KR20110099353A

KR20110099353A - 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법

Info

Publication number: KR20110099353A
Application number: KR1020100018312A
Authority: KR
Inventors: 윤태기; 이동율; 임정은
Original assignee: 의료법인 성광의료재단
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2011-09-08

Abstract

본 발명은 정소로부터 유래된 세포를 역분화시켜 수득한 전분화능 정원줄기세포에 유전자를 도입하고 분화시키는 단계를 포함하는 형질전환된 정자의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법은 (ⅰ) 전분화능 정원줄기세포에 목적하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 도입하여 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 레티노인산(retinoic acid, RA)이 포함된 배양액에서 배양하여 생식세포로 분화시키는 단계; 및, (ⅲ) 분화된 생식세포를 수컷 동물의 정소내 세정관에 이식하고, 상기 수컷 동물을 6 내지 12주동안 사육하는 단계를 포함한다. 본 발명의 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법을 이용하면, 형질전환 동물의 생산효율을 향상시킬 수 있으므로, 형질전환 동물의 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법{Method for Manufacturing Transformed Sperm Employing Pluripotent Spermatogonial Stem Cells}

본 발명은 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 정소로부터 유래된 세포를 역분화시켜 수득한 전분화능 정원줄기세포에 유전자를 도입하고 분화시키는 단계를 포함하는 형질전환된 정자의 생산방법에 관한 것이다.

배아줄기세포(embryonic stem cell)는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로서 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지녔으나 아직 분화되지 않은 세포를 의미하고, 모든 조직의 세포로 분화할 수 있기 때문에, 적절한 분화환경이 주어지게 되면 생식세포인 난자유사체나 정자로 분화될 수 있다고 알려져 있다(참조: Hubner, K. et al., Science, 300:1251-1256, 2003; Geijsen, N. et al., Nature, 427:148-154, 2004). 특히, 일차적으로 생식세포계통으로의 분화에 이어 정소내로 치환할 경우에는 생식능력을 가진 정자의 생산이 가능하다(참조: Toyooka, Y. et al., PNAS, 100:11457-11462, 2003).

한편, 전분화능 정원줄기세포주는 정자만을 생산할 수 있는 단분화능(unipotent) 정원줄기세포로부터 역분화된 세포로서 기존의 전분화능 배아줄기세포와 매우 유사한 형태와 특성을 가지고 있다. 상기 전분화능 정원줄기세포주는 실험실적 조건(in vitro)에서는 3배엽성세포로 분화시킬 수 있어, 재생의학을 위한 새로운 환자 맞춤형 세포치료제로서의 가능성을 가지고 있다고 보고되었다(참조: Kanatsu-Shinohara, M. et al., Cell, 119:1001-1012, 2004; Guan, K. et al., Nature, 440:1199-1203, 2006; Conrad, S. et al., Nature, 456:344-349, 2008). 아울러, 전분화능 정원줄기세포는 그들의 유전체의 조작이 가능하고, 배아 내에 이식되었을 때 생식계통으로 전이(germ-line transmission)시킬 수 있어, 배아줄기세포와 유사하게 형질전환동물을 생산하는 방법에도 적용할 수 있다고 보고되었다(참조: Takehashi, M. et al., Developmental biology, 312:344-352, 2007). 그러나, 전분화능 정원줄기세포주는 강력한 전분화능을 가지고 있어, 성체의 정소내로 도입될 경우, 생식세포로 분화되기 전에 기형종을 형성하고, 상기 기형종으로 인하여 도입된 정소가 생식세포로서의 특성을 상실한다고 보고되었다(참조: Kanatsu-Shinohara, M. et al., PNAS, 103:8018-8023, 2006).

따라서, 전분화능 정원줄기세포의 특성이 배아줄기세포와 유사하고, 이에 더불어 역분화가 일어났더라도 생식세포로서의 특성이 유지된다면 형질전환 정자의 생산효율은 더욱 높을 수 있을 것으로 예측되므로, 상기 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 정원줄기세포를 형질전환시키고, 이를 생식세포로 체외에서 분화시킨 후에, 성체의 정소로 도입할 경우, 정원줄기세포주의 전분화능에 의한 기형종이 생성되지 않고, 형질전환 정자를 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법은 (ⅰ) 전분화능 정원줄기세포에 목적하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 도입하여 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 레티노인산(retinoic acid, RA)이 포함된 배양액에서 배양하여 생식세포로 분화시키는 단계; 및, (ⅲ) 분화된 생식세포를 수컷 동물의 정소내 세정관에 이식하고, 상기 수컷 동물을 6 내지 12주동안 사육하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 전분화능 정원줄기세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 정소내의 단분화능 정원줄기세포를 역분화시켜서 수득하는 것을 사용함이 바람직하고, 상기 레티노인산의 농도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 0.1ng/ml임이 바람직하며, 상기 배양액은 특별히 이에 제한되지 않으나, EB 배양액을 사용함이 바람직하다.

본 발명의 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법을 이용하면, 형질전환 동물의 생산효율을 향상시킬 수 있으므로, 형질전환 동물의 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 전분화능 정원줄기세포주에서 발현되는 전분화능 줄기세포의 마아커의 발현양상을 나타내는 사진이다.
도 2는 배아줄기세포와 전분화능 정원줄기세포, 생쥐 태아섬유세포, 서르토리세포, 정원줄기세포에서의 miRNA발현 양상을 나타내는 그래프이다.
도 3은 Cs-CDF-CG-PRE 플라스미드의 벡터맵을 나타내는 모식도이다.
도 4는 전분화능 정원줄기세포의 생식세포계통으로의 분화효율을 비교한 그래프이다.
도 5는 이식된 SCID 생쥐의 부고환 내에서 관찰된 형질전환(GFP-발현) 정자를 나타내는 현미경사진이다.

본 발명자들은 본 발명자들은 전분화능 정원줄기세포를 이용하여 형질전환 정자를 생산하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 전분화능 정원줄기세포의 강력한 전분화능은 정소내에서 기형종을 형성할 수 있으나, 상기 전분화능 정원줄기세포를 일단 생식세포로 분화시키고, 이를 정소에 이식하면 기형종이 전혀 형성되지 않을 것이라 예상하였다.

이를 확인하기 위하여, GFP를 발현하도록 형질전환된 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포를 각각 생식세포로 분화시킨 후에 이를 정소내의 세정관에 이식하여, 각각의 정자를 생산한 다음, 이를 암컷에게 주입하여 수정을 유도하였다. 그 결과, 배아줄기세포로부터 유래된 정자보다는 전분화능 정원줄기세포로부터 유래된 정자에 의하여, 포배로의 발생율이 증가함을 알 수 있었다.

이러한 결과는 같은 전분화능을 가진 줄기세포임에도 불구하고 전분화능 정원줄기세포가 배아줄기세포에 비해 발생능력이 뛰어난 정자를 생산할 수 있으며, 이러한 점은 전분화능 정원줄기세포가 생식세포의 특성을 유지하고 있음에서 기인하는 것이라고 유추할 수 있었으므로, 형질전환 정자를 이용한 형질전환동물의 생산에는 전분화능 정원줄기세포가 보다 적합하며, 향후 이 기술을 통해 형질전환동물의 생산 효율을 보다 증진할 수 있다는 점을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 전분화능 정원줄기세포주의 수득

1단계: 생후 5일령 된 ICR 생쥐로부터 얻은 정소로부터 백막을 제거하고, 5mg/ml collagenase(Type IV), 10μg/ml DNase I 및 1mg/ml 히알루로니다제(hyaluronidase)가 들어있는 완충용액에 5분간 37℃에서 저속으로 교반하여 정소로부터 단세포를 분리하였다.

상기 분리된 단세포들을 PBS로 세척하고 용해완충용액을 가하여 적혈구를 제거하며, serum-free germ-stem cell(GS) 배양액이 담겨있는 0.1% 젤라틴 코팅 배양접시에 1 - 1.5 X 10⁴cells/cm²의 농도로 현탁시킨다음, 이를 배양하였다. 이때, GS 배양액의 조성은 아래와 같다.

StemPro-34 SFM(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)(6mg/ml D(+)-glucose, 5 X 10^-5M β-mercaptoethanol, 1μM d(L)-lactic acid, 2mM L-glutamine, 30μM pyruvic acid, 10^-4M ascorbic acid, 60ng/ml progesterone, 30ng/ml β-estradiol, 0.2% BSA, 100U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, Insulin-Transferrin-Selenium supplements, MEM vitamin solution(Invitrogen, USA), MEM non-essential amino acid(Invitrogen, USA), 20ng/ml mouse EGF, 10ng/ml human bFGF, 1% knockoutTM serum replacement(KSR, Invitrogen, USA), 10ng/ml rat GDNF(R&D systems, Inc., USA) and 10³U/ml ESGRO(Chemicon, USA))

배양하는 단세포 중에서 체세포는 배양접시 바닥에 붙어서 성장하고, 단분화능 정원줄기세포는 상기 체세포의 상층에서 성장하여, 2주가 경과한 시점에서 특이적 형태의 세포덩어리(clump)를 형성함을 확인하였다.

상기 형성된 clump를 GS 배양액에 담긴 마우스 배아유래 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 위에 1 - 1.5 X 10⁴cells/cm2의 농도로 옮겨주고, 배양액을 2일 마다 바꿔주면서 5일간격으로 계대 배양하며 약 2주동안 배양하였다. 그 결과, 세포간 경계가 뚜렷한 clump와는 달리 표면이 매끈하고 세포간 경계가 뚜렷하지 않으며 기존 정원줄기세포의 특성과 다분화능 정원줄기세포의 특성을 동시에 보여주는 둥근세포군집(round colony) 상태인 정원줄기세포가 발생하였다.

상기 정원줄기세포가 발생하면 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 부가성분(20% knockoutTM serum replacement, 50μM β-mercaptoethanol, non-essential amino acids, 2mM L-glutamine, 100U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 및 103U/ml ESGRO)을 첨가한 배양액으로 2일 마다 바꿔주면서 4일간격으로 계대 배양하여, 전분화능 정원줄기세포를 수득하였다.

실시예 2: 전분화능 정원줄기세포의 특성확인

상기 실시예 1에서 수득한 전분화능 정원줄기세포주의 특성확인을 위해 전분화능 줄기세포의 마아커의 발현을 분석하였다(참조: 도 1). 도 1은 전분화능 정원줄기세포주에서 발현되는 전분화능 줄기세포의 마아커의 발현양상을 나타내는 사진이다. 상기 도 1에서 보듯이, 전분화능 정원줄기세포의 콜로니에서 전분화능 줄기세포의 마아커인 OCT-4와 NANOG, SOX2, C-MYC, KLF4의 발현이 관찰되어 미분화된 전분화능이 잘 유지되고 있음을 알 수 있었다.

그런데, 이러한 전분화능 정원줄기세포는 100번이상의 계대배양 후에도 정원줄기세포의 마아커인 GFR-α1과 mouse vasa homolog (MVH)의 발현이 관찰되었다. 이러한 현상으로부터 Takehashi 등에 의해 보고된 것과는 달리 전분화능 정원줄기세포는 역분화가 일어났음에도 불구하고 생식세포로서의 특징을 일부 유지하고 있다는 사실을 알 수 있다.

또한, 전분화능 정원줄기세포에서 특이하게 발현하는 micro(mi) RNA의 분석결과에 의하면 배아줄기세포에서 특이하게 발현하는 miR-290 family (miR-290~291a~291b~292~293~294 ~295)가 역시 발현되어 이들이 전분화능을 가지고 있다는 사실을 알 수 있었다(참조: 도 2). 도 2는 배아줄기세포와 전분화능 정원줄기세포, 생쥐 태아섬유세포, 서르토리세포, 정원줄기세포에서의 miRNA발현 양상을 나타내는 그래프이다.

그런데, 이들에게서도 역시 생식세포 계통의 세포에서만 특이하게 발현하는 miR-20 family (miR-20a/b~18~19a/b~106a~93)가 발현되는 것을 확인하였다.

이상의 전분화능 정원줄기세포의 특성분석 결과는 이들이 역분화 되었음에도 불구하고 100계대 이상까지 생식세포의 특성을 보유하고 있다는 사실을 알 수 있게 하였다.

실시예 3: 전분화능 정원줄기세포의 형질전환

유전자변형 정자와 배아의 생산효율의 비교를 위해 전분화능 정원줄기세포는 lentiviral vector를 이용하여 형질전환 하였다. 연구를 위해 lentiviral 벡터는 Hiroyuki Miyoshi 박사 (Riken Tsukuba Institute, Ibaraki, Japan)로부터 공여 받은 CS-CDF-CG-PRE 플라스미드를 사용하고, packaging 벡터로는 pMDLg/pRRE를, envelop으로는 pCMV-VSV-G-RSV-Rev를 사용하였으며, 4인산2칼슘 침전법을 이용하였다(참조: 도 3). 도 3은 Cs-CDF-CG-PRE 플라스미드의 벡터맵을 나타내는 모식도이다.

세 플라스미드를 packaging 세포가 있는 완충액에서 4인산2칼슘 침전법으로 침전시키고 16시간 이후 배양액을 교체하였다. 48시간 후에 다시 상층배양액을 회수하여 이를 0.22μm(Millipore, Bedford, MA, USA)로 필터 한 후에 초고속원심분리기를 이용해 50,000 Ｘ g 에서 150분간 4℃에서 농축하였다. Viral pellet을 배양액으로 희석한 후 다분화능 정원줄기세포의 배양액에 첨가하였다. 배양 48시간 후에 GFP의 발현을 형광현미경 하에서 관찰하였다. 바이러스는 배양액을 교체하기 전까지 5% CO2와 37℃에서, 배양액을 교체하고 회수하기 전까지는 10% CO2 와 37℃ 온도 하에서 배양하였다.

실시예 4: 전분화능 정원줄기세포의 생식세포계통으로의 분화능 확인 및 비교

배양하고 있는 형질전환된 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포를 지지세포로부터 분리한 후 3가지 배양액(I: 0.1ng/ml retinoic acid(RA) + EB 배양액; II: 10ng/ml bone morphogenetic protein(BMP) + EB 배양액; III: 0.1ng/ml RA + 10ng/ml BMP4 + EB 배양액)에서 3일간 추가 배양하였다. 배양된 각 세포들을 회수하여 정원줄기세포의 마아커인 anti-Thy-1과 -GFR-α1, -integrin α1으로 반응한 후 유세포분석기로 계측하였다(참조: 도 4). 도 4는 전분화능 정원줄기세포의 생식세포계통으로의 분화효율을 비교한 그래프이다. 도 4에서 보듯이, integrin α1과 Thy-1, GFR-α1를 이용하여 분석한 결과 세가지 배양액에서 모두 전분화능 정원줄기세포가 배아줄기세포에 비해 생식세포 계통으로 분화하는 효율이 높다는 결과를 얻었다.

그리고, 0.1ng/ml RA 만이 포함된 배양액이 전분화능 정원줄기세포의 생식세포계통으로의 분화에 보다 효과적임을 알 수 있었다.

실시예 5: 생식계통으로 분화된 전분화능 정원줄기세포의 생쥐 정소내 치환과 형질전환 정자의 생산

상기 실시예 4의 결과에 따라, 0.1ng/ml RA가 포함된 배양액에서 전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포를 분화시켜 생성된 생식세포를 anti-Thy-1 항체를 사용한 magnetic activating cell sorting (MACS)을 이용하여 분리하였고, 이들을 GDNF와 LIF가 들어있는 생식세포배양액에서 3일간 추가로 배양하여 증식을 유도하였다(Lim et al., 2010). 최종적으로 2x106의 분화된 생식세포를 busulfan (44mg/Kg)을 주사한 후 5주가 지난 SCID 생쥐의 정소 내 세정관에 이식하였다(참조: 도 5). 도 5는 이식된 SCID 생쥐의 부고환 내에서 관찰된 형질전환(GFP-발현) 정자를 나타내는 현미경사진이다. 도 5에서 보듯이, 이식 후 6-12주에 정소의 세정관과 부정소에서 정자로의 분화에 성공하였고, 정자에서 GFP 단백질이 발현됨을 관찰하여 형질전환된 정자가 생산됨을 확인하였다.

실시예 6: 형질전환된 정자를 이용한 형질전환 배아의 생산

전분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포를 각각 분화시키고, 이를 생쥐의 생식조직에 이식한 다음, 생쥐의 정소와 부정소로부터 얻은 정자를 배란된 생쥐난자에 세포질 내 직접주입술을 이용하여 수정을 유도하고 형질전환된 포배로의 발생률을 비교하였다(참조: 표 1). 이때, 대조군으로는 이식되지 않은 생쥐로부터 수득한 정자를 주입한 생쥐를 사용하였다.

배아발생율의 비교

	주입된 배아의 수	난할		포배
	주입된 배아의 수	갯수	비율(%)	갯수	비율(%)
대조군	421	298	70.8	91	30.5
배아줄기세포	204	107	52.5	12	11.2
정원줄기세포	201	87	43.3	19	21.8

상기 표 1에서 보듯이, 전분화능 정원줄기세포에서 유래된 정자를 이용하여 수정시킨 배아의 포배로의 발생율이 배아줄기세포에서 유래된 정자로부터 수정된 배아에 비해 유의하게 높음을 알 수 있었다.

이러한 결과는 같은 전분화능을 가진 줄기세포임에도 불구하고 전분화능 정원줄기세포가 배아줄기세포에 비해 발생능력이 뛰어난 정자를 생산할 수 있으며, 이러한 점은 전분화능 정원줄기세포가 생식세포의 특성을 유지하고 있음에서 기인하는 것이라고 유추할 수 있었다.

이상의 결과를 종합하면 형질전환 정자를 이용한 형질전환동물의 생산에 는 전분화능 정원줄기세포가 보다 적합하며, 향후 이 기술을 통해 형질전환동물의 생산 효율을 보다 증진할 수 있을 것이다.

Claims

(ⅰ) 전분화능 정원줄기세포에 목적하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 도입하여 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 수득하는 단계;
(ⅱ) 상기 형질전환된 전분화능 정원줄기세포를 레티노인산(retinoic acid, RA)이 포함된 배양액에서 배양하여 생식세포로 분화시키는 단계; 및,
(ⅲ) 분화된 생식세포를 수컷 동물의 정소내 세정관에 이식하고, 상기 수컷 동물을 6 내지 12주동안 사육하는 단계를 포함하는, 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법.
제 1항에 있어서,
전분화능 정원줄기세포는 정소내의 단분화능 정원줄기세포를 역분화시켜서 수득하는 것을 특징으로 하는
전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법.
제 1항에 있어서,
레티노인산의 농도는 0.1ng/ml인 것을 특징으로 하는
전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법.
제 1항에 있어서,
배양액은 EB 배양액인 것을 특징으로 하는
전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법.