ES2865024T3 - Producción a gran escala de células de epitelio pigmentario retiniano - Google Patents

Abstract

Método de producción de células de epitelio pigmentario retiniano (EPR) que comprende: (a) cultivar células madre pluripotentes humanas en un medio acondicionado con células alimentadoras humanas para obtener una población cultivada de células madre pluripotentes humanas, en el que dicha etapa de cultivar se produce en ausencia de células alimentadoras; (b) diferenciar dicha población cultivada de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende un agente de diferenciación para obtener células en diferenciación; y (c) diferenciar además dichas células en diferenciación en un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia de TGFb.

Description

Producción a gran escala de células de epitelio pigmentario retiniano

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a la producción a gran escala de células de epitelio pigmentario retiniano a partir de células madre embrionarias.

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a células de epitelio pigmentario retiniano y, más particularmente, pero no exclusivamente, a la evaluación de tales células como productos terapéuticos. La presente invención también se refiere a la generación de células de epitelio pigmentario retiniano a partir de células madre embrionarias.

El epitelio pigmentado retiniano (EPR) es una monocapa de células pigmentadas, que se sitúa entre la retina neural y los coriocapilares. Las células de EPR desempeñan papeles cruciales en el mantenimiento y la función de la retina y sus fotorreceptores. Estos incluyen la formación de la barrera hematorretiniana, absorción de luz parásita, suministro de nutrientes a la retina neural, regeneración de pigmento visual, y captación y reciclado de los segmentos externos desprendidos de los fotorreceptores.

El tejido retiniano puede degenerarse por diversos motivos. Entre ellos están: oclusión de arterias o venas, retinopatía diabética y retinopatía del prematuro, que son habitualmente no hereditarias. Existen enfermedades hereditarias tales como retinitis pigmentosa, retinosquisis, degeneración en empalizada, enfermedad de Best, enfermedad de Stargardt que también implican la degeneración de tejido retiniano. Un estado de degeneración retiniana común es la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). Estos estados se caracterizan por tipos progresivos de degeneración retiniana.

Las células de EPR pueden usarse posiblemente para la terapia de reemplazo celular de la degeneración del EPR en las enfermedades retinianas mencionadas anteriormente. También pueden usarse como vehículo para la introducción de genes para el tratamiento de enfermedades de degeneración retiniana. Estas células también pueden servir como modelo in vitro de enfermedades de degeneración retiniana, como herramienta para selección de alto rendimiento del efecto terapéutico de moléculas pequeñas, y para el descubrimiento y prueba de nuevos fármacos para enfermedades de degeneración retiniana. Las células de EPR también podrían usarse para investigación básica de desarrollo, maduración, características, propiedades, metabolismo, inmunogenicidad, función e interacción de EPR con otros tipos de células.

El EPR fetal y adulto humano se ha usado como una fuente donante alternativa para alotrasplante. Sin embargo, problemas prácticos en la obtención de suficiente suministro de tejidos y las preocupaciones éticas respecto al uso de tejidos de fetos abortados limitan el uso extendido de estas fuentes donantes. Dadas estas limitaciones en el suministro de injertos de EPR adulto y fetal, se ha estudiado el potencial de fuentes donantes alternativas. Las células madre pluripotentes humanas proporcionan ventajas significativas como fuente de células de EPR para trasplante. Su potencial de desarrollo pluripotente puede permitir su diferenciación para dar auténticas células de EPR funcionales, y dado su potencial de autorrenovación infinita, pueden servir como fuente donante ilimitada de células de EPR. De hecho, se ha demostrado que las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPS) pueden diferenciarse para dar células de EPR in vitro, atenuar la degeneración retiniana y conservar la función visual después del trasplante subretiniano al modelo de rata del Royal College of Surgeons (RCS) de degeneración retiniana que es provocada por la disfunción del EPR. Por tanto, las células madre pluripotentes pueden ser una fuente ilimitada para la producción de células de EPR.

Los protocolos actuales para la derivación de células de EPR a partir de células madre pluripotentes requieren mucho tiempo y trabajo, produciendo números limitados de células pigmentadas. Se requieren nuevos métodos para producir células de EPR en cantidades suficientemente grandes para que puedan usarse en el ámbito clínico.

Los antecedentes de la técnica incluyen los documentos WO 2013/114360, WO 2008/129554 y WO 2013/184809.

Buchholz et al., Stem Cells Translational Medicine, vol. 2, n.° 5, 18 de abril de 2013 (18-04-2013), páginas 384-393, se refieren a una diferenciación dirigida rápida y eficiente de células madre pluripotentes humanas para dar epitelio pigmentario retiniano.

Lane et al., Stem Cells Translational Medicine, vol. 3, n.° 11, 1 de octubre de 2014 (01-10-2014), páginas 1295-1304, se refieren a la diferenciación de epitelio pigmentario retiniana eficiente mediante ingeniería a partir de células madre pluripotentes humanas.

ldelson et al., Cell Stem Cell, vol. 5, n.° 4, 1 de octubre de 2009 (01-10-2009), páginas 396-408, estudian la diferenciación dirigida de células madre embrionarias humanas para dar células de epitelio pigmentario retiniano funcionales.

El documento WO 2014/121077 A2 describe un método para generar células de epitelio pigmentario retiniano (rpe) a partir de células madre pluripotentes inducidas (ipsc).

Sumario de la invención

La presente invención se define mediante las reivindicaciones

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de generación de células de epitelio pigmentario retiniano (EPR) que comprende:

(a) cultivar células madre pluripotentes humanas en un medio acondicionado con células alimentadoras humanas para obtener una población cultivada de células madre pluripotentes humanas;

(b) cultivar la población cultivada de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende un agente de diferenciación para obtener células en diferenciación; y

(c) cultivar las células en diferenciación en un medio que comprende uno o más miembros de las superfamilia de TGFp, generando así las células de EPR.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de generación de células de EPR que comprende:

(a) cultivar células madre pluripotentes humanas en un medio acondicionado con células alimentadoras humanas para obtener una población cultivada de células madre pluripotentes humanas;

(b) cultivar la población cultivada de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende un agente de diferenciación para obtener células en diferenciación;

(c) cultivar las células en diferenciación en un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia de TGFp para obtener células de EPR; y

(d) cultivar las células de EPR en una superficie adherente para generar una población expandida de células de EPR. Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad retiniana que comprende:

(a) cultivar células madre pluripotentes humanas en un medio acondicionado con células alimentadoras humanas para obtener una población cultivada de células madre pluripotentes humanas;

(b) cultivar la población cultivada de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende un agente de diferenciación para obtener células en diferenciación;

(c) cultivar las células en diferenciación en un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia de TGFp para obtener células de EPR;

(d) cultivar las células de EPR en una superficie adherente para generar una población expandida de células de EPR; (e) recoger la población expandida de células de EPR; y

(f) trasplantar las células de EPR en el ojo del sujeto tras la recogida, tratando así la enfermedad.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una población de células de EPR generadas según el método descrito en el presente documento.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno retinianos en un sujeto que lo necesita que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de las células de EPR descritas en el presente documento al sujeto, tratando así la enfermedad o trastorno retinianos.

Según algunas realizaciones de la invención, el método se realiza a gran escala.

Según algunas realizaciones de la invención, el medio acondicionado con células alimentadoras se aísla a partir de las células alimentadoras que se usan para generar dicho medio acondicionado con células alimentadoras.

Según algunas realizaciones de la invención, el medio acondicionado con células alimentadoras humanas comprende El cultivo de la etapa (a) se realiza en ausencia de células alimentadoras.

Según algunas realizaciones de la invención, el medio acondicionado con fibroblastos de cordón umbilical humanos se genera cultivando los fibroblastos de cordón umbilical humanos en un medio de cultivo durante al menos dos días.

Según algunas realizaciones de la invención, se irradian los fibroblastos de cordón umbilical humanos.

Según algunas realizaciones de la invención, el medio acondicionado comprende Nutristem.

Según algunas realizaciones de la invención, el trasplante de las células de EPR diferenciadas se realiza en el espacio subretiniano del ojo.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de EPR se trasplantan en una suspensión, o como una monocapa de células inmovilizadas en una matriz o un sustrato.

Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes humanas comprenden células madre embrionarias humanas.

Según algunas realizaciones de la invención, el agente de diferenciación comprende nicotinamida.

Según algunas realizaciones de la invención, el medio de la etapa (b) está desprovisto de activina A.

Según algunas realizaciones de la invención, el miembro de la superfamilia de TGFp se selecciona del grupo que consiste en TGFp1, TGFp3 y activina A.

Según algunas realizaciones de la invención, el medio de la etapa (c) comprende nicotinamida y activina A.

Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además una etapa de cultivar las células de EPR

en un medio que comprende nicotinamida y desprovisto de activina A tras la etapa (c).

Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (b) se realiza en condiciones no adherentes.

Según algunas realizaciones de la invención, las condiciones no adherentes comprenden una placa de cultivo no adherente.

Según algunas realizaciones de la invención, las condiciones no adherentes comprenden un sustrato no adherente.

Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (b) comprende:

i) cultivar la población cultivada de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende nicotinamida, en ausencia de activina A; en condiciones no adherentes para genera un agrupamiento de células que comprende células en diferenciación; y posteriormente;

ii) cultivar las células en diferenciación de (i) en un medio que comprende nicotinamida, en ausencia de activina A en condiciones adherentes.

Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además disociar el agrupamiento de células antes de la etapa (ii) para generar aglomeraciones de células o una suspensión celular individual de células.

Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (a) se realiza durante aproximadamente una semana. Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (b) se realiza durante al menos una semana.

Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (c) se realiza durante al menos una semana.

Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además retirar las células no pigmentada etapa (c) y antes de la etapa (d).

Según algunas realizaciones de la invención, al menos una porción del cultivo se realiza en condiciones en las que el nivel de oxígeno atmosférico es menor de aproximadamente el 10%.

Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo se realiza en condiciones en las que el nivel de oxígeno atmosférico es mayor de aproximadamente el 10%.

humanas en células alimentadoras antes de la etapa (a).

Según algunas realizaciones de la invención, las células alimentadoras comprenden fibroblastos de cordón umbilical humanos.

Según algunas realizaciones de la invención, la expansión se realiza durante al menos dos pases.

Según algunas realizaciones de la invención, la expansión se realiza durante al menos una semana.

Según algunas realizaciones de la invención, la enfermedad o trastorno retinianos se selecciona de al menos una de retinitis pigmentosa, amaurosis congénita de Leber, degeneración macular hereditaria o adquirida, degeneración macular asociada a la edad (DMAE), enfermedad de Best, desprendimiento de retina, atrofia girata, coroideremia, distrofia en patrón, distrofias del EPR, enfermedad de Stargardt, daño del EPR y retiniano debido al daño provocado por uno cualquiera de lesión fótica, por láser, inflamatoria, infecciosa, por radiación, neovascular o traumática.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y/o científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la técnica al que pertenece la invención. Los métodos y/o materiales a modo de ejemplo se describen a continuación. En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva de la patente, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean necesariamente limitativos.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento sólo a modo de ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos. Ahora, con referencia específica a los dibujos en detalle, se enfatiza que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con el propósito de una discusión ilustrativa de las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos pone de manifiesto para los expertos en la técnica cómo pueden ponerse en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

la figura 1 es una ilustración esquemática de un protocolo para generar células de EPR según las realizaciones de la presente invención.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a la producción a gran escala de células de epitelio pigmentario retiniano a partir de células madre embrionarias.

Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de ser practicada o llevada a cabo de diversas maneras. Se han propuesto células madre embrionarias humanas como fuente celular para la generación de células de EPR. Se han usado dos enfoques generales para obtener células de epitelio pigmentario retiniano (EPR) a partir de hESC, diferenciación espontánea y diferenciación dirigida. En la diferenciación espontánea, se permite que las hESC en colonias planas o en cuerpos embrioides (EB) se diferencien de manera espontánea para dar una población de células que contienen células pigmentadas de EPR. El método de diferenciación dirigida usa varios factores para dirigir la diferenciación de las hESC (que están presentes en cuerpos esferoides) para dar células de EPR, véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.956.866.

Una limitación clave del protocolo descrito en ese documento es su naturaleza de baja escala, que limita la producción industrial en masa. La etapa inicial de la producción de EPR descrita en la patente estadounidense n.° 8.956.866 se basa en el cultivo de colonias de hESC en células alimentadoras de cordón umbilical dentro de placas de cultivo de un solo pocillo. Las colonias se expanden mediante pases mecánicos repetitivos. Este enfoque permite la propagación a baja escala, requiere mucho trabajo y tiempo.

En la siguiente etapa del protocolo descrito en la patente estadounidense n.° 8.956.866, se producen cuerpos esferoides (SB) recogiendo agrupamientos de hESC de las células alimentadoras y cultivando en condiciones no adherentes. Este enfoque genera un número limitado de SB y las células alimentadoras residuales en los SB interfieren con el proceso de diferenciación posterior. Estas limitaciones reducen la cantidad de células pigmentadas de EPR. Ahora, los presentes inventores proponen que la cantidad de células de EPR generadas mediante diferenciación dirigida de las hESC en cuerpos esferoides puede mejorarse usando sistemas de cultivo libres de células alimentadoras. Más específicamente, los presentes inventores proponen que las células madre embrionarias deben diferenciación dirigida adicionales.

Mientras reducen la presente invención a la práctica, los presentes inventores muestran que en el mismo período de tiempo, el número de hESC no diferenciadas que pueden obtenerse se aumenta en un factor de al menos tres en comparación con el protocolo que se basa únicamente en células alimentadoras para la expansión de las hESC. Además, con un pase enzimático adicional de células no diferenciadas, la cantidad de hESC que puede obtenerse se aumenta en 13 veces. La cantidad de trabajo necesaria para la expansión de las hESC se redujo drásticamente. Además, los presentes inventores encontraron que la reproducibilidad en la obtención de altos niveles de células de EPR usando los cultivos libres de células alimentadoras descritos en el presente documento era mucho mayor en comparación con el protocolo que se basa únicamente en células alimentadoras para la expansión de las hESC. Además, los presentes inventores demostraron que cuando las ESC se cultivan en sistemas de cultivo de células no alimentadoras, el protocolo completo para generar células de EPR es igualmente eficaz en condiciones bajas y normales de oxígeno, lo que hace innecesarias etapas costosas y elaboradas tales como la manipulación de las condiciones de oxígeno.

Por tanto, según un aspecto de la presente invención se proporciona un método de generación de células de epitelio pigmentario retiniano (EPR) que comprende:

(a) cultivar células madre pluripotentes humanas en un medio acondicionado con células alimentadoras humanas para obtener una población cultivada de células madre pluripotentes humanas, en el que dicho medio acondicionado con células alimentadoras se aísla de las células alimentadoras que se usan para generar dicho medio acondicionado con células alimentadoras;

(b) cultivar la población cultivada de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende un agente de diferenciación para obtener células en diferenciación;

(c) cultivar las células en diferenciación en un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia de TGFp, generando así las células de EPR.

“Células de epitelio pigmentario retiniano”, “células de EPR”, “EPR”, que pueden usarse de manera intercambiable según lo permita el contexto, se refiere a células de un tipo celular funcionalmente similar al de las células de EPR nativas que forman la capa de células de epitelio pigmentario de la retina (por ejemplo, tras el trasplante dentro de un ojo, presentan actividades funcionales similares a las de las células de EPR nativas).

Según una realización, la célula de EPR expresa al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco marcadores de células de EPR maduras. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a CARLBP, RPE65, PEDF, PMEL17, bestrofina y tirosinasa. Opcionalmente, la célula de EPR también puede expresar un marcador de un progenitor de EPR, por ejemplo, MITF. En otra realización, las células de EPR expresan PAX-6. En otra realización, las células de EPR expresan al menos un marcador de una célula progenitora retiniana incluyendo, pero sin limitarse a Rx, OTX2, SIX3, SIX6 y LHX2.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “marcadores de células de EPR maduras” se refiere a antígenos (por ejemplo, proteínas) que están elevados (por ejemplo, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces) en células de EPR maduras con respecto a células distintas de EPR o células de EPR inmaduras.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “marcadores de células progenitoras de EPR” se refiere a antígenos (por ejemplo, proteínas) que están elevados (por ejemplo, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces) en células progenitoras de EPR con respecto a células distintas de EPR.

Según otra realización, las células de EPR tienen una morfología similar a la de las células de EPR nativas que forman la capa de células de epitelio pigmentario de la retina, es decir, pigmentadas y que tienen una forma poligonal característica.

Según todavía otra realización, las células de EPR son capaces de tratar enfermedades tales como degeneración macular.

Según todavía otra realización, las células de EPR cumplen al menos 1, 2, 3, 4 o todos los requisitos enumerados anteriormente en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “células madre” se refiere a células que son capaces de permanecer en un estado no diferenciado (por ejemplo, células madre pluripotentes o multipotentes) durante periodos prolongados de tiempo en cultivo hasta que se induzca a diferenciarse en otros tipos de células que tienen una función especializada particular (por ejemplo, células totalmente diferenciadas). Preferiblemente, la expresión “células madre” abarca células madre embrionarias (ESC), células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre adultas, células madre mesenquimales y células madre hematopoyéticas.

Seg ún una realización particular, las células de EPR se generan a partir de células madre pluripotentes (por ejemplo, ESC o iPSC).

Pueden generarse células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de células somáticas mediante manipulación genética de células somáticas, por ejemplo, mediante transducción retroviral de células somáticas tales como fibroblastos, hepatocitos, células epiteliales gástricas con factores de transcripción tales como Oct-3/4, Sox2, c-Myc y KLF4 [Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1):39-49; Aoi T, et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. 14 de febrero de 2008. (Publicación electrónica antes de la impresión); IH Park, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008; 451:141-146; K Takahashi, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131:861-872].

Las células madre embrionarias de algunas realizaciones de la invención pueden obtenerse usando métodos de cultivo celular bien conocidos. Los blastocitos humanos se obtienen normalmente a partir de embriones humanos de preimplantación in vivo o a partir de embriones fertilizados in vitro (IVF). Alternativamente, un embrión humano de una única célula puede expandirse a la fase de blastocito. Como referencia, para el aislamiento de células ES humanas la zona pelucida se elimina del blastocito y la masa celular interna (ICM) se aísla mediante un procedimiento en el que las células de trofoectodermo se lisan y eliminan a partir de la ICM intacta pipeteando suavemente. Luego se siembra la ICM en un matraz de cultivo tisular que contiene el medio apropiado que permite su excrecencia. Después de 9 a 15 días, la excrecencia derivada de ICM se disocia para dar aglomeraciones o bien mediante una disociación mecánica o bien mediante una degradación enzimática y luego se vuelven a sembrar en placa las células en un medio de cultivo tisular recién preparado. Las colonias que demuestran una morfología ino diferenciada se seleccionan de manera individual mediante micropipeta, se disocian de manera mecánica para dar aglomeraciones, y se vuelven a sembrar en placa. Luego se dividen de manera rutinaria las células ES resultantes cada 4-7 días. Para detalles adicionales sobre métodos de referencia para la preparación de células ES humanas véanse Reubinoff et al., Nat Biotechnol, mayo de 2000: 18(5): 559; Thomson et al., [patente estadounidense n.° 5.843.780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; Bongso et al., [Hum Reprod 4: 706, 1989]; y Gardner et al., [Fertil. Steril. 69: 84, 1998].

Se apreciará que también pueden usarse células madre disponibles comercialmente según algunas realizaciones de la invención. Pueden adquirirse células ES humanas del registro de células madre embrionarias humanas del NIH [Hypertext Transfer Protocol://grants (dot) nih (dot) gov/stem_cells/registry/current (dot) htm]. Los ejemplos de referencia no limitativos de líneas de células madre embrionarias disponibles comercialmente son HAD-C102, ESI, BG01, BG02, BG03, BG04, CY12, CY30, CY92, CY10, TE03, TE32, CHB-4, CHB-5, CHB-6, CHB-8, CHB-9, CHB-10, CHB-11, CHB-12, HUES 1, HUES 2, HUES 3, HUES 4, HUES 5, HUES 6, HUES 7, HUES 8, HUES 9, HUES 10, HUES 11, HUES 12, HUES 13, HUES 14, HUES 15, HUES 16, HUES 17, HUES 18, HUES 19, HUES 20, HUES 21, HUES 22, HUES 23, HUES 24, HUES 25, HUES 26, HUES 27, HUES 28, CyT49, RUES3, WA01, UCSF4, NYUES1, NYUES2, NYUES3, NYUES4, NYUES5, NYUES6, NYUES7, UCLA 1, UCLA 2, UCLA 3, WA077 (H7), WA09 (H9), WA13 (H13), WA14 (H14), HUES 62, HUES 63, HUES 64, CT1, CT2, CT3, CT4, MA135, Eneavour-2, WIBR1, WIBR2, WIBR3, WIBR4, WIBR5, WIBR6, HUES 45, Shef 3, Shef 6, BJNhem19, BJNhem20, SA001.

Según una realización de referencia específica, la línea de células madre embrionarias es HAD-C102 o ESI.

Además, también pueden obtenerse células ES de otras especies, incluyendo ratón (Mills y Bradley, 2001), hámster dorado [Doetschman et al., 1988, Dev Biol. 15127: 224-7], rata [Iannaccone et al., 1994, Dev Biol. 163: 288-92], conejo [Giles et al. 1993, Mol Reprod Dev. 36: 130-8; Graves y Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 36: 424-33], varias especies de animales domésticos [Notarianni et al., 1991, J Reprod Fertil Suppl. 43: 255-60; Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6: 563-8; Mitalipova et al., 2001, Cloning. 3: 59-67] y especies de primates no humanos (macaco de la India y tití) [Thomson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA. 92: 7844-8; Thomson et al., 1996, Biol Reprod. 55: 254-9].

Solo como referencia, las células de blastocisto expandidos (EBC) pueden obtenerse a partir de un blastocisto de al menos nueve días después de la fertilización en una fase anterior a la gastrulación. Antes de cultivar el blastocisto, la zona pelúcida se digiere [por ejemplo, mediante la solución ácida de Tyrode (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.)] para exponer la masa celular interna. Luego, los blastocistos se cultivan como embriones completos durante al menos nueve y no más de catorce días después de la fertilización (es decir, antes del evento de gastrulación) in vitro usando métodos convencionales de cultivo de células madre embrionarias.

Otro método para preparar células ES se describe en Chung et al., Cell Stem Cell, volumen 2, número 2, 113-117, 7 de febrero de 2008. Este método comprende eliminar una única célula de un embrión durante un procedimiento de fertilización in vitro. El embrión no se destruye en este procedimiento.

Las células EG se preparan a partir de células germinales primordiales obtenidas de fetos de aproximadamente 8-11 semanas de gestación (en el caso de un feto humano) usando técnicas de laboratorio conocidas por cualquier experto en la técnica. Las crestas genitales se disocian y se cortan en pequeños trozos que luego se desagregan para dar células mediante disociación mecánica. Luego, las células EG se hacen crecer en matraces de cultivo tisular con el conforme a las células EG, normalmente después de 7-30 días o 1-4 pases. Para obtener detalles adicionales sobre los métodos de preparación de células EG humanas, véanse Shamblott et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998] y la patente estadounidense n.° 6.090.622.

Aún otro método para preparar células ES es mediante partenogénesis. El embrión tampoco se destruye en el procedimiento.

Según este aspecto de la presente invención, las células madre pluripotentes humanas se cultivan en medio acondicionado antes de la primera fase de diferenciación dirigida. El medio acondicionado con células alimentadoras se aísla de (o se recoge de) las células alimentadoras que se usan para generar dicho medio acondicionado con células alimentadoras. Por tanto, las células madre embrionarias se cultivan preferiblemente en un envase diferente al envase usado para generar el medio acondicionado con células. Aunque pueden estar comprendidas cantidades traza de células alimentadoras en el medio acondicionado, esta etapa de cultivar se lleva a cabo normalmente en ausencia de células alimentadoras. El cultivo de las células madre pluripotentes humanas se realiza normalmente durante al menos un día, más preferiblemente al menos dos días, por ejemplo, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días o siete días. Preferiblemente, el cultivo en medio acondicionado no se lleva a cabo durante más de 21 días, por ejemplo no más de 14 días. Según una realización particular, el cultivo se realiza en una placa o un matraz (por ejemplo, un matraz T75 o un matraz T175). La superficie sólida puede recubrirse con un sustrato no adherente tal como fibronectina, laminina, poli-D-lisina o gelatina. Después de un periodo de tiempo adecuado, pueden eliminarse las colonias de hESC de la superficie sólida usando un agente adecuado, por ejemplo, usando colagenasa A, dispasa, TrypLE Select o EDTA.

Medio acondicionado

El medio acondicionado es el medio de crecimiento de un cultivo celular en monocapa (es decir, células alimentadoras) presentes después de un determinado período de cultivo. El medio acondicionado incluye factores de crecimiento y citocinas secretados por las células en la monocapa en el cultivo.

El medio acondicionado de la presente invención puede recogerse de una variedad de células humanas que forman monocapas en cultivo. Los ejemplos incluyen medio acondicionado con prepucio humano, medio acondicionado con fibroblastos embrionarios humanos, medio acondicionado con células epiteliales de la trompa de Falopio humanas y medio acondicionado con fibroblastos de cordón umbilical humanos.

Los medios acondicionados particularmente adecuados son los derivados de células humanas, tales como el medio acondicionado con fibroblastos de cordón umbilical humanos que se produce cultivando células de fibroblastos de cordón umbilical humanos en un medio de crecimiento en condiciones adecuadas para producir el medio acondicionado.

Según una realización específica, las células alimentadoras se inactivan de manera mitótica mediante irradiación. Pueden usarse otros métodos de inactivación tal como el tratamiento con mitomicina.

Un medio de crecimiento de este tipo puede ser cualquier medio adecuado para cultivar células alimentadoras. El medio de crecimiento puede complementarse con factores nutritivos, tales como aminoácidos, (por ejemplo, L-glutamina), antioxidantes (por ejemplo, beta-mercaptoetanol) y factores de crecimiento, que benefician el crecimiento de células madre en un estado no diferenciado. El suero y los reemplazos de suero se añaden en intervalos de concentración eficaces tal como se describe en otra parte (solicitud de patente estadounidense n.° 10/368.045).

Las células alimentadoras se cultivan en el medio de crecimiento durante un tiempo suficiente para permitir la acumulación adecuada de factores secretados para apoyar la proliferación de células madre en un estado no diferenciado. Normalmente, el medio se acondiciona cultivando durante 4-48 horas a 37°C. Sin embargo, el período de cultivo puede ajustarse a escala evaluando el efecto del medio acondicionado sobre el crecimiento y la diferenciación de células madre.

Según una realización particular, el medio acondicionado se prepara sembrando células de cordón umbilical humanas irradiadas en un medio (por ejemplo, DMEM) en presencia de suero humano durante aproximadamente 5-24 horas. También pueden ser eficaces periodos de cultivo más prolongados de hasta aproximadamente 7 días. Luego se cultivan las células en un medio (por ejemplo, Nutristem) en ausencia de suero humano durante otras 24 horas. El segundo medio puede comprender albúmina sérica humana. Además, el segundo medio puede comprender factores de crecimiento tales como FGF básico y factores de la superfamilia de TGFp. Según una realización particular, las placas de cultivo en las que se prepara el medio acondicionado no están recubiertas con gelatina. Según otra realización, los medios de cultivo que se usan para preparar el medio acondicionado no comprenden factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) o factores de la superfamilia de TGFp. La selección del aparato de cultivo para acondicionar el medio se basa en la escala y el fin del medio acondicionado. La producción a gran escala implica preferiblemente el uso de dispositivos dedicados. Según una realización particular, el medio acondicionado se prepara en matraces. Los sistemas de cultivo celular continuos se revisan en Furey (2000) Genetic Eng. News 20:10.

Tras la acumulación de factores adecuados en el medio, el medio de crecimiento (es decir, el medio acondicionado) se separa de las células alimentadoras y se recoge. Se apreciará que las células alimentadoras pueden usarse repetidamente para acondicionar lotes adicionales de medio durante períodos de cultivo adicionales, siempre que las células conserven su capacidad para acondicionar el medio.

Preferiblemente, el medio acondicionado se esteriliza (por ejemplo, filtración usando un filtro de 20 |iM) antes de su uso. El medio acondicionado de algunas realizaciones de la invención puede aplicarse directamente sobre células madre o extraerse para concentrar el factor eficaz, por ejemplo mediante filtración con sales. Para su uso futuro, el medio acondicionado se almacena preferiblemente congelado a -80°C.

Se apreciará que la presente invención contempla etapas adicionales antes de la etapa del medio acondicionado libre de células alimentadoras que ayudan a la expansión de las células madre pluripotentes.

Por tanto, según una realización particular, las ESC se expanden en células alimentadores antes de la etapa de medio acondicionado libre de células alimentadoras. A continuación, se describen en el presente documento ejemplos de cultivos basados en capas de células alimentadoras contemplados por la presente divulgación. La expansión se realiza normalmente durante al menos dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días o siete días. La expansión se realiza durante al menos 1 pase o al menos 2 pases.

Capa de células alimentadoras de cordón umbilical humano - Pueden expandirse fibroblastos de cordón umbilical humanos en medio de Eagle modificado con Dulbecco (por ejemplo, DMEM, SH30081.01, Hyclone) complementado con suero humano (por ejemplo, al 20%). Preferiblemente, se irradian las células de cordón umbilical humanas. Esto puede realizarse usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, célula gamma, 220 Exel, MDS Nordion 3.500 rads). Una vez que se obtienen suficientes células pueden congelarse (por ejemplo, crioconservarse). Para la expansión de las ESC, los fibroblastos de cordón umbilical humanos se siembran normalmente en una superficie sólida (por ejemplo, matraces T75 o T175) recubierta opcionalmente con un sustrato adherente tal como gelatina (por ejemplo, gelatina humana recombinante (RhG100-001, Fibrogen) a una concentración de 25-30000 células/cm2 en DMEM (por ejemplo SH30081.01, Hyclone) complementado con aproximadamente suero humano al 20%. Las hESC se siembran en placa normalmente por encima de las células alimentadoras 1-4 días después en un medio de apoyo (por ejemplo, Nutristem). Pueden añadirse factores adicionales al medio para impedir la diferenciación de las e Sc tales como bFGF y TGF-p. Una vez que se obtiene una cantidad suficiente de hESC, las células pueden romperse de manera mecánica (por ejemplo, usando una punta estéril o una herramienta de células madre estéril desechable; 14602 Swemed). Alternativamente, las células pueden eliminarse mediante tratamiento enzimático (por ejemplo, colagenasa A o Tryple Select). Este procedimiento puede repetirse varias veces para alcanzar la cantidad necesaria de hESC. Según una realización particular, tras la primera ronda de expansión, las hESC se eliminan usando Tryple Select y tras la segunda ronda de expansión, las hESC se eliminan usando colagenasa A.

Fibroblastos embrionarios humanos o células epiteliales de trompa de Falopio adultas como capas de células alimentadoras - Las células ES humanas pueden hacerse crecer y mantenerse usando fibroblastos embrionarios humanos o células epiteliales de trompa de Falopio adultas. Cuando se hacen crecer en estas células alimentadoras humanas, las células ES humanas presentan cariotipos normales, presentan actividad de fosfatasa alcalina, expresan Oct-4 y otros marcadores de superficie de células embrionarias, incluyendo SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 y GCTM-2, forman teratomas in vivo, y conservan todas las características morfológicas clave [Richards M, Fong CY, Chan WK, Wong PC, Bongso A. (2002). Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20: 933-6].

Capas de células alimentadoras de prepucio - Las células ES humanas pueden cultivarse sobre una capa de células alimentadoras de prepucio humanas tal como se divulga en la solicitud de patente estadounidense n.° 10/368.045. Las capas de células alimentadoras derivadas de prepucio consisten en un entorno completamente libre de componentes de origen animal adecuado para cultivar células ES humanas. Además, las células de prepucio pueden mantenerse en cultivo durante 42 pases desde su derivación, proporcionando a las células ES un entorno relativamente constante. En estas condiciones se encontró que las células ES humanas eran funcionalmente indistinguibles de las células que se hicieron crecer con protocolos alternativas (por ejemplo, MEF). Tras la diferenciación, las células ES expresaron genes asociados con las tres capas germinales embrionarias, in vitro, y formaron teratomas in vivo, que consisten en tejido que surge de las tres capas germinales.

Preferiblemente, el tipo de célula alimentadora que se usa para la generación del medio acondicionado es idéntico al tipo de célula alimentadora usado para la expansión inicial de las hESC. Por tanto, por ejemplo, si se usan fibroblastos de cordón umbilical humanos para generar el medio acondicionado, entonces la expansión inicial de las hESC debe llevarse a cabo en células alimentadoras de fibroblastos de cordón umbilical humanos.

Después del cultivo en el medio acondicionado con células alimentadoras humanas, las ESC se someten a diferenciación dirigida usando un agente de diferenciación.

En un protocolo de diferenciación a modo de ejemplo, las células madre embrionarias se diferencian hacia el linaje de EPR usando un miembro de la superfamilia de factor de crecimiento transformante p (TGFp), (por ejemplo, subtipos TGFpi, TGFp2 y TGFp3, así como ligandos homólogos que incluyen activina (por ejemplo, activina A, activina B y activina AB), hormona antimülleriana nodal (AMH), algunas proteínas morfogenéticas óseas (BMP), por ejemplo BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 y BMP7, y factores de crecimiento y diferenciación (GDF)). Según una realización específica, el miembro de superfamilia de factor de crecimiento transformante p (TGFp) es activina A, por ejemplo, entre 20-200 ng/ml, por ejemplo, 100-180 ng/ml.

Según una realización particular, el primer agente de diferenciación es nicotinamida (NA), por ejemplo, entre 1­ 100 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo, 10 mM.

Según otra realización, el primer agente de diferenciación es 3-aminobenzamida.

NA, también conocida como “niacinamida”, es la forma derivada de amida de la vitamina B3 (niacina) que se piensa que conserva y mejora la función de células beta. La NA tiene la fórmula química C6H6N2O. La NA es esencial para el crecimiento y la conversión de alimentos en energía, y se ha usado en el tratamiento de la artritis y el tratamiento y la prevención de la diabetes.

Según una realización particular, la nicotinamida es un derivado de nicotinamida o un mimético de nicotinamida. El término “derivado de nicotinamida (NA)” tal como se usa en el presente documento indica un compuesto que es un derivado químicamente modificado de la NA natural. En una realización, la modificación química puede ser una sustitución del anillo de piridina de la estructura básica de NA (a través del miembro de carbono o nitrógeno del anillo), a través de los átomos de nitrógeno o de oxígeno del resto amida. Cuando está sustituido, uno o más átomos de hidrógeno pueden reemplazarse por un sustituyente y/o un sustituyente puede unirse a un átomo de N para formar un nitrógeno tetravalente cargado positivamente. Por tanto, la nicotinamida de la presente invención incluye una nicotinamida sustituida o no sustituida. En otra realización, la modificación química puede ser una deleción o sustitución de un único grupo, por ejemplo, para formar un análogo de tiobenzamida de NA, todo lo cual es apreciado por aquellos versados en química orgánica. El derivado en el contexto de la invención también incluye el derivado de nucleósido de NA (por ejemplo, nicotinamida adenina). Se describe una variedad de derivados de NA, algunos también en relación con una actividad inhibidora de la enzima PDE4 (documentos WO03/068233; WO02/060875; GB2327675A), o como inhibidores de la tirosina cinasa del receptor de VEGF (documento WO01/55114). Por ejemplo, el procedimiento de preparación de derivados de 4-aril-nicotinamida (documento WO05/014549). Otros derivados de nicotinamida a modo de ejemplo se divulgan en los documentos WO01/55114 y EP2128244.

Los miméticos de nicotinamida incluyen formas modificadas de nicotinamida y análogos químicos de nicotinamida que recapitulan los efectos de la nicotinamida en la diferenciación y maduración de las células de EPR a partir de células pluripotentes. Los miméticos de nicotinamida a modo de ejemplo incluyen ácido benzoico, ácido 3-aminobenzoico y 6-aminonicotinamida. Otra clase de compuestos que pueden actuar como miméticos de nicotinamida son los inhibidores de la poli-(ADP-ribosa) polimerasa (PARP). Los inhibidores de PARP a modo de ejemplo incluyen 3-aminobenzamida, iniparib (BSI 201), olaparib (AZD-2281), rucaparib (AG014699, PF-01367338), veliparib (ABT-888), CEP 9722, MK 4827 y BMN-673.

Según una realización particular, la diferenciación se realiza de la siguiente manera:

a) cultivo de las ESC en un medio que comprende un primer agente de diferenciación (por ejemplo, nicotinamida); y

b) cultivo de las células obtenidas de la etapa a) en un medio que comprende un miembro de la superfamilia de TGFp (por ejemplo, activina A) y el primer agente de diferenciación (por ejemplo, nicotinamida).

Preferiblemente la etapa (a) se realiza en ausencia del miembro de la superfamilia de TGFp.

El protocolo descrito anteriormente puede continuarse cultivando las células obtenidas en la etapa b) en un medio que comprende el primer agente de diferenciación (por ejemplo, nicotinamida), pero desprovisto de un miembro de la El protocolo descrito anteriormente se describe ahora con más detalle, con realizaciones adicionales.

Etapa (a): el procedimiento de diferenciación comienza una vez que se obtienen cantidades suficientes de las ESC. Se eliminan normalmente del cultivo celular del medio acondicionado (por ejemplo, usando colagenasa A, dispasa, TrypLE Select, EDTA) y se siembran en un sustrato no adherente (por ejemplo, una placa de cultivo celular tal como una placa de cultivo recubierta con agarosa tal como Hydrocell o placas de Petri bacteriológicas) en presencia de nicotinamida (y ausencia de activina A). Las concentraciones a modo de ejemplo de nicotinamida son de entre 1-100 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo, 10 mM. Una vez que las células se siembran en el sustrato no adherente (por ejemplo, placa de cultivo celular), el cultivo celular puede denominarse suspensión celular, preferiblemente agrupamientos flotantes libres en un cultivo en suspensión, es decir, agregados de células derivados de células madre embrionarias humanas (hESC). Los agrupamientos celulares no se adhieren a ningún sustrato (por ejemplo, placa de cultivo, portador). Las fuentes de células madre flotantes libres se describieron previamente en el documento WO 06/070370. Esta fase puede realizarse durante un mínimo de 1 día, más preferiblemente dos días, tres días, 1 semana o incluso 14 días. Preferiblemente, las células no se cultivan durante más de 3 semanas en suspensión junto con la nicotinamida, por ejemplo, de entre 1-100 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo, 10 mM (y en ausencia de activina).

En una realización, las células se cultivan durante 6-8 días en suspensión junto con la nicotinamida, por ejemplo, de entre 1-100 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo, 10 mM (y en ausencia de activina A).

Según una realización, cuando las células se cultivan en el sustrato no adherente, por ejemplo, placas de cultivo celular, las condiciones de oxígeno atmosférico son del 20%. Sin embargo, la manipulación de las condiciones de oxígeno atmosférico también se contempla de manera que el porcentaje de oxígeno atmosférico es menos de aproximadamente el 20%, el 15%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6% o incluso menos de aproximadamente el 5% (por ejemplo, entre el 1%-20%, el 1%-10% o el 0-5%).

Según una realización particular, las células se cultivan en el sustrato no adherente inicialmente en condiciones normales de oxígeno atmosférico y luego se reducen a menos de las condiciones normales de oxígeno atmosférico.

Los ejemplos de placas de cultivo celular no adherentes incluyen las fabricadas por Nunc (por ejemplo, n.° de cat. de Hydrocell 174912).

Normalmente, los agrupamientos comprenden al menos 50-500.000, 50-100.000, 50-50.000, 50-10.000, 50-5000, 50­ 1000 células. Según una realización, las células en los agrupamientos no están organizadas en capas y forman formas irregulares. En una realización, los agrupamientos están desprovistos de células madre embrionarias pluripotentes. En otra realización, los agrupamientos comprenden pequeñas cantidades de células madre embrionarias pluripotentes (por ejemplo, no más del 5% o no más del 3% (por ejemplo, el 0,01-2,7%), células que expresan conjuntamente OCT4 y TRA 1-60 a nivel de proteína). Normalmente, los agrupamientos comprenden células que se han diferenciado de manera parcial bajo la influencia de la nicotinamida. Tales células expresan principalmente marcadores de precursores neurales y retinianos tales como PAX6, Rax, Six3 y/o CHX10 así como marcadores de progenitores de otros linajes tales como alfa-fetoproteína, MIXL1 y Brachyury.

Los agrupamientos pueden disociarse usando métodos enzimáticos o no enzimáticos (por ejemplo, mecánicos) conocidos en la técnica. Según una realización, las células se disocian de manera que ya no están en agrupamientos, por ejemplo, agregados o aglomeraciones de 2-100.000 células, 2-50.000 células, 2-10.000 células, 2-5000 células, 2-1000 células, 2-500 células, 2-100 células, 2-50 células. Según una realización particular, las células están en una suspensión celular individual.

Las células (por ejemplo, las células disociadas) se siembran luego en un sustrato adherente y se cultivan en presencia de nicotinamida, por ejemplo de entre 1-100 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo 10 mM (y ausencia de activina A). Esta fase puede realizarse durante un mínimo de 1 día, más preferiblemente dos días, tres días, 1 semana o incluso 14 días. Preferiblemente, las células no se cultivan durante más de 3 semanas en presencia de nicotinamida (y en ausencia de activina). En una realización a modo de ejemplo, esta fase se realiza durante 6-7 días.

Según una realización, cuando las células se cultivan en el sustrato adherente, por ejemplo, laminina, las condiciones de oxígeno atmosférico son del 20%. Pueden manipularse de manera que el porcentaje es de menos de aproximadamente el 20%, el 15%, el 10%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 9%, menos de aproximadamente el 8%, menos de aproximadamente el 7%, menos de aproximadamente el 6% y más preferiblemente aproximadamente el 5% (por ejemplo, entre el 1%-20%, el 1%-10% o el 0-5%).

Según una realización particular, las células se cultivan en el sustrato adherente inicialmente en condiciones normales de oxígeno atmosférico y luego se reducen a menos que las condiciones normales de oxígeno atmosférico.

Los ejemplos de sustratos adherentes incluyen, pero no se limitan a, fibronectina, laminina, poli-D-lisina y gelatina.

ejemplo, de entre 1-100 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo, 10 mM), luego se someten las células semidiferenciadas a una fase adicional de diferenciación en un sustrato adherente - cultivo en presencia de activina A (por ejemplo, 100­ 200 ng/ml, por ejemplo, 140 ng/ml, 150 ng/ml, 160 ng/ml o 180 ng/ml). También puede añadirse nicotinamida a esta fase (por ejemplo, entre 1-100 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo, 10 mM).

Esta fase puede realizarse durante de 1 día a 10 semanas, de 3 días a 10 semanas, de 1 semana a 10 semanas, de una semana a ocho semanas, de una semana a cuatro semanas, por ejemplo, durante al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos 5 días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas, al menos seis semanas, al menos siete semanas, al menos ocho semanas, al menos nueve semanas, al menos diez semanas.

Según una realización específica, esta fase se realiza durante aproximadamente dos semanas. Esta fase de diferenciación puede realizarse en condiciones normales o bajas de oxígeno atmosférico, tal como se detalló anteriormente en el presente documento.

Etapa (c): tras la segunda fase de diferenciación dirigida (es decir, cultivo en presencia de nicotinamida y activina A en un sustrato adherente; etapa (b)), las células adicionalmente diferenciadas se someten opcionalmente a una fase posterior de diferenciación en el sustrato adherente - cultivo en presencia de nicotinamida (por ejemplo, de entre 1­ 100 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo, 10 mM), en ausencia de activina A. Esta fase puede realizarse durante al menos un día, 2 días, 5 días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas o incluso cuatro semanas. Preferiblemente, esta fase se realiza durante aproximadamente una semana. Esta fase de diferenciación también puede llevarse a cabo en condiciones normales o bajas de oxígeno atmosférico, tal como se detalló anteriormente en el presente documento.

El medio básico en el que se diferencian las ESC es cualquier medio de cultivo celular conocido en la técnica para apoyar el crecimiento celular in vitro, normalmente, un medio que comprende una disolución de base definida, que incluye sales, azúcares, aminoácidos y cualquier otro nutriente necesario para el mantenimiento de las células en el cultivo en un estado viable. Según una realización específica, el medio básico no es un medio acondicionado. Los ejemplos no limitativos de medios básicos disponibles comercialmente que pueden utilizarse según la invención comprenden Nutristem (sin bFGF y TGFp para la diferenciación de ESC, con bFGF y TGFp para la expansión de ESC) Neurobasal™, KO-DMEM, DMEM, DMEM/F12, medio de crecimiento de células madre Cellgro™ o X-Vivo™. El medio básico puede complementarse con una variedad de agentes conocidos en la técnica que tratan con cultivos celulares. La siguiente es una referencia no limitativa a diversos complementos que pueden incluirse en el sistema de cultivo que se usará según la presente divulgación:

- suero o con un medio que contiene reemplazo de suero, tal como, sin limitarse a lo mismo, reemplazo de suero inactivo (KOSR), Nutridoma-CS, TCH™, N2, derivado de N2 o B27 o una combinación;

- un componente de matriz extracelular (ECM), tal como, sin limitarse a lo mismo, fibronectina, laminina, colágeno y gelatina. La ECM puede usarse entonces para portar uno o más miembros de la superfamilia de TGFp de factores de crecimiento;

- un agente antibacteriano, tal como, sin limitarse a lo mismo, penicilina y estreptomicina;

- aminoácidos no esenciales (NEAA), neurotrofinas que se sabe que desempeñan un papel en el fomento de la supervivencia de las SC en cultivo, tales como, sin limitarse lo mismo, BDNF, NT3, NT4.

Según una realización preferida, el medio usado para diferenciar las ESC es medio Nutristem (por ejemplo, Biological Industries, 06-5102-01-lA).

Según una realización particular, la diferenciación y expansión de las ESC se realiza en condiciones libres de xeno.

Según una realización, el medio de proliferación/crecimiento está desprovisto de xenocontaminantes, es decir, libre de componentes derivados de animales tales como suero, factores de crecimiento y albúmina derivados de animales. Por tanto, según esta realización, el cultivo se realiza en ausencia de xenocontaminantes.

Otros métodos para cultivar las ESC en condiciones libres de xeno se proporcionan en la solicitud de patente estadounidense n.° 20130196369.

Las preparaciones que comprenden células de EPR pueden prepararse según Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) (por ejemplo, las preparaciones cumplen con las BPF) y/o las Buenas Prácticas Tisulares (BPT) actuales (por ejemplo, las preparaciones pueden cumplir las BPT).

Durante las etapas de diferenciación, las células madre embrionarias pueden monitorizarse para determinar su estado de diferenciación. Puede determinarse la diferenciación celular tras el examen de marcadores específicos de células Los marcadores específicos de tejido/células pueden detectarse usando técnicas inmunológicas bien conocidas en la técnica [Thomson JA et al., (1998). Science 282: 1145-7]. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo para marcadores unidos a la membrana o intracelulares, inmunohistoquímica para marcadores extracelulares e intracelulares e inmunoensayo enzimático, para marcadores moleculares secretados.

Una vez que las células se promueven al destino de EPR, las células de EPR pueden seleccionarse y/o expandirse. Según una realización particular, la selección se basa en una selección negativa - es decir, eliminación de células distintas de EPR. Esto puede realizarse de manera mecánica mediante la eliminación de células no pigmentadas o mediante el uso de marcadores de superficie.

Según otra realización, la selección se basa en una selección positiva, es decir, selección de células pigmentadas. Esto puede realizarse mediante análisis visual o el uso de marcadores de superficie.

Según todavía otra realización, la selección se basa primero en una selección negativa y luego en una selección positiva.

La expansión de células de EPR puede realizarse en una matriz extracelular, por ejemplo gelatina, colágeno, fibronectina o laminina (por ejemplo, laminina 521) y poli-D-lisina. Para la expansión, las células pueden cultivarse en KOM libre de suero, medio que comprende suero (por ejemplo, DMEM 20%) o medio Nutristem (06-5102-01-1A Biological Industries). En estas condiciones de cultivo, después del pase y la siembra en placa a baja densidad (aproximadamente 130.000 células/cm2), las células pigmentadas reducen la pigmentación y adquieren una morfología similar a un fibroma. Después de un cultivo más prolongado y una proliferación en cultivos de alta densidad, las células vuelven a adquirir la morfología de forma poligonal característica y aumentan la pigmentación de las células de EPR. En una realización, la expansión se realiza en presencia de nicotinamida (por ejemplo, entre 1-100 mM, 5-50 mM, 5­ 20 mM, por ejemplo, 10 mM), y en ausencia de activina A.

Las células de EPR pueden expandirse en suspensión o en una monocapa. La expansión de las células de EPR en cultivos en monocapa puede modificarse para la expansión a gran escala en biorreactores mediante métodos bien conocidos por los versados en la técnica.

Según una realización, la fase de expansión se realiza durante al menos una semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas, al menos 7 semanas, al menos 8 semanas, al menos 9 semanas o incluso 10 semanas. Preferiblemente, la fase de expansión se realiza durante 1 semana -10 semanas, más preferiblemente 2 semanas -10 semanas, más preferiblemente 3 semanas -10 semanas, más preferiblemente 4 semanas -10 semanas o 4 semanas - 8 semanas.

Según todavía otra realización, las células se pasan al menos 1 vez durante la fase de expansión, al menos dos veces durante la fase de expansión, al menos tres veces durante la fase de expansión, al menos cuatro veces durante la fase de expansión, al menos cinco veces durante la fase de expansión o al menos seis veces durante la fase de expansión.

La población de células de EPR generada según los métodos descritos en el presente documento puede caracterizarse según varios parámetros diferentes.

Por tanto, por ejemplo, las células de EPR obtenidas pueden tener forma poligonal y estar pigmentadas.

La recogida de la población expandida de células de EPR puede realizarse usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, usando una enzima tal como tripsina).

Después de la recogida, la población expandida de células de EPR puede crioconservarse opcionalmente usando métodos conocidos en la técnica.

El método de este aspecto de la presente invención puede realizarse a gran escala.

El término “a gran escala” se refiere a un procedimiento de producción que implica al menos un recipiente de cultivo de al menos 100 ml. En realizaciones preferidas, sin embargo, la escala es normalmente de al menos 250 ml, tal como al menos 500 ml, por ejemplo al menos 1 l o incluso 5 l o más.

El término “a gran escala” puede usarse de manera intercambiable con los términos “a escala industrial” y “a escala de producción”.

Se apreciará que las poblaciones celulares divulgadas en el presente documento están desprovistas de células madre 60+, tal como se mide, por ejemplo, mediante FACS. Las células también tienen expresión regulada por disminución (en más de 5.000 veces) de GDF3 o TDGF tal como se mide mediante PCR.

Las células de EPR de este aspecto de la presente invención no expresan marcadores de células madre embrionarias. Dichos uno o más marcadores de células madre embrionarias pueden comprender OCT-4, NANOG, Rex-1, fosfatasa alcalina, Sox2, TDGF-beta, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 y/o TRA-1-81.

Las preparaciones de EPR pueden purificarse sustancialmente, con respecto a células de no EPR, que comprenden al menos aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% de células de EPR. La preparación de células de EPR puede estar esencialmente libre de células distintas de EPR o consistir en células de EPR. Por ejemplo, la preparación de células de EPR sustancialmente purificada puede comprender menos de aproximadamente el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2% o el 1% de tipo de células distintas de EPR. Por ejemplo, la preparación de células de EPR puede comprender menos de aproximadamente el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2%, el 1%, el 0,9%, el 0,8%, el 0,7%, el 0,6%, el 0,5%, el 0,4%, el 0,3%, el 0,2%, el 0,1%, el 0,09%, el 0,08%, el 0,07%, el 0,06%, el 0,05%, el 0,04%, el 0,03%, el 0,02%, el 0,01%, el 0,009%, el 0,008%, el 0,007%, el 0,006%, el 0,005%, el 0,004%, el 0,003%, el 0,002%, el 0,001%, el 0,0009%, el 0,0008%, el 0,0007%, el 0,0006%, el 0,0005%, el 0,0004%, el 0,0003%, el 0,0002% o el 0,0001% de células distintas de EPR.

Las preparaciones de células de EPR pueden ser sustancialmente puras, tanto con respecto a células distintas de EPR y con respecto a células de EPR de otros niveles de madurez. Las preparaciones pueden estar sustancialmente purificadas, con respecto a las células distintas de EPR, y enriquecidas para células de EPR maduras. Por ejemplo, en preparaciones de células de EPR enriquecidas para células de EPR maduras, al menos aproximadamente el 30%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99%, o el 100% de las células de EPR son células de EPR maduras. Las preparaciones pueden purificarse sustancialmente, con respecto a células distintas de EPR, y enriquecidas para células de EPR diferenciadas en vez de células de EPR maduras. Por ejemplo, al menos aproximadamente el 30%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% de las células de EPR pueden ser células de EPR diferenciadas en vez de células de EPR maduras.

Las preparaciones descritas en el presente documento pueden estar sustancialmente libres de contaminación o infección bacteriana, viral o fúngica incluyendo, pero sin limitarse a, la presencia de VIH 1, VIH 2, VHB, VHC, VHA, CMV, HTLV 1, HTLV 2, parvovirus B19, virus de Epstein-Barr o virus del herpes 1 y 2, SV40, VHH5, 6, 7, 8, CMV, poliomavirus, PVH, enterovirus. Las preparaciones descritas en el presente documento pueden estar sustancialmente libres de contaminación o infección por micoplasma.

Otra manera de caracterizar las poblaciones celulares divulgadas en el presente documento es mediante la expresión de marcadores, Por tanto, por ejemplo, al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de las células expresan bestrofina 1, tal como se mide mediante inmunotinción. Según una realización, entre el 85-100% de las células expresan bestrofina.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan el factor de transcripción asociado a la microftalmia (MITF), tal como se mide mediante inmunotinción. Por ejemplo, entre el 85-100% de las células expresan el MITF.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan gen de caja emparejada 6 (PAX-6) tal como se mide mediante inmunotinción o FACS.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan la proteína de unión a retinaldehído celular (CRALBP), tal como se mide mediante inmunotinción. Por ejemplo, entre el 85-100% de las células expresan la CRALBP.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan la proteína específica del epitelio pigmentario retiniano de 65 kDa (RPE65), tal como se mide mediante inmunotinción. Por ejemplo, entre el 85-100% de las células expresan la RPE65.

Las células de EPR expresan de manera conjunta normalmente marcadores indicativos de diferenciación terminal, por ejemplo, bestrofina 1, proteína premelanosoma (PMEL17), CRALBP y/o RPE65.

Los versados en la técnica apreciarán que la derivación de células de EPR es de gran beneficio. Pueden usarse como modelo in vitro para el desarrollo de nuevos fármacos para fomentar la supervivencia, regeneración y función. Las células de EPR pueden servir para la selección de alto rendimiento de compuestos que tienen un efecto tóxico o regenerativo sobre las células de EPR. Pueden usarse para descubrir mecanismos, nuevos genes, factores solubles o unidos a la membrana que son importantes para el desarrollo, diferenciación, mantenimiento, supervivencia y función Las células de EPR también pueden servir como una fuente ilimitada de células de EPR para el trasplante, la reposición y el apoyo de las células de EPR que funcionan mal o degeneradas en las degeneraciones retinianas. Además, las células de EPR modificadas genéticamente pueden servir como vector para transportar y expresar genes en el ojo y la retina después del trasplante.

Los estados oculares para los que las células de EPR pueden servir como agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, enfermedades o trastornos retinianos asociados generalmente con disfunción retiniana, lesión retiniana y/o pérdida de epitelio pigmentario retiniano. Una lista no limitativa de estados que pueden tratarse según la invención comprende retinitis pigmentosa, amaurosis congénita de Leber, degeneración macular hereditaria o adquirida, degeneración macular asociada a la edad (DMAE), DMAE seca, enfermedad de Best, desprendimiento de retina, atrofia girata, coroideremia, distrofia en patrón así como otras distrofias del EPR, enfermedad de Stargardt, daño del EPR y la retina debido a daño provocado por cualquiera de lesión fótica, por láser, inflamatoria, infecciosa, por radiación, neovascular o traumática.

Los sujetos que pueden ser tratados incluyen primates (incluyendo humanos), caninos, felinos, ungulados (por ejemplo, equinos, bovinos, porcinos (por ejemplo, cerdos)), aves y otros sujetos. Los humanos y los animales no humanos que tienen importancia comercial (por ejemplo, ganado y animales domésticos) son de particular interés. Los mamíferos a modo de ejemplo que pueden tratarse incluyen, caninos; felinos equinos; bovinos; ovinos; roedores, etc. y primates, particularmente humanos. Modelos animales no humanos, particularmente mamíferos, por ejemplo, primates, murinos, lagomorfos, etc. pueden utilizarse para investigaciones experimentales.

Las células de EPR generadas tal como se describe en el presente documento pueden trasplantarse a diversos sitios diana en el ojo de un sujeto. Según una realización, el trasplante de las células de EPR se realiza en el espacio subretiniano del ojo, que es la ubicación anatómica normal del EPR (entre los segmentos externos del fotorreceptor y la coroides). Además, dependiendo de la capacidad migratoria y/o de los efectos paracrinos positivos de las células, puede considerarse el trasplante en compartimentos oculares adicionales que incluyen el espacio vítreo, la parte interna o externa de la retina, la periferia de la retina y el interior de la coroides.

El número de células viables que pueden administrarse al sujeto son normalmente entre 50.000-5x106 por inyección.

Las células se formulan normalmente en un portador (por ejemplo, una disolución isotónica y/o una solución salina) tal como BSS plus™. Otras disoluciones contempladas incluyen disoluciones de crioconservación tales como Cryostor 5 o Cryostor 2. El portador puede comprender opcionalmente factores adicionales que apoyen el injerto, la integración, supervivencia, potencia, etc. del EPR.

El trasplante puede realizarse mediante diversas técnicas conocidas en la técnica. Los métodos para realizar trasplantes de EPR se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.962.027, 6.045.791 y 5.941.250 y en Eye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol marzo de 1997; 235(3):149-58; Biochem Biophys Res Commun 24 de febrero de 2000; 268(3): 842-6; Opthalmic Surg febrero de 1991; 22(2): 102-8. Los métodos para realizar trasplantes de córnea se describen en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.755.785, y en Eye 1995; 9 (Pt 6 Su):6-12; Curr Opin Opthalmol agosto de 1992; 3 (4): 473-81; Ophthalmic Surg Lasers abril de 1998; 29 (4): 305-8; Ophthalmology abril de 2000; 107 (4): 719-24; y Jpn J Ophthalmol noviembre-diciembre de 1999; 43(6): 502-8. Si se van a utilizan principalmente efectos paracrinos, las células también pueden administrarse y mantenerse en el ojo encapsuladas en un envase semipermeable, que también disminuirá la exposición de las células al sistema inmunitario del huésped (Neurotech USA CNTF delivery system; PNAS 7 de marzo de 2006 vol. 103(10) 3896-3901).

La etapa de administración puede comprender administración intraocular de las células de EPR en un ojo que lo necesita. La administración intraocular puede comprender inyección de las células de EPR en el espacio subretiniano.

Según una realización, el trasplante se realiza a través de cirugía de vitrectomía a través de la parte plana seguido por administración de las células a través de una pequeña abertura retiniana en el espacio subretiniano o mediante inyección directa.

Las células de EPR pueden trasplantarse de diversas formas. Por ejemplo, las células de EPR pueden introducirse en el sitio diana en forma de suspensión celular individual, con matriz o adheridas en una matriz o una membrana, matriz extracelular o sustrato tal como un polímero biodegradable o una combinación. Las células de EPR también pueden trasplantarse junto (trasplante conjunto) con otras células retinianas, tales como con fotorreceptores.

La eficacia del tratamiento puede evaluarse mediante diferentes medidas de la función y estructura visual y ocular, que incluyen, entre otras, la mejor agudeza visual con corrección (MAVC), la sensibilidad retiniana a la luz medida por perimetría o microperimetría en la oscuridad y estados adaptados a la luz, electrorretinografía (ERG) de campo completo, multifocal, focal o de patrón, sensibilidad al contraste, velocidad de lectura, visión del color, examen biomicroscópico clínico, fotografía de fondo de ojo, tomografía de coherencia óptica (OCT), autofluorescencia de fondo de ojo (FAF), obtención de imágenes infrarrojas y multicolores, fluoresceína o angiografía ICG, y medios adicionales Al sujeto se le pueden administrar corticosteroides antes o simultáneamente con la administración de las células de EPR, tales como prednisolona o metilprednisolona, Predforte.

Según otra realización, al sujeto no se le administran corticosteroides antes o simultáneamente con la administración de las células de EPR, tales como prednisolona o metilprednisolona, Predforte.

Pueden administrarse fármacos inmunosupresores al sujeto antes de, simultáneamente con y/o tras el tratamiento.

El fármaco inmunosupresor pueden pertenecer a las siguientes clases: glucocorticoides, citostáticos (por ejemplo, agente alquilante o antimetabolito), anticuerpos (policlonales o monoclonales), fármacos que actúan sobre inmunófilos (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimús o sirolimús). Los fármacos adicionales incluyen interferones, opioides, proteínas de unión a TNF, micofenolato y pequeños agentes biológicos.

Los ejemplos de fármacos inmunosupresores incluyen: células madre mesenquimales, anticuerpo policlonal contra globulina antilinfocítica (ALG), anticuerpo policlonal contra globulina antitimocítica (ATG), azatioprina, BASI LIXIMAB® (anticuerpo contra el receptor IL-2Ra), ciclosporina (ciclosporina A), DACLIZUMAB® (anticuerpo contra el receptor IL-2Ra), everolimús, ácido micofenólico, RITUXlMAB® (anticuerpo anti-CD20), sirolimús, tacrolimús y/o micofenolato mofetil.

Pueden administrarse antibióticos al sujeto antes de, simultáneamente con y/o tras el tratamiento. Los ejemplos de antibióticos incluyen Oflox, gentamicina, cloranfenicol, Tobrex, Vigamox o cualquier otra preparación antibiótica tópica autorizada para uso ocular.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a ± 10% .

Los términos “comprende”, “que comprende”, “ incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “que incluye pero no se limita a”.

El término “que consiste en” significa “que incluye y se limita a”.

El término “que consisten esencialmente en” significa que la composición, método o estructura pueden incluir componentes, etapas y/o partes adicionales, pero sólo si los componentes, etapas y/o partes adicionales no alteran sustancialmente las características básicas y nuevas de la composición, método o estructura reivindicados.

Tal como se usa en el presente documento, la forma singular “un/uno”, “una” y “el/la” incluyen las referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

Siempre que se indique en el presente documento un intervalo numérico, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccionario o integral) dentro del intervalo indicado. Las expresiones “que oscila(n)/oscila(n) entre” un primer número indicado y un segundo número indicado e “que oscila(n)/oscila(n) desde” un primer número indicado “a” un segundo número indicado se usan en el presente documento de manera intercambiable y están destinadas a incluir el primer y segundo número indicados y todos los numerales fraccionarios e integrales entre los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “método” se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos que se conocen o se desarrollan fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos realizados por profesionales de las técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tratar” incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de un estado, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de un estado o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de un estado.

Se aprecia que determinadas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones individuales, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. A la inversa, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención, tal como se delinearon anteriormente en el presente documento y tal como se reivindican en la sección de reivindicaciones a continuación, encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora, se hace referencia a los siguientes ejemplos que, junto con las descripciones anteriores, ilustran algunas realizaciones de la invención de forma no limitativa.

Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” volúmenes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley y Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbar Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías tal como se exponen en las patentes estadounidenses n.os 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, volúmenes 1-111 Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; “Current Protocols in lmmunology” volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), “Selected Métodos in Cellular lmmunology”, W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen de manera extensa en la bibliografía de patentes y científica, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. l., ed. (1986); “ lmmobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Métodos in Enzymology” vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). Otras referencias generales se proporcionan en todo este documento. Se cree que los procedimientos en los mismos son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector.

EJEMPLO 1

MATERIALES Y MÉTODOS

Protocolo corto

Preparación de medio acondicionado: Se sembraron matraces T75 con células de cordón umbilical irradiadas (2,3 x 106 sin gelatina) en DMEM medio con suero humano al 20%. Después de 5-24h, se reemplazó el medio con Nutristem HSA para acondicionar. Después de 16 a 72 horas de acondicionamiento, se recogió el medio y se reemplazó por medio recién preparado. Según esta metodología, el acondicionamiento secuencial del medio podría realizarse 3-4 veces por semana.

Cultivo de las hESC en medio acondicionado (experimentos CM 1,3,4): se trataron las colonias de hESC (día 8) de cuatro placas de pocillos centrales con colagenasa A, se recogieron y se trituraron suavemente. Se sembraron las hESC en un matraz T75 recubierto con gelatina y se cultivaron con medio acondicionado del matraz de cordón umbilical. Se reemplazó el medio acondicionado cada 1-3 días. Después de 6-7 días, el matraz estaba lleno de colonias de hESC que se recogieron con colagenasa A para formar un cultivo purificado de SB libres de células alimentadoras.

Expansión de las hESC (experimento CM 11,12): se recogieron células de cuatro placas de pocillos centrales como anteriormente y se sembraron en placa las células en un matraz T75 sembrado previamente con células alimentadoras de cordón umbilical (2,3 x 106 por matraz). Después de una semana de cultivo en Nutristem HSA, se recogieron las hESC con Tryple Select (diluido 1:1 con PBS en algunos experimentos) y se dividieron, sembrando 2x106 hESC por matraz T175 sembrado previamente con células alimentadoras de cordón umbilical (5x 106 por matraz). Para la expansión adicional (experimento CM 12), después de una semana de cultivo en Nutristem h Sa , se recogieron las hESC y se dividieron como anteriormente, sembrando 2x106 hESC por matraz T175.

Para la transferencia al cultivo libre de células alimentadoras en medio acondicionado, se recogieron las hESC usando colagenasa A después de una semana de cultivo en matraces T175 como anteriormente, y se sembró un cuarto de ellas en un matraz T175 libre de células alimentadoras y se cultivó en medio acondicionado. Después de 7 días, el matraz estaba lleno de colonias de hESC que se recogieron con colagenasa A.

Generación de células de EPR: se cultivaron los agrupamientos de hESC recogidos de las condiciones de cultivo con medio acondicionado en placas de Hydrocell de 6 cm y se incubaron con medio Nutristem Minus (Nutristem sin complementación con factores de crecimiento) con la adición de nicotinamida 10 mM, en condiciones bajas de oxígeno (el 5% de O2; experimentos CM1, CM3) u normales de oxígeno (el 20% de O2; experimentos CM4, CM9, CM11, esferoides (SB) y se sembraron en placas recubiertas con laminina 511 humana, y se mantuvieron durante una semana con nicotinamida (10 mM) y dos semanas con nicotinamida (10 mM) y activina A (140 ng/ml) (en condiciones normales o bajas de oxígeno).

Cuando aparecieron áreas pigmentadas, se eliminaron las áreas no pigmentadas mediante tratamiento con Tryple Select (6-20 min en 37°C) combinado con separación mecánica. Se separaron adicionalmente las células pigmentadas de la placa mediante soplado suave del medio de la pipeta, se recogieron, se contaron y se sembraron como P0 en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina con medio Nutristem Minus en condiciones normales de oxígeno. Después de dos semanas, se pasaron las células pigmentadas con Tryple Select en matraces sin gelatina y se cultivaron con medio Nutristem Minus (P1). Después de dos semanas adicionales, se realizó un pase similar adicional (P2).

En la figura 1 aparece la presentación esquemática de los procedimientos del experimento CM11.

La tabla 1 resume los resultados de los experimentos CM1, CM3, CM4, CM11. Presenta el número total de células de EPR en cada fase a lo largo del protocolo. El rendimiento de células de EPR por pocillo en P0 es similar entre los cuatro experimentos (cuarta columna). La cantidad promedio de células de EPR por pocillo es de 5,64±0,68x106 (n=4). La pequeña DE indica que la variación entre los experimentos es muy baja.

Tabla 1- La cantidad de células de EPR recogidas a lo largo del protocolo

La tabla 2 proporciona una comparación entre las cantidades de las células de EPR recogidas generadas usando los protocolos descritos en el presente documento (CM1, CM3, CM4, CM11) y otro protocolo usado previamente que es similar al divulgado en el presente documento a partir de la fase de diferenciación de agrupamientos de hESC flotantes en presencia de nicotinamida.

La cantidad de células de EPR que se obtuvieron a partir del material de partida de hESC no diferenciadas cultivadas en cuatro placas de pocillos centrales en los experimentos CM1, CM3, CM4 (quinta columna) era reproducible (14,5 ±1,2x106) con baja DE, a diferencia del protocolo previo que no incluía una etapa de cultivo en medio acondicionado (RPE2, 3, 5 y 6; 50,4±22,6x 106).

El rendimiento promedio de células de EPR en relación con la cantidad de hESC no diferenciadas iniciales en placas de pocillos centrales (columnas siete y ocho) era dos veces mayor (3,6 x106 frente a 1,7 x106), en los experimentos CM1, CM3, CM4, y diez veces mayor en el experimento CM11, que el rendimiento obtenido usando el protocolo previo sin etapa de cultivo en medio acondicionado (RPE2, 3, 5 y 6).

Tabla 2: comparación entre el rendimiento de EPR en los experimentos CM1-4 y la producción según las BPF de los lotes 2 , 3 , 5 y 6 de HADC-EPR

La tabla 3 muestra un cálculo extrapolado de la producción en masa de células de EPR usando el protocolo divulgado. Tabla 3: comparación del rendimiento de las metodologías previas y divulgadas para la producción de EPR

Aunque la invención se ha descrito junto con realizaciones específicas de la misma, resulta evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

Además, la mención o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no se interpretará como una admisión de que tal referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención. En la medida en que se usen títulos de sección, no deben interpretarse como necesariamente limitativos.

Claims (13)

1. i. Método de producción de células de epitelio pigmentario retiniano (EPR) que comprende:

   (a) cultivar células madre pluripotentes humanas en un medio acondicionado con células alimentadoras humanas para obtener una población cultivada de células madre pluripotentes humanas, en el que dicha etapa de cultivar se produce en ausencia de células alimentadoras;

   (b) diferenciar dicha población cultivada de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende un agente de diferenciación para obtener células en diferenciación; y

   (c) diferenciar además dichas células en diferenciación en un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia de TGFp.
2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho medio acondicionado con células alimentadoras humanas comprende un medio acondicionado con fibroblastos de cordón umbilical humanos irradiados.
3. 3. Método según la reivindicación 1, en el que dichas células madre pluripotentes humanas comprenden células madre embrionarias humanas.
4. 4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho agente de diferenciación comprende nicotinamida.
5. 5. Método según la reivindicación 1, en el que dicho miembro de la superfamilia de TGFp se selecciona del grupo que consiste en TGFp1, TGFp3 y activina A.
6. 6. Método según la reivindicación 1, en el que dicho medio de la etapa (c) comprende nicotinamida y activina A.
7. 7. Método según la reivindicación 6, que comprende además una etapa de cultivar dichas células de EPR en un medio que comprende nicotinamida y desprovisto de activina A tras la etapa (c).
8. 8. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en condiciones no adherentes.
9. 9. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende:

   i) cultivar dicha población cultivada de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende nicotinamida, en ausencia de activina A; en condiciones no adherentes para generar un agrupamiento de células que comprende células en diferenciación; y posteriormente

   ii) cultivar dichas células en diferenciación de (i) en un medio que comprende nicotinamida, en ausencia de activina A en condiciones adherentes.
10. 10. Método según la reivindicación 9, que comprende además disociar dicho agrupamiento de células antes de la etapa (ii) para generar aglomeraciones de células o una suspensión celular individual de células.
11. 11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además expandir dichas células madre pluripotentes humanas en células alimentadoras antes de la etapa (a).
12. 12. Método según la reivindicación 11, en el que dicho expansión comprende al menos dos pases.
13. 13. Método según la reivindicación 1, en el que las células de EPR son útiles para tratar una enfermedad o trastorno retinianos.