JP7055095B2

JP7055095B2 - 網膜色素上皮細胞の大規模生産

Info

Publication number: JP7055095B2
Application number: JP2018504790A
Authority: JP
Inventors: ベンジャミンイーサンルビノフ; オーナシンガー
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2016-07-28
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2036-07-28
Also published as: EP3862425A1; EP3328995A1; WO2017017686A1; US20180216064A1; US11746324B2; IL257148B; JP2018525986A; US11230696B2; IL257148A; EP3328995B1; ES2865024T3; US20220098551A1

Description

本発明は、そのいくつかの態様において、胚性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の大規模生産に関する。

本発明は、そのいくつかの態様において、網膜色素上皮細胞に関し、より具体的には、これらに限定される訳ではないが、そのような細胞の治療としての評価に関する。本発明はまた、胚性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の作製に関する。

網膜色素上皮(RPE)は、神経網膜と脈絡毛細管板との間にある色素細胞の単層である。RPE細胞は、網膜およびその光受容体の維持および機能において重大な役割を果たす。これらには、血液網膜関門の形成、迷光(stray light)の吸収、神経網膜への栄養の供給、視色素の再生、ならびに光受容体の脱落した外節の取り込みおよび再利用が含まれる。

網膜組織はいくつかの理由のために変性する可能性がある。それらの中には、動脈または静脈閉塞、糖尿病網膜症および未熟児網膜症があり、これらは通常遺伝性ではない。網膜組織の変性も伴う網膜色素変性、網膜分離症、網膜格子状変性、ベスト病、シュタルガルト病などの遺伝性疾患が存在する。よく見られる網膜変性状態は加齢黄斑変性(AMD)である。これらの状態は網膜変性の進行のタイプによって特徴付けられる。

RPE細胞は、上述の網膜疾患において変性RPEの細胞置換療法のために潜在的に用いられる可能性がある。それはまた、網膜変性疾患の処置のための遺伝子の導入向けの媒体として用いられる可能性もある。これらの細胞はまた、網膜変性疾患のインビトロモデルとして、低分子の治療効果についてのハイスループットスクリーニング用、および網膜変性疾患向けの新たな薬物の発見および試験用のツールとして機能する可能性がある。RPE細胞はまた、RPEの発生、成熟、特性解析、性質、代謝、免疫原性、機能および他の細胞型との相互作用の基礎研究のためにも用いることができる。

ヒト胎児および成人のRPEは、同種移植用の代替ドナー供給源として用いられている。しかしながら、十分な組織供給を入手する上での現実的な問題および中絶胎児からの組織の使用に関する倫理上の懸念が、これらのドナー供給源の広範な使用を制限する。成人および胎児RPE移植組織の供給におけるこれらの制限を考慮して、代替ドナー供給源の可能性が研究されている。ヒト多能性幹細胞は、移植向けのRPE細胞の供給源として重大な利点をもたらす。その多分化能は、真の機能的なRPE細胞へのその分化を可能にする可能性があり、その無限の自己再生能を考慮すると、それらはRPE細胞の無制限のドナー供給源として機能する可能性がある。実際、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(iPS)は、インビトロでRPE細胞に分化し、RPE機能障害によって引き起こされる網膜変性のRoyal College of Surgeons (RCS)ラットモデルへの網膜下移植後に、網膜変性を減弱して視覚機能を保護する可能性があることが実証されている。したがって、多能性幹細胞は、RPE細胞の産生の無制限な供給源となる可能性がある。

多能性幹細胞からのRPE細胞の誘導のための現在のプロトコールは、労働集約的でありかつ多大な時間を要し、限られた数の色素細胞を生じさせる。臨床の場で用いることができるのに十分なほど多い数でRPE細胞を産生する新たな方法が必要とされる。

背景技術には、WO 2013/114360（特許文献1）、WO 2008/129554（特許文献2）およびWO 2013/184809（特許文献3）が含まれる。

WO 2013/114360 WO 2008/129554 WO 2013/184809

本発明のいくつかの態様の1つの局面によれば、以下の工程を含む、網膜色素上皮(RPE)細胞を作製する方法が提供される：
(a)ヒトフィーダー細胞馴化培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、ヒト多能性幹細胞の培養集団を得る工程；
(b)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の培養集団を培養し、分化細胞を得る工程；および
(c)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地中で分化細胞を培養し、それによってRPE細胞を作製する工程。

本発明のいくつかの態様の1つの局面によれば、以下の工程を含む、RPE細胞を作製する方法が提供される：
(a)ヒトフィーダー細胞馴化培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、ヒト多能性幹細胞の培養集団を得る工程；
(b)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の培養集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(c)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地中で分化細胞を培養し、RPE細胞を得る工程；および
(d)接着性表面上でRPE細胞を培養し、RPE細胞の増殖した集団を作製する工程。

本発明のいくつかの態様の1つの局面によれば、以下の工程を含む、網膜疾患を処置する方法が提供される：
(a)ヒトフィーダー細胞馴化培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、ヒト多能性幹細胞の培養集団を得る工程；
(b)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の培養集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(c)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地中で分化細胞を培養し、RPE細胞を得る工程；
(d)接着性表面上でRPE細胞を培養し、RPE細胞の増殖した集団を作製する工程；
(e)RPE細胞の増殖した集団を回収する工程；および
(f)回収する工程の後にRPE細胞を対象の眼の中に移植し、それによって疾患を処置する工程。

本発明のいくつかの態様の1つの局面によれば、本明細書に記載の方法によって作製されたRPE細胞の集団が提供される。

本発明のいくつかの態様の1つの局面によれば、本明細書に記載のRPE細胞の治療的有効量を対象に投与し、それによって網膜疾患または網膜障害を処置する工程を含む、その必要がある対象において網膜疾患または網膜障害を処置する方法が提供される。

本発明のいくつかの態様によれば、方法は大規模で行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、フィーダー細胞馴化培地は、該フィーダー細胞馴化培地を作製するために用いられるフィーダー細胞から分離される。

本発明のいくつかの態様によれば、ヒトフィーダー細胞馴化培地は、ヒト臍帯線維芽細胞馴化培地を含む。

本発明のいくつかの態様によれば、工程(a)の培養は、フィーダー細胞の非存在下で行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、ヒト臍帯線維芽細胞馴化培地は、少なくとも2日間培養培地中でヒト臍帯線維芽細胞を培養することによって作製される。

本発明のいくつかの態様によれば、ヒト臍帯線維芽細胞は放射線照射される。

本発明のいくつかの態様によれば、馴化培地はNutristemを含む。

本発明のいくつかの態様によれば、分化したRPE細胞の移植は、眼の網膜下腔で行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、RPE細胞は、懸濁物の状態で、またはマトリックスまたは基質上に固定化された細胞の単層として、移植される。

本発明のいくつかの態様によれば、ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞を含む。

本発明のいくつかの態様によれば、分化作用物質はニコチンアミドを含む。

本発明のいくつかの態様によれば、工程(b)の培地はアクチビンAを欠いている。

本発明のいくつかの態様によれば、TGFβスーパーファミリーのメンバーは、TGFβ1、TGFβ3、およびアクチビンAからなる群より選択される。

本発明のいくつかの態様によれば、工程(c)の培地はニコチンアミドおよびアクチビンAを含む。

本発明のいくつかの態様によれば、方法は、工程(c)の後に、ニコチンアミドを含みかつアクチビンAを欠いている培地中でRPE細胞を培養する工程をさらに含む。

本発明のいくつかの態様によれば、工程(b)は非接着性条件下で行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、非接着性条件は、非接着性培養プレートを含む。

本発明のいくつかの態様によれば、非接着性条件は非接着性基質を含む。

本発明のいくつかの態様によれば、工程(b)は以下を含む：
(i)非接着性条件下、アクチビンAの非存在下でニコチンアミドを含む培地中でヒト多能性幹細胞の培養集団を培養し、分化細胞を含む細胞のクラスターを作製する工程；および続いて
(ii)接着性条件下、アクチビンAの非存在下でニコチンアミドを含む培地中で(i)の分化細胞を培養する工程。

本発明のいくつかの態様によれば、方法は、工程(ii)の前に細胞のクラスターを解離させ、細胞の凝集塊または細胞のシングルセル懸濁物を作製する工程をさらに含む。

本発明のいくつかの態様によれば、工程(a)は約1週間行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、工程(b)は少なくとも1週間行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、工程(c)は少なくとも1週間行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、方法は、工程(c)の後かつ工程(d)の前に非色素細胞を除去する工程をさらに含む。

本発明のいくつかの態様によれば、培養の少なくとも一部は、大気中酸素レベルが約10％未満である条件下で行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、培養は、大気中酸素レベルが約10％を上回る条件下で行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、方法は、工程(a)の前にフィーダー細胞上でヒト多能性幹細胞を増殖させる工程をさらに含む。

本発明のいくつかの態様によれば、フィーダー細胞はヒト臍帯線維芽細胞を含む。

本発明のいくつかの態様によれば、増殖させる工程は少なくとも2継代行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、増殖させる工程は少なくとも1週間行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、網膜疾患または網膜障害は、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、遺伝性または後天性の黄斑変性、加齢黄斑変性(AMD)、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィー、RPEジストロフィー、シュタルガルト病、ならびに光、レーザー、炎症、感染、放射線、血管新生、または外傷性損傷のいずれか1つによって引き起こされる傷害を原因とするRPEおよび網膜の傷害のうちの少なくとも1つから選択される。

他に定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および/または科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の態様の実施またはテストで用いることができるが、例示的な方法および/または材料を以下に記載する。矛盾がある場合、定義を含む特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は例示のみを目的とし、必ずしも限定することを意図しない。
[本発明1001]
以下の工程を含む、網膜色素上皮(RPE)細胞を作製する方法：
(a)ヒトフィーダー細胞馴化培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、ヒト多能性幹細胞の培養集団を得る工程；
(b)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の前記培養集団を培養し、分化細胞を得る工程；および
(c)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地中で前記分化細胞を培養し、それによってRPE細胞を作製する工程。
[本発明1002]
以下の工程を含む、RPE細胞を作製する方法：
(a)ヒトフィーダー細胞馴化培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、ヒト多能性幹細胞の培養集団を得る工程；
(b)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の前記培養集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(c)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地中で前記分化細胞を培養し、RPE細胞を得る工程；および
(d)前記RPE細胞を接着性表面上で培養し、RPE細胞の増殖した集団を作製する工程。
[本発明1003]
以下の工程を含む、網膜疾患を処置する方法：
(a)ヒトフィーダー細胞馴化培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、ヒト多能性幹細胞の培養集団を得る工程；
(b)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の前記培養集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(c)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地中で前記分化細胞を培養し、RPE細胞を得る工程；
(d)前記RPE細胞を接着性表面上で培養し、RPE細胞の増殖した集団を作製する工程；
(e)RPE細胞の前記増殖した集団を回収する工程；および
(f)前記回収する工程の後に前記RPE細胞を対象の眼の中に移植し、それによって疾患を処置する工程。
[本発明1004]
大規模で行われる、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
前記フィーダー細胞馴化培地が、前記フィーダー細胞馴化培地を作製するために用いられるフィーダー細胞から分離されている、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記ヒトフィーダー細胞馴化培地がヒト臍帯線維芽細胞馴化培地を含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1007]
工程(a)の培養がフィーダー細胞の非存在下で行われる、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記ヒト臍帯線維芽細胞馴化培地が、ヒト臍帯線維芽細胞を培養培地中で少なくとも2日間培養することによって作製されている、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記ヒト臍帯線維芽細胞が放射線照射されている、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記馴化培地がNutristemを含む、本発明1006～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
分化した前記RPE細胞の前記移植が眼の網膜下腔で行われる、本発明1003の方法。
[本発明1012]
前記RPE細胞が、懸濁物の状態で、またはマトリックスもしくは基質上に固定化された細胞の単層として、移植される、本発明1003の方法。
[本発明1013]
前記ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞を含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記分化作用物質がニコチンアミドを含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1015]
工程(b)の培地がアクチビンAを欠いている、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記TGFβスーパーファミリーのメンバーが、TGFβ1、TGFβ3、およびアクチビンAからなる群より選択される、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1017]
工程(c)の培地がニコチンアミドおよびアクチビンAを含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1018]
工程(c)の後に、ニコチンアミドを含みかつアクチビンAを欠いている培地中で前記RPE細胞を培養する工程をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
工程(b)が非接着性条件下で行われる、本発明1001、1002、1003または1015の方法。
[本発明1020]
前記非接着性条件が非接着性培養プレートを含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記非接着性条件が非接着性基質を含む、本発明1019の方法。
[本発明1022]
工程(b)が、
(i)非接着性条件下、アクチビンA非存在下でニコチンアミドを含む培地中でヒト多能性幹細胞の前記培養集団を培養し、分化細胞を含む細胞のクラスターを作製する工程；および続いて
(ii)接着性条件下、アクチビンA非存在下でニコチンアミドを含む培地中で(i)の前記分化細胞を培養する工程
を含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1023]
工程(ii)の前に前記細胞のクラスターを解離させ、細胞の凝集塊または細胞のシングルセル懸濁物を作製する工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
工程(a)が約1週間行われる、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1025]
工程(b)が少なくとも1週間行われる、本発明1001～1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
工程(c)が少なくとも1週間行われる、本発明1001～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
工程(c)の後かつ工程(d)の前に非色素細胞を取り除く工程をさらに含む、本発明1002または1006の方法。
[本発明1028]
前記培養の少なくとも一部が、大気中酸素レベルが約10％未満である条件下で行われる、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記培養が、大気中酸素レベルが約10％を上回る条件下で行われる、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1030]
工程(a)の前にフィーダー細胞上で前記ヒト多能性幹細胞を増殖させる工程をさらに含む、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記フィーダー細胞がヒト臍帯線維芽細胞を含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記増殖させる工程が少なくとも2継代行われる、本発明1030および1031の方法。
[本発明1033]
前記増殖させる工程が少なくとも1週間行われる、本発明1030～1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記網膜疾患または網膜障害が、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、遺伝性または後天性の黄斑変性、加齢黄斑変性(AMD)、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィー、RPEジストロフィー、シュタルガルト病、ならびに光、レーザー、炎症、感染、放射線、血管新生、または外傷性損傷のいずれか1つによって引き起こされる傷害を原因とするRPEおよび網膜の傷害のうちの少なくとも1つから選択される、本発明1003の方法。
[本発明1035]
本発明1001、1002および1006～1033のいずれかの方法により作製されたRPE細胞の集団。
[本発明1036]
本発明1035のRPE細胞の治療的有効量を対象に投与し、それによって網膜疾患または網膜障害を処置する工程を含む、その必要がある対象において網膜疾患または網膜障害を処置する方法。

本発明の一部の態様が、例示のためにのみ、添付の図面を参照して、本明細書において記載される。ここで該図面を詳細に具体的に参照して、示されている事項は例示のためでありかつ本発明の態様の例示的説明を目的とすることが強調される。この点について、図面によって行われた説明は、当業者に本発明の態様を実施しうる方法を明らかにする。

本発明の態様によるRPE細胞を作製するためのプロトコールの概略図である。

本発明の特定の態様の説明
本発明は、そのいくつかの態様において、胚性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の大規模生産に関する。

本発明の少なくとも1つの態様を詳細に説明する前に、本発明は以下の説明に記述されているかまたは実施例により例示されている詳細にその適用が限定される必要がないことが理解されるべきである。本発明は他の態様ができるか、または様々な方法で実施または実行することができる。

ヒト胚性幹細胞は、RPE細胞の作製のための細胞供給源として提案されている。2つの一般的なアプローチ、自発的分化および直接的分化が、hESCから網膜色素上皮(RPE)細胞を得るために用いられている。自発的分化では、扁平なコロニーまたは胚様体(EB)でのhESCは色素を有するRPE細胞を含有する細胞の集団に自発的に分化することができる。直接的分化方法は、いくつかの因子を用いてhESC(球状体(spheroid body)中に存在する)のRPE細胞への分化を駆動させる、例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,956,866号を参照されたい。

該文献に記載のプロトコールの重大な限界はその小規模な性質であり、これは工業的大量生産を制限する。米国特許第8,956,866号に記載のRPE生産の最初の工程は、シングルウェル培養ディッシュ内の臍帯フィーダー上でhESCコロニーを培養することに基づく。コロニーは機械的な継代の繰り返しによって増殖される。このアプローチは小規模での増殖を可能し、労働集約的でありかつ多大な時間を要する。

米国特許第8,956,866号に記載のプロトコールの次の工程では、フィーダーからhESCクラスターを回収し、非接着性条件下で培養することによって、球状体(SB)が産生される。このアプローチは限られた数のSBを生じ、SB中の残余フィーダーは下流の分化過程を妨害する。これらの制限は色素を有するRPE細胞の量を低下させる。

本発明者らは今回、球状体中のhESCの直接的分化によって生じるRPE細胞の量がフィーダーフリーな培養系を用いることによって増強できることを提案する。より具体的には、本発明者らは、胚性幹細胞が、球状体の作製およびさらなる直接的分化工程の前にフィーダーフリーな培地中で培養されるべきであることを提案する。

本発明を実行に移す一方で、本発明者らは、同じ期間に、得ることができる未分化hESCの数が、hESCの増殖のためにフィーダー細胞にのみ依拠するプロトコールと比較して少なくとも3倍増加することを示す。さらに、未分化細胞の1回の追加の酵素による継代によって、得ることができるhESCの量は13倍増大する。hESCの増殖に必要とされる労働量は劇的に低減した。加えて、本発明者らは、本明細書に記載のフィーダーフリーな培養を用いて高レベルのRPE細胞を得る際の再現性は、hESCの増殖のためにフィーダー細胞にのみ依拠するプロトコールと比較してはるかに高いことを見出した。さらに、本発明者らは、ESCを非フィーダー細胞培養系で培養すると、RPE細胞を生成するための全プロトコールは、低いおよび通常の酸素条件下でも等しく有効であり、それによって、酸素条件の操作などの高価かつ複雑な工程が不必要となることを示した。

したがって、本発明の1つの局面によれば、以下の工程を含む、網膜色素上皮(RPE)細胞を作製する方法が提供される：
(a)ヒトフィーダー細胞馴化培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、ヒト多能性幹細胞の培養集団を得る工程であって、該フィーダー細胞馴化培地が、該フィーダー細胞馴化培地を作製するために用いられるフィーダー細胞から分離される、工程；
(b)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の培養集団を培養し、分化細胞を得る工程；
(c)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地中で分化細胞を培養し、それによってRPE細胞を作製する工程。

「網膜色素上皮細胞」、「RPE細胞」、「RPE」は、文脈が許す限り互換的に用いることができ、網膜の色素上皮細胞層を形成するネイティブなRPE細胞のものと機能的に類似する細胞型の細胞を指す(例えば、眼の中に移植されると、それらはネイティブなRPE細胞のものと類似する機能的な活性を示す)。

1つの態様によれば、RPE細胞は、成熟RPE細胞の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのマーカーを発現する。そのようなマーカーには、これらに限定されるわけではないが、CARLBP、RPE65、PEDF、PMEL17、ベストロフィンおよびチロシナーゼが含まれる。任意で、RPE細胞は、RPE前駆体のマーカー（例えばMITF）も発現する可能性がある。別の態様において、RPE細胞はPAX-6を発現する。別の態様において、RPE細胞は、これらに限定されるわけではないが、Rx、OTX2、SIX3、SIX6およびLHX2を含む、網膜前駆体細胞の少なくとも1つのマーカーを発現する。

本明細書で用いられる語句「成熟RPE細胞のマーカー」は、非RPE細胞または未成熟RPE細胞に対して成熟RPE細胞において(例えば、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍)上昇している抗原(例えば、タンパク質)を指す。

本明細書で用いられる語句「RPE前駆体細胞のマーカー」は、非RPE細胞に対してRPE前駆体細胞において(例えば、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍)上昇している抗原(例えば、タンパク質)を指す。

別の態様によれば、RPE細胞は、網膜の色素上皮細胞層を形成するネイティブなRPE細胞のものと類似する、すなわち、色素を有しかつ特徴的な多角形の形状を有する、形態を有する。

さらに別の態様によれば、RPE細胞は黄斑変性などの疾患を処置することができる。

さらに別の態様によれば、RPE細胞は、本明細書において先に挙げた要件の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つまたは全てを満たす。

本明細書で用いられる語句「幹細胞」は、特定の特殊化した機能を有する他の細胞型(例えば、完全に分化した細胞)に分化するように誘導されるまで培養において長期間にわたって未分化の状態のままであることができる細胞(例えば、多能性または複能性幹細胞)を指す。好ましくは、語句「幹細胞」は、胚性幹細胞(ESC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、成体幹細胞、間葉系幹細胞および造血幹細胞を包含する。

特定の態様によれば、RPE細胞は多能性幹細胞(例えば、ESCまたはiPSC)から作製される。

人工多能性幹細胞(iPSC)は、体細胞の遺伝子操作によって、例えば、Oct-3/4、Sox2、c-Myc、およびKLF4などの転写因子による線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞などの体細胞のレトロウイルス形質導入によって体細胞から作製することができる(Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1):39-49；Aoi T, et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. 2008 Feb 14. (印刷物の前に電子出版)；IH Park, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008;451 : 141- 146；K Takahashi, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007；131 :861-872)。他の胚様幹細胞は、卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合、またはレシピエント細胞が有糸分裂で停止される場合には接合体内への核移植によって作製することができる。

語句「胚性幹細胞」は、3種類全ての胚性胚葉(すなわち、内胚様、外胚葉および中胚葉)の細胞に分化する能力がある、すなわち未分化状態のままである胚細胞を指す。語句「胚性幹細胞」は、妊娠後に形成される胚組織(例えば、胚盤胞) から胚の着床前(すなわち、着床前胚盤胞)に得られる細胞、着床後/原腸形成前段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞(EBC) (WO2006/040763を参照)、および妊娠中の任意の時点での、好ましくは妊娠の10週前の胎仔の生殖組織から得られる胚性生殖(EG)細胞を含みうる。本発明のいくつかの態様の胚性幹細胞は、周知の細胞培養法を用いて得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は典型的には、ヒトのインビボ着床前胚またはインビトロ受精(IVF)胚から得られる。あるいは、シングルセルヒト胚は胞胚期まで増殖させることができる。ヒトES細胞の単離のために、透明帯は胚盤胞から除去され、かつ内部細胞塊(ICM)は、栄養外胚葉細胞を溶解させ緩やかなピペッティングによってインタクトなICMから取り除く手法によって単離される。ICMは次いで、その外殖を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコ中にプレーティングされる。9から15日後、ICM由来の生成物は、機械的解離または酵素的分解のいずれかによって凝集塊に解離され、次いで、細胞は新鮮な組織培養培地上に再プレーティングされる。未分化形態を示すコロニーをマイクロピペットによって個別に選択し、凝集塊に機械的に解離させ、再プレーティングする。次いで、結果として生じるES細胞を4～7日毎にルーチン的に分割する。ヒトES細胞調製の方法に対するさらなる詳細については、Reubinoff et al., Nat Biotechnol 2000, May: 18(5): 559；Thomson et al., (米国特許第5,843,780号；Science 282: 1145, 1998；Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995)；Bongso et al., (Hum Reprod 4: 706, 1989)；and Gardner et al., (Fertil. Steril. 69: 84, 1998)を参照されたい。

市販の幹細胞もまた本発明のいくつかの態様にしたがって用いることができることが理解されよう。ヒトES細胞はNIHヒト胚性幹細胞レジストリ(Hypertext Transfer Protocol://grants (dot) nih (dot) gov/stem_cells/registry/current (dot) htm)から購入することができる。市販の胚性幹細胞株の非限定的な例は、HAD-C102、ESI、BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES 1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES 13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES 19、HUES 20、HUES 21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES 25、HUES 26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES 3、WA01、UCSF4、NYUES 1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUES5、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077 (H7)、WA09 (H9)、WA13 (H13)、WA14 (H14)、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CT1、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBR5、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BJNheml9、BJNhem20、SA001、SA001である。

特定の態様によれば、胚性幹細胞株はHAD-C102またはESIである。

加えて、ES細胞は、マウス(Mills and Bradley, 2001)、ゴールデンハムスター(Doetschman et al., 1988, Dev Biol. 127: 224-7)、ラット(Iannaccone et al., 1994, Dev Biol. 163: 288-92)、ウサギ(Giles et al. 1993, Mol Reprod Dev. 36: 130-8；Graves & Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 36: 424-33)、複数の家畜種(Notarianni et al., 1991, J Reprod Fertil Suppl. 43: 255-60；Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6: 563-8；Mitalipova et al., 2001, Cloning. 3: 59-67)、および非ヒト霊長類種（アカゲザルおよびマーモセット）(Thomson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 7844-8；Thomson et al., 1996, Biol Reprod. 55: 254-9)を含む、他の種からも入手することができる。

拡張胚盤胞細胞(EBC)は、原腸形成前の段階で受精後少なくとも9日の胚盤胞から得ることができる。胚盤胞を培養する前に、透明帯は消化され(例えば、Tyrode酸性液(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)によって)、内部細胞塊を露出させる。胚盤胞は次いで、受精後少なくとも9日間かつ14日間以下(すなわち、原腸形成事象前に)、標準的な胚性幹細胞培養法を用いて、全胚としてインビトロで培養される。

ES細胞を調製するための別の方法は、Chung et al., Cell Stem Cell, Volume 2, Issue 2, 113-117, 7 February 2008に記載される。この方法は、インビトロ受精過程時に胚からシングルセルを取り出すことを含む。胚はこの過程において破壊されない。

EG細胞は、当業者に公知の実験技術を用いて、妊娠の約8～11週(ヒト胎児の場合)の胎仔から得られた始原生殖細胞から調製される。生殖隆起は小さな塊に解離および切断され、その後、機械的解離によって細胞に脱凝集される。EG細胞は次いで、適切な培地によって組織培養フラスコ中で成長させる。EG細胞と一致する細胞形態が観察される、典型的には7～30日後または1～4継代後まで培地を毎日交換して、細胞を培養する。ヒトEG細胞調製の方法に対するさらなる詳細については、Shamblott et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998)および米国特許第6,090,622号を参照されたい。

ES細胞を調製するためのさらに別の方法は単為生殖によるものである。胚はこの過程でも破壊されない。

本発明のこの局面によれば、ヒト多能性幹細胞は、直接的分化の第1段階の前に馴化培地中で培養される。フィーダー細胞馴化培地は、該フィーダー細胞馴化培地を作製するために用いられるフィーダー細胞から分離される(または該細胞から収集される)。したがって、胚性幹細胞は好ましくは、細胞馴化培地を作製するために用いられた容器と異なる容器中で培養される。微量のフィーダー細胞が馴化培地中に含まれる可能性があるが、好ましくは、この培養工程は典型的にはフィーダー細胞の非存在下で実施される。ヒト多能性幹細胞の培養は典型的には、少なくとも1日間、より好ましくは少なくとも2日間、例えば、2日、3日、4日、5日、6日または7日間行われる。好ましくは、馴化培地中での培養は、21日以下、例えば14日以下実施される。特定の態様によれば、培養は、ディッシュまたはフラスコ(例えば、T75フラスコまたはT175フラスコ)で行われる。固体表面は、フィブロネクチン、ラミニン、ポリDリジンまたはゼラチンなどの非接着性基質でコーティングされる可能性がある。適当な時間の後、hESCコロニーは、適した作用物質を用いて（例えば、コラゲナーゼA、ディスパーゼ、TrypLE select、またはEDTAを用いて）固体表面から取り出される可能性がある。

馴化培地
馴化培地は、ある特定の培養期間後に存在する単層細胞培養(すなわち、フィーダー細胞)成長培地である。馴化培地には、培養中の単層細胞によって分泌される成長因子およびサイトカインが含まれる。

本発明の馴化培地は、培養において単層を形成するさまざまなヒト細胞から収集することができる。例には、ヒト包皮馴化培地、ヒト胚線維芽細胞馴化培地、ヒト卵管上皮細胞馴化培地、およびヒト臍帯線維芽細胞馴化培地が含まれる。

特に適した馴化培地は、馴化培地を生成するのに適した条件下で成長培地中でヒト臍帯線維芽細胞を培養することによって生成されるヒト臍帯線維芽細胞馴化培地などのヒト細胞に由来する馴化培地である。

特定の態様によれば、フィーダー細胞は放射線照射によって有糸分裂的に不活性化される。不活性化の他の方法は、マイトマイシン処理などが用いられうる。

そのような成長培地は、フィーダー細胞を培養するのに適した任意の培地でありうる。成長培地は、未分化状態の幹細胞成長のためになる、アミノ酸(例えば、L-グルタミン)、抗酸化剤(例えば、β-メルカプトエタノール)および成長因子などの栄養因子を補充することができる。血清および血清代替物は、他に記載されているような有効濃度範囲で加えられる(米国特許出願第10/368,045号)。

フィーダー細胞は、未分化状態の幹細胞増殖を支持するのに適切な分泌因子の蓄積を可能にするのに十分な時間、成長培地中で培養される。典型的には、培地は、37℃で4～48時間培養することによって馴化される。しかしながら、培養期間は、幹細胞成長および分化に対する馴化培地の効果を評価することによって調整されうる。

特定の態様によれば、馴化培地は、放射線照射したヒト臍帯細胞をヒト血清の存在下の培地(例えばDMEM)中に約5～24時間播種することによって調製される。最大で約7日のより長期の培養期間もまた有効でありうる。細胞は次いで、ヒト血清の非存在下の培地(例えばNutristem)中でさらに24時間培養される。第2の培地はヒト血清アルブミンを含みうる。さらに、第2の培地は、塩基性FGFなどの成長因子およびTGFβスーパーファミリー由来の因子を含みうる。特定の態様によれば、その上に馴化培地が調製される培養ディッシュはゼラチンでコーティングされない。別の態様によれば、馴化培地を調製するために用いられる培養培地は、線維芽細胞成長因子(FGF)またはTGFβスーパーファミリー因子を含まない。培地を馴化するための培養装置の選択は、馴化培地の規模および目的に基づく。大規模生産は好ましくは、専用のデバイスの使用を伴う。特定の態様によれば、馴化培地はフラスコ中で調製される。連続細胞培養系がFurey (2000) Genetic Eng. News 20:10において概説される。

培地における適切な因子の蓄積後、成長培地(すなわち、馴化培地)はフィーダー細胞から分離され収集される。フィーダー細胞は、培地を馴化するその能力を細胞が保持するならば、追加の培養期間にわたってさらなる培地のバッチを馴化するために繰り返し用いることができることが理解されよう。

好ましくは、馴化培地は使用前に滅菌される(例えば、20 μΜフィルターを用いるろ過)。本発明のいくつかの態様の馴化培地は、幹細胞に直接適用されるか、または塩ろ過などによって有効な因子を濃縮するように抽出されうる。将来の使用のために、馴化培地は好ましくは－80℃で凍結保管される。

本発明は、多能性幹細胞の増殖を助ける、フィーダーフリーな馴化培地工程の前の追加的工程を企図することが理解されよう。

したがって、特定の態様によれば、ESCはフィーダーフリーな馴化培地工程の前にフィーダー上で増殖される。本発明により企図される例示的なフィーダー層に基づく培養は本明細書の下記において説明される。増殖は典型的には、少なくとも2日、3日、4日、5日、6日または7日間行われる。増殖は少なくとも1継代または少なくとも2継代行われる。

ヒト臍帯フィーダー層
ヒト臍帯線維芽細胞は、ヒト血清を補充した(例えば20％)ダルベッコ変法イーグル培地(例えば、DMEM、SH30081.01、Hyclone)において増殖されうる。好ましくは、ヒト臍帯細胞は放射線照射される。これは、当技術分野において公知の方法を用いて行われうる(例えば、Gamma cell, 220 Exel, MDS Nordion 3,500 rad)。十分な細胞が得られると、それらは凍結されうる(例えば、凍結保存される)。ESCの増殖のために、ヒト臍帯線維芽細胞は典型的には、約20％ヒト血清を補充したDMEM(例えばSH30081.01, Hyclone)中で25～30000細胞/cm²の濃度でゼラチン(例えば、組換えヒトゼラチン(RhGlOO-001, Fibrogen))などの接着性基質で任意にコーティングされた固体表面(例えばT75またはT175フラスコ)上に播種される。hESCは典型的には、支持培地(例えばNutristem)において1～4日後のフィーダー細胞の上部にプレーティングされる。bFGFおよびTGF-βなどの追加的な因子が、ESCの分化を妨げるために培地に添加されうる。十分な量のhESCが得られると、細胞は機械的にばらばらにされうる(例えば、滅菌チップまたは使い捨ての滅菌幹細胞ツールを用いて；14602 Swemed)。あるいは、細胞は酵素処理(例えばコラゲナーゼAまたはTryple Select)によって取り出されうる。この工程は、必要な量のhESCに到達するまで複数回繰り返されうる。特定の態様によれば、第1ラウンドの増殖の後、hESCはTryple Selectを用いて取り出され、第2ラウンドの増殖の後、hESCはコラゲナーゼAを用いて取り出される。

フィーダー細胞層としてのヒト胚性線維芽細胞または成体卵管上皮細胞
ヒトES細胞は、ヒト胚性線維芽細胞または成体卵管上皮細胞を用いて成長および維持させることができる。これらのヒトフィーダー細胞上で成長させる場合、ヒトES細胞は、正常な核型を呈し、アルカリフォスファターゼ活性を示し、Oct-4ならびにSSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、およびGCTM-2を含む他の胚細胞表面マーカーを発現し、インビボでテラトーマを形成し、かつ全ての重要な形態的特徴を保持する(Richards M, Fong CY, Chan WK, Wong PC, Bongso A. (2002). Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20: 933-6)。

包皮フィーダー層
ヒトES細胞は、米国特許出願第10/368,045号に開示されているようにヒト包皮フィーダー層上で培養することができる。包皮に由来するフィーダー細胞層は、ヒトES細胞を培養するのに適した完全に動物質を含まない環境からなる。加えて、包皮細胞は、それらの誘導から42継代もの間培養中で維持することができ、ES細胞に比較的一定の環境を提供する。これらの条件下では、ヒトES細胞は、代替のプロトコール(例えば、MEF)で成長させた細胞とは機能的に異なることが見出された。分化後、ES細胞は、インビトロで3種類全ての胚性胚葉に関連する遺伝子を発現し、インビボで3種類全ての胚葉から生じる組織からなるテラトーマを形成した。

好ましくは、馴化培地の作製のために用いられるフィーダー細胞型は、hESCの初回の増殖のために用いられるフィーダー細胞型と同じである。したがって、例えば、ヒト臍帯線維芽細胞が馴化培地を作製するために用いられる場合、hESCの初回の増殖はヒト臍帯線維芽細胞フィーダー上で行われるべきである。

ヒトフィーダー細胞馴化培地での培養後、ESCは分化作用物質を用いる直接的分化に供される。

1つの例示的な分化プロトコールにおいて、胚性幹細胞は、第1の分化作用物質を用いてRPE細胞系列に向かって分化され、次いで、トランスフォーミング成長因子β(TGFBβ)スーパーファミリーのメンバー(例えば、TGFβ1、TGFβ2、およびTGFβ3サブタイプ、ならびにアクチビン(例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB)、nodal、抗ミュラー管ホルモン(AMH)、一部の骨形成タンパク質(BMP)、例えばBMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、および増殖分化因子(GDF)を含む相同リガンド)を用いてRPE細胞に向かってさらに分化される。特定の態様によれば、トランスフォーミング成長因子β(TGFβ)スーパーファミリーのメンバーはアクチビンA（例えば20～200 ng/ml、例えば100～180 ng/ml）である。

特定の態様によれば、第1の分化作用物質はニコチンアミド(NA)（例えば1～100 mM、5～50 mM、5～20 mM、例えば10 mM）である。

別の態様によれば、第1の分化作用物質は3-アミノベンズアミドである。

「ナイアシンアミド」としても公知のNAは、β細胞機能を保ちかつ向上させると考えられるビタミンB3(ナイアシン)のアミド誘導体形態である。NAは化学式C₆H₆N₂0を有する。NAは、成長および食料のエネルギーへの変換に必須であり、関節炎の治療ならびに糖尿病の治療および予防に用いられている。

特定の態様によれば、ニコチンアミドは、ニコチンアミド誘導体またはニコチンアミド模倣体である。本明細書で用いられる用語「ニコチンアミド(NA)の誘導体」は、天然のNAの化学的に修飾された誘導体である化合物を表す。1つの態様において、化学的修飾は、アミド部分の窒素原子または酸素原子を介する、基本NA構造のピリジン環の置換(該環の炭素または窒素構成要素を介する)でありうる。置換される場合、1つまたは複数の水素原子が置換成分によって置き換えられうる、および/または置換成分はN原子に結合され四価の正電荷を持つ窒素を形成しうる。よって、本発明のニコチンアミドには、置換されたまたは置換されていないニコチンアミドが含まれる。別の態様において、化学的修飾は、1つの基の欠失または交換である可能性があり、例えばNAのチオベンザミド類似体を形成する。これらの全ては有機化学に精通した者によって理解される。本発明の文脈における誘導体にはまた、NAのヌクレオシド誘導体(例えばニコチンアミドアデニン)も含まれる。NAのさまざまな誘導体が記載され、一部はPDE4酵素の阻害活性と関連して記載されるか(WO03/068233；WO02/060875；GB2327675A)、またはVEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤として記載される(WO01/55114)。例えば、4-アリール-ニコチンアミド誘導体を調製する工程(WO05/014549)。他の例示的ニコチンアミド誘導体はWO01/55114およびEP2128244に開示される。

ニコチンアミド模倣体には、ニコチンアミドの修飾形態、および多能性細胞由来のRPE細胞の分化および成熟においてニコチンアミドの作用を再現するニコチンアミドの化学的類似体が含まれる。例示的なニコチンアミド模倣体には、安息香酸、3-アミノ安息香酸、および6-アミノニコチンアミドが含まれる。ニコチンアミド模倣体として機能しうる別の化合物のクラスは、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)の阻害剤である。例示的なPARP阻害剤には、3-アミノベンズアミド、イニパリブ(BSI 201)、オラパリブ(AZD-2281)、ルカパリブ(AG014699、PF-01367338)、ベリパリブ(ABT-888)、CEP 9722、MK 4827、およびBMN-673が含まれる。

特定の態様によれば、分化は、以下のように行われる：
(a)第1の分化作用物質(例えばニコチンアミド)を含む培地中でのESCの培養；および
(b)TGFβスーパーファミリーのメンバー(例えばアクチビンA)および第1の分化作用物質(例えばニコチンアミド)を含む培地中での、(a)の工程から得た細胞の培養。

好ましくは、工程(a)は、TGFβスーパーファミリーのメンバーの非存在下で行われる。

上記のプロトコールは、第1の分化作用物質(例えばニコチンアミド)を含むが、TGFβスーパーファミリーのメンバー(例えばアクチビンA)を欠いている培地中で、工程(b)で得られた細胞を培養することによって続けられうる。この工程は本明細書において工程(c)と呼ばれる。

上記プロトコールはこれから、追加の態様によってさらに詳細に記載される。

工程(a)：分化プロセスは、十分な量のESCが得られたら開始される。それらは典型的には、(例えば、コラゲナーゼA、ディスパーゼ、TrypLE select、EDTAを用いることによって)馴化培地細胞培養から取り出され、非接着性の基質(例えば、Hydrocell等のアガロースでコーティングした培養ディッシュ、または細菌用ペトリ皿などの細胞培養プレート)の上にニコチンアミドの存在下(かつアクチビンAの非存在下)でプレーティングされる。ニコチンアミドの例示的な濃度は、1～100 mM、5～50 mM、5～20 mM、例えば 10 mMである。細胞が非接着性の基質(例えば、細胞培養プレート)の上にプレーティングされたら、細胞培養は、細胞懸濁物、好ましくは懸濁培養液中の浮遊性クラスター、すなわち、ヒト胚性幹細胞(hESC)に由来する細胞の凝集物と呼ばれうる。細胞クラスターは、いずれの基質(例えば培養プレート、担体)にも接着しない。浮遊性幹細胞の供給源は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、WO 06/070370において以前に記載されている。この段階は、最低で1日、より好ましくは、2日、3日、1週さらには14日間行われうる。好ましくは、細胞は、例えば1～100 mM、5～50 mM、5～20 mM、例えば 10 mMのニコチンアミドと一緒に(およびアクチビンの非存在下で)懸濁物の状態で3週間以下培養される。

1つの態様において、細胞は、ニコチンアミド1～100 mM、5～50 mM、5～20 mM、例えば 10 mMのニコチンアミドと一緒に(およびアクチビンAの非存在下で)懸濁物の状態で6～8日間培養される。

1つの態様によれば、細胞は非接着性の基質、例えば細胞培養プレート上で培養される場合、大気中酸素条件は20％である。しかしながら、大気中酸素のパーセントが約20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％未満さらには約5％未満(例えば1％～20％、1％～10％または0～5％)であるような大気中酸素条件の操作も企図される。

特定の態様によれば、細胞は、最初は通常の大気酸素条件下で、次いで通常のものより低い大気中酸素条件下で、非接着性の基質上で培養される。

非接着性の細胞培養プレートの例には、Nuncによって製造されたもの(例えば Hydrocell Cat No. 174912)が含まれる。

典型的には、クラスターは、少なくとも50～500,000、50～100,000、50～50,000、50～ 10,000、50～5000、50～1000個の細胞を含む。1つの態様によれば、クラスター中の細胞は層に組織化されず、不規則な形状を形成する。1つの態様において、クラスターは多能性胚性幹細胞を欠いている。別の態様において、クラスターは少量の多能性胚性幹細胞(例えば、タンパク質レベルでOCT4およびTRA 1-60を共発現する5％以下または3％以下(例えば0.01～2.7％)の細胞)を含む。典型的には、クラスターは、ニコチンアミドの影響下で部分的に分化されている細胞を含む。そのような細胞は主に、PAX6、Rax、Six3および/またはCHX10などの神経および網膜の前駆体マーカーならびにαフェトプロテイン、MIXL1およびブラキュリなどの他の細胞系列の前駆体のマーカーを発現する。

クラスターは、当技術分野において公知の酵素的または非酵素的方法(例えば、機械的)を用いて解離されうる。1つの態様によれば、細胞は、クラスター（例えば、2～100,000個の細胞、2～50,000個の細胞、2～10,000個の細胞、2～5000個の細胞、2～1000個の細胞、2～500個の細胞、2～100個の細胞、2～50個の細胞の凝集物または凝集塊）の状態となることはないように解離される。特定の態様によれば、細胞はシングルセル懸濁物の状態である。

細胞(例えば、解離された細胞)は次いで、接着性の基質上にプレーティングされ、例えば、1～100 mM、5～50 mM、5～20 mM、例えば 10 mMのニコチンアミドの存在下(およびアクチビンAの非存在下)で培養される。この段階は、最低でも1日、より好ましくは2日、3日、1週さらには14日間行われうる。好ましくは、細胞はニコチンアミドの存在下(およびアクチビンの非存在下)で3週間以内培養される。例示的な態様において、この段階は6～7日間行われる。

1つの態様によれば、細胞が接着性の基質、例えばラミニン上で培養される場合、大気中酸素条件は20％である。それらは、パーセンテージが、約20％、15％、10％未満、より好ましくは約9％未満、約8％未満、約7％未満、約6％未満およびより好ましくは約5％(例えば1％～20％、1％～10％または0～5％)となるように操作されうる。

特定の態様によれば、細胞は、最初は通常の大気中酸素条件下で、次いで通常のものより低い大気中酸素条件下で、接着性の基質上で培養される。

接着性の基質の例には、これらに限定されないが、フィブロネクチン、ラミニン、ポリD-リジンおよびゼラチンが含まれる。

工程(b)：直接的分化の第1の段階(工程a；すなわち、ニコチンアミド(例えば1～100 mM、5～50 mM、5～20 mM、例えば 10 mM)の存在下での培養)の後、半分化(semi-differentiated)細胞を次いで、接着性基質上でのさらなる分化の段階（アクチビンA(例えば100～200 ng/ml－例えば140 ng/ml、150 ng/ml、160 ng/mlまたは180 ng/ml)の存在下での培養）に供する。ニコチンアミドは、この段階でも添加されうる(例えば1～100 mM、5～50 mM、5～20 mM、例えば 10 mM)。

この段階は、1日から10週間、3日間から10週間、1週間から10週間、1週間から8週間、1週間から4週間、例えば、少なくとも 1日、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも 5日間、少なくとも 1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、少なくとも10週間行われうる。

特定の態様によれば、この段階は約2週間行われる。この分化の段階は、本明細書の上記において詳述したように、低いまたは通常の大気中酸素条件で行われうる。

工程(c)：直接的分化の第2の段階(すなわち、接着性の基質上でのニコチンアミドおよびアクチビンAの存在下での培養；工程(b))の後、さらに分化した細胞は任意で、接着性基質上でのそれに続く分化の段階（ニコチンアミドの存在下(例えば、1～100 mM、5～50 mM、5～20 mM、例えば10 mM)、アクチビンAの非存在下での培養）に供する。この段階は、少なくとも1日、2日間、5日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間さらには4週間行われうる。好ましくは、この段階は約1週間行われる。この分化の段階はまた、本明細書の上記において詳述したように、低いまたは通常の大気中酸素条件で行われうる。

ESCが分化される基本培地は、インビトロで細胞成長を支持することが当技術分野において知られている任意の公知の細胞培養培地であり、典型的には、培地は、塩類、糖類、アミノ酸、および生存可能な状態での培養において細胞の維持に必要とされる任意の他の栄養を含む定義された基礎溶液を含む。特定の態様によれば、基本培地は馴化培地ではない。本発明にしたがって利用されうる市販の基本培地の非限定的な例には、Nutristem(ESC分化用にはbFGFおよびTGFβなし、ESC増殖用にはbFGFおよびTGFβあり)、Neurobasal(商標)、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、Cellgro(商標)Stem Cell Growth Medium、またはX-Vivo(商標)が含まれる。基本培地は、細胞培養を扱う技術分野において公知のさまざま作用物質が補充されうる。以下は、本開示にしたがって用いられるべき培養系において含まれ得る種々の補助物質への非限定的な言及である：
－これらに限定されないが、ノックアウト血清代替物(KOSR)、Nutridoma-CS、TCH(商標)、N2、N2誘導体、もしくはB27または組み合わせなど、血清または血清代替物含有培地；
－これらに限定されないが、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよびゼラチンなど、細胞外基質(ECM)成分。ECMは次いで、成長因子のTGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを運ぶために用いられうる；
－これらに限定されないが、ペニシリンおよびストレプトマイシンなど、抗菌剤；
－これらに限定されないが、BDNF、NT3、NT4など、培養中のSCの生存を促進する役割を果たすことが公知である、非必須アミノ酸(NEAA)、ニュートロフィン。

好ましい態様によれば、ESCを分化させるために用いられる培地はNutristem培地(例えばBiological Industries, 06-5102-01-1A)である。

特定の態様によれば、ESCの分化および増殖はゼノフリーな条件下で行われる。

1つの態様によれば、増殖/成長培地は異種由来成分の混入物を欠いている、すなわち、血清、動物由来の成長因子およびアルブミンなどの動物由来の成分を含まない。よって、この態様によれば、培養は異種由来成分の混入物の非存在下で実施される。

ゼノフリー条件下でESCを培養するための他の方法は、その内容の全体が組み入れられる、米国特許出願第20130196369号に提供される。

RPE細胞を含む調製物は、Good Manufacturing Practices (GMP)にしたがって (例えば、調製物はGMPに適合している)および/または最新のGood Tissue Practices(GTP)にしたがって(例えば、調製物はGTPに適合しうる)調製されうる。

分化工程時、胚性幹細胞はその分化状態についてモニターされうる。細胞分化は、分化の指標であることが知られている細胞または組織特異的マーカーの検査により判定することができる。

組織/細胞特異的マーカーは、当技術分野において周知の免疫学的技術を用いて検出することができる(Thomson JA et al., (1998). Science 282: 1145-7)。例には、これらに限定されないが、膜結合型または細胞内マーカーについてフローサイトメトリー、細胞外および細胞内マーカーについて免疫組織化学的検査、および分泌分子マーカーについて酵素的免疫アッセイが含まれる。

細胞がRPEの運命に進めば、RPE細胞は選択および/または増殖されうる。

特定の態様によれば、選択は負の選択、すなわち非RPE細胞の除去に基づく。これは、非色素細胞の除去によってまたは表面マーカーの使用によって機械的に行われうる。

別の態様によれば、選択は正の選択、すなわち色素細胞の選択に基づく。これは、視覚的分析または表面マーカーの使用によって行われうる。

さらに別の態様によれば、選択はまず負の選択に基づき、次いで正の選択に基づく。

RPE細胞の増殖は、細胞外マトリックス、例えば、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニン(例えばラミニン521)およびポリ-D-リジン上で行われうる。増殖に関して、細胞は、血清を含まないKOM、血清を含む培地(例えばDMEM＋20％)またはNutristem培地(06-5102-01-1A Biological Industries)中で培養されうる。これらの培養条件下で、継代および低密度でのプレーティング(約130,000細胞/cm²)後、色素細胞は、色素形成を低減させ、類線維腫様の形態を獲得する。高密度クラスターへのさらなる長期の培養および増殖の後、細胞は特徴的な多角形の形状の形態を再獲得し、RPE細胞の色素形成を増大させる。

1つの態様において、増殖させる工程は、ニコチンアミド(例えば1～100 mM、5～50 mM、5～20 mM、例えば 10 mM)の存在下かつアクチビンAの非存在下で行われる。

RPE細胞は懸濁物の状態でまたは単層で増殖されうる。単層培養でのRPE細胞の増殖は、当技術分野に精通した者に周知の方法によってバイオリアクターでの大規模増殖に改変されうる。

1つの態様によれば、増殖段階は、少なくとも1週間、少なくとも 2週間、少なくとも 3週間、少なくとも 4週間、少なくとも 5週間、少なくとも 6週間、少なくとも 7週間、少なくとも 8週間、少なくとも 9週間さらには10週間行われる。好ましくは、増殖段階は1週間～10週間、より好ましくは2週間～10週間、より好ましくは3週間～10週間、より好ましくは4週間～10週間、または4週間～8週間行われる。

さらに別の態様によれば、細胞は、増殖段階時に少なくとも1回、増殖段階時に少なくとも2回、増殖段階時に少なくとも3回、増殖段階時に少なくとも4回、増殖段階時に少なくとも5回、または増殖段階時に少なくとも6回継代される。

本明細書に記載の方法にしたがって作製されたRPE細胞の集団は、いくつかの異なるパラメーターにしたがって特徴付けされうる。

よって、例えば、得られたRPE細胞は多角形の形状でありかつ色素を有しうる。

RPE細胞の増殖した集団の回収は、当技術分野において公知の方法を用いて(例えばトリプシンなどの酵素を用いて)行われうる。

回収後、RPE細胞の増殖した集団は任意で、当技術分野において公知の方法を用いて凍結保存されうる。

本発明のこの局面の方法は大規模で行われうる。

用語「大規模」は、少なくとも100 mLの少なくとも1つの培養容器を伴う生産プロセスを指す。しかしながら、好ましい態様において、規模は典型的には少なくとも250 mL、例えば少なくとも500 mL、例えば少なくとも1 Lさらには5 L以上である。用語「大規模」は、用語「工業的規模」および「生産規模」と互換的に用いられうる。

本明細書に開示の細胞集団は未分化ヒト胚性幹細胞を欠いていることが理解されよう。1つの態様によれば、例えばFACSによって測定される、1:250,000未満の細胞がOct4^＋TRA-1-60^＋細胞である。細胞はまた、PCRにより測定されるGDF3またはTDGFの発現が下方制御されている(5,000倍を上回って)。

本発明のこの局面のRPE細胞は胚性幹細胞マーカーを発現しない。該1つまたは複数の胚性幹細胞マーカーは、OCT-4、NANOG、Rex-1、アルカリフォスファターゼ、Sox2、TDGF-beta、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、および/またはTRA-1-81を含みうる。

RPE調製物は、非RPE細胞に対して実質的に精製され、少なくとも約75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％のRPE細胞を含みうる。RPE細胞調製物は非RPE細胞を本質的に含まない、またはRPE細胞からなる可能性がある。例えば、RPE細胞の実質的に精製された調製物は、約25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、または1％未満の非RPE細胞型を含みうる。例えば、RPE細胞調製物は、約25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％、または0.0001％未満の非RPE細胞を含みうる。

RPE細胞調製物は、非RPE細胞および他の成熟レベルのRPE細胞の両方に対して、実質的に純粋でありうる。調製物は、非RPE細胞に対して実質的に精製され、かつ成熟RPE細胞について濃縮されうる。例えば、成熟RPE細胞について濃縮されたRPE細胞調製物では、少なくとも約30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99％、または100％のRPE細胞が成熟RPE細胞である。調製物は非RPE細胞に対して実質的に精製され、かつ成熟RPE細胞ではなく分化したRPE細胞について濃縮されうる。例えば、少なくとも約30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％のRPE細胞が、成熟RPE細胞ではなく分化したRPE細胞でありうる。

本明細書に記載の調製物は、これらに限定されないが、HIV I、HIV 2、HBV、HCV、HAV、CMV、HTLV 1、HTLV 2、パルボウイルスB19、エプスタイン・バーウイルス、またはヘルペスウイルス1および2、SV40、HHV5、6、7、8、CMV、ポリオーマウイルス、HPV、エンテロウイルスの存在を含む、細菌、ウイルスまたは真菌の混入または感染が実質的にない可能性がある。本明細書に記載の調製物は、マイコプラズマの混入または感染が実質的にない可能性がある。

本明細書に開示された細胞集団を特徴付ける別の方法はマーカー発現による。したがって、例えば、細胞の少なくとも80％、85％、90％、95％または100％は、免疫染色よって測定される、ベストロフィン1を発現する。1つの態様によれば、細胞の85～100％はベストロフィンを発現する。

別の態様によれば、細胞の少なくとも80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％は、免疫染色によって測定される、小眼球症関連転写因子(MITF)を発現する。例えば、細胞の85～100％はMITFを発現する。

別の態様によれば、細胞の少なくとも80％ 85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％は、免疫染色またはFACSによって測定される、ペアードボックス遺伝子6(PAX-6)を発現する。

別の態様によれば、細胞の少なくとも80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％は、免疫染色によって測定される、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)を発現する。例えば、細胞の85～100％はCRALBPを発現する。

別の態様によれば、細胞の少なくとも80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％または100％は、免疫染色によって測定される、網膜色素上皮特異的タンパク質65 kDa(RPE65)を発現する。例えば、細胞の85～100％はRPE65を発現する。

RPE細胞は典型的には、最終分化の指標となるマーカー、例えば、ベストロフィン1、プレメラノソームタンパク質(PMEL17)、CRALBPおよび/またはRPE65を共発現する。

RPE細胞の誘導は大いに役立つことが当技術分野に精通した者によって理解されよう。それらは、その生存、再生および機能を促進する新たな薬物の開発のためのインビトロモデルとして用いられうる。RPE細胞は、RPE細胞に対して毒性または再生作用を有する化合物のハイスループットスクリーニングのために機能しうる。それらは、光受容体細胞の発生、分化、維持、生存および機能に重要なメカニズム、新規遺伝子、可溶性または膜結合型因子を明らかにするために用いられうる。

RPE細胞はまた、網膜変性における機能不全または変性RPE細胞の移植、補充および支持のためのRPE細胞の無制限の供給源としても機能しうる。さらに、遺伝的に改変させたRPE細胞は、移植後に眼および網膜において遺伝子を運びかつ発現させるためのベクターとして機能しうる。

RPE細胞が治療として機能しうる眼の状態には、これらに限定されないが、一般的には網膜機能不全、網膜傷害、および/または網膜色素上皮の欠失に関連する網膜疾患または障害が含まれる。本発明にしたがって処置されうる状態の非限定的なリストには、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、遺伝性または後天性黄斑変性、加齢黄斑変性 (AMD)、萎縮型AMD、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィーならびにRPEの他のジストロフィー、シュタルガルト病、ならびに光、レーザー、炎症、感染、放射線、血管新生または外傷性損傷のいずれか1つによって引き起こされる傷害を原因とするRPEおよび網膜の傷害が含まれる。

処置されうる対象には、霊長類(ヒトを含む)、イヌ、ネコ、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ブタ(swine)(例えば、ブタ(pig))、トリ、および他の対象が含まれる。ヒトおよび商業的重要性を有する非ヒト動物(例えば、家畜動物および飼い慣らされた動物)は特に関心対象となる。処置されうる例示的な哺乳動物には、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、齧歯類など、および霊長類、特にヒトが含まれる。非ヒト動物モデル、特に哺乳動物、例えば霊長類、ネズミ科、ウサギ目などは、実験的調査のために用いられうる。

本明細書に記載のように作製されるRPE細胞は、対象の眼内のさまざまな標的部位に移植されうる。1つ態様によれば、RPE細胞の移植は、RPEの正常な解剖学的位置である眼の網膜下腔(光受容体外節と脈絡膜との間)に対して行われる。加えて、細胞の遊走能力および/または正のパラクライン作用に依存して、硝子体空間、網膜の内側または外側、網膜周辺部および脈絡膜の内部を含む、さらなる眼内区画内への移植が考慮されうる。

対象に投与されうる生細胞の数は典型的には1回の注入当たり50,000～5×10⁶個である。

細胞は典型的には、BSS plus(商標)などの担体(例えば、等張液および/または生理食塩水)中で調剤される。他の企図される溶液には、Cryostor 5またはCryostor 2などの凍結保存溶液が含まれる。担体は任意で、RPEの生着、組み込み、生存、能力等を支持する追加的因子を含みうる。

移植は、当技術分野において公知のさまざまな技法によって実施されうる。RPE移植を実施するための方法は、例えば、米国特許第5,962,027号、同第6,045,791号、および同第5,941,250号、ならびにEye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol March 1997；235(3): 149-58；Biochem Biophys Res Commun Feb. 24, 2000；268(3): 842-6；Opthalmic Surg February 1991；22(2): 102-8に記載される。角膜移植を実施するための方法は、例えば、米国特許第5,755,785号、およびEye 1995；9 (Pt 6 Su):6-12；Curr Opin Opthalmol August 1992；3 (4): 473-81；Ophthalmic Surg Lasers April 1998；29 (4): 305-8；Ophthalmology April 2000；107 (4): 719-24；およびJpn J Ophthalmol November-December 1999；43(6): 502-8に記載される。主にパラクライン作用が利用される場合、半透過性容器内に封入された細胞が、眼中に送達および維持されてもよく、宿主免疫系への細胞の曝露も低減させる(Neurotech USA CNTF delivery system；PNAS March 7, 2006 vol. 103(10) 3896-3901)。

投与する工程は、その必要がある眼内へのRPE細胞の眼内投与を含みうる。眼内投与は、網膜下腔内へのRPE細胞の注入を含みうる。

1つの態様によれば、移植は、経扁平部硝子体切除術と、その後に続く網膜の小孔を通って網膜下腔内への細胞の送達または直接注入を介して実施される。

RPE細胞はさまざまな形態で移植されうる。例えば、RPE細胞は、シングルセル懸濁物の形態で、マトリックスにより標的部位に導入されうるか、またはマトリックスもしくは膜、細胞体マトリックス、もしくは生分解ポリマーなどの基質、または組み合わせの上に接着させうる。RPE細胞はまた、光受容体などの他の網膜細胞と一緒に移植されうる(共移植)。

処置の有効性は、特に、最高矯正視力(BCVA)、暗状態および明順応状態でのペリメトリーまたはマイクロペリメトリーによって測定される光に対する網膜の感度、全視野、多局所、局所またはパターン網膜電図(ERG)、対比感度、読書速度、色覚、臨床的生体顕微鏡検査、眼底写真、光干渉断層撮影(OCT)、眼底自発蛍光画像(FAF)、赤外線多色イメージング、蛍光またはICG血管造影、および視覚機能および眼球構造を評価するために用いられるさらなる手段を含む、視覚および眼球の機能および構造のさまざま測定によって評価されうる。

対象は、RPE細胞の投与の前にまたはそれと同時に、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロン、Predforteなどのコルチコステロイドが投与されうる。

別の態様によれば、対象は、RPE細胞の投与の前にまたはそれと同時に、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロン、Predforteなどのコルチコステロイドが投与される。

免疫抑制薬が、処置の前に、それと同時におよび/またはそれの後に対象に投与されうる。

免疫抑制薬は以下のクラスに属しうる：グルココルチコイド、細胞分裂阻害薬(例えば、アルキル化剤または抗代謝物質)、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)、イムノフィリンに対して作用する薬物(例えば、シクロスポリン、タクロリムスまたはシクロリムス)。さらなる薬物には、インターフェロン、オピオイド、TNF結合タンパク質、ミコフェノール酸塩および低分子生物剤が含まれる。

免疫抑制薬の例には以下が含まれる：間葉系幹細胞、抗リンパ球グロブリン(ALG)ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)ポリクローナル抗体、アザチオプリン、BAS1 L1X1MAB(登録商標)(抗IL-2Ra受容体抗体)、シクロスポリン(シクロスポリンA)、DACLIZUMAB(登録商標)(抗IL-2Ra受容体抗体)、エベロリムス、ミコフェノール酸、RITUX1MAB(登録商標)(抗CD20抗体)、シロリムス、タクロリムス、タクロリムスおよび/またはミコフェノール酸モフェチル。

抗生物質は、処置の前に、それと同時におよび/またはそれの後に対象に投与されうる。抗生物質の例には、Oflox、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、Tobrex、Vigamox、または眼での使用について許可されている任意の他の局所用抗菌調製物が含まれる。

本明細書で用いられる用語「約」は±10％を指す。

用語「含む(comprise)」、「含む(comprising)」、「含む(include)」、「含む(including)」、「有する」およびその活用形は、「限定されないが含むこと」を意味する。

用語「からなる」は「含みかつ限定されること」を意味する。

用語「から本質的になる」は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および/またはパーツを含んでもよいことを意味するが、追加の成分、工程および/またはパーツが本願発明の組成物、方法または構造の基本的および新規な特徴を実質的に変更しない場合に限る。

本明細書で用いられる単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈が他に明確に指示していない限り、複数への言及を含む。例えば、用語「1つの化合物」または「少なくとも1つの化合物」は、その混合物を含む、複数の化合物を含みうる。

本明細書において数値範囲が示されている場合、それは、示された範囲内の任意の言及された数(分数または正数)を含むことを意味する。第1の示された数字と第2の示された数字との「間の範囲である/範囲」および第1の示された数「から」第2の示された数「までの範囲である/範囲」という語句は、本明細書において互換的に用いられ、第1および第2の示された数ならびにそれらの間にある全ての分数および正数を含むことを意味する。

本明細書で用いられる用語「方法」は、これらに限定されないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医学分野の当業者によって公知であるかまたは公知の方式、手段、技術および手法から容易に開発される方式、手段、技術および手法を含む、所与の課題を達成するための方式、手段、技術および手法を指す。

本明細書で用いられる、用語「処置すること」には、状態の進行を抑制すること、実質的に阻害すること、遅らせることもしくは元に戻すこと、状態の臨床的または審美的症状を実質的に寛解させること、または状態の臨床的または審美的症状の出現を実質的に妨げることが含まれる。

明確にするために別個の態様の文脈において説明される本発明のある特定の特徴は、1つの態様において組み合わせて提供されうることも理解されよう。逆に、簡略にするために1つの態様の文脈において説明される本発明のさまざまな特徴はまた、別々に、または任意の適したサブコンビネーションで、または本発明の任意の他の記載された態様に適したように提供されうる。さまざまな態様の文脈において説明されたある特定の特徴は、該態様がそれらの要素なしに動作不能でない限り、それらの態様の必須な特徴と認識されるべきではない。

本明細書の上記において描写したまたは添付の特許請求の範囲部分において特許請求した本発明のさまざまな態様および局面は、以下の実施例において実験的な裏付けが分かる。

次に、以下の実施例について参照して、上記説明と合わせて非限定的に本発明の一部の態様を例示する。

概して、本明細書において用いられる術語体系および本発明で利用される検査法は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えDNA技術を含む。そのような技術は、文献おいて十分に説明される。例えば、それらの全てが参照により本明細書に全体が記載されているように組み入れられる、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)；"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)；Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York；Birren et al. (編集) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第4,666,828号；同第4,683,202号；同第4,801,531号；同第5,192,659号および同第5,272,057号に記載の方法論；"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)；"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley- Liss, N. Y. (1994), Third Edition；"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)；Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい、利用可能な免疫アッセイは特許および科学文献に幅広く記載されており、例えば、米国特許第3,791,932号；同第3,839,153号；同第3,850,752号；同第3,850,578号；同第3,853,987号；同第3,867,517号；同第3,879,262号；同第3,901,654号；同第3,935,074号；同第3,984,533号；同第3,996,345号；同第4,034,074号；同第4,098,876号；同第4,879,219号；同第5,011,771号および同第5,281,521号；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)；"Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)；"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)；"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照されたい。その他の一般的な記載はこの文献全体を通じて提供される。それらの文献の手法は、当技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれる全ての情報は参照によって本明細書に組み入れられる。

実施例１
材料および方法
簡潔なプロトコール
馴化培地の調製：T75フラスコに放射線照射した臍帯細胞(2.3×10⁶ ゼラチンなし)をDMEM＋20％ヒト血清培地中に播種した。5～24時間後、馴化のために培地をNutristem＋HSAと交換した。馴化の16から72時間後、培地を回収し、新鮮な培地によって交換した。この方法論によれば、培地の連続的な馴化は1週あたり3～4回実施されうる。

馴化培地中でのhESCの培養(試験CM1、3、4)：4枚のセンターウェルプレートのhESCコロニー(8日目)をコラゲナーゼA処理し、回収し、緩やかにトリチュレートした。hESCをゼラチンでコーティングしたT75フラスコに播種し、臍帯フラスコ由来の馴化培地で培養した。馴化培地を1～3日毎に交換した。6～7日後、フラスコはhESCコロニーで満たされ、該コロニーはコラゲナーゼAを用いて回収され、フィーダーフリーなSBの精製された培養を形成した。

hESCの増殖(試験CM11、12)：4枚のセンターウェルプレートを上記のように回収し、細胞を、臍帯フィーダーを予め播種したT75フラスコ中にプレーティングした(1フラスコ当たり2.3×10⁶)。Nutristem＋HSA中で1週間の培養後、hESCを(一部の試験ではPBCで1:1に希釈した) Tryple Selectで回収して分割し、臍帯フィーダーを予め播種した(1フラスコ当たり5×10⁶)T175フラスコ当たり2×10⁶ hESCを播種した。さらなる増殖のために(試験CM12)、 Nutristem＋HSA中で1週間の培養後、hESCを回収して上記のように分割し、T175 フラスコ当たり2×10⁶ hESCを播種した。

馴化培地中でのフィーダーフリーな培養への移行のために、上記のT175フラスコ中の1週間培養の後、hESCをコラゲナーゼAを用いて回収し、それらの1/4をフィーダーフリーなT175フラスコ内に播種し、馴化培地中で培養した。7日後、フラスコはhESCコロニーで満たされ、該コロニーはコラゲナーゼAを用いて回収された。

RPE細胞の作製：馴化培地培養条件から回収したhESCクラスターを6 cmハイドロセルディッシュ中で培養し、低酸素条件(5％0₂;試験CM1、CM3)または通常酸素(20％O₂；試験CM4、CM9、CM11、CM12)下で、10 mMニコチンアミドを追加したNutristem Minus培地(成長因子補充なしのNutristem)でインキュベートした。7～13日後(CM1 - 7日、CM3 - 13日、CM4 - 9日、CM11 - 7日)、球状体(SB)をトリチュレートし、ヒトラミニン511でコーティングしたプレート上に播種し、ニコチンアミド(10 mM)で1週間およびニコチンアミド(10 mM)およびアクチビンA(140 ng/ml)で2週間(低酸素条件および通常酸素条件下で)維持した。

色素性領域が現れたとき、非色素性領域を機械的分離と組み合わせたTryple Select処理(37℃で6～20分)によって取り除いた。色素細胞をさらに、ピペットからの培地の緩やかなブローによってディッシュから分離させ、回収し、計数し、通常の酸素条件下でNutristem Minus培地を用いてゼラチンでコーティングした6ウェルプレート上にP0として播種した。2週後、色素細胞をTryple Selectを用いてゼラチンなしフラスコ内に継代し、Nutristem Minus培地で培養した(P1)。さらに2週後、さらなる同様の継代を実施した(P2)。

試験CM11の手法の概略図は図1に表示される。

表1に試験CM1、CM3、CM4、CM11の結果を要約する。プロトコールに沿って各段階におけるRPE細胞の総数を示す。P0での1ウェル当たりのRPE細胞の収量は4つの試験間で類似している(第4列)。1ウェル当たりのRPE細胞の平均量は5.64±0.68×10⁶(n=4)である。SDの小ささは試験間のばらつきが非常に低いことを示す。

（表１）プロトコールに沿って回収したRPE細胞の量

表2は、本明細書に記載のプロトコールを用いて作製した、回収したRPE細胞(CM1、CM3、CM4、CM11)の量と、ニコチンアミドの存在下での浮遊性hESCクラスターの分化の段階からの本明細書に開示されたものと類似する以前に用いられた別のプロトコールを用いた量との間の比較を提供する。

CM1、CM3、CM4試験において4枚のセンターウェルプレート中で培養した未分化のhESCの出発物質から得たRPE細胞の量(第5列)は、馴化培地中での培養工程を含まなかった以前のプロトコール(RPE2、3、5および6；50.4±22.6×10⁶)とは対照的に、低いSDで再現可能であった(14.5±1.2×10⁶)。

センターウェルプレート中の最初の未分化hESCの量に対するRPE細胞の平均収量(第7および8列)は、馴化培地中での培養工程を含まない以前のプロトコールを用いて得られた収量(RPE2、3、5および6)より、CM1、CM3、CM4試験で約2倍高く(1.7×10⁶に対して3.6×10⁶)、CM11試験では10倍高かった。

（表２）試験CM 1～4でのRPE収量とHADC-RPEのGMP生産バッチ2、3、5および6でのRPE収量との間の比較

表3は、開示されたプロトコールを用いるRPE細胞の大量生産の推定計算を示す。

（表３）RPE生産について以前の方法論と開示された方法論の収量の比較

本発明はその特定の態様と併せて記載されているが、多くの代替方法、変更形態および変形形態が当業者に明白であることは明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内に含まれるそのような代替方法、変更形態および変形形態の全てを包含することが意図される。

本出願において言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み入れられることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度で、参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる。加えて、本明細書における任意の参考文献の引用または確認は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。項の見出しが用いられる場合、それらは必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。

Claims

以下の工程を含む、網膜色素上皮(RPE)細胞を作製する方法：
(a)ヒトフィーダー細胞馴化培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、ヒト多能性幹細胞の培養集団を得る工程、ここで、該培養工程がフィーダー細胞の非存在下で行われる；
(b)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の前記培養集団を分化させ、分化細胞を得る工程、ここで、該分化作用物質がニコチンアミドを含む；および
(c)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地中で前記分化細胞をさらに分化させ、それによってRPE細胞を作製する工程。
以下の工程を含む、網膜色素上皮(RPE)細胞を作製する方法：
(a)ヒトフィーダー細胞馴化培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、ヒト多能性幹細胞の培養集団を得る工程、ここで、該培養工程がフィーダー細胞の非存在下で行われる；
(b)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の前記培養集団を分化させ、分化細胞を得る工程、ここで、該分化作用物質がニコチンアミドを含む；
(c)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地中で前記分化細胞をさらに分化させ、RPE細胞を得る工程；および
(d)前記RPE細胞を接着性表面上で培養し、RPE細胞の増殖した集団を作製する工程。
以下の工程を含む、網膜疾患を処置するための網膜色素上皮(RPE)細胞を作製する方法：
(a)ヒトフィーダー細胞馴化培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、ヒト多能性幹細胞の培養集団を得る工程、ここで、該培養工程がフィーダー細胞の非存在下で行われる；
(b)分化作用物質を含む培地中でヒト多能性幹細胞の前記培養集団を分化させ、分化細胞を得る工程、ここで、該分化作用物質がニコチンアミドを含む；
(c)TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを含む培地中で前記分化細胞をさらに分化させ、RPE細胞を得る工程；
(d)前記RPE細胞を接着性表面上で培養し、RPE細胞の増殖した集団を作製する工程；および
(e)RPE細胞の前記増殖した集団を回収する工程；
ここで、前記RPE細胞は、対象の眼の中に移植され、それによって疾患を処置するために使用される。
大規模で行われる、請求項1または2に記載の方法。
前記フィーダー細胞馴化培地が、前記フィーダー細胞馴化培地を作製するために用いられるフィーダー細胞から分離されている、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
前記ヒトフィーダー細胞馴化培地がヒト臍帯線維芽細胞馴化培地を含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
前記ヒト臍帯線維芽細胞馴化培地が、ヒト臍帯線維芽細胞を培養培地中で少なくとも2日間培養することによって作製されている、請求項6に記載の方法。
前記ヒト臍帯線維芽細胞が放射線照射されている、請求項7に記載の方法。
前記馴化培地が、定義されたゼノフリーな成長培地を含む、請求項6～8のいずれか一項に記載の方法。
分化した前記RPE細胞の前記移植が眼の網膜下腔で行われる、請求項3に記載の方法。
前記RPE細胞が、懸濁物の状態で、またはマトリックスもしくは基質上に固定化された細胞の単層として、移植される、請求項3に記載の方法。
前記ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞を含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
工程(b)の培地がアクチビンAを欠いている、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
前記TGFβスーパーファミリーのメンバーが、TGFβ1、TGFβ3、およびアクチビンAからなる群より選択される、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
工程(c)の培地がニコチンアミドおよびアクチビンAを含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
工程(c)の後に、ニコチンアミドを含みかつアクチビンAを欠いている培地中で前記RPE細胞を培養する工程をさらに含む、請求項15に記載の方法。
工程(b)が非接着性条件下で行われる、請求項1、2、3または13に記載の方法。
前記非接着性条件が非接着性培養プレートを含む、請求項17に記載の方法。
前記非接着性条件が非接着性基質を含む、請求項17に記載の方法。
工程(b)が、
(i)非接着性条件下、アクチビンA非存在下でニコチンアミドを含む培地中でヒト多能性幹細胞の前記培養集団を培養し、分化細胞を含む細胞のクラスターを作製する工程；および続いて
(ii)接着性条件下、アクチビンA非存在下でニコチンアミドを含む培地中で(i)の前記分化細胞を培養する工程
を含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
工程(ii)の前に前記細胞のクラスターを解離させ、細胞の凝集塊または細胞のシングルセル懸濁物を作製する工程をさらに含む、請求項20に記載の方法。
工程(a)が約1週間行われる、請求項1～20のいずれか一項に記載の方法。
工程(b)が少なくとも1週間行われる、請求項1～22のいずれか一項に記載の方法。
工程(c)が少なくとも1週間行われる、請求項1～23のいずれか一項に記載の方法。
工程(c)の後かつ工程(d)の前に非色素細胞を取り除く工程をさらに含む、請求項2または6に記載の方法。
前記培養および分化工程の少なくとも一つが、約10％未満の酸素条件下で行われる、請求項1～25のいずれか一項に記載の方法。
前記培養工程が、約10％を上回る酸素条件下で行われる、請求項1～25のいずれか一項に記載の方法。
工程(a)の前にフィーダー細胞上で前記ヒト多能性幹細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項1～27のいずれか一項に記載の方法。
前記フィーダー細胞がヒト臍帯線維芽細胞を含む、請求項28に記載の方法。
前記増殖させる工程が少なくとも2継代行われる、請求項28または29に記載の方法。
前記増殖させる工程が少なくとも1週間行われる、請求項28～30のいずれか一項に記載の方法。
前記網膜疾患または網膜障害が、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、遺伝性または後天性の黄斑変性、加齢黄斑変性(AMD)、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィー、RPEジストロフィー、シュタルガルト病、ならびに光、レーザー、炎症、感染、放射線、血管新生、または外傷性損傷のいずれか1つによって引き起こされる傷害を原因とするRPEおよび網膜の傷害のうちの少なくとも1つから選択される、請求項3に記載の方法。
前記フィーダー細胞が、β-メルカプトエタノールの存在下で培養される、請求項1～31のいずれか一項に記載の方法。