WO2018030720A1 - 단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템 - Google Patents

단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템 Download PDF

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stem cells
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목지원
주희정
최준섭
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Definitions

  • the present invention relates to a method and system for culturing corneal stem cell-like cell lines that induce differentiation of induced pluripotent stem cells using protein ligands.
  • Stem cells are pluripotent cells that can differentiate into all the cells that make up our body. Theoretically, stem cells can differentiate into all cells, and if they understand their differentiation mechanism and differentiate into desired cells, it is possible to restore or regenerate various body organs.
  • stem cells have the property of proliferating and differentiating themselves to become cancer cells when transplanted into a living body, stem cells themselves cannot be used for tissue regeneration or treatment.
  • cell cultured iPSCs have a longer cultivation period, and the number of subcultures decreases the capacity of stem cells and increases the possibility of differentiating or killing unwanted cells, thereby reducing expected effects. do.
  • the present invention aims to solve the problems of the prior art as described above and the technical problems that have been requested from the past.
  • the inventors of the present application induce differentiation of induced pluripotent stem cells to culture corneal stem cell-like cell lines as described below.
  • a feeder free culture medium by coating the recombinant protein with Vitronectin, culturing induced pluripotent stem cells in the feeder-free medium, and then sequentially added BMP4 and Wnt3a to induce pluripotent stem cells.
  • BMP4 and Wnt3a to induce pluripotent stem cells.
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • a basal medium comprising DMEM F12, L-ascorbic acid, sodium selenite, and sodium chloride;
  • the additive for culturing induced pluripotent stem cells may include holo transferrin, bFGF, TGF beta1, and insulin.
  • the additive for forming a stem cell growth environment may include EGF and insulin.
  • Wnt3a in the process of sequentially adding the BMP4 and Wnt3a, after the treatment of about 2 to 4 days after the addition of BMP4, Wnt3a can be added, in detail after the treatment for about 3 days after the addition of BMP4 Wnt3a can be added
  • Wnt3a in the process of sequentially adding the BMP4 and Wnt3a, Wnt3a may be added and treated for about 2 to 4 days, and in detail, Wnt3a may be added and treated for about 3 days.
  • the PI culture medium may include Panserin (Isocove Media) 2: 1 to 1: 2 by weight, specifically 1: 1.
  • cells differentiated from the induced pluripotent stem cells may be cultured in a PI culture for 1 to 3 weeks.
  • the cells differentiated from the induced pluripotent stem cells in a PI culture medium may further include a step of passage culture.
  • the subculture may include Epi media, FBS, hydrocortisone, insulin, choleratoxin, and EGF.
  • cells differentiated from the induced pluripotent stem cells may be cultured in PI culture for 3 weeks and then passaged.
  • the present invention also provides a system for inducing differentiation of induced pluripotent stem cells to culture corneal stem cell-like cell lines.
  • the system includes a feeder prepared by adding an additive for induced pluripotent stem cell culture to a basal medium containing DMEM F12, L-ascorbic acid, sodium selenite, and sodium chloride, and coating Vitronectin recombinant human protein. badge;
  • An additive for forming a stem cell growth environment added to the feeder-free medium
  • BMP4 and Wnt3a sequentially added to induce induced pluripotent stem cells to be differentiated into corneal stem cell-like cell lines in a medium containing the additive for culturing induced pluripotent stem cells and stem cell growth environment cultured in the feeder-free medium;
  • It may include; PI culture for culturing cells differentiated from the induced pluripotent stem cells.
  • the cells differentiated from the induced pluripotent stem cells in PI culture medium may further include a passage culture medium for passage culture.
  • Example 1 is a photograph taken over time of induced pluripotent stem cells cultured in a feeder-free medium of Example 1;
  • Figure 2 is a photograph of induced pluripotent stem cells cultured for 7 days in the feeder containing medium of Comparative Example 1;
  • FIG. 3 and 4 are photographs obtained by immunostaining induced pluripotent stem cells cultured in a feeder-free medium of Example 1 with an undifferentiated iPSC marker and using a protein expression array;
  • Figure 9 is a photograph of the results of performing Air Lift for three weeks, the cells cultured for one week in PI culture after Wnt3a treatment of Example 1;
  • FIG. 11 is a photograph showing the result of Air Lift culture of corneal epithelial stem cells cultured in a passage culture medium of Example 1.
  • FIG. 11 is a photograph showing the result of Air Lift culture of corneal epithelial stem cells cultured in a passage culture medium of Example 1.
  • a basal medium containing DMEM F12, L-ascorbic acid, sodium selenite, and sodium chloride was prepared and adjusted to pH 7.4. 10 ⁇ g / ml of holotransferrin, 100 ng / mL of bFGF, 1.74ng / ml of TGF beta1, and 20 ⁇ g / ml of insulin were added to the basal medium as an additive for pluripotent stem cell culture.
  • the immune response may be problematic when transplanting differentiated corneal epithelial cells.
  • a feeder-free medium without using a feeder, recombination of vitronectin into a basal medium Human protein (Vitronectin Recombinant Human Protein) was coated, and then induced pluripotent stem cells were cultured for 7 days.
  • Vitronectin recombinant human protein coating was performed by the following procedure. On a 6 well plate culture vessel, 60 ml of Vitronectin recombinant human protein (50 ⁇ g / ml) was added to 9 ml of DPBS (Ca 2+ and Phosphate buffered Saline without Mg 2+ ), and each well was diluted. 1.5 ml was poured into the flask, and the mixture was not dried, and reacted for 12 hours in a refrigerated state (about 4 ° C). Then, it was reacted at room temperature for 1 hour and washed with PBS.
  • DPBS Ca 2+ and Phosphate buffered Saline without Mg 2+
  • DMEM Cells cultured for about 1-3 weeks in the PI culture were passaged. Subculture was added to epimedium with DMEM: F12 3: 1 by weight, FBS (Fetal Bovine Serum) by 5% by weight, hydrocortisone 50 ng / ml, 5 ⁇ g / ml of insulin, 30 ng / ml of choleratoxin, and 10 ng / ml of EGF were used and prepared.
  • F12 3 1 by weight
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • hydrocortisone 50 ng / ml, 5 ⁇ g / ml of insulin, 30 ng / ml of choleratoxin, and 10 ng / ml of EGF were used and prepared.
  • Example 1 the passage was cultured in the same manner as in Example 1 except that the passage was used in the same composition as the PI culture.
  • a basal medium containing DMEM F12, L-ascorbic acid, sodium selenite, and sodium chloride was prepared and adjusted to pH 7.4. 10 ⁇ g / ml of holotransferrin, 100 ng / mL of bFGF, 1.74ng / ml of TGF beta1, and 20 ⁇ g / ml of insulin were added to the basal medium as an additive for pluripotent stem cell culture.
  • a feeder 25,000 cells / cm 2 of MMC (mitomycin C) -treated MEF (mouse embryonic fibroblast) feeder was added, and then induced pluripotent stem cells were cultured.
  • FIG. 1 is a photograph taken over time of induced pluripotent stem cells cultured in a feeder-free medium of Example 1
  • Figure 2 is a photograph of induced pluripotent stem cells cultured in a feeder-containing medium of Comparative Example 1 for 7 days It is a photograph.
  • the induced pluripotent stem cells cultured in the feeder-free medium of Example 1 compared to the induced pluripotent stem cells cultured in the feeder-containing medium of Comparative Example 1, clearly forming colonies It can be confirmed, which can be seen that the induced pluripotent stem cells of Example 1 were cultured in a uniform size and shape.
  • Induced pluripotent stem cells cultured in the feeder-free medium of Example 1 were immunostained with undifferentiated iPSC markers SOX2, OCT4A, SSEA4, TRA-1-81, TRA1-60S, and identified using a protein expression sequence. The results are shown in FIGS. 3 and 4.
  • Corneal stem cell markers (ABCG2, ⁇ Np63, Pax6, CK14) and corneal epithelial cells, respectively, were cultured from cells differentiated from induced pluripotent stem cells of Example 1 before and after 3 weeks of culture in PI culture medium. Expression status was analyzed with markers (CK3, CK12).
  • Example 1 As a result, in Example 1, both corneal stem cell markers ABCG2 and ⁇ Np63 and corneal epithelial cell markers CK3 and CK12 were observed when cultured for 3 weeks by treatment with Wnt3a. 5 to 8 show photographs photographing the expression state of the marker for Example 1.
  • FIG. 1 shows that both corneal stem cell markers ABCG2 and ⁇ Np63 and corneal epithelial cell markers CK3 and CK12 were observed when cultured for 3 weeks by treatment with Wnt3a.
  • Air lift culture was performed to confirm the corneal epithelial cell differentiation ability of the corneal epithelial stem cells differentiated from induced pluripotent stem cells of Example 1. The results are shown in FIG.
  • the corneal epithelial cell layer of about 3 to 4 layers was formed as a result of performing Air Lift for 3 weeks on the cells cultured in the PI culture medium after the Wnt3a treatment of Example 1 for 1 week.
  • Example 1 The proliferation rate of the passaged cells in Example 1 and Example 2 was measured. Markers Pax6, CK3, and Hoechst were used, and the results are shown in FIG. 10, and the results of Example 1 using a passage medium containing epimedia were shown on the left, and Example 2 using a PI culture as a passage medium. The results of are shown on the right.
  • the passaged cells maintained the best morphology of corneal epithelial cells while maintaining the expression of corneal epithelial cells and corneal epithelial stem cell markers. Through this, a corneal stem cell-like cell line having a differentiation rate of 70% or more was obtained.
  • Corneal epithelial stem cells cultured in subcultures containing epimedia were observed by electron microscopy as a result of Air Lift culture. The results are shown in FIG. 11, through which it was confirmed that a multilayer cell layer was formed.
  • the method and system for culturing corneal stem cell-like cell lines by inducing differentiation of induced pluripotent stem cells can provide corneal epithelial cells with low immune response during corneal transplantation.
  • the method and system according to the present invention can enhance the differentiation ability of induced pluripotent stem cells into corneal stem cell-like cell lines.
  • Corneal epithelial stem cell-like cell lines provided from the methods and systems according to the present invention can be applied and utilized in corneal epithelial cell differentiation studies and corneal epithelial transplantation studies for the treatment of corneal disease.

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Abstract

본 발명은 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell)의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법으로서, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하는 과정; 상기 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하는 과정; 상기 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하는 과정; 상기 피더 비포함 배지에 유도만능줄기세포를 첨가하여 배양하는 과정; 상기 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제를 첨가하는 과정; 상기 유도만능줄기세포를 각막 줄기세포 유사 세포주로 분화하도록 유도하기 위해, 피더 비포함 배지에 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정; 및 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양하는 과정;을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템
본 발명은 단백질 리간드를 이용하여 유도만능줄기세포의 분화를 유도하는 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
줄기세포는 우리 몸을 구성하는 모든 세포로 분화될 수 있는 만능세포를 의미한다. 이론적으로 줄기세포는 모든 세포로 분화될 수 있으며, 이들의 분화 메커니즘을 이해하고 원하는 세포로 분화시킨다면, 각종 신체 장기를 복원 또는 재생하는 것이 가능하다.
다만, 줄기세포는 생체에 이식되면 스스로 증식하고 분화하여 암세포화 되는 성질을 가지고 있기 때문에, 줄기세포 자체를 조직의 재생이나 치료에 사용할 수는 없다.
또한, 세포주화 된 유도만능줄기세포(iPSC)는 배양하는 기간이 길수록, 계대 배양하는 횟수가 많아 질수록 줄기세포의 능력이 감소되며, 원하지 않는 세포로 분화되거나 사멸될 가능성이 높아져 기대 효과가 저하된다.
따라서, 유도만능줄기세포를 줄기세포의 성격을 계속 유지시키며 배양할 수 있고, 분화될 세포에 가장 적합한 상태로 배양하여, 줄기세포를 원하는 세포로 분화시키는 비율을 향상시킬 수 있는 기술에 대한 필요성이 높은 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 발명자들은 심도 있는 연구와 다양한 실험을 거듭한 끝에, 이후 설명하는 바와 같이, 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell)의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법으로서, 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하고, 피더 비포함 배지에서 유도만능줄기세포를 배양한 후, BMP4및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하여 유도만능줄기세포를 각막 줄기세포 유사 세포주로 분화하도록 유도하는 경우, 각막 이식 시 면역 반응이 낮은 세포를 제공할 수 있고, 각막 줄기세포 유사 세포주로의 분화능이 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법은,
DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하는 과정;
상기 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하는 과정;
상기 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하는 과정;
상기 피더 비포함 배지에 유도만능줄기세포를 첨가하여 배양하는 과정;
상기 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제를 첨가하는 과정;
상기 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화하도록 유도하기 위해, 피더 비포함 배지에 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정; 및
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양하는 과정;을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포 배양용 첨가제는 홀로 트랜스페린(Holo transferrin), bFGF, TGF 베타1, 및 인슐린을 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제는 EGF 및 인슐린을 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정에서, BMP4를 첨가하고 약 2일 내지 4일간 처리 후, Wnt3a를 첨가할 수 있고, 상세하게는 BMP4를 첨가하고 약 3일간 처리 후 Wnt3a를 첨가할 수 있다
하나의 구체적인 예에서, 상기 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정에서, Wnt3a를 첨가하고 약 2일 내지 4일간 처리할 수 있고, 상세하게는 Wnt3a를 첨가하고 약 3일간 처리할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 PI 배양액은 판세린(Panserin):이소코브 미디아(Isocove Media)를 중량을 기준으로 2:1 내지 1:2, 상세하게는 1:1로 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 1주 내지 3주 동안 배양할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양 후, 계대 배양하는 과정을 더 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 계대 배양 시, 계대 배양액은 에피 미디아(Epi media), FBS, 히드로코르티손, 인슐린, 콜레라독소(choleratoxin), 및 EGF를 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 3주 동안 배양한 후 계대 배양할 수 있다.
본 발명은 또한, 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 시스템을 제공한다.
상기 시스템은, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨, 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하고, 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 제조된 피더 비포함 배지;
상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포;
상기 피더 비포함 배지에 첨가되는 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제;
상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포 및 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제가 포함된 배지에 유도만능줄기세포를 각막 줄기세포 유사 세포주로 분화하도록 유도하기 위해 순차적으로 첨가되는 BMP4 및 Wnt3a; 및
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 배양하기 위한 PI배양액;을 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양 후, 계대 배양하기 위한 계대 배양액을 더 포함할 수 있다.
도 1은 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 시간 경과에 따라 촬영한 사진이다;
도 2는 비교예 1의 피더 포함 배지에서 7일간 배양한 유도만능줄기세포를 촬영한 사진이다;
도 3 및 도 4는 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 비분화 iPSC 마커로 면역염색하고, 단백질 발현 배열(array)을 사용한 결과를 촬영한 사진이다;
도 5 내지 도 8은 실시예 1에 대한 마커의 발현 상태를 촬영한 사진이다;
도 9는 실시예 1의 Wnt3a 처리 후 PI 배양액에서 1주 동안 배양한 세포에 대해, Air Lift를 3주간 수행한 결과를 촬영한 사진이다;
도 10은 마커 Pax6, CK3, 및 Hoechst를 사용하여, 실시예 1 및 실시예 2에서 계대 배양된 세포들의 증식율을 측정한 사진이다;
도 11은 실시예 1의 계대 배양액에서 배양한 각막 상피 줄기 세포를 Air Lift 배양한 결과를 촬영한 사진이다.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 참조하여 설명하지만, 이는 본 발명의 더욱 용이한 이해를 위한 것으로, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
유도만능줄기세포를 배양하기 위하여, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨, 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하고, pH 7.4로 조절하였다. 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제로서 홀로 트랜스페린을 10 ㎍/ml, bFGF을 100 ng/mL, TGF 베타1을 1.74ng/ml, 및 인슐린을 20 ㎍/ml 첨가하였다.
피더(feeder)를 사용하여 줄기세포를 배양하는 경우, 분화된 각막 상피 세포를 이식 시 면역 반응이 문제될 수 있으므로, 피더를 사용하지 않는 피더 비포함 배지를 제조하기 위하여, 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질(Vitronectin Recombinant Human Protein)을 코팅하고, 다음으로 유도만능줄기세포를 7일간 배양하였다.
비트로넥틴 재조합 인간 단백질 코팅은 다음의 과정을 통해 실시하였다. 6 well plate 배양 용기 기준으로, 9 ml의 DPBS(Ca2+ 및 Mg2+가 없는 Phosphate buffered Saline)에 60 ㎕의 비트로넥틴 재조합 인간 단백질 (50 ㎍/ml)을 투입하여 희석하고, 이를 각 well에 1.5 ml 넣고, 건조하지 않게 한 다음, 냉장상태 (약 4℃)에서 12시간 반응시켰다. 이후, 1시간 동안 실온에서 반응 시키고, PBS로 세척하였다.
배양된 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화시키기 위해, 우선, 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제로서, EGF를 10 ng/ml 및 인슐린을 5 ㎍/ml 첨가하였다.
다음으로, 외배엽 프로지니터(ectoderm progenitors)를 초기에 유도하기 위하여 BMP4를 100 ng/ml 첨가하고 3일간 처리하였고, 다음으로 각막 줄기세포 유사 세포주로 분화를 위하여 Wnt3a를 100 ng/ml 첨가하고 3일간 처리하였다.
다음으로, 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 판세린:이소코브 미디아를 중량을 기준으로 1:1로 혼합한 PI 배양액에서 약 1주 내지 3주 동안 배양하였다.
PI 배양액에서 약 1주 내지 3주 동안 배양한 세포들을 계대 배양하였다. 계대 배양액은 DMEM:F12를 중량을 기준으로 3:1로 혼합한 에피 미디아에, FBS (Fetal Bovine Serum, 소태아혈청)를 중량을 기준으로 5%로 첨가하고, 히드로코르티손을 50 ng/ml, 인슐린을 5 ㎍/ml, 콜레라독소를 30 ng/ml, 및 EGF를 10 ng/ml 포함하도록 제조하여 사용하였다.
<실시예 2>
실시예 1에서 계대 배양액을 PI 배양액과 동일한 조성으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다.
<비교예 1>
유도만능줄기세포를 배양하기 위하여, DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨, 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하고, pH 7.4로 조절하였다. 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제로서 홀로 트랜스페린을 10 ㎍/ml, bFGF을 100 ng/mL, TGF 베타1을 1.74ng/ml, 및 인슐린을 20 ㎍/ml 첨가하였다. 피더로서 MMC (mitomycin C) 처리한 MEF (mouse embryonic fibroblast) 피더를 25,000 cells/cm2 첨가하고, 다음으로 유도만능줄기세포를 배양하였다.
<실험예 1>
실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포와, 비교예 1의 피더 포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포의 배양 상태를 관찰하였다. 그 결과를 촬영한 사진을 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1은 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 시간 경과에 따라 촬영한 사진이고, 도 2는 비교예 1의 피더 포함 배지에서 7일간 배양한 유도만능줄기세포를 촬영한 사진이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포가 비교예 1의 피더 포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포에 비해, 콜로니를 명확하게 형성하고 있음을 확인할 수 있고, 이는 실시예 1의 유도만능줄기세포가 크기와 형태가 균일한 상태로 배양된 것으로 볼 수 있다.
<실험예 2>
실시예 1의 피더 비포함 배지에서 배양한 유도만능줄기세포를 비분화 iPSC 마커인 SOX2, OCT4A, SSEA4, TRA-1-81, TRA1-60S로 면역염색하고, 단백질 발현 배열을 사용하여 확인하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
우선, 도 3을 참조하면, 배양된 유도만능줄기세포(iPSC)에서 줄기세포 특성이 있음을 나타내는 단백질 마커인 TRA-1- 81, TRA1-60S, SSEA4, OCT4A의 발현 유무를 확인하였다.
다음으로, 도 4를 참조하면, 배양된 유도만능줄기세포에서 단백질을 분리하고, 단백질 발현 양상을 비교하기 위하여 줄기세포 마커에 대한 protein array를 실시하였고, 줄기세포의 마커인 SOX2, OT 3/4의 발현을 확인하였다.
<실험예 3>
실시예 1의 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포로부터 분화된 세포를, PI 배양액에서 배양 전 및 3주간 배양한 후에 대하여 각각, 각막 줄기세포 마커 (ABCG2, △Np63, Pax6, CK14) 및 각막 상피 세포 마커 (CK3, CK12)로 발현 상태를 분석하였다.
그 결과, 실시예 1의 경우, Wnt3a를 처리하여 3주간 배양 시 각막 줄기세포 마커인 ABCG2 및 △Np63와 각막 상피 세포 마커인 CK3 및 CK12가 모두 관찰되었다. 실시예 1에 대한 마커의 발현 상태를 촬영한 사진을 도 5 내지 도 8에 나타내었다.
도 7및 도 8을 참조하면, Wnt3a 처리 후 3주 동안 배양된 줄기세포(iPSC)에서 CK14, Pax6를 확인한 결과 두 단백질이 발현되었음을 알 수 있다. 또한, Wnt3a를 처리한 배양된 줄기세포(iPSC)에서 각막 상피 줄기세포의 마커인 ABCG2의 발현은 일부 감소하였으나 각막 상피 세포 분화 마커인 CK3의 발현은 증가하였음을 알 수 있다.
<실험예 4>
실시예 1의 유도만능줄기세포로부터 분화된 각막 상피 줄기세포의 각막 상피세포 분화 능력을 확인하기 위한 Air Lift 배양을 실시하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9를 참조하면, 실시예 1의 Wnt3a 처리 후 PI 배양액에서 1주 동안 배양한 세포에 대해, Air Lift를 3주간 수행한 결과 약 3층 내지 4층의 각막 상피 세포층이 형성되었음을 확인할 수 있었다.
<실험예 5>
실시예 1 및 실시예 2에서 계대 배양된 세포들의 증식률을 측정하였다. 마커 Pax6, CK3, 및 Hoechst를 사용하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었고, 에피 미디아를 포함하는 계대 배양액을 사용한 실시예 1의 결과를 왼쪽에 나타내었고, PI 배양액을 계대 배양액으로 사용한 실시예 2의 결과를 오른쪽에 나타내었다.
도 10을 참조하면, 에피 미디아를 포함하는 계대 배양액을 사용한 실시예 1의 경우에 더욱 높은 밀집도를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
또한, 계대 배양 이전에 PI 배양액에서 1주, 2주, 및 3주간 배양 후, 각각을 계대 배양하였다. PI 배양액에서 3주간 배양 후 계대 배양한 세포가 각막 상피 세포의 형태를 가장 잘 유지하면서 각막 상피 세포와 각막 상피 줄기세포 마커의 발현을 지속적으로 유지하였다. 이를 통해, 분화율이 70% 이상인 각막 줄기세포 유사 세포주를 얻을 수 있었다.
<실험예 6>
에피 미디아를 포함하는 계대 배양액에서 배양한 각막 상피 줄기 세포를 Air Lift 배양한 결과, 다층의 세포층이 형성되었음을 전자현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었고, 이를 통해, 다층의 세포층이 형성되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상 본 발명의 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법 및 시스템은, 각막 이식 시 면역 반응이 낮은 각막 상피 세포를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 시스템은 유도만능줄기세포로부터 각막 줄기세포 유사 세포주로의 분화능을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 시스템으로부터 제공되는 각막 상피 줄기세포 유사 세포주는, 각막 상피 세포의 분화 연구 및 각막 질환 치료를 위한 각막 상피 이식 연구에 응용 및 활용할 수 있다.

Claims (15)

  1. 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell)의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 방법으로서,
    유도만능줄기세포를 각막 줄기세포 유사 세포주로 분화하도록 유도하기 위해, 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)에 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정; 및
    상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 배양하는 과정;
    을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 각막 상피 세포로 분화를 유도하기 전에,
    피더 비포함 배지를 제조하는 과정;
    상기 피더 비포함 배지에 유도만능줄기세포를 첨가하여 배양하는 과정; 및
    상기 피더 비포함 배지에 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제를 첨가하는 과정을 더 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 피더 비포함 배지를 제조하는 과정은,
    DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨(Sodium selenite), 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지를 준비하는 과정;
    상기 기본배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하는 과정; 및
    상기 기본배지에 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 피더 비포함 배지(feeder free culture medium)를 제조하는 과정을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포 배양용 첨가제는 홀로 트랜스페린(Holo transferrin), bFGF, TGF 베타1, 및 인슐린을 포함하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제는 EGF 및 인슐린을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정에서, BMP4를 첨가하고 2일 내지 4일간 처리 후 Wnt3a를 첨가하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 BMP4 및 Wnt3a를 순차적으로 첨가하는 과정에서, Wnt3a를 첨가하고 2일 내지 4일간 처리하는 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 PI 배양액은 판세린(Panserin):이소코브 미디아(Isocove Media)를 중량을 기준으로 2:1 내지 1:2로 포함하는 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 1주 내지 3주 동안 배양하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 배양 후, 계대 배양하는 과정을 더 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 계대 배양 시, 계대 배양액은 에피 미디아(Epi media), FBS, 히드로코르티손, 인슐린, 콜레라독소(choleratoxin), 및 EGF를 포함하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양액에서 3주 동안 배양한 후 계대 배양하는 방법.
  14. 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 줄기세포 유사 세포주를 배양하는 시스템으로서,
    DMEM F12, L-아스코르브산, 아셀렌산 나트륨, 및 염화 나트륨을 포함하는 기본 배지에 유도만능줄기세포 배양용 첨가제를 첨가하고, 비트로넥틴 재조합 인간 단백질을 코팅하여 제조된 피더 비포함 배지;
    상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포;
    상기 피더 비포함 배지에 첨가되는 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제;
    상기 피더 비포함 배지에서 배양된 유도만능줄기세포 및 줄기세포 성장 환경 조성용 첨가제가 포함된 배지에 유도만능줄기세포를 각막 상피 세포로 분화하도록 유도하기 위해 순차적으로 첨가되는 BMP4 및 Wnt3a 및
    상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 배양하기 위한 PI배양액;
    을 포함하는 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 PI 배양 후, 계대 배양하기 위한 계대 배양액을 더 포함하는 시스템.
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