ES2932823T3 - Preparación de células del epitelio pigmentario de la retina - Google Patents

Abstract

Se describe un método para generar células del epitelio pigmentario de la retina. También se describen las poblaciones de células que las comprenden y los usos de las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación de células del epitelio pigmentario de la retina

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a métodos para preparar células del epitelio pigmentario de la retina a partir de células madre pluripotentes.

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a células del epitelio pigmentario de la retina y, más particularmente, pero no exclusivamente, a la evaluación de tales células como agente terapéutico. La presente invención también se refiere a la generación de células del epitelio pigmentario de la retina a partir de células madre embrionarias.

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa de células pigmentadas que se encuentra entre la retina neural y la coriocapilar. Las células del RPE desempeñan un papel crucial en el mantenimiento y funcionamiento de la retina y sus fotorreceptores. Estos incluyen la formación de la barrera hematorretiniana, la absorción de la luz parásita, el suministro de nutrientes a la retina neural, la regeneración del pigmento visual y la captación y el reciclaje de los segmentos externos desprendidos de los fotorreceptores.

El tejido retiniano puede degenerarse por diversos motivos. Entre ellos se encuentran: la oclusión arterial o venosa, la retinopatía diabética y la retinopatía de la prematuridad, que suelen ser no hereditarias. Hay enfermedades hereditarias tales como la retinitis pigmentaria, la retinosquisis, la degeneración reticular, la enfermedad de Best, la enfermedad de Stargardt que también implican la degeneración del tejido retiniano. Una afección común de degeneración retiniana es la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). Estas afecciones se caracterizan por tipos progresivos de degeneración retiniana.

Las células del RPE pueden usarse potencialmente para la terapia de reposición celular del RPE en degeneración en las enfermedades retinianas mencionadas anteriormente. También pueden usarse como vehículo para la introducción de genes para el tratamiento de enfermedades degenerativas retinianas. Además, estas células pueden usarse en combinación con otras células (tales como fotorreceptores) o en combinación con moléculas pequeñas. Estas células también pueden servir como un modelo in vitro de enfermedades de degeneración retiniana, como una herramienta para el cribado de alto rendimiento en busca de un efecto terapéutico de las moléculas pequeñas y para el descubrimiento y las pruebas de nuevos fármacos para enfermedades de degeneración retiniana. Las células del RPE también podrían usarse para la investigación básica del desarrollo, la maduración, las características, las propiedades, el metabolismo, la inmunogenicidad, la función y la interacción del RPE con otros tipos de células.

El RPE humano fetal y adulto se ha usado como fuente de donante alternativa para el trasplante alogénico. Sin embargo, los problemas prácticos para obtener un suministro suficiente de tejido y las preocupaciones éticas con respecto al uso de tejidos de fetos abortados limitan el uso generalizado de estas fuentes de donante. Dadas estas limitaciones en el suministro de injertos de RPE fetal y adulto, se ha estudiado el potencial de fuentes de donante alternativas. Las células madre pluripotentes humanas proporcionan ventajas significativas como fuente de células del RPE para el trasplante. Su potencial de desarrollo pluripotente puede permitir su diferenciación en auténticas células del RPE funcionales y, dado su potencial de autorrenovación infinita, pueden servir como una fuente de donante ilimitada de células del RPE. De hecho, se ha demostrado que las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) pueden diferenciarse en células del RPE in vitro, atenuar la degeneración retiniana y conservar la función visual después del trasplante subretiniano para el modelo de degeneración retiniana en ratas del Royal College of Surgeons (RCS) provocado por la disfunción del RPE. Por tanto, las células madre pluripotentes pueden ser una fuente ilimitada para la producción de células del RPE.

Los protocolos actuales para la derivación de células del RPE a partir de células madre pluripotentes requieren mucho trabajo y tiempo, y producen un número limitado de células pigmentadas. Se requieren nuevos métodos para producir células del RPE en cantidades lo suficientemente grandes como para que puedan usarse en el ámbito clínico.

La técnica anterior incluye los documentos WO 2013/114360, WO 2008/129554 y WO 2013/184809, y Buchholz et al., Stem Cells Translational Medicine 2013;2:384-393, Rapid and Efficient Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Retinal Pigmented Epithelium.

Sumario de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para generar células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), que comprende:

(a) cultivar una población de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende un agente de diferenciación para obtener células en diferenciación;

(b) cultivar las células en diferenciación en un cultivo que comprende un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia de TGFp, generando así una población mixta de células que comprende células del RPE;

(c) retirar la población mixta de células a partir del cultivo, en el que más del 10% de las células de la población mixta de células son células no pigmentadas; y posteriormente;

(d) cultivar la población mixta de células sobre una superficie adherente para generar una población expandida de células del RPE; y

(e) recoger la población expandida de células del RPE, generando así las células del RPE.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una población de células del RPE generadas según el método descrito en el presente documento.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para tratar una enfermedad o un trastorno retiniano o neurodegenerativo en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de las células del RPE descritas en el presente documento, tratando así la enfermedad o el trastorno retiniano o neurodegenerativo.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para tratar una enfermedad o un trastorno retiniano o neurodegenerativo en un sujeto que lo necesita, que comprende:

(a) generar células del RPE según el método descrito en el presente documento; y

(b) trasplantar una cantidad terapéuticamente eficaz de las células del RPE al ojo del sujeto después de la recogida, tratando así la enfermedad.

Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (c) se efectúa enzimáticamente.

Según algunas realizaciones de la invención, más del 50% de todas las células del cultivo se retiran en la etapa (c). Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además expandir las células madre pluripotentes humanas antes de la etapa (a).

Según algunas realizaciones de la invención, más del 70% de las células de la población expandida de células del RPE son CRALBP+PMEL17+.

Según algunas realizaciones de la invención, la superficie adherente se selecciona del grupo que consiste en gelatina, fibronectina, laminina, colágeno I y colágeno IV.

Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo de la población de células sobre la superficie adherente se efectúa durante al menos 3 semanas.

Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo de la población de células sobre la superficie adherente se efectúa durante al menos 8 pases.

Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además la crioconservación de las células del RPE después de la etapa (e).

Según algunas realizaciones de la invención, la crioconservación se efectúa en un medio seleccionado del grupo que consiste en el 90% de suero humano/el 10% de DMSO, CryoStor al 2%, CryoStor al 5% y CryoStor al 10%, y Stem Cell Banker.

Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes humanas comprenden células madre embrionarias humanas.

Según algunas realizaciones de la invención, el agente de diferenciación comprende nicotinamida.

Según algunas realizaciones de la invención, el medio de la etapa (a) está desprovisto de activina A.

Según algunas realizaciones de la invención, el miembro de la superfamilia de TGFp se selecciona del grupo que consiste en TGFp1, TGFp3 y activina A.

Según algunas realizaciones de la invención, el medio de la etapa (b) comprende nicotinamida y activina A.

Según algunas realizaciones de la invención, la población expandida de células del RPE ha experimentado más de 30 duplicaciones de células.

Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además una etapa de cultivar las células del RPE en un medio que comprende nicotinamida y desprovisto de activina A después de la etapa (b) y antes de la etapa (c). Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (a) se efectúa en condiciones no adherentes.

Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (a) se efectúa inicialmente en condiciones no adherentes y posteriormente en condiciones adherentes.

Según algunas realizaciones de la invención, las condiciones no adherentes comprenden una placa de cultivo no adherente.

Según algunas realizaciones de la invención, las condiciones no adherentes comprenden un sustrato no adherente. Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (a) comprende:

i) cultivar la población cultivada de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende nicotinamida, en ausencia de activina A; en condiciones no adherentes para generar un grupo de células que comprende células en diferenciación; y posteriormente; y

ii) cultivar las células en diferenciación de (i) en un medio que comprende nicotinamida, en ausencia de activina A, en condiciones adherentes.

Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además disociar el grupo de células antes de la etapa (ii) para generar grupos de células o una suspensión celular individual de células.

Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (a) se efectúa durante al menos cinco días.

Según algunas realizaciones de la invención, la etapa (b) se efectúa durante al menos una semana.

Según algunas realizaciones de la invención, al menos una parte del cultivo se efectúa en condiciones en las que el nivel de oxígeno atmosférico es menor de aproximadamente el 10%.

Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo se efectúa en condiciones en las que el nivel de oxígeno atmosférico es mayor de aproximadamente el 10%.

Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes humanas se expanden en células alimentadoras.

Según algunas realizaciones de la invención, las células alimentadoras comprenden fibroblastos de cordón umbilical humano.

Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo de la población de células sobre la superficie adherente se efectúa durante al menos 3 pases.

Según algunas realizaciones de la invención, el trasplante de las células del RPE diferenciadas se efectúa en el espacio subretiniano del ojo.

Según algunas realizaciones de la invención, las células del RPE se trasplantan en una suspensión, o como una monocapa de células inmovilizadas sobre una matriz o un sustrato.

Según algunas realizaciones de la invención, la enfermedad o el trastorno retiniano se selecciona de al menos uno de retinitis pigmentaria, amaurosis congénita de Lebers, degeneración macular hereditaria o adquirida, degeneración macular asociada a la edad (DMAE), enfermedad de Best, desprendimiento de retina, atrofia girata, coroideremia, distrofia en patrón, distrofias del RPE, enfermedad de Stargardt, daño al RPE y retiniano debido al daño provocado por una cualquiera de lesiones fóticas, por láser, inflamatorias, infecciosas, por radiación, neovasculares o traumáticas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y/o científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o las pruebas de realizaciones de la invención, a continuación se describen métodos y/o materiales a modo de ejemplo. En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva de la patente, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean necesariamente limitativos.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento, sólo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos y las imágenes adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a los expertos en la técnica cómo pueden ponerse en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

La figura 1A es un resumen del proceso de fabricación de RPE y los puntos de control en proceso para el ejemplo 1 (estrellas amarillas, controles en proceso, IPC 1-11). NUTSPlus, medio Nutristem que contiene bFGF y TGFP; NUTSMinus, medio Nutristem sin bFGF ni TGFP; NIC, nicotinamida; SB, cuerpos esferoides.

La figura 1B es un resumen del proceso de fabricación de RPE y los puntos de control en proceso para el ejemplo 2 (estrellas amarillas, controles en proceso, IPC 1-11). NUTSPlus, medio Nutristem que contiene bFGF y TGFP; NUTSMinus, medio Nutristem sin bFGF ni TGFP; NIC, nicotinamida; SB, cuerpos esferoides.

La figura 2 ilustra el nivel de células CRALBP+PMEL17+ a lo largo del proceso de producción 1. Diagramas de densidad de los puntos 5-9 del IPC y diagramas de densidad representativos de células del RPE de control positivo y hESC de control de referencia negativo. Los números dentro del cuadrante superior derecho e inferior derecho en cada gráfico indican el porcentaje de células CRALBP+PMEL17+ y CRALBP+PMEL17', respectivamente, de la población separada de células individuales vivas. El análisis se realizó usando el software FCS express 4.

La figura 3 ilustra el nivel de células CRALBP+PMEL17+ en el producto terminado. Diagramas de densidad del punto 11 del IPC (producto terminado, RPE en P2 tras la crioconservación) y diagramas de densidad representativos del RPE de control positivo y hESC de control de referencia negativo. Los números dentro del cuadrante superior derecho en cada gráfico indican el porcentaje de CRALBP+PMEL17+ de la población separada de células individuales vivas. El análisis se realizó usando el software FCS express 4.

La figura 4 ilustra la morfología de las células del RPE a lo largo del proceso de producción.

Las figuras 5A-C ilustran la viabilidad y la vitalidad posteriores a la descongelación de células aisladas mecánicamente (Mec) y recogidas enzimáticamente (Enz) que se expandieron en diversas matrices y se crioconservaron en el 90% de suero humano (HS) que contiene el 10% de DMSO (control; barras azules) o en CryoStor al 5% (CS; barras rojas). Gel, rhGelatina con o sin nicotinamida (Nic); Col I, colágeno I; Col IV, colágeno IV; Lm521, laminina 521.

Las figuras 6A-D ilustran la viabilidad, las células viables totales/vial y la vitalidad posteriores a la descongelación de células aisladas mecánicamente que se expandieron en rhGelatina con nicotinamida y se crioconservaron en diversos medios de crioconservación: el 90% de suero humano (HS) que contiene el 10% de DMSO, CryoStor al 5% (CS5), Biological Industries Solutions 1-3 (BI1-3), Prime XV (PXV), Stem Cell Banker (SCB). Como control, se midieron la viabilidad, las células viables totales/vial y la vitalidad posteriores a la descongelación de las células que se expandieron en rhGelatina sin nicotinamida y se crioconservaron en SCB (gel de SCB).

Figuras 7A-B: rendimiento celular acumulado al final de la fase de expansión. Rendimientos celulares acumulados tras el aislamiento mecánico (A) y la recogida enzimática (B).

La figura 8 ilustra la tinción conjunta de las células del RPE del producto terminado del proceso 2 usando anticuerpos contra MITF y Zo-1 y anticuerpos contra bestrofina-1 y Zo-1.

La figura 9 ilustra el % de células CRALBP+PMEL17+ a lo largo del proceso de producción 2. Se presentan diagramas de densidad de los puntos 5-9 del IPC y diagramas de densidad representativos de células del r Pe de control positivo y hESC de control de referencia negativo. Los números indican el porcentaje de células doblemente positivas CRALBP+PMEL17+ de la población separada de células individuales vivas. El análisis se realizó usando el software FCS express 4.

La figura 10 ilustra el % de células Oct4+Tra-1-60+ a lo largo del proceso de producción 2. Se presentan diagramas de densidad de los puntos 1, 8 y 11 del IPC y diagramas de densidad representativos de células del RPE de control positivo y hESC de control de referencia negativo. Los números indican el porcentaje de células doblemente positivas Oct4+TRA-1-60+ de la población separada de células individuales vivas.

La figura 11 ilustra el % de células Pax6+ a lo largo del proceso de producción 2. Se presentan diagramas de densidad de los puntos 8 y 11 del IPC y diagramas de densidad representativos de células del RPE de control positivo y hESC de control de referencia negativo. Los números indican el porcentaje de células positivas Pax6+ de la población separada de células individuales vivas.

La figura 12 presenta gráficos que comparan los perfiles de crecimiento de glucosa y lactato en células a lo largo del proceso de producción 2 usando recogida enzimática de todas las células o aislamiento mecánico de células poligonales/pigmentadas en diferentes pases a lo largo de la fase de expansión del RPE.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a métodos para preparar células del epitelio pigmentario de la retina a partir de células madre pluripotentes.

Antes de explicar en detalle al menos una realización de la invención, debe entenderse que la aplicación de la invención no está necesariamente limitada a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de ponerse en práctica o llevarse a cabo de diversas maneras.

Las células madre embrionarias humanas se han propuesto como una fuente celular para la generación de células del RPE. Se han usado dos enfoques generales para obtener células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) a partir de hESC de referencia, la diferenciación espontánea y la diferenciación dirigida. En la diferenciación espontánea, se permite que las hESC de referencia en colonias planas o en cuerpos embrioides (EB) se diferencien espontáneamente en una población de células que contiene células del RPE pigmentadas. El método de diferenciación dirigida usa una serie de factores de referencia para impulsar la diferenciación de las hESC de referencia en células del RPE. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.956.866.

Una limitación clave del protocolo descrito en el presente documento es su naturaleza de baja escala, lo que limita la producción en masa industrial. La etapa final de la diferenciación del RPE descrita en la patente estadounidense n.° 8.956.866 se basa en el aislamiento mecánico de células del RPE poligonales/pigmentadas a partir de células no pigmentadas. Este enfoque es laborioso y requiere mucho tiempo.

Los presentes inventores proponen ahora que pueden obtenerse poblaciones purificadas de células del RPE sin realizar aislamiento mecánico de las células poligonales/pigmentadas.

Las pruebas de pureza del RPE CRALBP+PMEL17+ realizadas después de la expansión de células recogidas mecánica y enzimáticamente demostraron que, después de dos ciclos de expansión, las células recogidas enzimáticamente eran tan puras como las células aisladas mecánicamente con una pureza del 95,20% cuando se sembraron en colágeno I (en comparación con el 97,99% cuando se aislaron mecánicamente), una pureza del 95,02% cuando se sembraron en colágeno IV (en comparación con el 96,68% cuando se aislaron mecánicamente) y una pureza del 94,91% cuando se sembraron en laminina 521 (en comparación con el 96,41% cuando se aislaron mecánicamente). Se observaron resultados similares después de tres ciclos de expansión. Estos resultados fueron respaldados por pruebas de morfología que demostraron la morfología típica de monocapa epitelial de forma poligonal y por pruebas funcionales que demostraron secreción de PEDF, función de barrera y secreción polarizada de VEGF y PED^f . Para ilustrar la consistencia de estos hallazgos, se realizó una segunda serie de producción (figura 9).

Por tanto, según un primer aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para generar células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), que comprende:

(a) cultivar una población de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende un agente de diferenciación para obtener células en diferenciación;

(b) cultivar las células en diferenciación en un cultivo que comprende un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia de TGFp, generando así una población mixta de células que comprende células del RPE;

(c) retirar la población mixta de células a partir del cultivo, en el que más del 10% de las células de la población mixta de células son células no pigmentadas; y posteriormente;

(d) cultivar la población mixta de células sobre una superficie adherente para generar una población expandida de células del RPE; y

(e) recoger la población expandida de células del RPE, generando así las células del RPE.

“Células del epitelio pigmentario de la retina”, “células del RPE”, “RPE”, que pueden usarse de manera intercambiable según lo permita el contexto, se refieren a células de un tipo celular funcionalmente similar al de las células del RPE nativas que forman la capa de células del epitelio pigmentario de la retina (por ejemplo, tras el trasplante dentro de un ojo, presentan actividades funcionales similares a las de las células del RPE nativas).

Según una realización, la célula del RPE expresa al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco marcadores de células del RPE maduras. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a, CRALBP, RPE65, PEDF, PMEL17, bestrofina y tirosinasa. Opcionalmente, la célula del RPE también puede expresar un marcador de un progenitor del RPE, por ejemplo, MITF. En otra realización, las células del RPE expresan PAX-6. En otra realización, las células del RPE expresan al menos un marcador de una célula progenitora retiniana, incluyendo, pero sin limitarse a, Rx, OTX2 o SIX3. Opcionalmente, las células del RPE expresan SIX6 y/o LHX2.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “marcadores de células del RPE maduras” se refiere a antígenos (por ejemplo, proteínas) que están elevados (por ejemplo, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces) en células del RPE maduras con respecto a células que no son del RPE o células del RPE inmaduras.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “marcadores de células progenitoras del RPE” se refiere a antígenos (por ejemplo, proteínas) que están elevados (por ejemplo, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces) en las células progenitoras del RPE con respecto a las células que no son del RPE.

Según otra realización, las células del RPE tienen una morfología similar a la de las células del RPE nativas que forman la capa de células del epitelio pigmentario de la retina, es decir, pigmentadas, y que tienen una forma poligonal característica.

Según todavía otra realización, las células del RPE son capaces de tratar enfermedades tales como la degeneración macular.

Según todavía otra realización, las células del RPE cumplen al menos 1, 2, 3, 4 o todos los requisitos enumerados anteriormente en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “células madre” se refiere a células que son capaces de permanecer en un estado indiferenciado (por ejemplo, células madre pluripotentes o multipotentes) durante largos periodos de tiempo en cultivo hasta su inducción a diferenciarse en otros tipos de células que tienen una función particular y especializada (por ejemplo, células completamente diferenciadas). Preferiblemente, la expresión “células madre” abarca células madre embrionarias (ESC), células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre adultas, células madre mesenquimatosas y células madre hematopoyéticas.

Según una realización particular, las células del RPE se generan a partir de células madre pluripotentes (por ejemplo, ESC o iPSC).

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden generarse a partir de células somáticas mediante manipulación genética de células somáticas, por ejemplo, mediante transducción retroviral de células somáticas tales como fibroblastos, hepatocitos, células epiteliales gástricas con factores de transcripción tales como Oct-3/4, Sox2, c-Myc y KLF4 [Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1):39-49; Aoi T, et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. 14 de febrero de 2008. (Epub antes de la impresión); IH Park, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008;451:141-146; Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007;131:861-872]. Pueden generarse otras células madre de tipo embrionario mediante transferencia nuclear a ovocitos, fusión con células madre embrionarias o transferencia nuclear a cigotos si las células receptoras se detienen en la mitosis. Además, las iPSC pueden generarse usando métodos no integradores, por ejemplo, usando moléculas pequeñas o ARN.

La expresión “células madre embrionarias” se refiere a células embrionarias que son capaces de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias (es decir, endodermo, ectodermo y mesodermo), o permanecer en un estado indiferenciado. La expresión “células madre embrionarias” puede comprender células que se obtienen del tejido embrionario formado después de la gestación (por ejemplo, blastocisto) antes de la implantación del embrión (es decir, un blastocisto previo a la implantación), células de blastocisto extendidas (EBC) que se obtienen a partir de un blastocisto en fase posterior a la implantación/previa a la gastrulación (véase el documento WO2006/040763) y células germinales embrionarias (EG) que se obtienen del tejido genital de un feto en cualquier momento durante la gestación, preferiblemente antes de las 10 semanas de gestación. Las células madre embrionarias de algunas realizaciones de la invención pueden obtenerse usando métodos de cultivo celular bien conocidos. Sólo como referencia, las células madre embrionarias humanas pueden aislarse a partir de blastocistos humanos. Los blastocistos humanos se obtienen normalmente a partir de embriones humanos previos a la implantación in vivo o a partir de embriones fecundados in vitro (FIV). Alternativamente, un embrión humano de una sola célula puede expandirse a la fase de blastocisto. Para el aislamiento de células ES humanas, la zona pelúcida se retira del blastocisto y la masa celular interna (ICM) se aísla mediante un procedimiento en el que las células del trofoectodermo se someten a lisis y se retiran de la ICM intacta mediante pipeteo suave. A continuación, la ICM se coloca en placas en un matraz de histocultivo que contiene el medio apropiado que permite su crecimiento. Después de 9 a 15 días, el crecimiento derivado de ICM se disocia en grumos o bien por una disociación mecánica o bien por una degradación enzimática y luego las células vuelven a sembrarse en un medio de histocultivo nuevo. Las colonias que muestran una morfología indiferenciada se seleccionan individualmente con una micropipeta, se disocian mecánicamente en grumos y vuelven a sembrarse. A continuación, las células ES resultantes se dividen de manera rutinaria cada 4-7 días. Sólo como referencia, para obtener más detalles sobre los métodos de preparación de células ES humanas, véanse Reubinoff et al. Nat Biotechnol 2000, mayo: 18(5): 559; Thomson et al., [patente estadounidense n.° 5.843.780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol.38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; Bongso et al., [Hum Reprod 4: 706, 1989]; yGardner et al., [Fertil. Steril. 69: 84, 1998].

Se apreciará que las células madre comercialmente disponibles también pueden usarse según algunas realizaciones de la invención. Pueden adquirirse células ES humanas de referencia del registro de células madre embrionarias humanas del NIH [www.grants(dot)nih(dot)gov/stem_cells/registry/current(dot)htm] o de otros registros de hESC. Sólo como referencia, ejemplos no limitativos de líneas de células madre embrionarias disponibles comercialmente son HAD-C102, ESI, BG01, BG02, BG03, BG04, CY12, CY30, CY92, CY10, TE03, TE32, CHB-4, CHB-5, CHB-6, CHB-8, CHB-9, CHB-10, CHB-11, CHB-12, HUES 1, HUES 2, HUES 3, HUES 4, HUES 5, HUES 6, HUES 7, HUES 8, HUES 9, HUES 10, HUES 11, HUES 12, HUES 13, HUES 14, HUES 15, HUES 16, HUES 17, HUES 18, HUES 19, HUES 20, HUES 21, HUES 22, HUES 23, HUES 24, HUES 25, HUES 26, HUES 27, HUES 28, CyT49, RUES3, WA01, UCSF4, NYUES1, NYUES2, NYUES3, NYUES4, NYUES5, NYUES6, NYUES7, UCLA 1, UCLA 2, UCLA 3, WA077 (H7), WA09 (H9), WA13 (H13), WA14 (H14), HUES 62, HUES 63, HUES 64, CT1, CT2, CT3, CT4, MA135, Eneavour-2, WIBR1, WIBR2, WIBR3, WIBR4, WIBR5, WIBR6, HUES 45, Shef 3, Shef 6, BJNhem19, BJNhem20, SA001, SA001.

Sólo como referencia, la línea de células madre embrionarias es HAD-C102 o ESI.

Además, las células ES también pueden obtenerse de otras especies, incluyendo ratón (Mills y Bradley, 2001), hámster dorado [Doetschman et al., 1988, Dev Biol. 127: 224-7], rata [Iannaccone et al., 1994, Dev Biol. 163: 288-92], conejo [Giles et al. 1993, Mol Reprod Dev. 36: 130-8; Graves y Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 36: 424-33], varias especies de animales domésticos [Notarianni et al., 1991, J Reprod Fertil Supl. 43: 255-60; Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6: 563-8; Mitalipova et al., 2001, Cloning. 3: 59-67] y especies de primates no humanos (macaco de la India y tití) [Thomson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 7844-8; Thomson et al., 1996, Biol Reprod. 55: 254-9].

Sólo como referencia, las células de blastocisto extendidas (EBC) pueden obtenerse de un blastocisto de al menos nueve días tras la fecundación en una fase anterior a la gastrulación. Antes de cultivar el blastocisto, la zona pelúcida se digiere [por ejemplo, con la disolución ácida de Tyrode (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.)] para exponer la masa celular interna. Luego, los blastocistos se cultivan como embriones completos durante al menos nueve y no más de catorce días después de la fecundación (es decir, antes del acontecimiento de gastrulación) in vitro usando métodos convencionales de cultivo de células madre embrionarias.

Sólo como referencia, otro método para preparar células ES se describe en Chung et al., Cell Stem Cell, volumen 2, número 2, 113-117, 7 de febrero de 2008. Este método comprende la retirada de una sola célula de un embrión durante un proceso de fecundación in vitro. El embrión no se destruye en este proceso.

Las células EG se preparan a partir de células germinales primordiales obtenidas de fetos de aproximadamente 8-11 semanas de gestación (en el caso de un feto humano) usando técnicas de laboratorio conocidas por cualquier experto en la técnica. Las crestas genitales se disocian y se cortan en pequeños trozos que luego se desagregan en células por disociación mecánica. A continuación, las células EG se cultivan en matraces de histocultivo con el medio apropiado. Las células se cultivan con sustitución diaria del medio hasta que se observa una morfología celular compatible con las células EG, normalmente después de 7-30 días o de 1-4 pases. Para obtener detalles adicionales sobre los métodos de preparación de células EG humanas, véanse Shamblott et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998] y la patente estadounidense n.° 6.090.622.

Aún otro método para preparar células ES mediante partenogénesis. El embrión tampoco se destruye en el proceso.

Los métodos de cultivo de ES practicados actualmente se basan principalmente en el uso de capas de células alimentadoras que secretan los factores necesarios para la proliferación de células madre, mientras que al mismo tiempo inhiben su diferenciación. El cultivo se efectúa normalmente sobre una superficie sólida, por ejemplo una superficie recubierta de gelatina o vimentina. Las capas de células alimentadoras a modo de ejemplo incluyen fibroblastos embrionarios humanos, células epiteliales de trompa de Falopio adultas, fibroblastos embrionarios de ratón primarios (PMEF), fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), fibroblastos fetales murinos (MFF), fibroblastos embrionarios humanos (HEF), fibroblastos humanos obtenidos a partir de la diferenciación de células madre embrionarias humanas, células musculares fetales humanas (HFM), células cutáneas fetales humanas (HFS), células cutáneas adultas humanas, fibroblastos de prepucio humano (HFF), fibroblastos de cordón umbilical humano, células humanas obtenidas a partir del cordón umbilical o la placenta y células estromales de médula humana (hMSC). Pueden añadirse factores de crecimiento al medio para mantener las ESC en un estado indiferenciado. Tales factores de crecimiento incluyen bFGF y/o TGFp. En otra realización, pueden añadirse agentes al medio para mantener las hESC de referencia en un estado indiferenciado virgen; véase, por ejemplo, Kalkan et al., 2014, Phil. Trans. R. Soc. B, 369: 20130540.

Capa de células alimentadoras de cordón umbilical humano - Los fibroblastos de cordón umbilical humano pueden expandirse en medio de Eagle modificado por Dulbecco (por ejemplo, DMEM, SH30081.01, Hyclone) complementado con suero humano (por ejemplo, 20%) y glutamina. Preferiblemente, las células de cordón umbilical humano se irradian. Esto puede efectuarse usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, célula Gamma, 220 Exel, MDS Nordion 3.500 rads). Una vez que se obtienen suficientes células, pueden congelarse (por ejemplo, crioconservarse). Para la expansión de ESC, los fibroblastos de cordón umbilical humano normalmente se siembran sobre una superficie sólida (por ejemplo, matraces T75 o T175) opcionalmente recubiertos con un sustrato adherente tal como gelatina (por ejemplo, gelatina humana recombinante (RhG100-001, Fibrogen)) a una concentración de 25-40.000 células/cm2 en DMEM (por ejemplo, SH30081.01, Hyclone) complementado con aproximadamente el 20% de suero humano (y glutamina). Las hESC de referencia normalmente se colocan en placas encima de las células alimentadoras 1-4 días después en un medio de apoyo (por ejemplo, Nutristem con albúmina sérica humana). Pueden añadirse factores adicionales al medio para evitar la diferenciación de las ESC, tales como bFGF y TGF-p. Una vez que se obtiene una cantidad suficiente de hESC de referencia, las células pueden romperse mecánicamente (por ejemplo, usando una punta estéril o una herramienta estéril desechable para células madre; 14602 Swemed). Alternativamente, las células pueden retirarse mediante tratamiento enzimático (por ejemplo, colagenasa A o TrypLE Select). Este proceso puede repetirse varias veces para alcanzar la cantidad necesaria de hESC de referencia. Según una realización particular, tras la primera ronda de expansión, se retiran las hESC de referencia usando TrypLE Select, y tras la segunda ronda de expansión, se retiran las hESC de referencia usando colagenasa A.

Fibroblastos embrionarios humanos o células epiteliales de trompa de Falopio adultas como capas de células alimentadoras - Las células ES humanas pueden hacerse crecer y mantenerse usando fibroblastos embrionarios humanos o células epiteliales de trompa de Falopio adultas. Cuando se hacen crecer sobre estas células alimentadoras humanas, las células ES humanas presentan cariotipos normales, presentan actividad fosfatasa alcalina, expresan Oct-4 y otros marcadores de superficie celular embrionaria, incluyendo SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 y GCTM-2, forman teratomas in vivo y conservan todas las características pluripotentes morfológicas clave [Richards M, Fong CY, Chan WK, Wong P^c , Bongso A. (2002). Las células alimentadoras humanas respaldan el crecimiento indiferenciado prolongado de masas de células internas humanas y células madre embrionarias [Nat. Biotechnol. 20: 933-6].

Capas de células alimentadoras de prepucio - Las células ES humanas pueden cultivarse sobre la capa de células alimentadoras de prepucio humano tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense n.° 10/368.045. Las capas de células alimentadoras derivadas del prepucio consisten en un entorno completamente libre de componentes animales adecuado para el cultivo de células madre embrionarias humanas. Además, las células del prepucio pueden mantenerse en cultivo hasta 50 pases desde su derivación, proporcionando a las células ES un entorno relativamente constante. En estas condiciones, se encontró que las células ES humanas eran funcionalmente indistintas de las células cultivadas con protocolos alternativos (por ejemplo, MEF). Después de la diferenciación, las células ES expresaron genes asociados con las tres capas germinales embrionarias, in vitro, y formaron teratomas in vivo, que consisten en tejido que surge de las tres capas germinales.

También se han usado sistemas libres de células alimentadoras en el cultivo de células ES, utilizando tales sistemas matrices complementadas con reposición de suero, citocinas y factores de crecimiento (incluyendo IL6 y quimera del receptor de lL6 soluble) como reposición de la capa de células alimentadoras. Las células madre pueden cultivarse sobre una superficie sólida, tal como una matriz extracelular (por ejemplo, MatrigelRTM o laminina) en presencia de un medio de cultivo, por ejemplo, el sistema Lonza L7, mTeSR, StemPro, XFKSR, E8). A diferencia de los cultivos basados en células alimentadoras que requieren el crecimiento simultáneo de células alimentadoras y células madre y que pueden dar como resultado poblaciones mixtas de células, las células madre cultivadas en sistemas sin células alimentadoras se separan fácilmente de la superficie.

Las ESC pueden expandirse en las células alimentadoras antes de la fase de diferenciación. Los cultivos basados en capa de células alimentadoras a modo de ejemplo contemplados por la presente descripción se describen anteriormente en el presente documento. La expansión se efectúa normalmente durante al menos dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días o siete días. La expansión se efectúa durante al menos 1 pase, al menos 2 pases, al menos 3 pases, al menos 4 pases, al menos 5 pases, al menos 6 pases, al menos 7 pases, al menos 8 pases, al menos 9 pases o al menos 10 pases.

Tras la expansión, las células madre pluripotentes (por ejemplo, ESC) se someten a diferenciación dirigida usando un agente de diferenciación.

En un protocolo de diferenciación a modo de ejemplo, las células madre embrionarias se diferencian hacia el linaje de células del RPE usando un primer agente de diferenciación y luego se diferencian adicionalmente hacia las células del RPE usando un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (TGFp) (por ejemplo, los subtipos TGFpi, TGFp2 y TGFp3, así como ligandos homólogos que incluyen activina (por ejemplo, activina A, activina B y activina AB), nodal, hormona antimülleriana (AMH), algunas proteínas morfogenéticas óseas (BMP), por ejemplo ^b M^p2, BMP3, B^m P4, BMP5, BMP6 y BMP7, y factores de crecimiento y diferenciación (GDF)). Según una realización específica, el miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (TGFp) es la activina A, por ejemplo, entre 20-200 ng/ml, por ejemplo 100-180 ng/ml.

Según una realización particular, el primer agente de diferenciación es la nicotinamida (NA), por ejemplo entre 0,01­ 100 mM, 0,1-100 mM, 0,1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo 10 mM.

Según otra realización, el primer agente de diferenciación es la 3-aminobenzamida.

La NA, también conocida como “niacinamida”, es la forma de derivado de amida de la vitamina B3 (niacina) que se cree que conserva y mejora la función de las células beta. La NA tiene la fórmula química C6H6N2O. La NA es esencial para el crecimiento y la conversión de los alimentos en energía, y se ha usado en el tratamiento de la artritis y en el tratamiento y la prevención de la diabetes.

Según una realización particular, la nicotinamida es un derivado de la nicotinamida o un mimético de la nicotinamida. El término “derivado de nicotinamida (NA)” , tal como se usa en el presente documento, indica un compuesto que es un derivado químicamente modificado de la NA natural. En una realización, la modificación química puede ser una sustitución del anillo de piridina de la estructura básica de NA (a través del miembro de carbono o nitrógeno del anillo), a través de los átomos de nitrógeno u oxígeno del resto amida. Cuando está sustituida, uno o más átomos de hidrógeno pueden reemplazarse por un sustituyente y/o puede unirse un sustituyente a un átomo de N para formar un nitrógeno tetravalente con carga positiva. Por tanto, la nicotinamida de la presente descripción incluye una nicotinamida sustituida o no sustituida. En otra realización, la modificación química puede ser una deleción o un reemplazo de un solo grupo, por ejemplo, para formar un análogo de tiobenzamida de la NA, todo ello apreciado por los expertos en química orgánica. El derivado en el contexto de la descripción también incluye el derivado de nucleósido de la NA (por ejemplo, nicotinamida-adenina). Se describen una variedad de derivados de NA, algunos también en relación con una actividad inhibidora de la enzima PDE4 (documentos WO03/068233; WO02/060875; GB2327675A), o como inhibidores de la tirosina cinasa del receptor de VEGF (documento WO01/55114). Por ejemplo, el proceso de preparación de derivados de 4-aril-nicotinamida (WO05/014549). Otros derivados de nicotinamida a modo de ejemplo se divulgan en los documentos WO01/55114 y EP2128244.

Los miméticos de nicotinamida incluyen formas modificadas de nicotinamida y análogos químicos de nicotinamida que recapitulan los efectos de la nicotinamida en la diferenciación y maduración de células del RPE a partir de células pluripotentes. Los miméticos de nicotinamida a modo de ejemplo incluyen ácido benzoico, ácido 3-aminobenzoico y 6-aminonicotinamida. Otra clase de compuestos que pueden actuar como miméticos de nicotinamida son los inhibidores de poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP). Los inhibidores de PARP a modo de ejemplo incluyen 3-aminobenzamida, iniparib (BSI 201), olaparib (AZD-2281), rucaparib (AG014699, PF-01367338), veliparib (Ab T-888), CEP 9722, MK 4827 y BMN-673.

Los agentes de diferenciación contemplados adicionales incluyen, por ejemplo, nogina, antagonistas de Wnt (Dkk1 o IWR1e), antagonistas nodales (Lefty-A), ácido retinoico, taurina, inhibidor de GSK3b (CHIR99021) e inhibidor de Notch (DAPT).

Según una realización particular, la diferenciación se efectúa de la siguiente manera:

a) cultivar las ESC en un medio que comprende un primer agente de diferenciación (por ejemplo, nicotinamida); y ^{b) cultivar las células obtenidas de la etapa a) en un medio que comprende un miembro de la superfamilia de TGF}p (por ejemplo, activina A) y el primer agente de diferenciación (por ejemplo, nicotinamida).

^{Preferiblemente, la etapa (a) se efectúa en ausencia del miembro de la superfamilia de TGF}p ^{(por ejemplo, activina} A).

En una realización, el medio en la etapa (a) está completamente desprovisto de un miembro de la superfamilia de ^TGFp^{. En otra realización, el nivel del miembro de la superfamilia de TGF}p ^{en el medio es inferior a 20 ng/ml, 10 ng/ml,} 1 ng/ml o incluso inferior a 0,1 ng/ml.

El protocolo descrito anteriormente puede continuarse cultivando las células obtenidas en la etapa b) en un medio que comprende el primer agente de diferenciación (por ejemplo, nicotinamida), pero sin un miembro de la superfamilia de ^TGFp ^{(por ejemplo, activina A). Esta etapa se denomina en el presente documento etapa (b*).}

El protocolo descrito anteriormente se describe ahora con más detalle, con realizaciones adicionales.

Etapa (a): el proceso de diferenciación se inicia una vez que se obtienen cantidades suficientes de ESC. Normalmente, se retiran del cultivo celular (por ejemplo, mediante el uso de colagenasa A, dispasa, TrypLE Select, EDTA) y se colocan en placas sobre un sustrato no adherente (por ejemplo, una placa de cultivo celular tal como Hydrocell o una placa de cultivo recubierta de agarosa, o placas de Petri bacteriológicas) en presencia de nicotinamida (y ausencia de activina A). Las concentraciones a modo de ejemplo de nicotinamida están entre 0,01-100 mM, 0,1-100 mM, 0,1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo 10 mM. Una vez que las células se colocan en placas sobre sobre el sustrato no adherente (por ejemplo, una placa de cultivo celular), el cultivo celular puede denominarse suspensión celular, preferiblemente agrupaciones flotantes libres en un cultivo en suspensión, es decir, agrupaciones de células derivadas de células madre embrionarias humanas (hESC) de referencia. Las agrupaciones de células no se adhieren a ningún sustrato (por ejemplo, placa de cultivo, soporte). Las fuentes de células madre flotantes libres se describieron previamente en el documento WO 06/070370. Esta fase puede efectuarse durante un mínimo de 1 día, más preferiblemente dos días, tres días, 1 semana o incluso 14 días. Preferiblemente, las células no se cultivan durante más de 3 semanas en suspensión junto con la nicotinamida, por ejemplo entre 0,01-100 mM, 0,1-100 mM, 0,1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo 10 mM (y en ausencia de activina A). En una realización, las células se cultivan durante 6-8 días en suspensión junto con la nicotinamida, por ejemplo entre 0,01-100 mM, 0,1-100 mM, 0,1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo 10 mM (y en ausencia de activina A).

Según una realización, cuando las células se cultivan en el sustrato no adherente, por ejemplo, placas de cultivo celular, las condiciones de oxígeno atmosférico son del 20%. Sin embargo, también se contempla la manipulación de las condiciones del oxígeno atmosférico de modo que el porcentaje de oxígeno atmosférico sea inferior al 20%, al 15%, al 10%, al 9%, al 8%, al 7%, al 6% o incluso inferior al 5% (por ejemplo, entre el 1% - 20%, el 1%-10% o el 0-5%).

Según una realización particular, las células se cultivan sobre el sustrato no adherente inicialmente en condiciones de oxígeno atmosférico normales y luego se reducen a condiciones de oxígeno atmosférico inferiores a las normales.

Los ejemplos de placas de cultivo celular no adherentes incluyen las fabricadas por Nunc (por ejemplo, n.° de cat. de Hydrocell 174912), etc.

Normalmente, las agrupaciones comprenden al menos 50-500.000, 50-100.000, 50-50.000, 50-10.000, 50-5000, 50­ 1000 células. Según una realización, las células en las agrupaciones no están organizadas en capas y forman formas irregulares. En una realización, las agrupaciones están desprovistas de células madre embrionarias pluripotentes. En otra realización, las agrupaciones comprenden pequeñas cantidades de células madre embrionarias pluripotentes (por ejemplo, no más del 5% o no más del 3% (por ejemplo, el 0,01-2,7%) de células que coexpresan OCT4 y TRA-1-60 al nivel de proteína). Normalmente, las agrupaciones comprenden células que se han diferenciado parcialmente bajo la influencia de nicotinamida. Tales células expresan principalmente marcadores precursores neurales y retinianos tales como PAX6, Rax, Six3 y/o CHX10.

Las agrupaciones pueden disociarse usando métodos enzimáticos o no enzimáticos (por ejemplo, mecánicos) conocidos en la técnica. Según una realización, las células se disocian de manera que ya no están en agrupaciones, por ejemplo, agregados o grupos de 2-100.000 células, 2-50.000 células, 2-10.000 células, 2-5000 células, 2­ 1000 células, 2-500 células, 2-100 células, 2-50 células. Según una realización particular, las células se encuentran en una suspensión celular individual.

A continuación, las células (por ejemplo, células disociadas) se colocan en placas sobre un sustrato adherente y se cultivan en presencia de nicotinamida, por ejemplo, entre 0,01-100 mM, 0,1-100 mM, 0,1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo 10 mM (y en ausencia de activina A). Esta fase puede efectuarse durante un mínimo de 1 día, más preferiblemente dos días, tres días, 1 semana o incluso 14 días. Preferiblemente, las células no se cultivan durante más de 3 semanas en presencia de nicotinamida (y en ausencia de activina). En un ejemplo de realización, esta fase se efectúa durante 6-7 días.

Según una realización, cuando las células se cultivan sobre el sustrato adherente, por ejemplo, laminina, las condiciones de oxígeno atmosférico son del 20%. Pueden manipularse de manera que el porcentaje sea inferior a aproximadamente el 20%, el 15%, el 10%, más preferentemente inferior al 9%, inferior al 8%, inferior al 7%, inferior al 6% y más preferiblemente de aproximadamente el 5% (por ejemplo, entre el 1% - 20%, el 1% -10% o el 0-5%).

Según una realización particular, las células se cultivan sobre el sustrato adherente inicialmente en condiciones de oxígeno atmosférico normales y luego se reducen a condiciones de oxígeno atmosférico inferiores a las normales.

Los ejemplos de sustratos adherentes incluyen, pero no se limitan a, fibronectina, laminina, poli-D-lisina, colágeno y gelatina.

Etapa (b): Tras la primera fase de diferenciación dirigida (etapa a; es decir, cultivo en presencia de nicotinamida (por ejemplo, entre 0,01-100 mM, 0,1-100 mM, 0,1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo 10 mM), las células parcialmente diferenciadas se someten a continuación a una fase de diferenciación adicional sobre un sustrato adherente: cultivo en presencia de activina A (por ejemplo, 0,01-1000 ng/ml, 0,1-200 ng/ml, 1 -200 ng/ml, por ejemplo, 140 ng/ml, 150 ng/ml, 160 ng/ml o 180 ng/ml). Por tanto, la activina A puede añadirse a una molaridad final de 0,1 pM-10 nM, 10 pM-10 nM, 0,1 nM-10 nM, 1 nM-10 nM, por ejemplo 5,4 nM.

También puede añadirse nicotinamida en esta fase (por ejemplo, entre 0,01-100 mM, 0,1-100 mM, 0,1-50 mM, 5­ 50 mM, 5-20 mM, por ejemplo 10 mM). Esta fase puede efectuarse de 1 día a 10 semanas, de 3 días a 10 semanas, de 1 semana a 10 semanas, de una semana a ocho semanas, de una semana a cuatro semanas, por ejemplo, durante al menos un día, al menos dos días, al menos al menos tres días, al menos 5 días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas, al menos seis semanas, al menos siete semanas, al menos ocho semanas, al menos nueve semanas, al menos diez semanas.

Según una realización específica, esta fase se efectúa durante aproximadamente dos semanas. Esta fase de diferenciación puede efectuarse en condiciones de oxígeno atmosférico bajas o normales, tal como se detalló anteriormente en el presente documento.

Etapa (b*): Tras la segunda fase de diferenciación dirigida (es decir, cultivo en presencia de nicotinamida y activina A sobre un sustrato adherente; etapa (b)), las células más diferenciadas se someten opcionalmente a una fase de diferenciación posterior sobre el sustrato adherente: cultivo en presencia de nicotinamida (por ejemplo, entre 0,01-100 mM, 0,1-100 mM, 0,1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo 10 mM), en ausencia de activina A. Esta fase puede efectuarse durante al menos un día, 2 días, 5 días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas o incluso cuatro semanas. Preferiblemente, esta fase se efectúa durante aproximadamente una semana. Esta fase de diferenciación también puede realizarse en condiciones de oxígeno atmosférico bajas o normales, tal se detalló anteriormente en el presente documento.

El medio básico en el que se diferencian las ESC es cualquier medio de cultivo celular conocido en la técnica para respaldar el crecimiento celular in vitro, normalmente, un medio que comprende una disolución de base definida, que incluye sales, azúcares, aminoácidos y cualquier otro nutriente requerido para el mantenimiento de las células en el cultivo en un estado viable. Según una realización particular, el medio básico no es un medio condicionado. Los ejemplos no limitativos de medios básicos comercialmente disponibles que pueden utilizarse según la invención comprenden Nutristem (sin bFGF ni TGFp para la diferenciación de ESC, con bFGF y TGFp para la expansión de ESC), Neurobasal™, KO-DMEM, DMEM, DMEM/F12, medio de crecimiento de células madre Cellgro™, o X-Vivo™. El medio básico puede complementarse con una variedad de agentes conocidos en la técnica relacionada con cultivos celulares. Lo siguiente es una referencia no limitativa a diversos complementos que pueden incluirse en el cultivo que va a usarse según la presente divulgación:

• suero o con un medio que contiene reemplazo de suero, tal como, sin limitarse a, reemplazo de suero con genes inactivados (KOSR), Nutridoma-CS, TCH™, N2, derivado de N2, o B27, o una combinación;

• un componente de la matriz extracelular (ECM), tal como, sin limitarse a, fibronectina, laminina, colágeno y gelatina. A continuación, la ECM puede usarse para transportar uno o más miembros de la superfamilia de factores de crecimiento TGFP;

• un agente antibacteriano, tal como, sin limitarse a, penicilina y estreptomicina; y

• aminoácidos no esenciales (NEAA),

• neurotrofinas que se sabe que desempeñan un papel en la promoción de la supervivencia de las ESC en cultivo, tales como, sin limitarse a, BDN^f , NT3, NT4.

Según una realización preferida, el medio usado para diferenciar las ESC es el medio Nutristem (Biological Industries, 06-5102-01-1A).

Según una realización particular, la diferenciación y expansión de ESC se efectúa en condiciones libres de componentes foráneos.

Según una realización, el medio de proliferación/crecimiento está desprovisto de contaminantes foráneos, es decir, libre de componentes derivados de animales tales como suero, factores de crecimiento derivados de animales y albúmina. Por tanto, según esta realización, el cultivo se realiza en ausencia de contaminantes foráneos.

Otros métodos para cultivar ESC en condiciones libres de componentes foráneos se proporcionan en solicitud de patente estadounidense n.° 20130196369.

Las preparaciones que comprenden células del RPE pueden prepararse según las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) (por ejemplo, las preparaciones cumplen con las BPF) y/o las Buenas Prácticas de Tejido (BPT) actuales (por ejemplo, las preparaciones pueden cumplir con las BPT).

Durante las fases de diferenciación, las células madre embrionarias pueden monitorizarse en cuanto a su estado de diferenciación. La diferenciación celular puede determinarse mediante el examen de marcadores específicos de células o tejidos que se sabe que son indicativos de diferenciación.

Los marcadores específicos de células/tejidos pueden detectarse usando técnicas inmunológicas bien conocidas en la técnica [Thomson JA et al., (1998). Science 282: 1145-7]. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo para marcadores unidos a la membrana o intracelulares, inmunohistoquímica para marcadores extracelulares e intracelulares e inmunoensayo enzimático para marcadores moleculares secretados.

Tras las fases de diferenciación descritas anteriormente en el presente documento, se obtiene una población mixta de células que comprende células tanto pigmentadas como no pigmentadas.

Según este aspecto de la presente descripción, las células de la población mixta de células se retiran de la placa.

En una realización, esto se efectúa enzimáticamente (por ejemplo, usando tripsina, (TrypLE Select)). Según este aspecto de la presente descripción, al menos el 10%, el 20%, el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70% de las células que se retiran del cultivo (y posteriormente se expanden) son células no pigmentadas.

En otra realización, esto se efectúa mecánicamente, por ejemplo, usando un raspador de células.

En aún otra realización, esto se efectúa químicamente (por ejemplo, EDTA).

También se contemplan combinaciones de tratamiento enzimático y químico, por ejemplo, EDTA y tratamiento enzimático.

Además, al menos el 10%, el 20% o incluso el 30% de las células que se retiran del cultivo (y posteriormente se expanden) son células pigmentadas.

Según este aspecto de la presente descripción, al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 100% de todas las células del cultivo se retiran (y posteriormente se expanden).

La expansión de la población mixta de células puede efectuarse en una matriz extracelular, por ejemplo, gelatina, colágeno I, colágeno IV, laminina (por ejemplo, laminina 521), fibronectina y poli-D-lisina. Para la expansión, las células pueden cultivarse en KOM libre de suero, medio que comprende suero (por ejemplo, DMEM con el 20% de suero humano) o medio Nutristem (06-5102-01-1A, Biological Industries). En estas condiciones de cultivo, después de realizar pases en condiciones adecuadas, la razón de células pigmentadas:células no pigmentadas aumenta de manera que se obtiene una población de células del RPE purificadas. Tales células muestran la morfología de forma poligonal característica y la pigmentación de las células del RPE.

En una realización, la expansión se efectúa en presencia de nicotinamida (por ejemplo, entre 0,01-100 mM, 0,1­ 100 mM, 0,1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, por ejemplo 10 mM) y en ausencia de activina A.

La población mixta de células puede expandirse en suspensión (con o sin un microportador) o en una monocapa. La expansión de la población mixta de células en cultivos monocapa o en cultivo en suspensión puede modificarse a una expansión a gran escala en biorreactores o multi/hiperapilamientos mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Según una realización, la fase de expansión se efectúa durante al menos una semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas, al menos 7 semanas, al menos 8 semanas, al menos 9 semanas o incluso 10 semanas. Preferiblemente, la fase de expansión se efectúa durante 1 semana -10 semanas, más preferiblemente 2 semanas -10 semanas, más preferiblemente 3 semanas -10 semanas, más preferiblemente 4 semanas -10 semanas, o 4 semanas - 8 semanas.

Según todavía otra realización, la población mixta de células se somete a pases al menos 1 vez durante la fase de expansión, al menos dos veces durante la fase de expansión, al menos tres veces durante la fase de expansión, al menos cuatro veces durante la fase de expansión, al menos cinco veces durante la fase de expansión, o al menos seis veces durante la fase de expansión.

Los presentes inventores han demostrado que cuando las células se recogen enzimáticamente, es posible continuar la expansión durante más de 8 pases, más de 9 pases e incluso más de 10 pases (por ejemplo, 11-15 pases). El número total de duplicaciones de células puede aumentarse hasta más de 30, por ejemplo, 31, 32, 33, 34 o más.

La población de células del RPE generada según los métodos descritos en el presente documento puede caracterizarse según varios parámetros diferentes.

Por tanto, por ejemplo, las células del RPE obtenidas pueden ser de forma poligonal y pigmentadas.

La recogida de la población expandida de células del RPE puede efectuarse usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, usando una enzima tal como tripsina, o usando químicamente EDTA, etc.).

Tras la recogida, la población expandida de células del RPE puede crioconservarse opcionalmente usando métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos de medios adecuados para la crioconservación incluyen, pero no se limitan a, el 90% de suero humano/el 10% de DMSO, CryoStor al 10%, al 5% y al 2%, Stem Cell Banker y Prime XV® FreezIS.

Se apreciará que las poblaciones de células divulgadas en el presente documento están desprovistas de células madre embrionarias humanas no diferenciadas. Según una realización, menos de 1:250.000 células son células Oct4+TRA-1-60+, tal como se mide mediante, por ejemplo, FACS. Las células también han regulado por disminución (en más de 5.000 veces) la expresión de GDF3 o ^t D^g F tal como se mide mediante PCR; véase, por ejemplo, la figura 10.

Las células del RPE de este aspecto de la presente descripción no expresan marcadores de células madre embrionarias. Tales uno o más marcadores de células madre embrionarias pueden comprender OCT-4, NANOG, Rex-1, fosfatasa alcalina, Sox2, TDGF-beta, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 y/o TRA-1-81.

Las preparaciones de células del RPE pueden estar sustancialmente purificadas, con respecto a las células que no son del RPE, que comprenden al menos aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% de células del RPE. La preparación de células del RPE puede estar esencialmente libre de células que no son del RPE o consistir en células del RPE. Por ejemplo, la preparación sustancialmente purificada de células del RPE puede comprender menos de aproximadamente el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2% o el 1% de tipos de células que no son del RPE. Por ejemplo, la preparación de células del RPE puede comprender menos de aproximadamente el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2%, el 1%, el 0,9%, el 0,8%, el 0,7%, el 0,6%, el 0,5%, el 0,4%, el 0,3%, el 0,2%, el 0,1%, el 0,09%, el 0,08%, el 0,07%, el 0,06%, el 0,05%, el 0,04%, el 0,03%, el 0,02%, el 0,01%, el 0,009%, el 0,008%, el 0,007%, el 0,006%, el 0,005%, el 0,004%, el 0,003%, el 0,002%, el 0,001%, el 0,0009%, el 0,0008%, el 0,0007%, el 0,0006%, el 0,0005%, el 0,0004%, el 0,0003%, el 0,0002% o el 0,0001% de células que no son del RPE.

Las preparaciones de células del RPE pueden ser sustancialmente puras, tanto con respecto a las células que no son del RPE como con respecto a las células del RPE de otros niveles de madurez. Las preparaciones pueden estar sustancialmente purificadas, con respecto a las células que no son del RPE, y enriquecidas en células del RPE maduras. Por ejemplo, en preparaciones de células del RPE enriquecidas en células del RPE maduras, al menos aproximadamente el 30%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99%, el 99% o el 100% de las células del RPE son células del RPE maduras. Las preparaciones pueden estar sustancialmente purificadas, con respecto a las células que no son del RPE, y enriquecidas en células del RPE diferenciadas en lugar de células del RPE maduras. Por ejemplo, al menos aproximadamente el 30%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% de las células del RPE pueden ser células del RPE diferenciadas en lugar de células del RPE maduras.

Las preparaciones descritas en el presente documento pueden estar sustancialmente libres de contaminación o infección bacteriana, viral o fúngica, incluyendo, pero sin limitarse a, la presencia de VIH 1, VIH 2, VHB, VHC, VHA, CMV, HTLV 1, HTLV 2, parvovirus B19, virus de Epstein-Barr, o virus del herpes 1 y 2, SV40, HHV5, 6, 7, 8, CMV, poliomavirus, VPH, Enterovirus. Las preparaciones descritas en el presente documento pueden estar sustancialmente libres de contaminación o infección por micoplasma.

Otra forma de caracterizar las poblaciones de células divulgadas en el presente documento es mediante la expresión de marcadores. Por tanto, por ejemplo, al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de las células expresan bestrofina 1, tal como se mide mediante inmunotinción. Según una realización, entre el 80-100% de las células expresan bestrofina 1.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF), tal como se mide mediante inmunotinción. Por ejemplo, entre el 80-100% de las células expresan MITF.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan tanto el factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF) como bestrofina 1, tal como se mide mediante inmunotinción. Por ejemplo, entre el 80-100% de las células coexpresan MITF y bestrofina 1.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan tanto el factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF) como ZO-1, tal como se mide mediante inmunotinción. Por ejemplo, entre el 80-100% de las células coexpresan MITF y ZO-1.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan tanto ZO-1 como bestrofina 1, tal como se mide mediante inmunotinción. Por ejemplo, entre el 80-100% de las células coexpresan ZO-1 y bestrofina 1.

Según otra realización, al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan el gen 6 de caja emparejada (PAX-6) tal como se mide mediante inmunotinción o FACS; véase, por ejemplo, la figura 11.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan la proteína de unión a retinaldehído celular (CRALBP), tal como se mide mediante inmunotinción. Por ejemplo, entre el 85-100% de las células expresan CRALBP.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan la proteína específica del epitelio pigmentario de la retina de 65 kDa (RPE65), tal como se mide mediante inmunotinción. Por ejemplo, entre el 80-100% de las células expresan RPE65.

Las células del RPE normalmente coexpresan marcadores indicativos de diferenciación terminal, por ejemplo, bestrofina 1, CRALBP y/o RPE65.

Tras la fase de expansión, se obtienen poblaciones de células que comprenden células del RPE de las que al menos el 70%, el 71%, el 72%, el 73%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99 o incluso el 100% de las mismas son CRALBP+PMEL17+.

Sería muy apreciado por los expertos en la técnica que la derivación de células del RPE es de gran beneficio. Pueden usarse como un modelo in vitro para el desarrollo de nuevos fármacos para promover su supervivencia, regeneración y función. Las células del RPE pueden servir para el cribado de alto rendimiento de compuestos que tienen un efecto tóxico o regenerativo en las células del RPE. Pueden usarse para descubrir mecanismos, nuevos genes, factores solubles o unidos a la membrana que son importantes para el desarrollo, la diferenciación, el mantenimiento, la supervivencia y la función de las células fotorreceptoras.

Las células del RPE también pueden servir como una fuente ilimitada de células del RPE para trasplante, reposición y soporte de células del RPE degeneradas o que funcionan mal en degeneraciones retinianas y otros trastornos degenerativos. Además, las células del RPE modificadas genéticamente pueden servir como vector para transportar y expresar genes en el ojo y la retina después del trasplante.

Las afecciones oculares para las que las células del RPE pueden servir como agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, enfermedades o trastornos retinianos generalmente asociados con disfunción de la retina, lesión de la retina y/o pérdida del epitelio pigmentario de la retina. Una lista no limitativa de afecciones que pueden tratarse según la invención comprende retinitis pigmentaria, amaurosis congénita de Lebers, degeneración macular hereditaria o adquirida, degeneración macular asociada a la edad (DMAE), DMAE seca, enfermedad de Best, desprendimiento de retina, atrofia girata, coroideremia, distrofia en patrón así como otras distrofias del RPE, enfermedad de Stargardt, daño al RPE y retiniano debido al daño provocado por una cualquiera de lesiones luminosas, por láser, inflamatorias, infecciosas, por radiación, neovasculares o traumáticas.

Los trastornos degenerativos a modo de ejemplo que pueden tratarse usando las células de este aspecto de la presente descripción incluyen trastornos neurodegenerativos que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Parkinson, ELA, esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, encefalomielitis autoinmunitaria, neuropatía diabética, enfermedad de Alzheimer y epilepsia.

Los sujetos que pueden tratarse incluyen primates (incluyendo humanos), caninos, felinos, ungulados (por ejemplo, equinos, bovinos, porcinos (por ejemplo, cerdos)), aves y otros sujetos. Los humanos y los animales no humanos que tienen importancia comercial (por ejemplo, ganado y animales domésticos) son de particular interés. Los mamíferos a modo de ejemplo que pueden tratarse incluyen caninos; felinos; equinos; bovinos; ovinos; roedores, etc., y primates, particularmente humanos. Pueden usarse modelos animales no humanos, particularmente mamíferos, por ejemplo, primates, murinos, lagomorfos, etc., para investigaciones experimentales.

Las células del RPE generadas tal como se describe en el presente documento pueden trasplantarse a diversos sitios diana dentro del ojo de un sujeto u otros lugares (por ejemplo, en el cerebro). Según una realización, el trasplante de las células del ^r P^e es al espacio subretiniano del ojo, que es la ubicación anatómica normal del RPE (entre los segmentos externos fotorreceptores y la coroides). Además, dependiendo de la capacidad migratoria y/o los efectos paracrinos positivos de las células, puede considerarse el trasplante a compartimentos oculares adicionales, incluyendo el espacio vítreo, la retina interna o externa, la periferia de la retina y dentro de la coroides.

El número de células viables que pueden administrarse al sujeto es habitualmente de entre 50.000 y 5*10® por inyección.

Las células normalmente se formulan en un portador (por ejemplo, una disolución isotónica y/o una solución salina) tal como BSS plus™. Otras disoluciones contempladas incluyen disoluciones de crioconservación tales como Cryostor 5 o Cryostor 2. El portador puede comprender opcionalmente factores adicionales que respaldan el injerto, la integración, la supervivencia, la potencia, etc., del RPE.

El trasplante puede realizarse mediante diversas técnicas conocidas en la técnica. Los métodos para realizar trasplantes de RPE se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.962.027, 6.045.791, y 5.941.250 y en Eye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol marzo de 1997; 235(3):149-58; Biochem Biophys Res Commun 24 de febrero de 2000; 268(3): 842-6; Opthalmic Surg febrero de 1991; 22(2): 102-8. Los métodos para realizar trasplantes de córnea se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.755.785 y en Eye 1995; 9 (Pt 6 Su):6-12; Curr Opin Opthalmol agosto de 1992; 3 (4): 473-81; Opthalmic Surg Lasers abril de 1998; 29 (4): 305­ 8; Ophthalmology abril de 2000; 107 (4): 719-24; y Jpn J Ophthalmol noviembre-diciembre de 1999; 43(6): 502-8. Si van a utilizarse efectos principalmente paracrinos, las células también pueden administrarse y mantenerse en el ojo encapsuladas dentro de un recipiente semipermeable, lo que también disminuirá la exposición de las células al sistema inmunitario del huésped (sistema de administración CNTF de Neurotech USA; PNAS 7 de marzo de 2006 vol. 103(10) 3896-3901).

La etapa de administración puede comprender la administración intraocular de las células del RPE a un ojo que lo necesita. La administración intraocular puede comprender la inyección de células del RPE en el espacio subretiniano.

Según una realización, el trasplante se realiza mediante cirugía de vitrectomía a través de la parte plana seguida de la administración de las células a través de una pequeña abertura retiniana al espacio subretiniano o mediante inyección directa.

Las células del RPE pueden trasplantarse de diversas formas. Por ejemplo, las células del RPE pueden introducirse en el sitio diana en forma de suspensión celular individual, con matriz o adheridas a una matriz o membrana, matriz extracelular o sustrato tal como un polímero biodegradable, o una combinación. Las células del RPE también pueden trasplantarse juntas (cotrasplante) con otras células de la retina, tal como con fotorreceptores.

La eficacia del tratamiento puede evaluarse mediante diferentes medidas de la función y estructura visual y ocular, incluyendo, entre otras, la mejor agudeza visual corregida (BCVA), la sensibilidad retiniana a la luz tal como se mide mediante perimetría o microperimetría en los estados de adaptación a la luz y a la oscuridad, electrorretinografía (ERG) de campo completo, multifocal, focal o de patrón), sensibilidad al contraste, velocidad de lectura, visión del color, examen biomicroscópico clínico, fotografía de fondo de ojo, tomografía de coherencia óptica (OCT), autofluorescencia de fondo de ojo (^fA ^f ), obtención de imágenes infrarrojas y multicolores, fluoresceína o angiografía ICG, óptica adoptiva y medios adicionales usados para evaluar la función visual y la estructura ocular.

Al sujeto pueden administrársele corticosteroides antes de, o al mismo tiempo que, la administración de las células del RPE, tales como prednisolona o metilprednisolona, Predforte.

Según otra realización, al sujeto no se le administran corticosteroides antes de, o al mismo tiempo que, la administración de las células del RPE, tales como prednisolona o metilprednisolona, Predforte.

Los fármacos inmunosupresores pueden administrarse al sujeto antes de, al mismo tiempo que y/o después del tratamiento.

El fármaco inmunosupresor puede pertenecer a las siguientes clases:

Glucocorticoides, citostáticos (por ejemplo, agente alquilante o antimetabolito), anticuerpos (policlonales o monoclonales), fármacos que actúan sobre las inmunofilinas (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimús o sirolimús). Los fármacos adicionales incluyen interferones, opioides, proteínas de unión a TNF, micofenolato y agentes biológicos pequeños.

Los ejemplos de fármacos inmunosupresores incluyen: células madre mesenquimatosas, anticuerpo policlonal contra globulina antilinfocítica (ALG), anticuerpo policlonal contra globulina antitimocítica (ATG), azatioprina, BAS1 L1X1MAB® (anticuerpo anti-receptor IL-2Ra), ciclosporina (ciclosporina A), DACLIZUMAB® (anticuerpo anti-receptor IL-2Ra), everolimús, ácido micofenólico, RITUX1MAB® (anticuerpo anti-CD20), sirolimús, tacrolimús y/o micofenolato de mofetilo.

Los antibióticos pueden administrarse al sujeto antes de, al mismo tiempo que y/o después del tratamiento. Los ejemplos de antibióticos incluyen Oflox, gentamicina, cloranfenicol, Tobrex, Vigamox o cualquier otra preparación antibiótica tópica autorizada para uso ocular.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a ± 10%.

Los términos “comprende”, “que comprende”, “ incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “que incluye pero no se limita a”.

El término “que consiste en” significa “que incluye y se limita a”.

El término “que consiste esencialmente en” significa que la composición, el método o la estructura pueden incluir componentes, etapas y/o partes adicionales, pero sólo si los componentes, las etapas y/o las partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, el método o la estructura reivindicados.

Tal como se usa en el presente documento, la forma en singular “un”, “una” y “el/la” incluye las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

Siempre que se indique un intervalo numérico en el presente documento, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las expresiones “que oscila/oscila entre” un primer número indicado y un segundo número indicado y “que oscila/oscila desde” un primer número indicado “hasta” un segundo número indicado se usan de manera intercambiable en el presente documento y pretenden incluir el primer y el segundo número indicados y todos los números fraccionarios e integrales entre ellos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “método” se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea determinada, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos o bien conocidos o bien desarrollados fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos por profesionales de las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “que trata” incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.

Se aprecia que determinadas características de la invención, que se describen, para mayor claridad, en el contexto de realizaciones independientes, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. A la inversa, diversas características de la invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como adecuadas en cualquier otra realización descrita de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención, tal como se delimitaron anteriormente y se reivindican en la sección de reivindicaciones a continuación, encuentran respaldo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de manera no limitativa.

Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías que se exponen en las patentes estadounidenses n.os 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; “Current Protocols in Immunology” volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a edición), Appleton and Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la bibliografía de patentes y científica, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D. and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D. and Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “ Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” volúmenes 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Se cree que los procedimientos en esos documentos se conocen bien en la técnica y se proporcionan por conveniencia del lector.

EJEMPLO DE REFERENCIA 1

Este ejemplo analiza el efecto de la selección no mecánica de células del RPE generadas tal como se describe a continuación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Generación de células del RPE: Las hESC HAD-C 102 con calidad según GMP libres de componentes foráneos se expandieron como colonias en hUCF CRD008 con calidad según GMP libres de componentes foráneos irradiadas que se sembraron en vitronectina humana recombinante (rhVTN). La expansión de hESC se llevó a cabo en presencia de medio Nutristem que contiene albúmina sérica humana además de los factores de crecimiento FGF básico y TGF beta (Biological Industries 05-100-1A). Luego, las hESC expandidas se transfirieron a un cultivo en suspensión para iniciar la diferenciación de manera dirigida en condiciones normales de O². Se formaron cuerpos esferoides (SB) y luego se colocaron en placas como un cultivo celular adherente en condiciones continuas de diferenciación dirigida hacia un destino neuronal y, posteriormente, hacia un destino celular del RPE (figura 1). Al final de la fase de diferenciación, las células se recogieron usando las dos técnicas siguientes y se expandieron 1) las áreas no pigmentadas se extirparon y eliminaron manualmente y las áreas de células pigmentadas restantes se recogieron enzimáticamente y 2) las células (pigmentadas y no pigmentadas) se recogieron enzimáticamente. A continuación, las células se sembraron y expandieron durante 3 pases en placas de cultivo celular cubiertas con rhGelatina según las instrucciones de fabricación en presencia y ausencia de nicotinamida o sobre laminina 521, colágeno I o colágeno IV. Las células se recogieron y crioconservaron en el pase 2 (P2) en un medio criogénico compuesto por el 90% de suero humano y el 10% de DMSO según el SOP actual, y en varios medios criogénicos con calidad según GMP libres de componentes foráneos y libres de suero (CryoStor CS5 y CS10, BioLife Solutions; Stem Cell Banker AMSBIO; Prime-XV FreeIS DMSO Free, Irvine Scientific; BI1 BI2 y BI3, Biological Industries).

RESULTADOS

Pureza del RPE CRALBP/PMEL17 a lo largo del proceso de producción: las hESC HAD-C 102 cultivadas en hUCF CRD008 sembradas en rhVTN se diferenciaron a RPE. Al final de la fase de diferenciación, las células cultivadas en laminina 511 se recogieron de dos maneras: 1) mecánicamente, en la que las áreas no pigmentadas/no poligonales se excluyeron mecánicamente y luego las áreas pigmentadas/poligonales se recogieron enzimáticamente mediante TrypLE Select y 2) enzimáticamente, en la que todos los cultivos que contenían células poligonales/pigmentadas y células no poligonales/no pigmentadas se trataron con TrypLE y se recogieron todas las células. A continuación, las células se sembraron para su expansión en rhGelatina con y sin nicotinamida (control) así como en otras matrices (laminina 521, colágeno I y colágeno IV). La evaluación de las células CRALBP+PMEL17+ para la medición de la pureza del RPE se realizó al final de la fase de diferenciación después del aislamiento enzimático y mecánico (controles en proceso, IPC, 5-7), en P0 (IPC 8) y en P2 después de la crioconservación (IPC 11). Tal como puede observarse en la figura 2 y en la tabla 1, el nivel de pureza del RPE CRALBP+PMEL17+ al final de la fase de diferenciación fue del 12,2% tras la recogida enzimática de todas las células (punto 5 del IPC) y del 26,91% tras el aislamiento mecánico de las células poligonales/pigmentadas (punto 7 del IPC). Las áreas de células no poligonales/no pigmentadas que se aislaron mecánicamente (punto 6 del IPC) contenían sólo el 2,58% de células doblemente positivas CRALBP+PMEL17+, tal como se esperaba. Después de un ciclo de expansión en diversas matrices (P0, punto 8 del IPC; dos etapas antes del final del proceso de producción), el nivel de células doblemente positivas CRALBP+PMEL17+ estaba en el intervalo del 28,86%-66,07% cuando todas las células se recogieron enzimáticamente y en el intervalo del 64,33%-83,02% cuando las células poligonales/pigmentadas se aislaron mecánicamente. Después de dos ciclos de expansión, en P1 (punto 9 del IPC), no hubo mayor diferencia en el nivel de pureza del RPE CRALBP+PMEL17+ en cultivos que se originaron a partir de células tratadas mecánica y enzimáticamente, especialmente cuando las células se sembraron en colágeno I (el 95,20% en células recogidas enzimáticamente y el 97,99% en células recogidas mecánicamente), colágeno IV (el 95,02% en células recogidas enzimáticamente y el 96,68% en células recogidas mecánicamente) y laminina 521 (el 94,91% en células recogidas enzimáticamente y el 96,41% en mecánicamente). Se observaron resultados similares en P2 (producto terminado, punto 11 del IPC), especialmente cuando las células al final del proceso de diferenciación se crioconservaron en CryoStor al 5% (para más detalles, véanse las figuras 2 y 3 y la tabla 1).

Tabla 1: Nivel de células CRALBP+PMEL17+ a lo largo del proceso de producción.

DS, principio activo; DP, producto terminado; IPC, control en proceso; NA, no aplicable; ND, no realizado; P, pase.

Secreción de PEDF y medición de potencia a lo largo del proceso de producción:

El factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), que se sabe que se secreta de las células del RPE, se midió en el medio de cultivo celular en diversos puntos del IPC a lo largo de la fase de expansión del proceso de producción. Tal como puede observarse en la tabla 2, la secreción de PEDF al final de P0 (punto 8 del IPC) estaba en el intervalo de 1.846-2.698 ng/ml/día en cultivos celulares que se originaron a partir de células poligonales/pigmentadas aisladas mecánicamente cultivadas en diversas matrices. En cultivos celulares que se originaron a partir de células recogidas enzimáticamente que se cultivaron en diversas matrices, el intervalo fue de 212-1.113 ng de PEDF/ml/día. Al final de P1 (punto 9 del IPC; después de dos ciclos de expansión), el nivel de PEDF secretado estaba en el intervalo de 7.779­ 13.067 ng/ml/día en cultivos celulares que se originaron a partir de células pigmentadas aisladas mecánicamente cultivadas en diversas matrices. En cultivos celulares que se originaron a partir de células recogidas enzimáticamente que se cultivaron en diversas matrices, el intervalo fue de 4.251-9.347 ng de PEDF/ml/día.

Al final de P2 antes de la crioconservación (principio activo, punto 10 del IPC), la secreción de PEDF fue similar en los dos grupos de tratamiento (es decir, cultivos celulares que se originaron a partir de células poligonales/pigmentadas aisladas mecánicamente y células recogidas enzimáticamente).

Tabla 2 - Secreción de PEDF a lo largo del proceso de producción.

DS, principio activo; DP, producto terminado; IPC, control en proceso; NA, no aplicable; ND, no realizado; P, pase; TBD: a determinar.

Las uniones estrechas generadas entre las células del RPE permiten la generación de la barrera hematorretiniana y una secreción polarizada de PEDF y VEGF. El PEDF se secreta en el lado apical donde actúa como un factor de crecimiento antiangiogénico y neurotrópico. El VEGF se secreta principalmente en el lado basal donde actúa como un factor de crecimiento proangiogénico en el endotelio coroideo. La polarización del RPE (función de barrera y secreción polarizada de PEDF y VEGF) se midió en un sistema Transwell al final de P0 (punto 8 del IPC) en células que al final del proceso de producción se aislaron mecánicamente o se recogieron enzimáticamente y se expandieron en laminina 521. Tal como puede observarse en la tabla 3, se demostró la función de barrera/resistencia eléctrica transepitelial (TEER), así como la secreción polarizada de PEDF y VEGF.

Tabla 3 - Resultados de polarización a lo largo del proceso de producción.

Evaluación de morfología a lo largo del proceso de producción: se analizó la morfología de las células en diversos puntos a lo largo del proceso de producción (figura 4). Al final de la fase de diferenciación antes del tratamiento mecánico o enzimático de los pocillos de cultivo celular (punto 5 del IPC), se estimó el área relativa de células poligonales/pigmentadas en cada pocillo. El 45% ± 9% (promedio ± DE, n = 3 pocillos de una placa de 6 pocillos) del área se cubrió con células poligonales/pigmentadas (véanse las imágenes representativas en la figura 4). Tal como se indicó anteriormente, las áreas de células pigmentadas/poligonales se seleccionaron negativamente después de la extirpación manual de áreas/células no pigmentadas/no poligonales a partir de algunos de los pocillos de cultivo celular y se recogieron enzimáticamente de los otros pocilios de cultivo celular. Las células recogidas mecánica y enzimáticamente se expandieron en diferentes matrices [rhGelatina con y sin (control) nicotinamida, laminina 521, colágeno I y colágeno IV] y se analizó su morfología al final de P0 (punto 8 del IPC), P1 (punto 9 del IPC) y P2 (punto 10 del IPC). La morfología al final de la fase de expansión P0 demostró un cultivo densamente empaquetado con una morfología de monocapa epitelial de forma poligonal típica en los cultivos celulares que se originaron a partir de células poligonales/pigmentadas seleccionadas mecánicamente y cultivadas en las diversas matrices. En los cultivos celulares que se originaron a partir de células recogidas enzimáticamente, la mayoría de las áreas demostraron esta morfología típica, mientras que otras áreas contenían células con morfología diferente. Al final de P1 y P2, los cultivos que se originaron a partir de células tratadas mecánica y enzimáticamente demostraron una morfología consistente similar de monocapa epitelial de forma poligonal densamente empaquetada (figura 4).

Viabilidad y vitalidad posterior a la crioconservación: al final del proceso de producción, las células recogidas de los tratamientos mecánicos y enzimáticos que se expandieron en diversas matrices [rhGelatina con y sin (control) nicotinamida, colágeno I, colágeno IV y laminina 521] durante 3 pases se recogieron y crioconservaron en diversos medios de crioconservación con calidad según GMP libres de componentes foráneos/animales, descritos en la tabla 4, a 1,5x106 y 10x106 células/ml/vial.

Tabla 4A: Crioconservación de células al final del proceso de producción.

La viabilidad posterior a la descongelación (punto 11 del IPC) y la vitalidad de las células descongeladas un día después de la siembra se evaluaron mediante recuento celular (usando el ensayo de exclusión con azul de tripano o el contador de células Chemometec NC-200) y Tox8 (Sigma R-6892). Brevemente, las células del producto terminado posteriores a la descongelación se sembraron en una placa de 96 pocillos, por triplicado, a una densidad de 0,2x106 células viables/pocillo en un volumen final de 0,2 ml de DMEM que contenía suero humano al 20% por pocillo, durante 24 horas a 37°C y el 5% de CO². Al final del periodo de incubación, el cultivo se evaluó mediante Tox8 (Sigma R-6892) según las instrucciones del fabricante y luego se lavaron las células con PBS, y después del tratamiento con TrypLE Select, se enumeraron con el contador de células NC-200. A continuación, se calculó el porcentaje de vitalidad dividiendo el número promedio de células adheridas viables entre el número total de células sembradas por pocillo y multiplicándolo por 100.

La viabilidad posterior a la descongelación fue similar para las células aisladas mecánicamente y las células recogidas enzimáticamente que se expandieron en las diversas matrices [rhGelatina con y sin (control) nicotinamida, colágeno I, colágeno IV y laminina 521] y se crioconservaron en el 90% de suero humano que contenía el 10% de DMSO. (control; figura 5a , barras azules) o en CryoStor al 5% (CS; figura 5A, barras rojas), aunque la viabilidad posterior a la descongelación de las células expandidas en rhGelatina con nicotinamida fue ligeramente mejor. Aunque la viabilidad posterior a la descongelación fue similar en todos los grupos de tratamiento, la vitalidad fue significativamente mejor cuando las células se crioconservaron en CryoStor al 5% (figuras 5B y 5C, barras rojas) en comparación con las células crioconservadas en el 90% de suero humano que contenía el 10% de DMSO (figuras 5B y 5C, barras azules).

La evaluación de la viabilidad celular posterior a la descongelación y la vitalidad de las células aisladas mecánicamente que se expandieron en rhGelatina con nicotinamida y se crioconservaron en los diversos medios de congelación (el 90% de suero humano que contenía el 10% de DMSO, CryoStor al 5%, Biological Industries Solutions 1-3, Prime XV y Stem Cell Banker) mostró que CryoStor al 5% tiene una ventaja significativa sobre los otros medios criogénicos con una viabilidad posterior a la descongelación y una vitalidad después de 24 horas en cultivo del 92% y del 70,7%, respectivamente (figuras 6A y 6C, respectivamente). La viabilidad y la vitalidad de las células aisladas mecánicamente que se expandieron en rhGelatina con nicotinamida y se crioconservaron en SCB fueron del 83% y del 67%, respectivamente.

Rendimiento celular al final de la producción: al final de la fase de diferenciación, se contaron las células aisladas mecánicamente y las células recogidas enzimáticamente y se sembraron números similares de células viables por pocillo durante 3 ciclos de expansión en diversas matrices [rhGelatina con y sin (control) nicotinamida, colágeno I, colágeno IV y laminina 521]. Al final de cada pase, se midió el número de células por pocillo, así como el número acumulado de células, suponiendo que se sembraron todas las células recogidas en cada etapa. Tal como se muestra en la figura 7A, cuando las células se aislaron mecánicamente, el mayor rendimiento se logró cuando las células se expandieron en rhGelatina con nicotinamida. Cuando las células se aislaron enzimáticamente, el mayor rendimiento se logró cuando las células se expandieron en laminina 521 (figura 7B).

EJEMPLO DE REFERENCIA 2

Este ejemplo analiza el efecto de la selección no mecánica de células del RPE generadas tal como en el ejemplo 1, en un proceso de producción repetido.

MATERIALES Y MÉTODOS

Generación de células del RPE: las hESC HAD-C 102 con calidad según GMP libres de componentes foráneos se expandieron como colonias en hUCF CRD008 con calidad según GMP libres de componentes foráneos irradiadas que se sembraron en gelatina humana recombinante. La expansión de hESC se llevó a cabo en presencia de medio Nutristem que contiene albúmina sérica humana además de los factores de crecimiento FGF básico y TGF beta (Biological Industries 05-100-1A). Luego, las hESC expandidas se transfirieron a un cultivo en suspensión para iniciar la diferenciación de manera dirigida en condiciones de bajo contenido de O² (5%). Se formaron cuerpos esferoides (SB) y luego se colocaron en placas como un cultivo celular adherente en condiciones continuas de diferenciación dirigida hacia un destino neuronal y, posteriormente, hacia un destino celular del RPE (figura 1B). Al final de la fase de diferenciación, las células se recogieron usando las siguientes dos técnicas y se expandieron 1) las áreas no pigmentadas se extirparon y eliminaron manualmente y las áreas de células pigmentadas restantes se recogieron enzimáticamente y 2) todas las células (pigmentadas y no pigmentadas) se recogieron enzimáticamente. A continuación, las células se sembraron y expandieron durante 3 pases en placas de cultivo celular cubiertas con rhGelatina según las instrucciones de fabricación. Las células se recogieron y se crioconservaron en el pase 2 (P2) en un medio criogénico compuesto por el 90% de suero humano y el 10% de DMSO, y en diversos medios criogénicos con calidad según GMP libres de componentes foráneos y libres de suero (CryoStor con el 5% de DMSO (CS5) y el 2% de DMSO (CS2), BioLife Solutions).

En algunos experimentos, la fase de expansión se prolongó hasta 11 pases.

Evaluación por FACS del % de células que coexpresan CRALBP y PMEL17: se evaluó la coexpresión de CRALBP y PMEL17 en células en diversos puntos de control en proceso a lo largo del proceso de producción. Las células se tiñeron con tinte de viabilidad fijable FVS450 (BD, n.° de cat. 562247), se fijaron con metanol al 80% y se inmunotiñeron conjuntamente con anticuerpo primario de ratón anti-CRALBP (clon B2, n.° de cat. de Abcam ab15051) o su control de isotipo (IgG2a de ratón; n.° de cat. de Abcam ab170191) y anticuerpo monoclonal de conejo anti-PMEL17 humana (clon EPR4864, n.° de cat. de Abcam ab137062) o su control de isotipo (IgG monoclonal de conejo; n.° de cat. de Abcam ab172730) seguido de los anticuerpos secundarios de cabra anti-IgG de ratón (n.° de cat. de Dako F0479) y de cabra anti-IgG de conejo (n.° de cat. de Jackson 111-606-144), respectivamente. La adquisición de datos de FACS se realizó con el citómetro de flujo Navios (Beckman Coulter) y el análisis se realizó con el software FCS Express 4.

Evaluación por FACS del % de células que expresan PAX6: se evaluó la expresión de PAX6 en células en diversos puntos de control en proceso a lo largo del proceso de producción. Las células se tiñeron con tinte de viabilidad fijable FVS450 (BD, n.° de cat. 562247), se fijaron con tampón de fijación (BD n.° de cat. 554655) y se permeabilizaron con tampón de permeabilización III (BD, n.° de cat. 558050) y se inmunotiñeron con anticuerpo de ratón anti-PAX6 humana (BD, n.° de cat. 562249). La adquisición de datos de FACS se realizó con el citómetro de flujo Navios (Beckman Coulter) y el análisis se realizó con el software FCS Express 4.

Evaluación por FACS del % de células que coexpresan Oct4 y TRA-1-60: se evaluó la coexpresión de Oct4 y TRA-1-60 en células en diversos puntos de control en proceso a lo largo del proceso de producción. Las células se tiñeron con tinte de viabilidad fijable FVS450 (BD, n.° de cat. 562247), se fijaron y permeabilizaron con el conjunto de tampones de factor de transcripción de fijación/permeabilización (BD, n.° de cat. 562574) y se inmunotiñeron con anticuerpo de ratón anti-Oct3/4 humana (BD, n.° de cat. 562252) y anticuerpo de ratón anti-TRA-1-60 humana (BD, n.° de cat.

560193). La adquisición de datos de FACS se realizó con el citómetro de flujo Navios (Beckman Coulter) y el análisis se realizó con el software FCS Express 4. El límite de detección del ensayo es del 0,004% y el límite de cualificación del 0,001%.

Inmunotinción de bestrofina 1, MITF y ZO-1: las células del producto terminado de OpRegen se descongelaron, se cultivaron durante 24-30 días y luego se fijaron (PFA al 4%) y se permeabilizaron (usando Triton X-100 al 0,2% en PBS que contenía suero de burro normal al 5%). Las células se tiñeron conjuntamente con anticuerpo de ratón antibestrofina 1 humana (Novus Biologicals, n.° de cat. NB300-164) y anticuerpo de conejo anti-ZO-1 humana (Invitrogen, n.° de cat. 61-7300), así como con anticuerpo de ratón anti-MITF humana (Thermo Fisher Scientific/Neomarkers, n.° de cat. MS772-P1) y anticuerpo de conejo anti-ZO-1 humana. Las células se lavaron y se inmunotiñeron con los anticuerpos secundarios de burro anti-IgG de conejo (Jackson, n.° de cat. 711-546-152) y de burro anti-IgG de ratón (Jackson, n.° de cat. 715-606-151). Las células se lavaron y se montaron usando Vectashield DAPI (Vector Laboratories, n.° de cat. H-1200) y medio de montaje de fluorescencia (DAKO, n.° de cat. S3023). Se añadió DAPI como tinción contranuclear para la medición del número total de células. Se tomó una imagen confocal guiada por software con un aumento 10x (Olympus IX82 controlada por el software FluoView) del centro de cada pocillo de cultivo celular inmunoteñido y se analizaron un mínimo de 500 células positivas para DAPI de cada imagen para determinar la expresión de bestrofina 1 y MITF. Se calculó el porcentaje de células positivas para bestrofina 1 y MlTF.

Medición por ELISA del nivel de proteínas secretadas

El medio de cultivo celular se recogió en diversos puntos de control en proceso a lo largo del proceso de producción. La evaluación del nivel de proteínas secretadas se realizó según las instrucciones del fabricante usando los kits de ELISA indicados en la tabla 4B a continuación.

Tabla 4B

Evaluación del consumo de glucosa y la producción de lactato: el medio de cultivo celular se recogió en diversos puntos de control en proceso a lo largo del proceso de producción. Los niveles de glucosa y lactato se midieron con un medidor Accutrend Plus (Cobas) con tiras precalibradas para glucosa (Cobas, n.° de cat. 11447475) y lactato (Cobas, n.° de cat. 03012654).

Evaluación de la función de barrera y la secreción polarizada de PEDF y VEGF: el producto terminado de OpRegen se descongeló y se cultivó durante 14 días en presencia de nicotinamida. Luego, las células se transfieren a un Transwell (Costar 3460, 0,4 |im) durante 4 semanas adicionales, durante las cuales se midió la resistencia transepitelial (TEER; función de barrera) y se recogió semanalmente el medio de las cámaras superior e inferior del Transwell para evaluar la secreción de PEDF y VEGF. Se notifican las razones de secreción de PEDF apical con respecto a basal y de secreción de VEGF basal con respecto a apical.

RESULTADOS

En la tabla 5 se presenta una liberación de lotes de las células del producto terminado generadas tal como se describió anteriormente.

Tabla 5

* Cuando la TEER es > 100 Q, se espera la secreción polarizada de PEDF y VEGF; BLOD: por debajo del límite de detección (es decir, por debajo del 0,004%).

Las células que se sometieron a aislamiento mecánico demostraron perfiles similares de glucosa y lactato durante su expansión en comparación con las células que se recogieron enzimáticamente; véase la figura 12.

Tinción de M ITFy bestrofina 1: la expresión de MITF y bestrofina 1 se analizó en células del producto terminado. Tal como puede observarse en la figura 8, las células del RPE generadas sin aislamiento mecánico expresaron MITF y bestrofina 1 en la misma medida que las células del RPE generadas usando el mismo proceso de diferenciación, pero con aislamiento mecánico. Los resultados se cuantifican en la tabla 6 a continuación en el presente documento.

Tabla 6

Pureza del RPE CRALBP/PMEL17 a lo largo del proceso de producción: la evaluación de células CRALBP+PMEL17+ para medir la pureza del RPE se realizó al final de la fase de diferenciación después de la recogida enzimática de todas las células y el aislamiento mecánico de las células poligonales/pigmentadas (controles en proceso, IPC, 5-7), en P0 (IPC 8) y en P2 tras la crioconservación (producto terminado, IPC 11).

Los resultados se ilustran en la figura 9 y se resumen en la tabla 7 a continuación.

Tabla 7

Medición de hESC no diferenciadas a lo largo del proceso de producción: el análisis por FACS se llevó a cabo para analizar la extensión de las hESC no diferenciadas residuales (Oct4+ TRA-1-60+) en las células del RPE.

Los resultados se resumen en la tabla 8 y se presentan en la figura 10.

Tabla 8

BLOD: por debajo del límite de detección (es decir, por debajo del 0,004%).

Secreción de factores a lo largo del proceso de producción: se midió la secreción de PEDF, TIMP-2, sgp130 y sTNF-R1 a lo largo del proceso de producción. Los resultados se ilustran en la tabla 9 a continuación.

Tabla 9

Se midió la secreción de VEGF, angiogenina, TIMP-1 y MIF a lo largo del proceso de producción. Los resultados se ilustran en la tabla 10 a continuación.

Tabla 10

Se midió la secreción de VEGF, angiogenina, TIMP-1 y MIF a lo largo del proceso de producción. Los resultados se ilustran en la tabla 11 a continuación.

Tabla 11

Medición de células Pax6+ a lo largo del proceso de producción: se llevó a cabo un análisis de FACS para analizar el porcentaje de células Pax6+.

Los resultados se resumen en la tabla 12 y se presentan en la figura 11.

Tabla 12

Rendimiento celular al final de la producción: al final de la fase de diferenciación, se contaron las células aisladas mecánicamente y las células recogidas enzimáticamente y se sembraron números similares de células viables por pocillo hasta los ciclos de expansión en rhGelatina. Al final de cada pase, se midió el número de células, así como el número acumulado de células, suponiendo que se sembraron todas las células recogidas en cada etapa. Tal como se muestra en la tabla 13, las células aisladas enzimáticamente demostraron un mayor rendimiento celular y un mayor número de duplicaciones de células totales.

Tabla 13

* Las células no pudieron expandirse más.

Estos datos demuestran que, cuando todas las células se recogen enzimáticamente, la fase de expansión puede prolongarse.

Aunque la invención se ha descrito junto con realizaciones específicas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Por consiguiente, se pretende que la invención abarque todas las alternativas, modificaciones y variaciones que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no se interpretará como una admisión de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención. En la medida en que se usen títulos de sección, no deben interpretarse como necesariamente limitativos.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i. Método para generar células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), que comprende:

   (a) cultivar una población de células madre pluripotentes humanas en un medio que comprende un agente de diferenciación para obtener células en diferenciación;

   (b) cultivar dichas células en diferenciación en un cultivo que comprende un medio que comprende uno o más miembros de la superfamilia de TGFp, generando así una población mixta de células que comprende células del RPE;

   (c) retirar enzimáticamente al menos el 50% de dicha población mixta de células a partir de dicho cultivo sin aislamiento mecánico de las células, en el que más del 10% de las células de dicha población mixta de células son células no pigmentadas; y posteriormente;

   (d) cultivar dicha población mixta de células sobre una superficie adherente para generar una población expandida de células del RPE; y

   (e) recoger dicha población expandida de células del RPE, generando así las células del RPE.
2. 2. Método según la reivindicación 1, que comprende además expandir dichas células madre pluripotentes humanas antes de la etapa (a).
3. 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que más del 70% de las células de dicha población expandida de células del RPE son CRALBP+PMEL17+.
4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha superficie adherente se selecciona del grupo que consiste en gelatina, laminina, fibronectina, colágeno I y colágeno IV.
5. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho cultivo de dicha población de células sobre dicha superficie adherente se efectúa durante al menos 3 semanas.
6. 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho cultivo de dicha población de células sobre dicha superficie adherente se efectúa durante más de 8 pases.
7. 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha población expandida de células del RPE ha experimentado más de 30 duplicaciones de células.
8. 8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además crioconservar dichas células del RPE después de la etapa (e).
9. 9. Método según la reivindicación 8, en el que dicha crioconservación se efectúa en un medio seleccionado del grupo que consiste en el 90% de suero humano/el 10% de DMSO, CryoStor al 2%, CryoStor al 5% y CryoStor al 10%, y Stem Cell Banker.
10. 10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dichas células madre pluripotentes humanas comprenden células madre embrionarias humanas.
11. 11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho agente de diferenciación comprende nicotinamida.
12. 12. Método según la reivindicación 11, en el que dicho medio de la etapa (a) está desprovisto de activina A.
13. 13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho miembro de la superfamilia de TGFp se selecciona del grupo que consiste en TGFp1, TGFp3 y activina A.
14. 14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho medio de la etapa (b) comprende nicotinamida y activina A.