alimentadores derivados de cordón (Figs. 15A-15C); en fibroblastos embrionarios humanos (Figs. 15D-15F); y en alimentadores derivados de prepucio (Figs. 15G-15I).

La Figura 16 es un gráfico de barras que muestra el efecto de bFGF a la concentración indicada en el número de células que se recogieron por matraz en el momento de la división del cultivo como se muestra.

Las Figuras 17A-17D son imágenes de contraste de fases de alimentadores derivados del cordón, que muestran el efecto de bFGF en su morfología después de la propagación prolongada en presencia de suero sin complementación de bFGF (Fig. 17A) o con las dos concentraciones indicadas de complementaciones de bFGF (Fig. 17B y Fig. 17C), también se muestra el análisis de FACS del porcentaje de alimentadores que expresan CD44 y que son inmunorreactivos con anticuerpo anti-fibroblastos (ab anti-fib) (Fig. 17D). Se realizó un análisis en el pase 10 en presencia de suero y en el pase 17 cuando el medio se complementó con 5 ng/ml y 10 ng/ml de bFGF.

Las Figuras 18A-18F son imágenes de contraste de fases (Fig. 18A-18C) e imágenes inmunofluorescentes (Fig.18D-18F) de colonias de hESC cultivadas en fibroblastos derivados de cordón que se propagaron durante 17 pases en presencia (Figs. 18B, 18C, 18E y 18F) o ausencia (Figs. 18A y 18D) de bFGF. Los fibroblastos derivados de cordón apoyaron la proliferación indiferenciada de las hESC como se determinó por la expresión de fosfatasa alcalina por las hESC (Fig. 18D-18F) y la expresión de marcadores de células madre por un alto porcentaje de las hESC (análisis de FACS, Fig. 18G).

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La Figura 19 es una microfotografía de contraste de fases de hESC cultivadas en la capa alimentadora de HEF en medio Cellgro complementado con TCH al 1 % que muestra que las hESC conservan la morfología de células madre pluripotenciales indiferenciadas cuando se usa TCH como el complemento de reemplazo de suero.

La Figura 20 es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de SSEA-4 que se expresa en hESC, cuando se cultivan en una capa alimentadora de prepucio o HEF, que es similar cuando se complementa el KO DMEM con KO SR, TCH 2 % o Nutridoma 2 % y que muestra que el Nutridoma-CS es tan eficaz como TCH para apoyar la propagación indiferenciada de hESC.

La Figura 21 es una microfotografía de contraste de fases de colonias de hESC cultivadas dentro NBN2 que muestra que las hESCS conservan la morfología de células indiferenciadas cuando las colonias se cultivan en alimentadores humanos en NBN2.

Las Figuras 22A-22D son microfotografías de campo oscuro de grupos transparentes pequeños de células que se desarrollan 7 días después de la transferencia de hESC indiferenciadas en cultivos en suspensión dentro de medio NBN2 (Fig. 22A) y después de 3 semanas en cultivo en suspensión dentro de NBN2, el análisis inmunofluorescente indirecto mostró que la mayoría de las hESC expresan SSEA4 (Fig. 22B) y Oct4 (Fig. 22D). Los núcleos de células en D están contrateñidos con DAPI en (Fig. 22C).

Las Figuras 23A-23B son gráficos de barras que muestran el porcentaje de células SSEA-4+ (Fig. 23A) y número total de células/pocillo (Fig. 23B) como se analiza después de 3 semanas de cultivo en suspensión de números iniciales iguales de hESC en medio NBN2 + FGF2 complementado con diversas combinaciones de componentes de ECM y factores.

Las Figuras 24A-24D son microfotografías de campo oscuro de EB que se cultivaron durante 4 semanas en presencia y ausencia de NA (el medio de cultivo incluía FCS al 10 %). Se desarrollaron EB con estructuras quísticas típicas (EB quísticos) en ausencia de NA (Figs. 24A y 24B), mientras que en presencia de NA, no se observó formación quística y los EB estaban comprendidos por células estrechamente empaquetadas (Figs. 24C y 24D).

Figuras 25A-24P son microfotografías de campo oscuro de EB que se cultivaron durante 2-5 semanas en medio químicamente definido (NBN2) en presencia y ausencia de NA y ácido retinoico según se indica. Los EB con estructuras quísticas típicas (EB quísticos) se desarrollaron en ausencia de NA (Figs. 25A-25D, es decir, panel superior). En presencia de NA, no se observó formación quística, los EB estaban comprendidos por células estrechamente empaquetadas y eran significativamente mayores (Figs. 25E-25H, es decir, segundo panel). En presencia de RA, los EB eran menores e incluían múltiples quistes (Figs. 25I-25L, es decir, tercer panel). La NA bloquea los efectos de RA (Figs. 25M-25P, es decir, panel inferior).

La Figura 26 es un análisis de RT-PCR que demuestra que la expresión del marcador endodérmico fetoproteína se suprime dentro de los EB que se diferenciaron en presencia de NA en comparación con EB de control que se cultivaron en ausencia de NA. Después de 4 semanas de diferenciación, el efecto de la NA fue más prominente en comparación con el efecto después de 2 semanas.

Las Figuras 27A-27D son estudios inmunocitoquímicos que demuestran la expresión suprimida de fetoproteína (AFP) y citoqueratina-8 (CK) en EB que se diferenciaron en presencia de NA. Después de 4 semanas de diferenciación en presencia de NA, solamente algunas células en secciones de EB fueron inmunorreactivas con anti--fetoproteína (Fig. 27A) y citoqueratina-8 (Fig. 27B). Las células que expresaban fetoproteína (Fig. 27C) y citoqueratina-8 (Fig. 27D) eran abundantes dentro de secciones de EB de control que se diferenciaron en ausencia de NA.

Las Figuras 28A-28D son microfotografías de campo oscuro de EB que se diferenciaron en presencia de NA que muestra que el porcentaje de EB que incluía grupos de células diferenciadas que expresaban melanina aumentaba con el tiempo (Figs. 28A, 28B, 28C y 28D que representan resultados después de 2, 4, 6 y 12, respectivamente).

La Figura 29 es un análisis de PCR en tiempo real de EB diferenciados durante 6 semanas en presencia o ausencia de NA, que demuestran la inducción de expresión de marcadores de RPE por NA.

Las Figuras 30A-30H son imágenes que muestran que las células que expresan melanina que se generaron en presencia de NA tenían características morfológicas que eran típicas de células RPE. Se muestran específicamente microfotografía de campo oscuro (Fig. 30A), imagen de contraste de fases (Fig. 30B) y tinciones inmunofluorescentes indirectas de marcadores de células RPE incluyendo ZO-1 (Fig. 30C), Pax6 (Fig. 30D), MITF (Fig. 30E), CRALBP (Fig. 30F), Bestrofina (Fig. 30G) y RPE65 (Fig. 30H).

La Figura 31 es un análisis de RT-PCR que muestra la expresión de tipo cordina-1 por células dentro de EB que se desarrollaron en presencia de NA.

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Las Figuras 32A-C son imágenes de H y E y fluorescentes que demuestran la supervivencia de células RPE derivadas de hESC trasplantadas y su integración dentro de la capa de células RPE huésped. Una imagen de H y E que muestra la supervivencia de un injerto intra-vítreo, 4 semanas después de trasplante en el ojo de una rata RCS madura (Fig. 32). El injerto incluye células que expresan melanina (células de pigmentación oscura). La tinción inmunofluorescente indirecta demuestra que las células dentro del injerto expresan GFP (puntos blancos), confirmando su identidad humana (Figura 32B). También se demuestra la integración de células RPE derivadas de hESC trasplantadas (células pigmentadas marcadas con flechas) en la capa RPE de rata albina (Figura 32C). No se observaron células pigmentadas en la capa RPE de ojos no trasplantados de control.

Descripción detallada de realizaciones ejemplares

La divulgación se describe en la siguiente descripción detallada con referencia a cultivos celulares y sistemas de cultivo para manipular células madre, preferentemente células madre embrionarias humanas. Debería observarse que además de los cultivos celulares y sistemas de cultivo analizados en detalle posteriormente en el presente documento, también se abarcan usos de componentes específicos descritos con referencia al sistema de cultivo en la preparación de dichos sistemas de cultivo así como a procedimientos de uso del sistema de cultivo en la manipulación de cultivos de células madre y procedimientos para preparar células de cultivo.

Como se usan en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las formas “un” y “el” incluyen referencias singulares así como plurales, a no ser que el contexto claramente dicte otra cosa. Por ejemplo, la expresión “un sistema de cultivo” incluye uno o más sistemas de cultivo.

Como se usa en el presente documento, el término “o” significa uno o una combinación de dos o más de las elecciones enumeradas.

Además, como se usa en el presente documento, se entiende que la expresión “que comprende” significa que los procedimientos o la composición incluyen los elementos enumerados, pero sin excluir otros. De forma similar, “queconsiste esencialmente en” se usa para definir procedimientos y sistemas que incluyen los elementos enumerados pero excluye otros elementos que pueden tener una importancia esencial en la funcionalidad de los sistemas de cultivo de las invenciones. Por ejemplo, un sistema de cultivo que consiste esencialmente en un medio básico, complementos de medio y células alimentadoras no incluirá o incluirá solamente cantidades insignificantes (cantidades que tendrán un efecto insignificante en la propagación y diferenciación de células en el sistema de cultivo) de otras sustancias que tienen un efecto en células en un cultivo. Además, una composición que consiste esencialmente en los elementos como se han definido en el presente documento no excluiría contaminantes traza del procedimiento de aislamiento y purificación. “Que consiste en” significará que excluye más que los elementos traza de otros elementos.

Además, todos los valores numéricos, por ejemplo, concentración o dosis o intervalos de los mismos, son aproximaciones que varían (+) o (-) en hasta el 20 %, en ocasiones hasta el 10 % de los valores indicados. Debe entenderse, incluso si no se indica siempre de forma explícita que todas las designaciones numéricas se preceden del término “aproximadamente”. También debe entenderse, aunque no siempre se indique de forma explícita, que los reactivos descritos en el presente documento son meramente ejemplares y que se conocen en la técnica equivalentes de estos.

En su sentido más amplio, la presente divulgación se refiere a células de cultivo, sistemas y procedimientos para uso de los mismos en el cultivo de células madre. Como se usa en el presente documento, la expresión “células madre” se refiere a células que son capaces de diferenciarse en otros tipos celulares que tienen una función particular, especializada (es decir, células “completamente diferenciadas”) o que ese auto-renuevan y permanecen en un estado pluripotencial indiferenciado como se detalla posteriormente.

Como se usa en el presente documento, el término “célula” se refiere a una única célula así como a una población (es decir, más de una) de células. La población puede ser una población pura que comprende un tipo celular. Como alternativa, la población puede comprender más de un tipo celular. Además, como se usa en el presente documento, la expresión “cultivo celular” se refiere a cualquier cultivo in vitro de células. Se incluyen dentro de esta expresión líneas celulares continuas (por ejemplo, con un fenotipo inmortal), cultivos celulares primarios, líneas celulares finitas (por ejemplo, células no transformadas) y cualquier otra población celular mantenida in vitro.

Como se usa en el presente documento, la expresión “célula primaria” es una célula que se obtiene directamente de un tejido u órgano de un animal, incluyendo un ser humano, en ausencia de cultivo. Típicamente, aunque no necesariamente, una célula primaria es capaz de experimentar 10 o menos pases in vitro antes de la senescencia y/o el cese de la proliferación. Por el contrario, una “célula cultivada” que es una célula que se ha mantenido y/o propagado in vitro durante 10 o más pases.

Son ejemplos no limitantes de células madre las células madre hematopoyéticas obtenidas de tejido de médula ósea de un individuo a cualquier edad o de la sangre del cordón de un individuo neonato, células madre embrionarias (ES) obtenidas del tejido embrionario formado después de la gestación, (por ejemplo, blastocisto) o células germinales embrionarias (EG) obtenidas del tejido genital de un feto en cualquier momento durante la gestación,

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preferentemente antes de las 10 semanas de gestación. Las células madre preferidas son células madre humanas, más preferentemente, hESC.

Pueden obtenerse células madre usando procedimientos de cultivo celular bien conocidos. Por ejemplo, pueden aislarse hESC de blastocistos humanos. Los blastocistos humanos se obtienen típicamente de embriones preimplantación in vivo humanos o de embriones fertilizados in vitro (IVF). Como alternativa, un embrión humano de una única célula puede expandirse hasta el estadio de blastocisto. Para el aislamiento de células ES humanas se retira la zona pelúcida del blastocisto y se aísla la masa celular interna (ICM) por inmunocirugía, en la que se lisan las células del trofoectodermo y se retiran de la ICM intacta por pipeteo suave. Después se siembra la ICM en un matraz de cultivo tisular que contiene el medio apropiado que permite su crecimiento. Después de 9 a 15 días, el crecimiento derivado de ICM se disocia en grupos bien por una disociación mecánica o bien por una degradación enzimática y las células se vuelven a sembrar en placas en un medio de cultivo tisular nuevo. Las colonias que demuestran morfología indiferenciada se seleccionan individualmente por micropipeta, se disocian mecánicamente en grupos y se vuelven a sembrar en placas. Las células ES resultantes se dividen después rutinariamente cada 1-2 semanas. Para más detalles sobre procedimientos de preparación de células ES humanas, véase Thomson y col., [Patente de Estados Unidos Nº 5.843.780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; así como Bongso y col., [Hum Reprod 4: 706, 1989]; y Gardner y col., [Fertil. Steril.

69: 84, 1998].

Las células madre disponibles en el mercado también pueden usarse de acuerdo con la divulgación. Las células ES humanas pueden obtenerse del registro de células madre embrionarias humanas del NIH. Son ejemplos no limitantes de líneas de células madre embrionarias disponibles en el mercado BG01, BG02, BG03, BG04, CY12, CY30, CY92, CY10, TE03 y TE32.

Las aplicaciones potenciales de hESC son de gran alcance e incluyen descubrimiento y ensayo de fármacos, generación de células, tejidos y órganos para su uso en el trasplante, producción de biomoléculas, ensayo de la toxicidad y/o teratogenicidad de compuestos y facilitar el estudio de los procesos del desarrollo y otros biológicos. Por ejemplo, las enfermedades que se espera en la actualidad que puedan tratarse por trasplante terapéutico de hESC o células derivadas de hESC incluyen enfermedad de Parkinson, infartos cardiacos, diabetes mellitus de aparición juvenil y leucemia [Gearhart J. Science 282: 1061-1062, 1998; Rossant y Nagy, Nature Biotech. 17: 23-24, 1999].

Existen, sin embargo, obstáculos significativos para el aprovechamiento práctico de las hESC. Para mantener las hESC en un estado pluripotencial indiferenciado, las células habitualmente se cultivan en células alimentadoras. Las células alimentadoras pueden secretar factores necesarios para la auto-renovación y proliferación de las células madre, inhibiendo al mismo tiempo su diferenciación.

Las células alimentadoras habitualmente usadas incluyen un fibroblasto embrionario de ratón primario (PMEF), un fibroblasto embrionario de ratón (MEF), un fibroblasto fetal murino (MFF), un fibroblasto embrionario humano (HEF), una célula muscular fetal humana (HFM), una célula cutánea fetal humana (HFS), una célula cutánea de adulto humano, un fibroblasto de prepucio humano (HFF), una célula epitelial de trompa de Falopio adulta humana (HAFT) y una célula del estroma de la médula ósea (HMSC).

Como se usa en el presente documento, la expresión “células hES pluripotenciales indiferenciadas” o “hESC” se refiere a células precursoras humanas que tiene la capacidad de formar cualquier célula adulta. Dichas células son verdaderas líneas celulares porque (i) tiene capacidad de proliferación indefinida in vitro en un estado indiferenciado; y (ii) tiene capacidad de diferenciación en derivados de las tres capas de germinación embrionaria (endodermo, mesodermo y ectodermo) incluso después de cultivo prolongado. Las células ES humanas derivan de embriones fertilizados que tienen menos de una semana de edad.

Las SC pluripotenciales presentan en su superficie o expresan marcadores biológicos que se usan para identificar SC pluripotenciales así como para verificar que las células en el cultivo se mantienen en un estado indiferenciado [Thomson JA y col. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts Science 282(5391): 1145 -1147 (1998)]. Una lista no limitante de dichos marcadores celulares comprende antígeno embrionario específico de estadio tal como SSEA-3, SSEA-4; anticuerpos para moléculas de matriz extracelular específicas que se sintetizan por SC pluripotenciales indiferenciadas tales como TRA-1-60, TRA-1-81 y GCTM-2; expresión elevada de fosfatasa alcalina que se asocia con SC pluripotenciales indiferenciadas; factores de transcripción únicos de SC pluripotenciales y que son esenciales para el establecimiento y mantenimiento de SC indiferenciadas, tales como, OCT-4 y Genesis [Carpenter, m.k., Rosler, E., Rao M.S., Characterization and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Cloning and Stem Cells 5, 79-88, 2003].

Aunque se usan ampliamente, los cultivos de SC humanas basados en células alimentadoras de origen murino, son menos deseables. La tecnología de células alimentadoras no específicas de especie reduce el valor de los cultivos de células madre debido a la naturaleza ajena de la fuente de la célula alimentadora. Por ejemplo, dichas células alimentadoras no específicas de especie contienen tanto células ajenas como factores de crecimiento ajenos. Además, se cree que el uso de células alimentadoras no específicas de especie en combinación con células cultivadas diferentes pero deseables no puede proporcionar las condiciones de crecimiento óptimas como las células

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alimentadoras derivadas específicas de especie o medios acondicionados. El problema de la contaminación entre especies es particularmente relevante para los animales agrícolas, especies en peligro, animales de laboratorio, células de primates no humanos y hESC. Se ha mostrado que las hESC se contaminan por moléculas ajenas cuando se cultivan con alimentadores derivados de ratón (Martin, M.J., y col., Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 2005; 11: 228-32). La contaminación de hESC por moléculas/patógenos derivados de ratones puede interferir con su aprovechamiento como un modelo para investigación básica y plantea problemas acerca de su uso en la terapia de trasplante. Además, la tecnología de células alimentadoras no humanas reduce el valor de cultivos de SC derivadas de seres humanos, ya que, por ejemplo, dichas células alimentadoras no humanas contienen tanto células no humanas como factores de crecimiento no humanos. Además, se cree que el uso de células alimentadoras no humanas en combinación con células cultivadas humanas no puede proporcionar las condiciones de crecimiento óptimas de las células alimentadoras derivadas de seres humanos.

Por lo tanto, la presente invención proporciona, de acuerdo con el primero de sus aspectos, un cultivo celular derivado de tejido del cordón umbilical humano, preferentemente excluyendo el tejido hematopoyético, y que es capaz de mantener las SC en un estado indiferenciado cuando se co-cultiva con las mismas. Estas células alimentadoras se obtienen de cultivo, preferentemente en un sistema de cultivo sin animales, de células tomadas de tejido del cordón umbilical en condiciones que permiten que las células se propaguen/expandan y aislando las células propagadas de este modo. Las células en el cultivo son esencialmente células de fibroblastos y se usan preferentemente como alimentadores en sistemas de cultivo de células madre.

Los cultivos celulares (bien las células alimentadoras o bien los cultivos de SC) pueden ser un cultivo de células nuevo, cultivo crioconservado así como células crioconservadas y descongeladas.

Como se usa en el presente documento, el término “derivado” que puede usarse de forma intercambiable con el término “obtenido” cuando se usa en el contexto de la formación de células indica el desarrollo de una nueva línea celular a partir de otra línea celular. Por ejemplo, las células derivadas del cordón embrionario humano indican, de acuerdo con una realización de la invención, células de fibroblastos que se originan de tejido del cordón embrionario, que en condiciones adecuadas se propagan a una línea celular de fibroblastos.

Además, como se usa en el presente documento, la expresión “células alimentadoras” que se conocen indistintamente como “alimentadores” indica cualquier tipo de células que puede usarse como un sustrato para la unión y cultivo de otras células en un sistema de cultivo. Las células alimentadoras se usan típicamente para permitir el crecimiento y supervivencia de células madre indiferenciadas individuales. Las células alimentadoras proporcionan condiciones que mantienen la proliferación celular, inhiben la diferenciación celular y conservan la pluripotencialidad. Específicamente, las células alimentadoras son células que secretan factores necesarios para la proliferación de células madre, mientras que inhiben su diferenciación. Se conocen bien en la técnica procedimientos para preparar células alimentadoras (véase, por ejemplo, Publicación de Patente de Estados Unidos número 20030143736). En general, las células alimentadoras pueden ser fibroblastos u otros tipos de células, y las células se inactivan por una gran dosis de radiación antes de su uso, tal como rayos  o por fármacos, tal como mitomicina

C. Después del procedimiento de inactivación, las células supervivientes perdieron la capacidad de proliferar, pero conservaron sus funciones fisiológicas, tales como metabolismo y síntesis de factores de crecimiento.

Como se ha indicado anteriormente, las células alimentadoras derivan (se expanden) de tejido del cordón umbilical. El tejido de cordón umbilical puede obtenerse en el transcurso del suministro vaginal. Sin embargo, una ventaja importante del uso del tejido de cordón umbilical es que puede obtenerse durante una cesárea opcional en un ambiente estéril de un quirófano. Además, el cordón umbilical se obtiene del ambiente estéril del saco amniótico y no se ha expuesto a ningún agente contagioso externo antes de la donación. La naturaleza estéril de la donación del cordón umbilical permite la derivación de alimentadores del tejido del cordón umbilical sin el uso de antibióticos o fármacos antifúngicos. Evitar el uso de fármacos antibacterianos y antifúngicos es una ventaja ya que estos fármacos pueden interferir con el crecimiento de las células en cultivo, alterar los resultados de estudios científicos básicos y lo que es más importante pueden inducir reacciones alérgicas en receptores de células que se cultivaron en presencia de estos fármacos. La derivación de alimentadores de otros tejidos primarios humanos tales como el prepucio o fetos abortados se realiza en condiciones significativamente menos estériles. El prepucio se expone a bacterias que colonizan el área genital y puede desinfectarse pero no esterilizarse. Los fetos abortados también se exponen a contaminación potencial por la flora vaginal y genital durante la dilatación y el curetaje.

Una ventaja adicional del cordón umbilical con respecto al prepucio o tejidos fetales humanos es que puede tomarse una muestra de un volumen significativo de sangre del cordón umbilical, ensayarse con respecto a agentes contagiosos y archivarse. Esto no es posible con tejidos del prepucio donados por bebés neonatos o con fetos abortados. Finalmente, el cordón umbilical se descarta rutinariamente y su donación no se asocia con restricciones emocionales o morales, mientras que la donación de tejidos fetales plantea preocupaciones éticas y no está aceptado moralmente por muchas personas.

En relación con esto se proporciona por lo tanto un procedimiento para preparar células alimentadoras derivadas del cordón umbilical, comprendiendo el procedimiento aislar células del cordón umbilical de tejido del cordón umbilical y cultivar dichas células del cordón umbilical en un medio de cultivo que incluye suero, preparando de este modo

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dichas células alimentadoras del cordón umbilical humano. Las células del cordón umbilical pueden aislarse del tejido del cordón umbilical triturando el tejido y fijando el cordón umbilical en una pared, tal como una pared de un matraz, y permitiendo que las células se incuben sin perturbaciones durante varias semanas hasta que las células de fibroblastos comiencen a migrar fuera del tejido del cordón umbilical triturado.

El tejido del cordón umbilical puede obtenerse de mujeres embarazadas sanas que se someten a cesáreas opcionales a término.

De acuerdo con la invención se proporciona un sistema de cultivo para mantener células madre (SC) en un estado indiferenciado, comprendiendo el sistema de cultivo células alimentadoras seleccionadas de células obtenidas de tejido del cordón umbilical humano (excluyendo células obtenidas de la sangre del cordón umbilical), células de fibroblastos embrionarios humanos (HEF) o una combinación de los mismos. El sistema de cultivo de acuerdo con este aspecto de la invención se denomina en el presente documento “aspecto de células alimentadoras derivadas de seres humanos de la invención”.

Como se usa en el presente documento con respecto a todos los aspectos de la invención, el término “mantenimiento” significa supervivencia continuada de una célula o población de células, en ocasiones, con un aumento del número de células. “Proliferación”, “propagación”, “expansión” y “crecimiento”, que se usan indistintamente, se refieren a dicho aumento del número de células. De acuerdo con una realización, cuando se hace referencia al mantenimiento de hESC en células alimentadoras, este término se refiere a una supervivencia continua de las células durante al menos 10 semanas.

Los sistemas de cultivo de acuerdo con la invención son preferentemente para permitir el mantenimiento de una población de células madre cuando se cultivan en células alimentadoras y, en ocasiones, propagación de las mismas, durante un período de tiempo prolongado, siendo el periodo de tiempo de al menos 10 semanas.

Cuando las células alimentadoras derivan de tejido de cordón umbilical humano, las células alimentadoras son esencialmente células de fibroblastos. La expresión “esencialmente células de fibroblastos” indica que las células alimentadoras comprenden en su mayoría fibroblastos, es decir, al menos 70 de las células en la población de células alimentadoras son fibroblastos, preferentemente el 85 %, más preferentemente todas las células, es decir esencialmente el 100 % de las células alimentadoras son fibroblastos.

De acuerdo con una realización, las células alimentadoras se proporcionan en forma de una placa de cultivo revestida con monocapa a la que se añade un medio nutriente junto con las células de cultivo. Como se usa en el presente documento, las expresiones “monocapa”, “cultivo en monocapa” y “cultivo celular en monocapa” se refieren a células que se han adherido a un sustrato y crecen como una capa que es de una célula de grosor. Las células en monocapa pueden cultivarse en cualquier formato, incluyendo pero sin limitación matraces, tubos, cubreobjetos (por ejemplo, shell vials), frascos rotatorios, etc. Las células en monocapa también pueden cultivarse unidas a microvehículos, incluyendo pero sin limitación perlas. En ocasiones, el término monocapa también incluye el cultivo de células como colonias planas.

La expresión “sistema de cultivo” indica una combinación de elementos, tales como una matriz extracelular (ECM) y un medio de cultivo (nutriente) que proporcionan juntos condiciones adecuadas que apoyan el crecimiento de SC. Las condiciones son tales que las SC pueden continuar a través del ciclo celular, crecer y dividirse. Preferentemente, las condiciones son tales que permiten el crecimiento de células madre humanas, preferentemente, hESC. Además, el sistema de cultivo proporciona condiciones que permiten que las células madre embrionarias proliferen de forma estable en el sistema de cultivo durante al menos 10 semanas. El medio nutriente puede contener cualquiera de las siguientes combinaciones apropiadas: un medio básico (un medio de cultivo celular que comprende habitualmente una solución básica definida, que incluye sales, azúcares y aminoácidos) así como suero o reemplazo de suero, y otros factores añadidos de forma exógena. No se pretende que la expresión “medio de cultivo” o “medio nutriente” esté limitada a cualquier medio de cultivo particular. Por ejemplo, se pretende que la definición abarque medio de crecimiento así como de mantenimiento. De acuerdo con el aspecto de células alimentadoras derivadas de seres humanos de la invención, el sistema de cultivo también comprende las células alimentadoras. Sin embargo, las células alimentadoras pueden sustituirse con componentes derivados de células alimentadoras u otros sustitutos conocidos y aceptables de las mismas, por ejemplo, cuando se hacen referencia otros sistemas de cultivo desvelados en el presente documento.

De acuerdo con una realización, el sistema de cultivo se emplea para mantener hESC en un estado pluripotencial indiferenciado, como se demuestra en los siguientes ejemplos no limitantes por la expresión de proteínas tales como SSEA-4, TRA-1-60, OCT-4, APasa, pero no SSEA-1. Se conocen bien en la técnica procedimientos para preparar sistemas de cultivo para cultivar hESC [véase, por ejemplo, Reubinoff Be. y col., Nat. Biotechnol. 18: 3 99-404, 2002; Richards, M. y col., Nat. Biotechnol. 20: 933-936, 2002].

Un medio de hESC puede contener típicamente medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) al 80 %, Suero de Ternero Fetal definido al 20 %, L-Glutamina al 1 %, penicilina/estreptomicina al 0,5 %, aminoácidos no esenciales al 1 %, complemento de insulina-transferrina-selenio G al 1 % y -mercaptoetanol 1 mM.

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En un sistema de cultivo sin animales, que proporciona un ambiente sin patógenos para el cultivo de células ES, los cultivos se basan en capas alimentadoras humanas complementadas con suero humano o reemplazo del suero adecuado para el crecimiento de células madre humanas. Las células alimentadoras pueden ser cualquier célula adecuada de una fuente humana como se conoce en la técnica o las células alimentadoras derivadas del cordón umbilical aisladas de la invención; el medio de células madre DMEM (usado como el medio básico) puede reemplazarse con KO DMEM (Gibco, o equivalente), X-Vivo 10 (Biowhittaker, Maryland, o equivalente) o medio de cultivo de células madre Cellgro (CellGenix, Friburgo, Alemania, o equivalente); el FCS puede reemplazarse con sustituto de reemplazo de suero humanizado, tal como TCH (Protide Pharmaceuticals, St. Paul, MN, o equivalente) o Nutridoma-CS (Roche, Alemania, o equivalente). Dado que el sistema sin animales proporciona un ambiente sin patógenos, pueden eliminarse agentes reductores tales como -mercaptoetanol y agentes antibacterianos tales como penicilina/estreptomicina.

En el contexto del aspecto del sistema de cultivo de células alimentadoras derivadas de ser humano de la divulgación se proporciona también un procedimiento para mantener células madre en un estado indiferenciado, comprendiendo el procedimiento incubar (co-cultivar) dichas células con un sistema de cultivo que comprende células alimentadoras seleccionadas de células derivadas del tejido del cordón umbilical humano, células de fibroblastos embrionarios humanos (HEF) o una combinación de las mismas.

De acuerdo con una realización, las células madre se incuban en un sistema de cultivo en el que las células alimentadoras preferentemente se proporcionan como una capa de células, preferentemente una monocapa, formada en una base de una placa de cultivo. Después se proporciona al sistema de cultivo un ambiente de crecimiento, típicamente, un ambiente en el que las células de interés proliferarán in vitro. Se adoptan generalmente temperaturas de 37 ºC y CO2 5 % en aire.

En cultivos de hESC indiferenciadas siempre hay algún nivel de diferenciación extraembrionaria de fondo. Además, en los sistemas usados en la actualidad para el cultivo de hESC indiferenciadas, o para la inducción de su diferenciación hacia linajes somáticos, hay una tendencia de las hESC a diferenciarse hacia linajes extraembrionarios. Además, tras la inducción de la diferenciación, la ruta por defecto de la diferenciación hacia linajes extraembrionarios puede predominar, y limitar la diferenciación en linajes somáticos deseados.

Por lo tanto, la divulgación también proporciona un sistema de cultivo para inhibir o prevenir la diferenciación de células madre hacia linajes extraembrionarios (a células extraembrionarias). El sistema de cultivo comprende NA (NA) o un derivado de NA que tiene un efecto inhibidor en la diferenciación de células madre hacia linajes extraembrionarios (a células extraembrionarias) similar al de la NA. Este aspecto de la divulgación se denomina en el presente documento el “aspecto de nicotinamida de la divulgación”.

La NA es una forma de la Vitamina B3 que puede conservar y mejorar la función de células beta. La NA es esencial para el crecimiento y conversión de alimentos en energía y se ha usado en el tratamiento y prevención de la diabetes. Se ha descubierto ahora que la NA es capaz de inhibir, preferentemente, prevenir la diferenciación de células madre embrionarias hacia linajes extraembrionarios (a células extraembrionarias).

La expresión “derivado de nicotinamida” como se usa en el presente documento indica un compuesto que es una modificación química de la NA natural.

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La modificación química puede incluir sustitución del anillo de piridina de la estructura de NA básica (mediante el miembro de carbono o nitrógeno del anillo), mediante los átomos de nitrógeno o de oxígeno del resto de amida, así como deleción o reemplazo de un grupo, por ejemplo, para formar un análogo de tiobenzamida de NA, siendo todos ellos como se aprecia por los expertos en la química orgánica. El derivado también incluye el derivado nucleosídico de NA (por ejemplo adenina de nicotinamida). Se describe una diversidad de derivados de NA, algunos también en relación con una actividad inhibidora de la enzima PDE4 [documentos WO03068233; WO02060875; GB2327675A],

o como inhibidores de tirosina quinasa receptora de VEGF [documento WO01/55114]. Por ejemplo, el procedimiento para preparar derivados de 4-aril-nicotinamida se describe en el documento WO05014549A. Los derivados de NA son compuestos que se ha determinado que tienen un efecto inhibidor, preferentemente efecto preventivo, en la diferenciación de células madre a linajes extraembrionarios (células extraembrionarias) similar al de la NA.

El efecto de la NA puede ser el resultado de la inhibición de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP). Por lo tanto el efecto de la NA también puede conseguirse tratando las células con otros inhibidores de PARP tales como 3

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aminobenzamida, PJ-34 o 1,5-dihidroxiisoquinolina. Estos otros inhibidores de PARP también están incluidos en el contexto de la expresión “modificación de NA”. Además, el efecto de la NA también puede atribuirse a la inhibición de la proteína desacetilasa SIRT. Por lo tanto, su efecto puede obtenerse también por otros inhibidores de SIRT tales como esplitomicina y sirtinol, que se incluyen, por lo tanto, también en el contexto de la expresión “modificación de NA”.

De acuerdo con el aspecto de NA de la divulgación, las células madre pueden ser como se ha descrito anteriormente, es decir pueden ser células madres de cualquier fuente, pero son preferentemente células madre humanas; más preferentemente, células madre embrionarias humanas.

Como se usa en el presente documento la “inhibición de la diferenciación extraembrionaria” usada de forma sinónima con la expresión “prevención de la diferenciación extraembrionaria” indica el mantenimiento así como la expansión de células madre embrionarias en un cultivo celular y que el cultivo celular resultante está esencialmente sin células o membranas extraembrionarias. La expresión “esencialmente libre de” se usa para excluir células extraembrionarias que pueden tener una importancia esencial en la funcionalidad de las células madre o somáticas en el cultivo o que la cantidad de las células extraembrionarias en el cultivo celular es insignificante (una cantidad que tendrá un efecto insignificante en la propagación y diferenciación de células en el sistema de cultivo).

Se aprecia bien que si se elimina esencialmente la diferenciación extraembrionaria, un reto clave es dirigir adicionalmente la diferenciación a un linaje somático específico y a un tipo específico de célula. Se ha descubierto ahora que la complementación de un medio de cultivo con NA puede evitar la diferenciación por defecto de hESC hacia linajes extraembrionarios. También puede dirigir la diferenciación hacia un linaje somático específico tal como, pero sin limitación, diferenciación neural. Los ejemplos proporcionados en el presente documento muestran diferenciación a células precursoras neurales.

La proliferación y diferenciación de células madre embrionarias en células productoras de insulina en presencia de NA se ha sugerido por Vaca P. y col, [Transplant Proc. 35(5): 2021-3 2003]. Específicamente, se ha mostrado que aunque la proliferación dentro de EB con o sin complementación del medio con NA es similar (Figura 1A en Vaca P. y col.), el contenido de insulina aumenta en células que se diferencian en presencia de NA. No obstante no está claro si el aumento del contenido de insulina no estaba relacionado con un aumento de la captación de insulina del medio.

Se ha descubierto ahora que la NA induce eficazmente diferenciación de células madre en células somáticas. Específicamente, aunque no exclusivamente, se ha mostrado que la NA induce diferenciación en células neurales y, dentro del linaje neural, se ha descubierto que el tratamiento con NA promueve la diferenciación hacia células epiteliales pigmentadas retinianas (RPE). El uso de células RPE en trasplante ya se ha descrito [Haruta, M. y col., in vitro and in vivo characterization of pigment epithelial cells differentiated from primate embryonic stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 45: 1020-1025 (2004)]. Por lo tanto, debe entenderse que las células RPE obtenidas de acuerdo con la presente divulgación tienen diversas aplicaciones terapéuticas. Una de dichas aplicaciones incluye el trasplante de dichas células en el ojo para reponer las células RPE con mal funcionamiento o degradadas en degradaciones retinianas. Las células RPE modificadas genéticamente pueden actuar como un vector para transportar y expresar genes en la retina después del trasplante. Otras aplicaciones pueden ser el uso de células RPE derivadas de hESC como un modelo in vitro para el desarrollo de nuevos fármacos para promover la supervivencia y función de RPE. Las células RPE derivadas de hESC pueden actuar para exploración de alto rendimiento con respecto a compuestos que son tóxicos, tróficos, inducen diferenciación, proliferación y supervivencia de células RPE. Pueden usarse para descubrir mecanismos, nuevos genes, factores solubles o unidos a membrana que son importantes para el desarrollo, diferenciación, mantenimiento, supervivencia y función de células fotorreceptoras.

El sistema de cultivo en el aspecto de NA de la divulgación comprende elementos convencionales de medios de cultivo, como se ha definido anteriormente combinados con NA. La concentración de NA en el medio puede variar, sin embargo, será preferentemente en un intervalo de concentración entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 20 mM, más preferentemente a una concentración de aproximadamente 10 mM.

En el contexto de este aspecto se proporciona también un procedimiento para inhibir o prevenir la diferenciación de células madre hacia linajes extraembrionarios (a células extraembrionarias), comprendiendo el procedimiento incubar dichas células madre en un sistema de cultivo que comprende NA o un derivado de NA como se ha definido anteriormente.

Debería observarse que en el contexto de la presente divulgación los sistemas de cultivo basados en NA también fueron eficaces para aumentar la supervivencia de las SC en el sistema de cultivo. De acuerdo con una realización, las células sobrevivieron en el cultivo durante al menos 12 semanas.

También debería observarse que el sistema de cultivo basado en NA fue eficaz para inducir un aumento en el número de células dentro de cuerpos embrioides (EB) cultivados en el mismo.

Para la inducción de diferenciación somática, las células madre de acuerdo con el aspecto de NA de la divulgación

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se cultivan preferentemente como grupos de libre flotación en una suspensión. Como se usa en el presente documento, las expresiones “suspensión”y “cultivo en suspensión” se refieren a células que sobreviven y proliferan sin estar unidas a un sustrato.

Un aspecto adicional de la divulgación se refiere al uso de suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS)) en cultivos de SC. Ya se ha establecido que el suero es una fuente principal de factores de diferenciación no definidos y por lo tanto tiende a promover la diferenciación de células ES. Otros problemas también se asocian con el suero. Se observan con frecuencia variaciones entre lotes y se ha descubierto que algunos lotes de suero son tóxicos para las células [Robertson, E.J., ed., Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Reino Unido (1987)]. Además, el suero puede contaminarse con agentes infecciosos tales como micoplasmas, bacteriófagos y virus. Opcionalmente, debido a que el suero es un componente indefinido y variable de cualquier medio, el uso de suero evita la verdadera definición y dilucidación de los requisitos nutricionales y hormonales de las células cultivadas.

Se ha descubierto ahora que el uso de dos sustitutos de reemplazo de suero (SR) humanizados disponibles en el mercado y bien conocidos, que no se han usado hasta la fecha en tecnología de células madre embrionarias humanas, es decir TCH™ (Protide Pharmaceuticals, St. Paul, MN, o equivalente) y Nutridoma-CS (Roche, Alemania,

o equivalente) usados como sustitutos de reemplazo de suero, no alteraron la propagación indiferenciada de las células madre en el sistema de cultivo.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la divulgación también proporciona un sistema de cultivo humanizado para el mantenimiento de células madre (SC) en un estado indiferenciado, comprendiendo el sistema de cultivo humanizado medio básico de células madre sin animales y un sustituto de reemplazo del suero humanizado. Este aspecto de la divulgación se denomina el “sistema de cultivo sin suero humanizado de la divulgación”.

De acuerdo con una realización, el sistema de cultivo humanizado comprende un medio básico sin suero como se conoce por los expertos en la materia de células madre (es decir un medio que no tiene origen animal y es adecuado para el cultivo de células madre), seleccionado del Medio de Cultivo de Células Madre Cellgro, KO DMEM, Neurobasal™, o X-Vivo 10.

De acuerdo con otra realización, el sistema de cultivo humanizado comprende un sustituyente de reemplazo de suero seleccionado de TCH™, Nutridoma-CS o combinación de los mismos.

De acuerdo con otra realización más, cuando dicho medio básico sin suero es Neurobasal™, el sistema de cultivo comprende además complemento de N2 [Cultivo Celular GIBCO] o un complemento de N2 modificado, haciendo la modificación al complemento de medio adecuado para su uso con células madre. Se observa que el complemento de N2 convencional y disponible en el mercado comprende insulina, transferrina, progesterona, putrascina, selenita. La composición específica de complemento de N2 como se publica por StemCell Technologies Inc (hoja de información del producto, revisada en diciembre de 2002) incluye insulina rh 2,5 mg/ml, transferrina humana 10 mg/ml (que puede ser pobre en hierro o saturada en hierro), selenita sódica 0,52 g/ml, putrascina 1,61 mg/ml, progesterona 0,63 g/ml, todas en solución salina tamponada con fosfato. No obstante, las modificaciones del complemento de N2 convencional para el mantenimiento de células madre se prevén ya por los expertos en la materia. Por ejemplo, se complementa medio para la propagación de células madre neurales derivadas de ESC con N2 modificado [Conti, L, y col., Niche independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 9: e283 (2005)].

TCH™ es un reemplazo de suero definido completamente de forma bioquímica desarrollado principalmente para células humanas y producción de proteínas secretadas por células. TCH™ puede obtenerse de Protide Pharmaceuticals (MN, Estados Unidos) así como de BM Biomedicals (CA, Estados Unidos).

Nutridoma-CS también es un complemento de medio sin suero definido completamente de forma bioquímica compuesto de albúmina, insulina, transferrina, citocinas, una fuente de colesterol y otros compuestos orgánicos e inorgánicos definidos.

El uso de SR humanizado como se sugiere en el presente documento en combinación con medios básicos sin suero permite por lo tanto proporcionar un sistema de cultivo humanizado y sin animales para el mantenimiento así como la expansión de SC indiferenciadas, preferentemente SC humanas, más preferentemente, hESC. El sistema de cultivo puede comprender, además del SR humanizado, células alimentadoras derivadas de seres humanos tales como las desveladas anteriormente (así como las conocidas en la técnica).

La cantidad del SR humanizado puede variar y dependerá de otros elementos que forman parte del sistema de cultivo. Los expertos en la materia sabrán cómo manipular las concentraciones de SR en el sistema de cultivo para facilitar el mantenimiento de las células madre cultivadas en el mismo. De acuerdo con una realización, puede usarse TCH al 2 %. Sin embargo, pueden usarse concentraciones mayores o menores de TCH.

De acuerdo con el aspecto de SR humanizado de la divulgación también se proporciona el uso de sustituto de reemplazo de suero humanizado seleccionado de TCH™, Nutridoma-CS o una combinación de los mismos para la

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preparación de un sistema de cultivo para mantener células madre, preferentemente células madre embrionarias humanas, en un estado indiferenciado. De acuerdo con una realización, las células se co-cultivan con células alimentadoras, preferentemente células alimentadoras derivadas del ser humano.

Finalmente, la invención proporciona un sistema de cultivo adicional para mantener células madre, preferentemente humanas, más preferentemente, hESC, en un estado indiferenciado, comprendiendo el sistema de cultivo medio Neurobasal™. De acuerdo con una realización, el Neurobasal™ se complementa con complemento de N2 o una modificación de complemento de N2 (como se ha definido anteriormente) para un sistema de cultivo plano humanizado de hESC en alimentadores (véase por ejemplo Fig. 21) así como para el mantenimiento de células madre en suspensiones (véase por ejemplo Fig. 22). Neurobasal™ se conoce en la técnica de los cultivos celulares [Brewer GJ. Serumfree B27/Neurobasal medium supports differential growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, J Neurosci Res. 42(5): 674-83, (1995)] y está disponible en el mercado [Gibco, Invitrogen cell culture, Estados Unidos]. Este aspecto se denomina en el presente documento el “aspecto de cultivobasado en Neurobasal™ de la invención”.

Como se ha indicado anteriormente, el sistema de cultivo está complementado con complemento de N2, un aditivo definido químicamente para medio Neurobasal™.

Pueden añadirse elementos de cultivo adicionales, tales como una matriz extracelular (ECM) que es una entidad estructural compleja (tipo red) que rodea y apoya las células, compuesta de diferentes combinaciones de las siguientes tres clases principales de biomoléculas:

Proteínas estructurales: colágeno y elastina.

Proteínas especializadas: por ejemplo, fibrilina, fibronectina y laminina.

Proteoglucanos: conjugados de un núcleo proteico y glucosaminoglucanos (GAG).

Más elementos adicionales pueden incluir factores de crecimiento, por ejemplo, sin limitación, FGF (por ejemplo FGF2) así como otros conocidos en la técnica (véase también Fig. 23A y 23B).

Más elementos adicionales que pueden añadirse incluyen noggina y activina A, con los que están familiarizados los expertos en la materia de las células madre.

Como se apreciará por los expertos en la materia y también como se indica en el presente documento, hay algunas ventajas en el cultivo de células en suspensiones. Por ejemplo, para aprovechar el potencial de hESC para exploración de alto rendimiento, descubrimiento de fármacos, investigación básica, medicina regenerativa y otras aplicaciones potenciales, se requieren grandes números de células. El número de hESC que puede obtenerse con cultivos en monocapa es limitado. Se requiere cultivo de hESC en suspensión en lugar de en una monocapa para desarrollar cultivos a granel de hESC. Los cultivos en suspensión de hESC pueden permitir la expansión extensiva de las células con un sistema de biorreactor. Puede permitir el inicio de procesos de diferenciación en suspensión de un gran número de células, y el desarrollo de nuevas metodologías para dirigir la diferenciación de hESC dentro de cultivos en suspensión.

En el contexto de este aspecto de la divulgación también se proporciona un procedimiento para mantener SC, preferentemente humanas, más preferentemente, hESC, en un estado indiferenciado, comprendiendo el procedimiento incubar las SC con un sistema de cultivo que comprende Neurobasal™ en un ambiente de cultivo en el que las células de interés proliferarán in vitro, como se detalla en el presente documento.

La divulgación se describirá ahora por ejemplos no limitantes. Debe entenderse que la divulgación no se limita en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los ejemplos. La divulgación tiene capacidad para otras realizaciones o para practicarse o llevarse a cabo de otras maneras diversas. Además, debe entenderse que la fraseología y terminología empleada en el presente documento es para el fin de describir y no debería interpretarse como limitante.

Algunas realizaciones ejemplares

Materiales y procedimientos

Sistema de cultivo de uso no clínico de alimentadores humanos y hESC

Alimentadores humanos

Se cultivaron células alimentadoras de prepucio o embrionarias humanas en DMEM (Gibco, Gaithersburg, MD) complementado con Suero de Ternero Fetal al 10 % (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). Se pasaron por digestión con Tripsina (Gibco, Gaithersburg, MD) y se sembraron en placas de cultivo tisular pre-revestidas con Gelatina al 0,1 % (Sigma, St. Louis, Mo).

Cultivo de células HES

Se cultivaron ESC humanas (líneas celulares HES1 y HES2) en las capas alimentadoras humanas en medio KO

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(KOM) que consiste en KO-DMEM 85 %, KOSR 15 %, glutamina 1 mM, -mercaptoetanol 0,1 mM, aminoácidos no esenciales 1 %, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 g/ml (Gibco, Gaithersburg, MD) y bFGF 4 ng/ml (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN). Las células hES se pasaron semanalmente por disociación en suspensión celular casi individual con PBS sin Ca/Mg++ complementado con EDTA al 0,05 % (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) y se sembraron en placas en una capa alimentadora nueva.

Formación y caracterización de EB

Se retiraron células ES humanas de los alimentadores por tratamiento con dispasa (10 mg/ml; Gibco); y/o colagenasa de tipo IV (1 mg/ml; Gibco). Los grupos de células indiferenciadas que se obtuvieron se trituraron adicionalmente en grupos más pequeños dentro de PBS. Estos grupos se cultivaron durante diversos periodos en suspensión dentro de placas bacteriológicas revestidas con agarosa de baja temperatura de fusión al 0,1 % en DMEM (Gibco), complementado con FCS al 10-20 % (Biological Industries, Beit Haemek), L-glutamina 1 mM, mercaptoetanol 0,1 mM, reserva de aminoácidos no esenciales 1 %, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 mg/ml (todas de Gibco Invitrogen Corporation products, Estados Unidos) en presencia o ausencia de nicotinamida 10 mM (Sigma). En algunos experimentos se reemplazaron DMEM y FCS por KO-DMEM 86 % y KOSR 14 % o por medio Neurobasal complementado con N2 (Gibco).

Estudios inmunohistológicos de EB

Se fijaron EB que se desarrollaron 4 semanas en cultivo en suspensión en presencia y ausencia de nicotinamida (NA), en paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante una noche. Los EB se concentraron después en el fondo de un tubo de centrífuga y se incluyeron en agar. Los bloques de agar se deshidrataron y se incluyeron en parafina. Se inmunotiñeron secciones de 5 micrómetros con anti-citoqueratina humana 8 y anti--fetoproteína (ambos a 1:50, IgG monoclonal de ratón, DAKO). Se realizó localización de anticuerpos primarios usando el kit Picture™ plus (Zymed).

Tinción inmunofluorescente indirecta de células diferenciadas dentro de EB o esferas neurales

Se realizó diferenciación en esferas neurales de acuerdo con el protocolo publicado (Itsykson, P., y col. Derivation of neural precursors from human embryonic stem cells in the presence of noggin. Mol Cell Neurosci 30, 24-36 (2005)). Las esferas se disociaron mecánicamente por trituración. Se diseccionaron mecánicamente grupos pigmentados de células dentro de EB, que se habían diferenciado 8-10 semanas, por micropipetas de vidrio u hojas de bisturí.

Los EB se disociaron en grupos más pequeños mecánicamente con/sin la ayuda de digestión con tripsina (0,025 %, EDTA 3 mM en PBS). Los grupos pequeñas de células se sembraron en cubreobjetos de vidrio revestidos con poliD-lisina (30-70 kDa, 10 g/ml; Sigma, St. Louis, MO) y con laminina (4 g/ml; Sigma) y se cultivaron durante 3-5 semanas adicionales en el medio de cultivo usado para cultivo de suspensión de EB o esferas neurales. Las células diferenciadas dentro del crecimiento se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las membranas celulares se permeabilizaron con Triton X100 0,2 % (Sigma) en PBS durante 5 minutos para inmunotinción con anticuerpos anti-marcadores intracelulares. Las células se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: anti -tubulina III (IgG2b monoclonal de ratón, 1:2000, Sigma), anti-alfafetoproteína humana (IgG2a monoclonal de ratón, 1:200, Sigma), anti-actina muscular humana (IgG1 monoclonal de ratón, 1:10, Dako) y anti-desmina humana (IgG1, monoclonal de ratón, , 1:10, Dako), anti-Pax6 (Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo; IgG1 monoclonal de ratón, 1:100), anti-MITF (Lab Vision Corporation, Fremont, CA; IgG1 de ratón, 1:50), anti-RPE65 (Novus Biologicals, Littleton, CO; IgG1 de ratón, 1:300), anti-Bestrofina (Novus Biologicals, Littleton, CO; IgG1 de ratón, 1:150), anti-ZO-1 (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA; policlonal de conejo, 1:10) y anti-CRALBP (proporcionado amablemente por John C. Saari, Universidad de Washington, Seattle; policlonal de conejo, 1:100).

Se realizó localización de anticuerpos primarios usando anti-inmunoglobulinas de ratón de cabra conjugados con fluoresceinisotiocianato (FITC) (Dako, 1:20-50), anti-IgG de ratón de cabra conjugado con CyTH3 (1:500) y anti-Ig de conejo de cerdo conjugado con fluoresceinisotiocianato (FITC) (Dako, A/S Dinamarca; 1:50).

Análisis de EB por RT PCR

Para análisis por RT PCR, se recogió ARN total de EB que se habían desarrollado 4 semanas en cultivo en suspensión en presencia y ausencia de nicotinamida (NA). Se aisló el ARN total usando TRI REAGENT (Sigma) y se convirtió en ADNc complementario con transcriptasa inversa M-MLV (Promega). Se llevó a cabo una PCR usando protocolos convencionales con ADN Polimerasa Taq (Promega). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización a 94 ºC durante 60 segundos, hibridación a 55-60 ºC durante 60 segundos y extensión a 72 ºC durante 60 segundos. El número de ciclos fue de 35. Las secuencias de cebadores y longitudes de productos amplificados fueron:

Tipo cordina (Gene Bank del NCBI: BC002909)

5’TGCAAGGTGTGTCCAGGTAA (SEC ID Nº: 1);

3’CCAGCTTGAAGTGAGGAAGC (SEC ID Nº: 2);

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La longitud del producto de amplificación fue de 268 pb.

-fetoproteína (Gene Bank del NCBI NM001134)

5’CCATGTACATGAGCACTGTTG (SEC ID Nº: 3);

3’CTCCAATAACTCCTGGTATCC (SEC ID Nº: 4).

La longitud del producto de amplificación fue de 338 pb.

Trasplante intravítreo y sub-retiniano de células RPE derivadas de hESC

Se aislaron mecánicamente grupos de células pigmentadas por hojas de bisturí de EB que se estuvieron diferenciando en presencia de NA durante 6-8 semanas. Los grupos se disociaron en grupos más pequeños de células por digestión con Papaína (Sistema de Disociación de Papaína; Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, Nueva Jersey) a 37 ºC durante 30 minutos después de trituración. Se usaron ratas albinas y RCS exogámicas adultas (peso corporal 230-250 g) para trasplante intraocular. Todos los experimentos animales se realizaron de acuerdo con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y de Visión, y se aprobaron por el comité institucional para la investigación animal. Los animales se anestesiaron con Ketamina HCl (Ketalar, Parke Davis, Reino Unido, 100 mg/kg), inyectada por vía intra-peritoneal en combinación con el agente relajante Xilazina (2,0 mg/kg). Se administraron gotas anestésicas locales (Benoxinato HCl 0,4 %, Fischer Pharmaceuticals, Israel). Las pupilas se dilataron con Tropicamida 0,5 % (Mydramide, Fisher Pharmaceuticals, Israel) y Fenilefrina HCl 2,5 % (Fisher Pharmaceuticals, Israel). Bajo la visualización de un microscopio de disección (Stemi SV 11, Zeiss, Alemania), se inyectaron aproximadamente 100.000 células en 4 l de medio en el vítreo o el espacio subretiniano por una jeringa Hamilton y una aguja de calibre 33 mediante un enfoque transesclerótico, transcoroidal. Los ojos compañeros, no inyectados actuaron como un tipo de control. Como control adicional, se inyectó a ojos adultos solución salina (Inyección de Cloruro Sódico BP, 0,9 %, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemania). Durante y después de la inyección, no se observó hemorragia coroidal. Los animales se mantuvieron calientes durante y después del procedimiento usando una lámpara calefactora. Después del trasplante, todos los animales recibieron el agente inmunosupresor ciclosporina A (Sandimmune, Novartis Pharma AG, Basilea, Suiza, 50 mg/ml) en su agua para beber a una concentración de 210 mg/l. A las 4 semanas después de la inyección, los animales se sacrificaron y se nuclearon los ojos para examen histológico e inmunohistoquímico. Después de la perfusión transcardiaca con paraformaldehído al 4 % en tampón fosfato 0,1 M, los ojos se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones seriadas de 4 m. Cada quinto portaobjetos se tiñó con hematoxilina y eosina para evaluación histomorfológica. Para estudios inmunofluorescentes indirectos, se desparafinaron muestras de ensayo en xileno y se deshidrataron en alcoholes graduados. Se aclararon con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4), y se incubaron con tampón citrato 10 mM (pH 6,0) a 110 ºC durante 4 minutos. Después de lavar con PBS, las muestras de ensayo se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con solución de PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1 %, triton-x100 0,1 % y suero de cabra normal al 3 %. Posteriormente, las secciones se incubaron durante 24 horas a 4 ºC en una cámara humidificada con anti-proteína verde fluorescente (anti-GFP; Santa Cruz Biotechnology; policlonal de conejo, 1:100). Después de lavar en PBS, las muestras de ensayo se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anti-IgG de conejo de cabra conjugado con Cy™2 (1:200). Los núcleos se contratiñeron con medio de montaje que contenía 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, Ca). Para determinar la especificidad de la reacción de antígeno-anticuerpo, se realizaron controles negativos correspondientes con un anticuerpo de isotipo coincidente irrelevante. Se usó un microscopio Zeiss Axiovert 200 equipado con captura de imágenes Sensi Cam 12 Bit (Zeiss, Kelheim, Alemania) para captura de imágenes de microscopía óptica y fluorescente.

Alimentador de uso clínico y sistema de cultivo de hESC

Desarrollo de alimentadores humanos

Se obtuvieron alimentadores humanos de fetos abortados (10-12 semanas de gestación), cordones umbilicales y prepucio de neonato mediante Consentimiento Informado.

Las piernas y las manos de fetos humanos abortados se lavaron dos veces y se transfirieron a una gota de 200 l de medio que comprendía HyQ DMEM (Hyclone, Utah) que contenía suero humano al 10 % (Cambrex, Maryland) y se trituraron con dos hojas de bisturí en trozos pequeños de tejido. Los tejidos embrionarios triturados se incubaron 10 minutos en 10 ml de Solución de TrypLE Select (Gibco, Gaithersburg, MD) a 37 ºC con agitación intermitente. Los sobrenadantes se recogieron después y se inactivaron diluyendo la solución con 35 ml del medio para cultivo de fibroblastos (medio de alimentadores) que comprendía HyQ DMEM (Hyclone, Utah) complementado con suero humano al 10 %-20 % (Cambrex, Maryland) y glutamina 2 mM (Hyclone, Utah). Este procedimiento se realizó dos veces. Las células se centrifugaron y se sembraron 4-5 x 106 células en placas de cultivo tisular T-25 para propagación adicional en medio de alimentadores como anteriormente. Cuando fueron confluyentes, se pasaron usando solución TrypLE Select (Gibco, Gaithersburg, MD).

Se trituró tejido de cordón umbilical a término como anteriormente, y los trozos pequeños de tejido se sembraron en placas en el medio de cultivo de fibroblastos, como se ha descrito anteriormente. Para promover la adherencia de los trozos de tejido a la placa de cultivo, se incubaron matraces durante una noche en vertical. Las células que

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surgían de los trozos de tejido se propagaron como anteriormente.

Se obtuvo tejido de prepucio de neonatos y bebés circuncidados de 7 días a 6 meses. La circuncisión se realizó en el quirófano, y se usó el medio descrito anteriormente para el desarrollo y cultivo de los alimentadores de prepucio. El prepucio circular se cortó y se extendió en la placa de cultivo tisular. Se raspó la epidermis con una hoja de bisturí seguido de lavado con el medio de cultivo. Esto se repitió 5 veces y se sembraron trozos pequeños de tejido del prepucio en el medio de cultivo dentro un matraz. El matraz se incubó en vertical para potenciar la adherencia de los trozos de tejido a la placa y promotor el crecimiento de fibroblastos.

Los fibroblastos se crioconservaron en suero humano (Cambrex, Maryland, Maryland) complementado con Cryosure-DMSO (Wak-Chemie, Alemania) al 10 %. Se usaron procedimientos convencionales de enfriamiento rápido y descongelación rápida.

Para tinción inmunofluorescente indirecta los fibroblastos se sembraron en placas y se cultivaron en portaobjetos cubiertos. Se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente, y después se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % (Sigma) en PBS durante 5 minutos. Las células se incubaron con antivimentina humana (IgG2a monoclonal de ratón,  Dako, 1:10). Se realizó localización de anticuerpos primarios usando anti-inmunoglobulinas de ratón de cabra conjugados con fluoresceinisotiocianato (FITC) (Dako, 1:50).

Se realizó un análisis de FACS de la expresión del marcador por los alimentadores usando un sistema FACS Calibur (Becton-Dickinson, San José, CA). Se añadió yoduro de propidio (concentración final de 4 g/ml) para una mejor selección de células viables. Los alimentadores se disgregaron usando solución TrypLE Select (Gibco, Gaithersburg, MD). Las células se lavaron después con medio FACS que consistía en PBS complementado con BSA al 1 % y azida sódica 0,05 %. La suspensión celular individual se tiñó con anticuerpos anti-fibroblastos humanos (IgG2a monoclonal de ratón, Acris, 1:100) y anticuerpo conjugado con FITC anti-CD44 humano (IgG2b, monoclonal de ratón, IQ Products, Países Bajos, 1:10). Los alimentadores de control se tiñeron con un anticuerpo de control de isotipo. Se detectaron anticuerpos anti-fibroblastos humanos primarios con un anti-Ig de ratón de cabra marcado con FITC (1:100, Dako).

Sistema de cultivo de hESC de uso clínico

Se usaron fibroblastos embrionarios humanos derivados del cordón umbilical como se ha descrito en el presente documento o fibroblastos de prepucio como alimentadores. Los alimentadores se sembraron en placas de cultivo tisular prerrevestidas con Fibronectina humana 1 g/cm2 (BD Biosciences, Bedford, MA) o Gelatina recombinante 100 g/ml (FibroGen, SF). Se llevó a cabo inactivación mitótica incubando los alimentadores 2,5 horas con mitomicina-C (Kyowa, Tokio). Se usaron KO DMEM (Gibco), X-Vivo 10 (Biowhittaker, Maryland), o Medio de Cultivo de Células Madre (CellGenix Friburgo, Alemania) como los medios básicos. Se complementaron con TCH (1-2 %; Protide Pharmaceuticals, St. Paul, MN) o Nutridoma-CS (2 %; Roche, Alemania) como sustitutos de suero. Los medios se complementaron con glutamina 2 mM (Hyclone, Utah) y aminoácidos no esenciales (NEAA, 1 %; Hyclone Utah). Se dividieron hESC semanalmente con PBS sin Ca/Mg++ complementado con EDTA al 0,05 %.

Para crioconservación, se disgregaron hESC con PBS sin Ca/Mg++ complementado con EDTA 0,05 %, se centrifugaron y se resuspendieron en medio Cellgro, complementado con TCH al 2 % y Cryosure-DMSO (Wak-Chemie, Alemania) al 10 %. Se usaron procedimientos de enfriamiento a velocidad lenta y descongelación rápida convencionales.

Se realizó un análisis de FACS de la expresión del marcador en hESC después de la disgregación usando PBS sin Ca/Mg++ complementado con EDTA al 0,05 %. Las células se lavaron después con medio FACS consistente en PBS complementado con BSA 1 % y azida sódica 0,05 %. La suspensión celular se tiñó con anti-SSEA4 (1:100, IgG3 monoclonal de ratón, Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DHSB), Iowa City, IA), y anti-Tra-1-60 (1:20, IgM monoclonal de ratón, regalo del Prof. P. Andrews), anti-Tra-1-81 (1:100, IgM monoclonal de ratón, Chemicon International), anti-Oct 4 humano (IgG2b monoclonal de ratón, 1:50, Santa Cruz) y anti-SSEA1 (1:100, Chemicon). Se tiñeron hESC de control con los anticuerpos de control de isotipo respectivos. Los anticuerpos primarios se detectaron con anti-Ig de ratón de cabra marcado con FITC (1:100, Dako).

Cultivo en suspensión de hESC

En el transcurso del procedimiento de pase rutinario, se disociaron colonias de hESC con 0,05 % de EDTA durante 7-10 min a 37 ºC, o mecánicamente con la ayuda de la colagenasa IV (1 mg/ml, 120 min a 37 ºC). Se promovió la disociación celular por soplado suave del medio con una punta de pipeta de 1 ml hacia las colonias de hESC. Las células/grupos de células se resuspendieron en medio NBN2 (Neurobasal, complemento de N2 1:100, glutamina 2 mM, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 g/ml) complementado con bFGF 20 ng/ml, noggina 250 ng/ml, activina 25-50 ng/ml, fibronectina y laminina 5 ng/ml cada una, gelatina 0,001 %. La suspensión puede pasarse a través de una malla de 30-50 micrómetros para retirar grandes grupos y transferirse a placas de cultivo tisular (Costar, Corning Inc., Corning, NY, Estados Unidos) a una densidad de 0,7-1,2  106 células/ml. Las células muertas y sus fragmentos se retiraron gradualmente durante la renovación del medio y surgieron agregados celulares transparentes pequeños del 3º-5º día de cultivo en suspensión. Las células proliferaron como grupos

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pequeños de libre flotación de 20-50 células. Se evitó la agregación y el crecimiento excesivo de los grupos por su trituración diaria con una punta de pipeta de 1000 l. Como alternativa, cada 7 días se disociaron los grupos con PBS sin Ca/Mg complementado con EDTA 3 mM y tripsina 0,06 % y las células individuales se resuspendieron en medio nuevo.

Caracterización de hESC cultivadas en suspensión

Para la caracterización de las células dentro de los agregados flotantes, se disociaron con solución de EDTA (como anteriormente), seguido de trituración suave, y se sembraron en placas en NBN2 en portaobjetos de vidrio, pretratados con poli-D-lisina (30-70 kDa, 10 g/ml; Sigma, St. Louis, MO) y laminina (4 g/ml; Sigma). Después de una incubación de una hora a 37 ºC, las células se incubaron 1 min en solución de yoduro de propidio (Pl, 1 g/ml en PBS, Sigma) para distinguir las células muertas de las vitales. Las células se lavaron después con PBS y se fijaron con PFA al 4 % durante 20 min. Para inmunotinción con anticuerpos contra marcadores de superficie, las células fijadas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (TA) con los siguientes anticuerpos primarios: anti-SSEA4 (1:200 del IgM monoclonal de ratón concentrado, Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DHSB), Iowa City, IA), anti-Tra-1-60 (1:20), anti-Tra-1-81 (1:10) (IgM monoclonal de ratón, regalo del Prof. P. Andrews), anti-GCTM2 (sobrenadante, IgM monoclonal de ratón, regalo del Prof. M. Pera). Para caracterización de marcadores nucleares, las células se pretrataron con Triton X-100 0,2 % (Sigma) y después se tiñeron con anti-Oct-4 (1:100, IgG monoclonal de ratón, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Se realizó localización de anticuerpos primarios usando fluoresceinisotiocianato (FITC) conjugado bien con anti-inmunoglobulinas de ratón de cabra (Dako, 1:20) o bien con anti-IgM de ratón de cabra (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA). Para la caracterización de los efectos de diversos factores de crecimiento y componentes de ECM en el sistema de cultivo en suspensión, se usaron hESC con un brazo extra corto (p) del cromosoma 1. Se realizó análisis de FACS como anteriormente.

Resultados

Derivación y programación de hESC en sistemas de cultivo de uso clínico sin animales

El desarrollo de los sistemas de cultivo sin animales para la propagación de hESC indiferenciados es una etapa esencial para el aprovechamiento de hESC en la terapia de trasplante. Para este fin, se han desarrollado ahora sistemas de cultivo para la derivación de líneas de células alimentadoras humanas y hESC de los que pueden derivar productos terapéuticos. Estos sistemas cumplen con las regulaciones tanto de la FDA como europeas para Productos Biológicos, usando buenas prácticas de fabricación (GMP) en su fabricación, buenas prácticas tisulares (GTP) en su producción y buenas prácticas de laboratorio (GLP) en su ensayo. En estos sistemas de cultivo, no se usan reactivos derivados de animales, y todos los reactivos se obtienen de fuentes que cumplen con las GMP.

Células alimentadoras humanas (alimentadores)

Pueden utilizarse diversos alimentadores humanos, en estos sistemas, para la derivación y propagación de hESC indiferenciadas, tales como alimentadores de fibroblastos embrionarios humanos (HEF), alimentadores de fibroblastos derivados del cordón umbilical y fibroblastos derivados del prepucio.

En los ejemplos proporcionados en el presente documento las células alimentadoras se desarrollaron y cultivaron usando un sistema de cultivo sin animales de uso clínico que comprendía los siguientes reactivos:

-DMEM (HyQ DME (Hyclone, Utah o equivalente)); -suero humano (Cambrex, Maryland, o equivalente), que reemplaza el suero de ternero fetal (FCS), que se usa

más habitualmente; -fibronectina humana o gelatina recombinante (FibroGen, SF, o equivalente), que reemplaza la gelatina porcina

usada habitualmente para revestimiento de placas de cultivo tisular; -TrypleSelect (Gibco, Gaithersburg, MD, o equivalente), una enzima recombinante, que reemplaza la tripsina

derivada de animal para la división de fibroblastos; -Cryosure-DMSO (Wak-Chemie, Alemania), o equivalente, un producto clasificado GMP para la crioconservación

de fibroblastos; -Mitomicina C (USP o equivalente) de una fuente clasificada GMP para inactivación mitótica de fibroblastos.

Usando los reactivos anteriores, se derivaron nuevas líneas celulares de fibroblastos humanos de prepucio, fetos abortados y cordones umbilicales (Figura 1A-1D).

En general, se desarrollaron 8 nuevas líneas celulares de fibroblastos derivadas de prepucio, 10 derivadas de cordón umbilical y 5 derivadas de fetos abortados, de las que 6, 8 y 3 se desarrollaron dentro de una instalación de GMP, respectivamente.

Se caracterizaron dos líneas celulares de fibroblastos derivadas de cada uno de los tres grupos (en general 6 líneas celulares) entre los pases 5-8. Las células tenían una morfología de fibroblastos típica (Figuras 1A y 1C). La inmunotinción demostró que más del 70 % de las células en cada una de las líneas celulares eran inmunorreactivas con marcadores de fibroblastos incluyendo pero sin limitación anticuerpo anti-vimentina (Figuras 2A-2F), anti-CD44

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y anti-fibroblastos humanos (Figura 3). El cariotipo de los alimentadores fue normal (Figura 4A). La velocidad de duplicación de los fibroblastos fue entre 20 y 50 horas (Tabla 1). El ADN tuvo un perfil de STR humano definitivo (no mostrado).

Tabla 1: Número de células de fibroblastos derivadas del cordón umbilical

Línea

de Tiempo=0 Tiempo =24 h Tiempo =48 h Tiempo=75 h Tiempo de duplicación

alimentadores

Cordón 1 P6*

118148 252777 330833 400000 42,3 h

Cordón 2 P6

35185 52962 83555 91851 49,9 h

Prepucio 2 P5

31705 130000 260000 273000 23,2 h

Prepucio 4 P5

36666 115000 232592 396111 21,2 h

HEF1 P6

54259 114259 176876 357916 27,3 h

HEF2 P6

61093 115370 199092 309166 31,8 h

* P¡ indica el número de pases

Para evaluar el potencial de estas líneas celulares de fibroblastos para apoyar la propagación indiferenciada de hESC pluripotenciales, se cultivaron hESC en las capas alimentadoras durante un periodo de diez semanas y se caracterizó su fenotipo así como su potencial de desarrollo. El fenotipo de la hESC se caracterizó en dos periodos de tiempo. El primer punto temporal entre los pases 1-5 y el segundo punto temporal entre los pases 6-10.

Las células madre embrionarias humanas que se propagaron en los tres tipos de alimentadores (después de congelar y descongelar los alimentadores) mantuvieron su morfología típica (Figura 5A-5C) y expresaron los siguientes marcadores de superficie celular de hESC indiferenciadas: SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 (Figura 6A-6L) fosfatasa alcalina (AP; Figura 7A-7C), y Oct-4 (Figura 8A-8F). Más del 70 % de las hESC expresaron marcadores de células pluripotenciales cuando se analizaron en los periodos de pase temprano tardío (Figuras 9-11, hESC en fibroblastos del cordón, del prepucio y HEF respectivamente; Figuras 12-14 para Oct4, respectivamente). El porcentaje de hESC que expresaba SSEA1, un marcador de células diferenciadas, fue menor del 15 % (Figuras 911). Estos datos indicaron que todos los tipos de fibroblastos podrían apoyar la proliferación indiferenciada de las hESC.

El tiempo de duplicación de las hES cultivadas en los alimentadores fue de 21-30 horas, con una excepción de 36 horas (Tabla 2).

Tabla 2 – Nº de hESC cultivadas en tres tipos diferentes de alimentadores.

Línea de Tiempo=48 h Tiempo=120 h Tiempo=144 h Tiempo=168 h Tiempo de

alimentadores duplicación

hESC en Cordón 1 26666 85185 172222 271851 35,8 h

hESC en Cordón 2 28148 15666 397778 703166 20,3 h

hESC en Prepucio 2 25555 192251 275925 52000 28 h

hESC en Prepucio 4 26667 58518 493611 790000 19,4 h

hESC en HEF1 72129 448055 1147778 -25,4 h

hESC en HEF2 84445 593612 1098889 -27 h

En estos experimentos, las hESC se cultivaron en KO DMEM complementado con KO SR 20 %.

Se indujo diferenciación in vitro de hESC cultivadas en las diversas capas de alimentadores por la derivación de EB y neuroesferas. Los EB y las neuroesferas se disociaron, se sembraron en placas y se tiñeron con respecto a marcadores de las tres capas de germinación (Alfafetoproteína para endodermo, P Tubulina III para ectodermo y desmina muscular o actina muscular para mesodermo). Las células madre embrionarias humanas que se propagaron durante 10 pases en cada uno de los tres tipos de alimentadores pudieron diferenciarse in vitro en descendencia que representaba las tres capas germinales (Figura 15A-15I). Estos datos muestran que el potencial de desarrollo de las hESC, cuando se propagan en los tres tipos de alimentadores, podría mantenerse durante periodos prolongados de tiempo en cultivo.

Los alimentadores derivados de cordón pudieron mantenerse durante periodos prolongados (17 pases). También se ha descubierto ahora que la proliferación de los fibroblastos podría aumentarse mediante complementación del medio con FGF2 (Figura 16). Los fibroblastos mantuvieron su morfología típica y expresión de marcadores después de la expansión con o sin complementación de FGF2 (Figura 17A-17D). Los fibroblastos derivados de cordón que se propagaron en cultivo durante periodos prolongados de tiempo con o sin la adición de FGF2 pudieron apoyar la proliferación indiferenciada de hESC (Figura 18A-18G).

Las células alimentadoras de los tres tipos de tejidos primarios pudieron crioconservarse y descongelarse con éxito. Más del 55 % de las células sobrevivieron a la descongelación. La morfología y la expresión de marcadores y velocidad de crecimiento no se alteraron por la crioconservación. Los alimentadores crioconservados de las tres

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fuentes pudieron apoyar la proliferación indiferenciada de hESC pluripotenciales, como se ha detallado anteriormente. Cuando las células alimentadoras se crioconservaron con la solución de crioconservación habitual de los inventores (knockout (KO) DMEM, DMSO 10 %, reemplazo de suero (SR) KO 10 %), o en soluciones que no incluyen componentes animales (Suero Humano al 90 % y DMSO al 10 %), la viabilidad celular y la velocidad de crecimiento después de la descongelación fueron similares con ambas soluciones de crioconservación.

Células madre embrionarias humanas

El sistema de cultivo sin animales para hESC empleado en las realizaciones ejemplares presentadas en el presente documento, incluyó los siguientes componentes:

-KO DMEM (Gibco, o equivalente), X-Vivo 10 (Biowhittaker, Maryland, o equivalente) o Medio de Cultivo de

Células Madre Cellgro (CellGenix, Friburgo, Alemania, o equivalente) usados como los medios básicos. -Sustitutos de suero humanizados TCH (Protide Pharmaceuticals, St. Paul, MN, o equivalente) o Nutridoma-CS

(Roche, Alemania, o equivalente), usados como sustituto de reemplazo de suero. -Fibronectina humana (BD Biosciences, Badford, MA, o equivalente) o gelatina recombinante (FibroGen, SF, o

equivalente), usados para revestimiento de placas de cultivo tisular. -PBS sin calcio y magnesio, complementado con EDTA al 0,05 % usado para división. -Cryosure-DMSO (Wak-Chemie, Alemania, o equivalente) usado para crioconservación.

KO DMEM, X-Vivo 10 o Medio de Cultivo de Células Madre Cellgro se usaron como los medios básicos para la propagación de colonias de hESC indiferenciadas en alimentadores de Fibroblastos Embrionarios Humanos (HEF) o de prepucio. Estos medios básicos se complementaron con TCH, que es un sustituto de reemplazo de suero (SR) definido sin animales. TCH reemplazó a KO SR, que contenía productos animales y que se usa más habitualmente como un complemento del medio KO.

Se obtuvo proliferación indiferenciada de hESC con TCH complementando los tres medios básicos. Con TCH 2 % en KO DMEM, el 88 % de las hESC que se cultivaron en alimentadores de prepucio expresaban SSEA-4. Con TCH 1 % que complementaba medio Cellgro, el 98 % de las células fueron SSEA-4+, y con TCH 2 % en medio X-Vivo 10, el 99 %, respectivamente. Altos porcentajes (86 %) de las hESC también expresaban el marcador TRA-1-60, cuando se propagaron en HEF en Cellgro con la adición de TCH al 1 %. Las hESC conservaron la morfología de células madre pluripotenciales indiferenciadas, cuando se cultivaron en medio complementado con TCH (Figura 19).

Además de TCH, se ha descubierto ahora que Nutridoma-CS, que no es de origen animal, también puede actuar como un sustituto de SR para apoyar la propagación indiferenciada de hESC. Se ha descubierto que tanto TCH como Nutridoma-CS son tan eficaces como KO SR para apoyar la propagación indiferenciada de hESC. Cuando se cultivaron hESC en alimentadores humanos (fibroblastos o prepucios embrionarios) en KO DMEM complementado con KO SR, TCH al 2 % o Nutridoma-CS al 2 %, el porcentaje de células que expresaban SSEA-4 era comparable en los tres sistemas. Los porcentajes fueron 93 % y 79 % con KO+SR en Prepucio y HEF, respectivamente; 97 % y 72 % con KO+ TCH, y 93 % y 86 % con KO+ Nutridoma-CS (Figura 20).

En el sistema sin animales desvelado en el presente documento, la fibronectina o gelatina recombinante humana reemplazó la gelatina animal que se usa más habitualmente como una matriz para pre-revestir las placas de cultivo tisular. Con respecto a la gelatina recombinante, cuando se cultivaron hESC en una capa alimentadora de prepucio en KO DMEM + KO SR en placas de cultivo pre-revestidas con gelatina o gelatina recombinante, el porcentaje de hESC SSEA-4+ fue comparable (91 % y 94 %, respectivamente). Con respecto a fibronectina recombinante humana, cuando se cultivaron hESC en medio Cellgro complementado con TCH al 2 % en una matriz de gelatina o fibronectina humana, el porcentaje de células SSEA-4+ fue del 97 % y del 96 %, respectivamente, y el porcentaje de células Tra-1-60+ fue del 92 % en ambas matrices.

En el sistema humanizado desvelado en el presente documento, se omitieron Penicilina/Estreptomicina y -Mercaptoetanol de los medios de cultivos de hESC sin afectar a la velocidad de crecimiento o al nivel de diferenciación de fondo.

Para crioconservación de hESC, se usó con éxito Cryosure-DMSO de Wak-Chemie, Alemania, una compañía que cumple con las GMP. Cuando se crioconservaron hESC en medio Cellgro complementado con TCH al 2 % y Cryosure-DMSO al 10 %, 2 semanas después de descongelar y cultivar en alimentadores de fibroblastos de prepucio, el porcentaje de hESC que expresaba SSEA-4 y TRA-1-60 fue del 98 % y 95 %, respectivamente. Estos resultados fueron comparables a los obtenidos con la solución de congelación habitual de los inventores que comprendía FCS al 90 % y DMSO al 10 % (SSEA-4 98 % y TRA-1-60 96 %).

En un sistema alternativo, se usa medio Neurobasal™ (NB), que se desarrolló inicialmente para el mantenimiento de células neurales en atmósfera ambiental, y no tiene reactivos animales, como el medio básico del sistema de cultivo. Cuando se complementa con complemento N2 (que incluye insulina, transferrina, progesterona, putrascina, selenita, NBN2) permite la proliferación indiferenciada y propagación de hESC como colonias planas en los alimentadores. Las hESC se subcultivan semanalmente después de disgregación mecánica o enzimática (dispasa, colagenasa de tipo VI o tripsina) o tratamiento con PBS sin Ca/Mg++ complementado con EDTA, o la combinación de los anteriores. Las hESC conservaron la morfología de células indiferenciadas (Figura 21) y expresión de fosfatasa alcalina (AP).

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El medio puede complementarse con FGF2.

Sistema de cultivo en suspensión para la propagación de hESC a granel

Para aprovechar el potencial de hESC para exploración de alto rendimiento, descubrimiento de fármacos, investigación básica, medicina regenerativa y otras aplicaciones potenciales se requieren grandes números de células. El número de hESC que pueden obtenerse con cultivos en monocapa es limitado. Se requiere el cultivo de hESC en suspensión en lugar de en una monocapa para desarrollar cultivos a granel de hESC. Los cultivos en suspensión de hESC pueden permitir la expansión extensiva de las células con un sistema de biorreactor. Puede permitir el inicio de los procesos de diferenciación en suspensión de un gran número de células, y el desarrollo de nuevas metodologías para diferenciación directa de hESC dentro de cultivos en suspensión.

La propagación de hESC en suspensión puede conseguirse usando medio Neurobasal™ como el medio básico del sistema de cultivo. El medio Neurobasal™ puede complementarse con N2 (NBN2). Puede complementarse adicionalmente con factores solubles incluyendo pero sin limitación FGF, factores de la superfamilia de TGF, antagonistas de BMP así como componentes de la matriz extracelular (ECM) incluyendo pero sin limitación fibronectina, laminina, gelatina para promover la proliferación y supervivencia de las células y para evitar su diferenciación.

Para desarrollar cultivos en suspensión, se disocian colonias de hESC que se cultivan en alimentadores humanos en el sistema de cultivo KO con la ayuda de colagenasa de tipo VI o PBS sin Ca/Mg++ complementado con EDTA al 0,05 %. Las células/grupos de células que se obtienen se resuspenden dentro de medio NBN2 nuevo, complementado con FGF (bFGF 20 ng/ml).

La complementación adicional del medio con los siguientes componentes aumenta la supervivencia/proliferación y evita la diferenciación de las células:

-Factores de la superfamilia de TGF (activina 25-50 ng/ml) -Antagonistas de BMP (noggina 250 ng/ml) -Componentes de la ECM (laminina 5 ng/ml, fibronectina 5 ng/ml, gelatina 0,001 %)

Las células se transfieren a suspensión a una densidad de 0,7-1,2 x 106 células/ml. Las células muertas/fragmentadas se retiran gradualmente durante el cambio de medio. Después de 3-5 días de cultivo en suspensión, se desarrollan agregados celulares transparentes pequeños. Estas células transparentes proliferan como grupos pequeños de libre flotación de 20-50 células sin ninguna señal morfológica de diferenciación (Figura22A). Puede evitarse la agregación y el crecimiento excesivo de los grupos transparentes por trituración diaria mediante una punta de pipeta de 1000 l o mediante el uso de biorreactor. Las células expresan SSEA4 y OCT14 (Figuras 22B y 22D respectivamente). Cuando se vuelven a sembrar en placas con alimentadores humanos, después de 6 semanas de cultivo en suspensión, dan lugar a colonias con la morfología de hESC indiferenciadas.

Se ha descubierto adicionalmente y se desvela en el presente documento que cuando las hESC se cultivan 3 semanas en suspensión en estas condiciones de cultivo en medio complementado con todos los componentes mencionados anteriormente, 85 % de las células expresan SSEA4. Por lo tanto, estas condiciones de cultivo pueden apoyar el cultivo indiferenciado de hESC en suspensión.

Análisis del efecto de cada uno de los componentes, en presencia de FGF2, mostró que los componentes de la ECM promovían la supervivencia/proliferación de hESC (Figura 23B Lam=laminina, Fn=fibronectina, Gel=gelatina), la activina A evitó la diferenciación (Figure 23A), y la noggina podría promover la supervivencia/proliferación (Figura23B).

Puede añadirse nicotinamida al medio para evitar la diferenciación de las células hacia linajes extraembrionarios, para promover su supervivencia y para mantenerlas indiferenciadas.

Nicotinamida (NA) para el mantenimiento de células hES indiferenciadas, prevención de la diferenciación extraembrionaria y para la inducción de la diferenciación somática

El nuevo efecto de la NA en la diferenciación de hESC se demostró más profundamente durante la diferenciación espontánea de hESC dentro de cuerpos embrionarios (EB). Cuando las hESC se diferencian dentro de grupos flotantes, en medio complementado con suero, con el tiempo se desarrollan en EB quísticos que incluyen estructuras quísticas y áreas de células más densamente empaquetadas (Figuras 24A-24B). Estas estructuras quísticas se atribuyen en EB de ratón a diferenciación endodérmica extraembrionaria [Coucouvanis, E. y Martin, G.R. Signals for death and survival: a two-step mechanism for cavitation in the vertebrate embryo. Cell 83, 279-287 (1995); Doetschman, T.C., y col. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: fonnation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. J Embryo Exp Morphol 87, 27-45 (1985)]. Sin embargo, en presencia de NA, preferentemente a una concentración de 10 mM, no se formaron estructuras quísticas durante la diferenciación dentro de EB (Figuras 24C-24D). Además, las células diferenciadas adquirieron la morfología de células precursoras neurales.

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El efecto de la NA en la diferenciación dentro de EB no dependió de la presencia de suero y se observó también cuando los EB se diferenciaron en un medio químicamente definido (NBN2; Figuras 25A-25H, es decir los dos paneles superiores).

Además de su efecto en la diferenciación, la NA también tuvo un efecto en el tamaño de los EB. En medio sin suero complementado con NA, el tamaño de los EB después de dos semanas de diferenciación fue significativamente mayor (1,7 veces; diámetro máximo de los EB) en comparación con el tamaño de los EB que se cultivaron en las mismas condiciones en ausencia de NA (Figuras 25E-25F, es decir, imágenes izquierdas de los dos paneles superiores). El tamaño aumentado de los EB en presencia de NA reflejó un aumento en el número de células dentro de los EB. Cuando se generaron EB a partir de un número comparable de células indiferenciadas, después de 2 y 4 semanas, hubo 5,4 y 33 veces más células respectivamente, en cultivos que se trataron con NA en comparación con los controles. Por lo tanto puede usarse NA para aumentar el número de células diferenciadas que se obtienen de hESC.

Además, el tratamiento con NA permitió el cultivo prolongado de EB durante 12 semanas (Figura 28). El cultivo prolongado de EB es importante para la compleción de procesos de diferenciación complejos que requieren largos periodos de tiempo, y pueden promover la maduración de células diferenciadas.

Se sabe que el ácido retinoico induce la diferenciación extraembrionaria de células madre pluripotenciales humanas (Roach, S., Schmid, W., Pera, MF. Hepatocytic transcription factor expression in human embryonal carcinoma and yolk sac carcinoma cell lines: expression of HNF-3 alpha in models of early endodermal cell differentiation. Eep Cell Res 215, 189-98 (1994)). Cuando se cultivaron EB derivados de hESC en presencia de RA hubo una formación quística extensiva. La NA pudo bloquear el efecto de RA y cuando los EB se cultivaron en presencia de RA y NA el desarrollo de estructuras quísticas fue infrecuente (Figuras 25I-25P, es decir, los dos paneles inferiores).

Además, el número de células diferenciadas que se obtuvo en presencia de RA fue bajo. Este efecto de RA también se bloqueó cuando el medio se complementó con NA (Figuras 25I-25P, los dos paneles inferiores).

Los estudios inmunocitoquímicos y de RT-PCR mostraron que la expresión del marcador endodérmico (extraembrionario y definitivo) -fetoproteína, que se expresa por células dentro de EB que se cultivan en presencia del suero, no se detectó dentro de los EB después de la diferenciación en presencia de NA (Figuras 26 y 27A, 27C). De forma similar, la Citoqueratina-8, que es un marcador no específico de una amplia serie de tejidos epiteliales, que incluye tejidos extraembrionarios [Pera, M.F. y col. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP2 and its antagonist noggin. J Cell Sci 117, 1269-1280 (2004); Kemler, R., y col. Reactivity of monoclonal antibodies against intermediate filament proteins during embryonic development. J Embryol Exp Morphol 64, 45-60 (1981)], y que se expresa ampliamente dentro de EB, no se demostró dentro de EB que se desarrollaron en presencia de NA (Figuras 27B y 27D).

Un alto porcentaje de las células dentro de EB que se diferenciaron en presencia de NA (durante 6 semanas) expresaban marcadores precursores neurales en comparación con EB de control que se desarrollaron en ausencia de NA (PSA-NCAM 85,5 % frente a 19,9 %, respectivamente, análisis de FACS). Además, los estudios de inmunofluorescencia indirecta mostraron que en presencia de NA, el 58,3 % de las células expresaban nestina, y el 67,8 % expresaban -tubulina III.

Dentro del linaje neural, se descubrió que el tratamiento con NA promovía la diferenciación hacia células RPE. Las células RPE, que quedan inmediatamente debajo de los fotorreceptores y forman parte de la barrera sanguínea retiniana hacia el coroides, desempeñan un papel crucial en el apoyo y mantenimiento de los fotorreceptores. Sus tareas incluyen el transporte activo de nutrientes de los vasos coroidales a los fotorreceptores, el procesamiento de vitamina A y la captación y el reciclaje de segmentos externos que se desprenden continuamente por los fotorreceptores. Aunque la degeneración primaria de los fotorreceptores es la causa de la pérdida visual progresiva en algunos tipos de Retinitis Pigmentosa, en otras la lesión inicial es en células RPE y, como consecuencia, los fotorreceptores también se dañan y se produce degeneración retiniana. Lo que es aún más importante, en la Degeneración Macular Relacionada con la Edad (AMD), que es la causa más habitual de ceguera entre la población mayor, la insuficiencia de RPE es la causa principal de enfermedad [Smith W, Assink J, Klein R y col. Risk factors for age-related macular degeneration: Pooled findings from three continents. Ophthalmology 2001; 108: 697-704].

Por lo tanto, la derivación de este tipo celular de hESC puede ser muy beneficiosa. Se pueden usar como un modelo in vitro para el desarrollo de nuevos fármacos para promover su supervivencia y función. Las células RPE derivadas de hESC pueden actuar para exploración de alto rendimiento con respecto a compuestos que son tóxicos para células RPE. Se pueden usar para descubrir mecanismos, nuevos genes, factores solubles o unidos a membrana que son importantes para el desarrollo, diferenciación, mantenimiento, supervivencia y función de células fotorreceptoras. Estas células pueden actuar como una fuente ilimitada de células RPE para trasplante y reabastecimiento de células RPE con mal funcionamiento o degradadas en degradaciones retinianas. Las células RPE modificadas genéticamente pueden actuar como un vector para transportar y expresar genes en la retina después del trasplante.

Aunque las células pigmentadas se observaron en pocas ocasiones dentro de EB derivados de hESC que se

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diferenciaban en medio KO, los grupos de células pigmentadas eran abundantes dentro de EB que se diferenciaban en presencia de NA. El porcentaje de EB que incluía grupos de células pigmentadas aumentó gradualmente junto con la diferenciación en presencia de NA (34 %, 59 % y 70 % a las 5, 6 y 12 semanas de diferenciación, respectivamente; Figuras 28A-28D). Después de 6 semanas de diferenciación, el 9 % de las células dentro de los EB estaban pigmentadas. El potencial de la NA para inducir diferenciación hacia células RPE también se demostró al nivel de ARN por PCR en tiempo real. La expresión de los marcadores de RPE, RPE65 y MITF A aumentó significativamente en EB que se diferenciaron en presencia de NA en comparación con EB de control (Figura 29).

Cuando los EB se disociaron parcialmente y se sembraron en placas, se formaron colonias que comprendían una monocapa de las células pigmentadas entre otros tipos de células diferenciadas (Figuras 30A-30H). La tinción inmunofluorescente indirecta mostró que las células pigmentadas expresaban múltiples marcadores de células RPE incluyendo PAX6, MITF, ZO-1, CRALBP, Bestrofina y RPE65 confirmando de este modo la identidad retiniana de las células pigmentadas.

Fue posible enriquecer los cultivos con respecto a las células RPE aislando las células pigmentadas de otras células dentro de los EB por disección mecánica. Pueden usarse otros procedimientos tales como selección genética, inmunoselección, FACS y otros para purificar los cultivos con respecto a células RPE.

Se trasplantaron poblaciones enriquecidas de células RPE derivadas de hESC al espacio vítreo y al subretiniano de ratas RCS albinas respectivamente. El análisis inmunohistológico de los ojos, a las 4 semanas después del trasplante, demostró células RPE derivadas de hESC supervivientes (Figuras 32A-32B). Las células RPE trasplantadas migraron de injertos subretinianos y se integraron dentro de la capa de RPE de ratas albinas huésped (Figura 32C).

Se realizó una comparación diferencial del perfil de expresión génica de EB después de 4 semanas de cultivo en suspensión en presencia y ausencia de NA usando matrices génicas affymetrix. El nivel expresión de 1072 genes se reguló positiva o negativamente en al menos el doble; 442 genes estaban regulados positivamente y 630 genes estaban regulados negativamente. El análisis confirmó que la NA suprimía la expresión de -fetoproteína y citoqueratina-8. Además, la expresión de otras citoqueratinas también se suprimió, incluyendo las citoqueratinas 7, 18, 19, 23.

Resulta interesante que la expresión del gen de tipo cordina 1 estaba regulada positivamente. Este hallazgo se confirmó adicionalmente por RT PCR (Figura 31). La tipo cordina está compuesta de tres dominios ricos en cisteína (CR). La tipo cordina se une con BMP-4, BMP-5, BMP-6 y TGF- y 2 [Nakayama, N. y col. A novel chordin-like protein inhibitor for bone morphogenetic proteins expressed preferentially in mesenchymal cell lineages. Dev Biol 232, 372-387 (2001)]. En el embrión de ratón temprano, la expresión de cordina está restringida al nodo y la notocorda en un momento en el que la tipo cordina se expresa en la placa neural [García Abreu, J., y col. Chordinlike CR domains and the regulation of evolutionarily conserved extracellular signaling systems. Gene 287, 39-47 (2002)]. El tratamiento con NA indujo la expresión de genes que están implicados en la ruta de señalización de Wnt activa incluyendo Wnt4, Wnt 2B, Frizzled (FZD) 1, FZD2, FZD3, FZD10.

En línea con los hallazgos morfológicos e inmunohistológicos que mostraron el potencial de la NA para promover la diferenciación neural, la expresión de ZIC1, un miembro de la familia de zic 1, que se expresa durante la diferenciación neural, estaba regulada positivamente de forma notable en presencia de NA. La expresión del factor de determinación izquierda-derecha (LEFT) A y B así como PITX1 estaba regulado negativamente.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para mantener células madre en un estado indiferenciado, comprendiendo el procedimiento incubar dichas células con un sistema de cultivo que comprende células alimentadoras, en el que las células alimentadoras en el sistema de cultivo consisten esencialmente en células alimentadoras de fibroblastos expandidas de células del cordón umbilical humano y en el que dicho sistema de cultivo no tiene agentes antibacterianos ni agentes antifúngicos, en el que:

   (a)

   las células madre no son células madre embrionarias humanas;

   (b)

   las células madre son células madre hematopoyéticas obtenidas de tejido de médula ósea de un individuo de cualquier edad o de sangre del cordón de un individuo neonato; o

   (c)

   las células madre son células germinales embrionarias obtenidas del tejido genital de un feto en cualquier momento durante la gestación.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que todas las células alimentadoras en el sistema de cultivo son células de fibroblastos.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dichas células madre son células madre humanas.

4. 4.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para propagar dichas células madre en un estado indiferenciado.

5. 5.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende incubar dichas células madre con un sustituto de reemplazo de suero humanizado.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho sustituto de reemplazo de suero humanizado es seleccionado de TCH™, Nutridoma-CS, N2 y una combinación de los mismos.

7. 7.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sistema de cultivo es un sistema de cultivo sin suero.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el sistema de cultivo comprende un medio básico seleccionado de medio de cultivo de células madre Cellgro, KO DMEM, Neurobasal™ y X-Vivo 10.

9. 9.

   El procedimiento de la reivindicación 8, en el que cuando dicho medio básico es Neurobasal™, el sistema comprende además un complemento de N2 o una modificación de complemento de N2.

10. 10.

    Un procedimiento para obtener un cultivo celular que comprende células alimentadoras obtenidas de tejido del cordón umbilical humano, comprendiendo el procedimiento:

    (a)

    aislar células del cordón umbilical de tejido del cordón umbilical; y

    (b)

    cultivar dichas células del cordón umbilical en un medio de cultivo que incluye suero que no tiene agentes antibióticos ni agentes antifúngicos,

    en el que dichas células del cordón umbilical se obtienen triturando dicho tejido del cordón umbilical en trozos pequeños, y en el que los trozos de tejido del cordón umbilical triturados se fijan a las paredes de un recipiente en presencia de medio de cultivo, y se permite que se incuben sin perturbación durante varias semanas hasta que las células de fibroblastos comienzan a migrar fuera de los trozos del cordón umbilical, para obtener dicho cultivo celular en el que las células derivadas del cordón umbilical humano son capaces de mantener células madre en un estado indiferenciado cuando se co-cultivan con las mismas, y en el que las células alimentadoras consisten esencialmente en células de fibroblastos.

11. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho tejido del cordón umbilical es obtenido de mujeres embarazadas sanas que se someten a cesáreas opcionales a término.

12. 12.

    Un procedimiento para mantener células madre en un estado indiferenciado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho sistema de cultivo comprende un cultivo celular obtenido acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 10 u 11.

13. 13.

    Un sistema de cultivo que comprende células alimentadoras para el mantenimiento de células madre en un estado indiferenciado, en el que las células alimentadoras en el sistema de cultivo consisten esencialmente en células alimentadoras de fibroblastos expandidas de células del cordón umbilical humano, estando dicho sistema de cultivo sin agentes antibacterianos y agentes antifúngicos.

14. 14.

    El sistema de cultivo de la reivindicación 13 que es adecuado para el mantenimiento de células madre embrionarias en un estado indiferenciado.

15. 15.

    El sistema de cultivo de la reivindicación 13 o 14, en el que dichas células madre son células madre humanas.

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    E05821535

    10-12-2014

16. 16.

    El sistema de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, para la propagación de células madre indiferenciadas.

17. 17.

    El sistema de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, que es un sistema de cultivo sin animales.

18. 18.

    El sistema de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, que comprende un sustituto de reemplazo de suero humanizado.

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