WO2010008157A2 - 줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법 - Google Patents

줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법 Download PDF

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WO2010008157A2
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stem cells
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adult stem
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임진호
이영재
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(주)마리아 바이오텍
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    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/32—Polylysine, polyornithine

Definitions

  • the present invention relates to a method of differentiating stem cells into ectoderm cells. More specifically, the present invention relates to a method of differentiating stem cells into ectoderm cells, which induces differentiation into ectoderm cells by increasing intercellular interactions due to cell aggregation of adult stem cells.
  • Stem cells are cells that have the ability of self-replication and differentiate into two or more cells. Totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells can be classified as a multipotent stem cell.
  • the ultimate goal of stem cell research is to create cells and tissues of the desired type for use in cell therapy and tissue engineering.
  • a challenge to be solved is the development of a technology that can induce differentiation into desired cells.
  • the most time consuming step in stem cell differentiation research is to analyze the effects of specific culture conditions on differentiation induction.
  • a technique for efficiently differentiating stem cells into specific cells is required.
  • cerebral nervous system disease is considered to be the most appropriate target for cell transplantation treatment than any other disease. Unlike other tissues, cerebral nervous system has almost no immune rejection reactions. This is because long-term survival can be expected.
  • WO 2005/003320 discloses a method for inducing differentiation of stem cells into neurons, and more specifically, (a) culturing stem cells with basic fibroblast growth factor; (b) culturing the cells of step (a) with fibroblast growth factor 8 and Sonic Hedgehog; (c) culturing the cells of step (b) with brain-derived neurotrophic factors; And (d) co-culturing the cells of step (c) with glial astrocytic cells.
  • WO 2004/093812 discloses that compounds with specific chemical formulas can act as inducers for the differentiation of embryonic stem cells into neurons.
  • the present inventors can induce differentiation of adult stem cells into ectodermal cells, cells having a differentiation rate that can be clinically applied by simply changing the culture conditions without adding any known biochemical differentiation inducing substance. It confirmed that it exists and completed this invention.
  • An object of the present invention is to provide a method for differentiating adult stem cells into ectoderm cells.
  • the aggregation of the adult stem cells does not contain a biochemical for ectoderm differentiation, characterized in that it is carried out in a culture vessel coated with polyethyleneimine or poly-D-lysine.
  • the spherical body can be formed by inoculating 0.2 ⁇ 10 5 ⁇ 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm2 stem cells in the culture vessel and aggregated, preferably 1.0 ⁇ 10 5 ⁇ 1.5 ⁇ 10 5 cells / cm2 It can be inoculated.
  • the size of the formed spherical body is preferably 50 ⁇ 400 ⁇ m diameter, especially 100 ⁇ 200 ⁇ m.
  • Figure 2 is the result of karyotype analysis by proliferating cell number and Kimja staining of hPLC.
  • Figure 3 is a micrograph confirming the induction of differentiation into ectoderm progenitor cells using immunostaining.
  • Figure 4 is a Western blot results (A) and RT-PCR results (B) pictures for differentiated ectoderm progenitor cells.
  • 'Stem cell' refers to cells that can differentiate into each cell constituting the tissue (differentiation), and refers to a cell that can be differentiated to a specific cell by a specific differentiation stimulation (environment).
  • Stem cells may be divided into 'embryonic stem cells' derived from fertilized eggs and 'adult stem cells' derived from respective organs present in adults according to their cytological origin.
  • 'precursor cells refers to cells that are at a stage before they have the shape and function of a particular cell.
  • the term 'neural precursor cells' refers to neurons, astroglia, and oligodendrocytes that form the central nervous system. It refers to progenitor cells that can differentiate into neurons such as cells.
  • tissue' refers to a collection of cells having substantially the same function and / or shape in a multicellular organ.
  • the origin may be a collection of cells of the same origin, or a collection of cells of different origin, as long as they have the same function and / or shape.
  • 'Differentiation' refers to a phenomenon in which structures or functions are specialized during the division and proliferation of cells, that is, the shape or function of a living cell or tissue is changed to perform a given task.
  • a relatively simple system is divided into two or more qualitatively different sub systems. For example, qualitatively between parts of a living organism that were almost homogeneous in the first place, such as head or torso distinctions between eggs that were initially homogenous in the development, or cells such as muscle cells or neurons. Phosphorus difference, or as a result, is a state divided into subclasses or subclasses that can be distinguished qualitatively.
  • Biochemical differentiation inducing substance means any biological or chemical agent such as a protein, lipid or carbohydrate, salt, mineral, or organic substance that enhances the differentiation ability of stem cells into specific cells in vivo or ex vivo.
  • a protein, lipid or carbohydrate, salt, mineral, or organic substance that enhances the differentiation ability of stem cells into specific cells in vivo or ex vivo.
  • the differentiation inducing substances may be used alone or in combination as necessary.
  • the present invention relates to a method of differentiating "stem cells", in particular "adult stem cells” into ectoderm cells.
  • stem cells in particular "adult stem cells” into ectoderm cells.
  • Stem cells unlike differentiated cells that have ceased cell division, are capable of self-renewal by cell division and thus have proliferation (expansion) characteristics. Differentiation into cells can be differentiated into other cells by different environment or differentiation stimulus, so it has plasticity in differentiation.
  • stem cells can be divided into embryonic and adult stem cells according to their origin, and both of them can be used in the present invention, but preferably adult stem cells that have little biological, ethical or legal problems.
  • Adult stem cells like embryonic stem cells, are capable of self proliferation in culture and have differentiation ability to develop into cells having characteristic shapes and specialized functions according to changes in culture conditions and culture conditions.
  • the adult stem cells can differentiate into tissue-specific progenitor cells inherent in the human body.
  • Adult stem cells can be virtually any differentiated cell in the body and have the potential to generate replacement cells for a wide range of tissues and organs such as the heart, pancreas, nerve tissue, muscle, cartilage, and the like.
  • Such adult stem cells can be obtained from most tissues such as primates, preferably human bone marrow, cord blood, blood, fat, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, uterus, brain, pancreas, liver, eyes and fetal tissue. have.
  • tissues such as primates, preferably human bone marrow, cord blood, blood, fat, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, uterus, brain, pancreas, liver, eyes and fetal tissue. have.
  • placental stem cells which have differentiation ability to various tissues, are easily manipulated in vitro, and have immunomodulatory ability.
  • the obtained specific tissues are separated into single cell bodies by treatment with trypsin solution and / or collagenase, and then cultured in a suitable medium in which growth factors such as bFGF and EGF are added in an appropriate amount. Then, it can be separated by FACS or the like can be used to isolate adult stem cells according to the growth rate.
  • the present invention relates to a method for "differentiating" stem cells, in particular adult stem cells.
  • conventional methods for differentiation into ectoderm cells include retinoic acid, lithium chloride, basic fibroblast growth factor (bFGF), and epidermal growth factor (EGF). ), Betacellulin, activin, and sonic hedgehog (shh) are used for differentiation into endoderm cells, and dexamethasone for differentiation into mesodermal cells.
  • dexamethasone dimethyl sulfoxide, fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor (VEGF), etc. are used in a variety of drugs depending on the direction of differentiation.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the rate of differentiation is only about 70%. This is not only a poor efficiency for clinical applications, but also a problem because the remaining 30% of the cells that may be in an undifferentiated state are not precisely identified. That is, from a clinical point of view, in clinical application or in vivo transplantation, there is a dangerous result of transplanting the cells together which are not precisely identified. This is because even after the differentiation process is completed, it does not differentiate into a specific target cell, but also includes the possibility of remaining undifferentiated or differentiating into another unexpected cell.
  • the present invention solves the above problems and differentiates adult stem cells into ectoderm cells with an efficiency of about 100%.
  • the present invention relates to a method for differentiating stem cells to "high efficiency" into “ectoderm cells”.
  • the present invention relates to a method for agglomerating stem cells, preferably adult stem cells, to form a globular body without using a biochemical derivative for ectoderm tissue induction, and to obtain ectoderm cells by culturing the globular body.
  • stem cells preferably adult stem cells
  • the aggregation of the stem cells increases the cell interaction between the aggregated stem cells to differentiate into ectoderm cells without other differentiation inducing substances.
  • the method of aggregating adult stem cells increases cell interactions between stem cells, and thus, adult stem cells are differentiated into ectoderm cells without a specific ectoderm differentiation inducing substance.
  • adult stem cells can be aggregated in a culture vessel (plate) coated with polyethyleneimine or poly-D-lysine to form a globular body.
  • the polyethyleneimine is preferably diluted in a general buffer solution such as water or PBS at a concentration of 0.01 to 1% (w / v) and coated on a culture dish, most preferably at a concentration of 0.1%.
  • the poly D-lysine is preferably coated at a concentration of 0.1 to 100 ⁇ g / ml, most preferably at a concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • the polyethyleneimine or poly-D-lysine has a positive charge on the surface of the culture medium to enhance the ability of the cells to adhere to the surface, but when the stem cells are cultured at high concentrations, the cells do not adhere to the surface of the culture plate and Aggregate to form spherical body. It is preferable that the spherical body formed by aggregation of stem cells has a diameter of 50-400 ⁇ m, and more preferably, a diameter of 100-200 ⁇ m.
  • Stem cells inoculated at high concentration in the culture vessel to form such a globular form is 0.2 ⁇ 10 5 ⁇ 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm2 is appropriate, preferably 1.0 ⁇ 10 5 ⁇ 3.0 ⁇ 10 5 cells / cm2, Most preferably, it is 1.0 * 10 ⁇ 5> -1.5 * 10 ⁇ 5> cells / cm ⁇ 2>.
  • the size of the spherical body formed is too large to maintain its shape, and in the case of culturing fewer stem cells than 0.2 ⁇ 10 5 cells, It will adhere to the culture dish surface.
  • cultured cells are differentiated into ectoderm cells, for example, neural tissues or progenitor cells for neural tissue generation.
  • Genes specifically expressed in ectoderm and ectoderm tissues include Nestin, Beta Tubulin III, MAP-2, Neurofilament Heavy chain, Dopamine beta hydroxylase, Neural Neural cell adhesion molecules, S-100, Pax-6, neural tubulin, and choline acetyltransferase, and the like, and other known genes can be used depending on the type of cell.
  • genes such as Nestin, Dcx, Sox1, and HuD can be confirmed, and in the case of fully differentiated neurons, MAP2, NeuN, NF200, and NSE can be identified. In one embodiment of the present invention it was confirmed whether the expression of Nestin.
  • Nestin is a cell marker (specific expression gene) that is specific to neural progenitor cells, and the fact that nestin is expressed in all cells targeted for differentiation enhances the interaction between cells aggregated into a globular form. It suggests itself as a strong signal for ectoderm differentiation.
  • the ectoderm progenitor cells obtained by aggregating stem cells according to the present invention are characterized by expressing at least one of genes such as Dcx, Sox1, and HuD as well as nestin.
  • DCX, Sox1 and HuD genes are known as genes that are characteristically expressed in early neuronal progenitor cells.
  • the method of the present invention has the effect of showing a differentiation rate of 100%, in particular, all stem cells of interest, as compared to the previously known method.
  • the process is very simple, which significantly reduces the time required for differentiation, thereby increasing the viability of differentiated cells and further reducing the risk of contamination by other substances by eliminating differentiation-inducing drugs or gene conversion processes. There is this.
  • stem cells can be more efficiently differentiated into ectoderm cells such as neural progenitor cells or neurons, and the like, particularly for transplantation treatment for various neurodegenerative disorders and neuropathies. Clinical usefulness is great.
  • stem cells were prepared in order to implement the ectoderm differentiation method of stem cells according to the present invention.
  • fetal bovine serum FBS
  • 4ng / ml fibroblast growth factor 4ng / ml fibroblast growth factor
  • 0.1 mM beta-mercaptoethanol ⁇ -mercaptoethanol
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Media
  • hPLCs human placenta stem cells
  • FACS analysis showed positive for CD13, CD9, CD29, CD44, CD90, CD105 and HLA-ABC, as shown in FIG. 1; Negatives were shown for CD117, CD10, CD14, CD24, CD34, CD45, CD50, CD38, and HLA-DR.
  • HPLC having about 70% confluency was exposed to 0.1 ⁇ g / ml of colcemid in a 100 mm culture dish for 2 hours, collected, washed and treated in 75 mM potassium chloride solution at 37 ° C. for 20 minutes. It was. After incubation, the stock solution was washed by centrifugation, and then fixed with 5 ml of a fixed solution containing 3: 1 of methanol and acetic acid.
  • the fixed cells were harvested and resuspended in 0.5 ml of fixed solution. One drop of suspension was dropped on a frozen slide at a height of 30 cm. After drying the slides were exposed to 0.025% trypsin for 30 seconds and washed with PBS. The chromosomes were stained with 10% Giemsa solution and the karyotypes of normal human chromosomes were analyzed by Cytovision of Applied Imaging.
  • Example 2 Induction of differentiation into ectoderm progenitor cells
  • the hPLCs established in Example 1 were incubated in a culture dish coated with 0.1% polyethyleneimine at about 1.0 ⁇ 10 5 cells per cm 2. Meanwhile, in another example, about 1.0 ⁇ 10 5 cells per cm 2 were cultured in a culture dish coated with poly-D-lysine (10 ⁇ g / ml). On day 2, stem cells in each culture dish aggregated with each other without adhering to the culture dish surface to form spheroids.
  • the cultured globulars were transferred onto a cover slip, incubated for about 3 days, fixed with 4% paraformaldehyde solution at room temperature for 15 minutes, and washed with PBS. Fixed cells were diluted in PBS solution with 5% Triton X-100 and 5-10% normal goat serum at the rate indicated by the producer, added to the sample, and then at room temperature. The reaction was reacted overnight for 1 hour or in the cold.
  • TRITC tetrarhodamine isothiocyanate
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the results are shown in FIG.
  • the undifferentiated human placental cells were indicated by NV, Sph when spherical bodies were formed, Adh when the spherical bodies were cultured in a general culture dish, and P5 when the fifth passages of the globular bodies were cultured.
  • 3A is a photograph showing the expression of Nestin about 30% of undifferentiated human placental cells
  • B is a photograph showing that the expression of Nestin is already increased when the globular body is formed
  • C is a globular body Is a photograph showing that all cells express Nestin when incubated in a general culture dish
  • D is a photograph showing that the expression of Nestin is maintained when the globular body is passaged for more than one month.
  • Aa is a photograph showing the nuclei of all cells by Hoechst staining of the cells shown in A of the top photographs A to D of FIG. 3, and Ba is the top of FIG. 3.
  • Hoechst staining of the cells shown in B of the photographs showing the nuclei of all cells Ca is Hoechst staining of the cells shown in C of the top photo of Figure 3 is a photograph showing the nuclei of all the cells
  • Da is photograph D Hoechst staining of the cells shown in the photo shows the nuclei of all cells.
  • Target sequences from cDNA were amplified using the I-taq premix kit (Invitron Biotechnology) under the following conditions: denatured at 95 ° C. for 30 minutes, then denatured at 95 ° C. for 30 seconds and then at 53-60 ° C. 45
  • the synthesized cDNA was amplified by annealing for 35 seconds and repeating the amplification for 45 seconds at 72 ° C. for 35 seconds.
  • FIG. 4A is a photograph confirming the nestin expression by Western blotting for each generation
  • FIG. 4B shows the expression of Sox1, Dcx and HuD increased according to differentiation by RT-PCR, and is characteristic only in stem cells. It is a photograph showing that the expression of Oct4, Nanog, Tbn is reduced. The expression, morphology, and progenitor growth rate of nested cells in these differentiated cells were almost unchanged during 4 weeks of incubation, and the phenotype was maintained even after cryopreservation for more than two months (not shown).
  • Portmann-Lanz et al. (American J Obs Gyn 194; 664-673, 2006) isolated mesenchymal stem cells from different parts of the placenta, namely early chorion, late chorion and early villous, and differentiated them into retinoic acid. When 20-30% of the population was differentiated into ectoderm cells.
  • Yen et al. differentiated cells from the placenta with bFGF, EGF, mercaptoethanol, dimethyl sulfoxide, and butylated hydroxyanisole for 6 days and then treated with retinoic acid for about 10%. Showed ectoderm differentiation, but when IBMX (1-methyl-3-isobutylxanthine) was treated, it was confirmed that about 40-60% of cells differentiated into ectoderm cells.
  • the amount of inoculation of stem cells showing the most effective differentiation efficiency into ectoderm cells was examined. In other words, the cell density in the case where the interaction between stem cells is most effective for differentiation was investigated.
  • Group 1 Inoculate approximately 0.1 ⁇ 10 5 cells / cm2
  • Group 2 about 1.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2; 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2; Inoculate same medium at 3.0 ⁇ 10 5 cells / cm2
  • Group 3 Inoculate at approximately 7.0 ⁇ 10 5 cells / cm2
  • the spherical body was best formed (B of FIG. 5), and the diameter of the spherical body was about 50 to 300 ⁇ m.
  • the size and number of spherical bodies formed were smaller, and the first group inoculated with less than about 0.2 ⁇ 10 5 cells / cm 2 could not form spherical bodies (FIG. 5A).
  • the number of spherical bodies formed decreases gradually, but the size of the spherical body gradually increases (not shown).
  • the shape of the globular body was not constant as in the third group (FIG. 5C), and the cells were too large in size to die without differentiation.
  • the spherical body culture of the present invention is preferably formed by inoculating 0.2 ⁇ 10 5 to 6.0 ⁇ 10 5 / cm 2 stem cells by inoculating the culture vessel.
  • the present invention does not use any biochemical differentiation-inducing substance and differentiates into ectoderm cells using increased intercellular interactions due to the aggregation of stem cells, thereby simplifying the differentiation method and significantly shortening the time required for differentiation.
  • the survivability of differentiated cells is increased and the risk of contamination by other substances can be eliminated by eliminating differentiation-inducing material processing or gene conversion processes. Therefore, as compared with the existing method, it is possible to differentiate stem cells into ectoderm cells by a simpler and safer method, which will be useful for developing cell therapeutics for neurological diseases.

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 성체 줄기세포의 응집에 의해 형성된 구형상체를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 생화학적인 분화 유도 물질을 사용하지 않고, 줄기세포의 응집으로 인한 세포간 상호작용 증가를 이용하여 외배엽성 세포로 분화시키기 때문에, 타물질에 의한 오염의 위험성이 낮을 뿐만 아니라 훨씬 간단하게 성체 줄기세포를 외배엽성 세포로 분화시킬 수 있다.

Description

줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법
본 발명은 줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 성체 줄기세포의 세포 응집에 따른 세포간 상호작용의 증가에 의하여 외배엽성 세포로 분화하도록 유도하는, 줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법에 관한 것이다.
21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다.
줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.
줄기세포 연구의 궁극적인 목적은 원하는 종류의 세포나 조직을 만들어 세포 치료나 조직 공학 등의 기술에 활용하는데 있다. 줄기 세포를 실제적으로 활용하기 위하여 해결해야 할 당면과제는 원하는 세포로 분화를 유도할 수 있는 기술의 개발이다.
줄기세포의 분화 연구과정에서 가장 많은 시간이 걸리는 단계는 특정한 배양 조건이 분화 유도에 미치는 효과를 분석하는 단계이다. 특히, 세포 치료제로서의 줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 줄기세포를 효율적으로 특정세포로 분화시키는 기술이 필요하다.
그 중에서도, 뇌신경계 질환은 다른 어느 질병보다 세포 이식치료에 가장 합당한 대상이라 여겨지는데, 이는 뇌신경계 조직이 다른 조직과는 달리 면역거부반응이 거의 없어, 외부로부터 세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있기 때문이다.
따라서, 줄기세포를 신경 세포와 같은 외배엽성 세포로 분화시킬 수 있는 효과적인 방법이 요구되어지고 있다.
WO 2005/003320은 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법을 개시하고 있으며, 보다 상세하게는 (a) 줄기세포를 염기성 섬유아세포 성장인자로 배양하는 단계; (b) 단계 (a)의 세포를 섬유아세포 성장인자 8과 Sonic Hedgehog로 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 세포를 뇌-유래 신경영양 인자로 배양하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 세포를 신경교 성상세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 방법을 개시하고 있다. WO 2004/093812는 특정 화학구조식을 갖는 화합물이 배아줄기세포가 신경세포로 분화하는 데 유도제로 작용할 수 있다는 것을 개시하고 있다.
그러나, 이러한 기존의 방법은 분화율이 낮아 임상적용이 어려웠고, 분화에 오랜 시간이 걸려 분화과정 중 많은 양의 세포가 죽어 세포의 생존율도 큰 문제가 되어 왔으며, 분화유도 물질 등의 이용에 따른 타 물질에 의한 오염의 위험성도 존재하였다.
이에 본 발명자는 성체 줄기세포를 외배엽성 세포로 분화시키는데 있어서, 기존에 알려진 생화학적인 분화 유도 물질을 전혀 첨가하지 않고 단지 배양조건을 변화시킴으로써 임상적용이 가능한 분화율을 갖는 세포로 분화를 유도할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 성체 줄기세포를 외배엽성 세포로 분화시키는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 성체 줄기세포의 응집에 의해 형성된 구형상체를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법을 제공한다.
특히, 상기 성체 줄기세포의 응집은 외배엽 분화유도용 생화학물질을 함유하고 있지 않고, 폴리에틸렌이민 또는 폴리-D-라이신이 코팅된 배양용기에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 구형상체는 0.2×105∼6.0×105 cells/㎠의 줄기세포를 배양 용기에 접종하여 응집시킴으로써 형성될 수 있고, 바람직하게는 1.0×105∼1.5×105 cells/㎠로 접종할 수 있다. 형성된 구형상체의 크기는 직경 50~400㎛, 특히 100~200㎛인 것이 바람직하다.
도 1은 hPLC의 표면 발현 양상을 보여주는 유세포 분석(FACS analysis) 결과이다.
도 2는 hPLC의 증식 세포수 및 김자 염색에 의한 핵형 분석 결과이다.
도 3은 외배엽 전구세포로의 분화유도된 모습을 면역염색을 이용하여 확인한 현미경 사진이다.
도 4는 분화된 외배엽 전구세포에 대한 웨스턴블럿 결과(A) 및 RT-PCR 결과(B) 사진이다.
도 5는 세포밀도에 따른, 외배엽성 세포로의 분화효율을 나타내는 실험결과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
'줄기세포(stem cell)'란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)될 수 있는 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행될 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 세포학적 유래에 따라 수정란에서 유래하는 '배아 줄기세포(embryonic stem cells)'와 성체 내에 존재하는 각 기관에서 유래하는 '성체 줄기세포(adult stem cells)'로 나눌 수 있다.
'전구세포(precursor cells)'라는 용어는 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전 단계의 세포로서, '신경 전구세포(neural precursor cell)'란 중추신경계를 구성하는 신경세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포 등의 신경세포로 분화할 수 있는 전구세포를 의미한다.
'조직'이라는 용어는 다세포 기관 내에 실질적으로 같은 기능 및/혹은 형태를 가지는 세포의 집합을 의미한다. 전형적으로 기원(origin)이 같은 세포의 집합체이나 같은 기능 및/혹은 형태를 가지는 한 기원이 다른 세포들의 집합체도 될 수 있다.
'분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.
'생화학적인 분화 유도 물질'는 생체내 또는 생체외에서 줄기세포의 특정 세포로의 분화능을 향상시키는 단백질, 지질 또는 탄수화물, 염 (salt), 무기물, 유기물 등의 임의의 생물적 또는 화학적 작용제를 의미하며, 분화된 세포로 분화를 유도하는 것으로 알려진 모든 분화 유도제를 지칭한다. 상기 분화 유도 물질은 단독으로 또는 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명에 대해서 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 "줄기세포"를, 특히 "성체 줄기세포"를 외배엽성 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 영장류의, 보다 바람직하게는 인간 조직 유래 성체 줄기세포를 사용한다.
줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
이러한 줄기세포는 그들의 발생기원에 따라 배아와 성체 줄기 세포로 나눌 수 있고, 본 발명에서는 양자 모두 사용가능하나, 바람직하게는 생물학적, 윤리적, 법적인 문제가 별로 없는 성체 줄기세포를 사용한다.
성체 줄기세포는, 배아 줄기세포처럼, 배양상태에서 자기 증식(proliferation)이 가능하고 또한 배양조건 및 배양상태의 변화에 따라 특징적인 형상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달하는 분화능을 가진다.
상기 성체 줄기세포는 인체에 내재된 조직 특이적 전구세포로 분화할 수 있다. 성체 줄기세포는 체내의 분화된 거의 모든 세포가 될 수 있고, 심장, 췌장, 신경 조직, 근육, 연골 등과 같은 광범위하게 위치한 조직 및 기관에 대한 대체 세포를 생성할 수 있는 가능성을 가지고 있다.
상기와 같은 성체 줄기세포는 영장류, 바람직하게는 인간의 골수, 제대혈, 혈액, 지방, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 뇌, 췌장, 간, 눈 및 태아 조직 등 대부분의 조직으로부터 수득할 수 있다. 바람직한 일 구체예로, 다양한 조직으로의 분화능이 있고, in vitro에서의 조작이 용이하며, 면역조절 능력을 가지고 있는 태반 유래 줄기세포를 사용할 수 있다.
인간의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 각 조직에 적절한, 당업계에 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 수득한 특정 조직을, 트립신 용액 및/또는 콜라게나아제 등을 처리하여 단일 세포체로 분리한 후, bFGF, EGF등의 성장인자(growth factor)를 적합한 양으로 첨가한 적합한 배지에서 배양한 다음, FACS 등으로 분리하거나 성장속도에 따라 성체 줄기세포를 분리하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명은 줄기세포, 특히 성체 줄기세포를 "분화"시키는 방법에 관한 것이다.
통상적으로, 성체 줄기세포를 내배엽성, 중배엽성 또는 외배엽성 세포로 분화시키기 위해서는 각 배엽 특이적으로 분화를 유도하는 생화학 물질을 이용하는 방법이 사용되고 있다.
즉, 기존의 방법들은 외배엽성 세포로의 분화에는 레티노산(retinoic acid), 염화리튬(lithium chloride), 섬유세포성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF), 상피세포성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF) 등을 사용하고 있고, 내배엽성 세포로의 분화에는 베타셀류린(betacellulin), 액티빈(activin), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, shh) 등을 사용하고 있으며, 중배엽성 세포로의 분화에는 덱사메타손(dexamethasone), 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide), 섬유세포성장인자, 혈관내피세포성장인자(VEGF) 등을 사용하고 있는 것처럼, 분화의 방향에 따라 매우 다양한 약물을 사용하고 있으며. 이러한 분화유도용 생화학적 물질들의 다양한 조합을 사용하기도 한다. .
그러나, 앞서 언급한 바와 같이, 이러한 다양한 생화학적 물질들의 사용에도 불구하고 분화율이 낮은 문제가 존재하였다. 현재 문헌상으로는 100%의 분화율은 보고된 바가 없다. 또한, 종래의 방법에 의한 분화 방법은, 대부분 장기간 동안 분화 과정이 진행되므로, 분화과정 중 많은 양의 세포가 죽어 세포의 생존율도 큰 문제가 되어 왔다. 또한, 신경세포를 포함하여 대부분의 분화가 끝난 세포는 더 이상 분열하지 않는 특성이 있으므로, 시기적으로는 줄기세포의 분화 시작 시점에서 대규모의 배양이 필요하다는 제한이 존재하고 있다. 또한, 상기 bFGF, FGF8, SHH, BDNF 등은 대단히 고가여서 경제적으로도 장점이 존재하지 않는다.
특히, 분화율과 관련하여, 종래 방법 중에서 분화율이 가장 높은 것으로 알려져 있는 신경세포의 분화에서조차 분화율이 70% 전후에 불과한 실정이다. 이는 임상적용을 위하여서도 부족한 효율일 뿐 아니라, 미분화 상태에 있을 수도 있는 나머지 다른 30%의 세포의 성격도 정확히 규명되지 않고 있어 더욱 문제가 된다. 즉, 임상적인 측면에서 볼 때, 임상적용 시 또는 생체 이식 시, 성격이 정확하게 판명되지 않은 상기 세포를 함께 이식하는 위험한 결과를 초래한다. 이는 분화 과정이 완료된 후에도 특정 목표로 하는 세포로 분화하지 않고 미분화 상태로 남아 있거나 또는 전혀 예상치 않은 다른 세포로 분화할 가능성을 포함하고 있기 때문이다.
그러나, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하면서, 성체 줄기세포를 약 100%의 효율로 외배엽성 세포로 분화시킨다.
즉, 본 발명은 줄기세포를 "외배엽성 세포"로 "고효율"로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 외배엽 조직 유도용 생화학적 유도체를 사용하지 않고 줄기세포, 바람직하게는 성체 줄기세포를 응집시켜 구형상체를 형성하고, 상기 구형상체를 배양함으로써 외배엽성 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 방법에 따라서, 상기 줄기세포를 응집하면 응집된 줄기세포들 사이의 세포 상호작용이 증대되어 다른 분화 유도 물질 없이도 외배엽성 세포로 분화하게 된다.
앞서 설명한 것 처럼, 외배엽성 세포로의 분화를 위한 기존의 방법은 가용성 인자 및 성장 인자와 같은 생화학적 분화 유도물질을 함유하는 배지에서 배양함으로써 수행되어왔다.
이에 반하여, 본 발명에서는, 성체 줄기세포를 응집시키는 방법으로 줄기세포들 사이의 세포 상호작용을 증대시켜, 특별한 외배엽 분화 유도 물질 없이도 성체 줄기세포를 외배엽성 세포로 분화시키는 것을 특징으로 한다.
이 때, 폴리에틸렌이민이나 폴리-D-라이신을 코팅한 배양용기(접시)에서 성체 줄기세포를 응집시켜 구형상체를 형성시킬 수 있다.
상기 폴리에틸렌이민은 0.01~1%(w/v)의 농도로 물 또는 PBS 등 일반적인 완충용액으로 희석하여 배양접시에 코팅시키는 것이 바람직하고, 0.1%의 농도가 가장 바람직하다. 상기 폴리 D-라이신은 0.1~100㎍/㎖ 농도로 코팅시키는 것이 바람직하고, 1 ㎍/㎖의 농도가 가장 바람직하다.
일반적으로 상기 폴리에틸렌이민이나 폴리-D-라이신은 배양액 표면에서 양전하를 띠게 하여 세포가 표면에 부착하는 능력을 강화시키지만, 줄기세포를 고농도로 배양할 경우, 세포는 배양접시의 표면에 부착하지 못하고 서로 응집하여 구형상체를 이룬다. 줄기세포가 응집하여 형성된 구형상체는 그 직경이 50~400㎛를 형성토록 하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 100~200㎛의 직경을 형성토록 하는 것이 좋다.
이러한 구형상체를 형성시키기 위해 배양용기에 고농도로 접종하는 줄기세포는 0.2 ×105~6.0×105 cells/㎠가 적절하고, 바람직하게는 1.0×105~3.0×105 cells/㎠이고, 가장 바람직하게는 1.0×105~1.5×105 cells/㎠이다. 6.0×105 cells/㎠보다 더 많은 줄기세포를 배양하는 경우에는 형성된 구형상체의 크기가 너무 커서 그 형태가 잘 유지되지 않으며, 0.2×105 보다 적은 수의 줄기세포를 배양하는 경우에는 대부분이 배양 접시 표면에 부착하게 된다.
상기와 같이, 줄기세포가 응집되어 형성된 구형상체를 통상의 배지에 옮겨 배양하면 외배엽성 세포, 예를 들어, 신경 조직 또는 상기 신경 조직 발생용 전구세포로 분화하게 된다.
외배엽 및 외배엽성 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자는 네스틴(Nestin), 베타 튜불린 III, MAP-2, 뉴로필라멘트 헤비 체인(Neurofilament Heavy chain), 도파민 베타 하이드록실레이즈(Dopamine beta hydroxylase), 뉴랄 셀 어드히젼 물질(neurla cell adhesion molecule), S-100, Pax-6, 뉴랄 튜불린 및 콜린 아세틸트랜스퍼레이즈(Choline acetyltransferase)등이 있으며, 세포의 종류에 따라 그 외 공지의 유전자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 신경 전구세포인 경우 네스틴, Dcx, Sox1, HuD 등의 유전자의 발현을 확인할 수 있고, 완전 분화된 신경세포인 경우 MAP2, NeuN, NF200, NSE 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 이 중에서도 네스틴 발현여부를 확인하였다.
네스틴(nestin)은 신경전구 세포에 특유한 세포표지자(marker)[특이적 발현 유전자]로서, 분화의 대상이 된 모든 세포에서 네스틴이 발현되는 사실은 구형상체로 응집한 세포간 상호작용의 강화 자체로 외배엽 분화를 위한 강한 신호(signal)가 됨을 암시한다.
한편, 본 발명에 따라 줄기세포를 응집함으로써 수득한 외배엽성 전구세포는 네스틴(nestin)뿐만 아니라, Dcx, Sox1 및 HuD 등의 유전자들 중에서 적어도 하나 이상을 발현하는 것을 특징으로 한다. 특히, DCX, Sox1 및 HuD 유전자는 발생 초기 신경전구세포에서 특징으로 발현되는 유전자로 알려져 있다.
종래, 배아 줄기세포 등을 외배엽성 세포로 분화시키기 위한 연구가 일부 성공하였지만 분화율이 임상에 적용할 만큼 만족스럽지 못하였고, 따라서 이식 후 기형종(teratoma) 형성의 위험성이 여전히 내재하고 있으므로 실제적 응용이 어려운 상황이었다.
그러나, 본 발명의 방법은 특히, 이전에 알려진 방법에 비하여, 대상이 되는 모든 줄기세포가 분화하는, 100%의 분화율을 나타내는 효과가 있다. 뿐만 아니라 그 공정 역시 매우 간단한 바, 분화에 소요되는 시간을 현저히 단축시킴으로써 분화된 세포의 생존성을 증가시켰고, 나아가 분화 유도 약물 또는 유전자 변환의 과정을 없앰으로써 타 물질에 의한 오염의 위험성도 줄어드는 장점이 있다.
따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법에 의해, 보다 효율적으로 줄기 세포를 외배엽성 세포, 예를 들어 신경 전구세포 또는 신경 세포 등으로 분화시킴으로써, 특히, 다양한 신경변성 장애 및 신경병에 대한 이식 치료에 대하여 임상 유용성이 크다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 즉, 하기 단계들은 하나의 예시로써 설명되며, 본 발명의 범위가 이에 한정되지 않는다.
실시예 1 : 인간 태반으로부터 성체 줄기세포의 분리
우선, 본 발명에 따른 줄기세포의 외배엽 분화 방법을 구현하기 위해 줄기세포를 준비하였다.
마리아 불임병원(한국, 서울)으로부터 배아 이식 후 성공적으로 착상하였으나 이후의 발생이 정상적이지 못하여 초음파검사로 심장이 멎은 것이 확인된 5~7주의 태반을 무균 상태에서 분리하였다. 이를 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)으로 세척하고, 잘게 자른 후, 37℃에서 5~20분 동안 트립신 용액(0/25% trypsin/0.5nM EDTA)으로 처리하여 단일 세포체로 분리하였다. 분리된 세포는 100㎛ 나일론 메쉬를 사용하여 회수한 후, DPBS로 세척하였다.
또 다른 방법으로, 잘게 자른 태반 조직을 그대로 배양 접시에 두어 상기 태반 조직에서 세포가 스며나와 자라도록 유도한 후, 3~7일 후 남은 태반조직 조각을 제거하고 배양 접시에 붙어서 자라고 있는 세포로 하여금 세포주를 형성하도록 유도하였다.
상기 각 방법으로 수득한 세포들에 대하여 원심분리 과정을 거친 후, 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)과 4ng/ml 섬유세포성장인자, 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1% 비필수 아미노산(nonessential amino acids) 및 항생제가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)배지에 부유하여 37℃ 및 5% CO2에서 가습 배양기(humidified chamber)에서 배양하였다.
5일 후 배지를 교환하면서 비부착 조직 찌꺼기(debris)들을 제거하였다. 세포들이 증식하여 배양 표면(75㎠)에서 밀도가 높아질 때(confluent)를 1계대로(passage 1)하였다. 이러한 공정을 거쳐 총 11개의 인간 태반 유래 줄기세포주(human placenta stem cell, hPLC)를 확립하였다.
(1) 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석
hPLC의 표면 항원을 분석하기 위하여 세포를 2mM EDTA/5% FBS를 첨가한 PBS로 수거하고 PBS로 두 번 세척하였다. 그 후 세포 부유액에 2% FBS/PBS 완충액에 적당한 비율로 희석된 FITC 또는 PE(phycoerythrin)가 결합된 항체를 첨가하고 4℃에서 30분간 처리한 후 FACS Vantage SE(Becton&Dickson)로 세포의 형광을 측정하였다. 분석 이전에 사멸한 세포와 잔해들을 제거하기 위하여 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) 5㎍/㎖을 추가하였다. 얻어진 결과는 CellQuest (Becton & Dickinson) 프로그램을 사용하여 분석하였다.
FACS 분석결과, 도 1에 나타난 바와 같이, CD13, CD9, CD29, CD44, CD90, CD105 및 HLA-ABC에 대해서는 양성을; CD117, CD10, CD14, CD24, CD34, CD45, CD50, CD38, 및 HLA-DR에 대해서는 음성을 나타내었다.
이러한 결과는 당업계에 공지되어 있는, 제대혈의 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)에서 발현되는 것들과 유사한 것으로, CD13, CD9, CD90 및 CD105의 발현과 CD45, CD10 및 HLA-DR의 결핍은 양 세포의 공통점으로 나타났으나, 본 발명의 hPLCs에서는 MSCs의 동정 마커인 CD34의 발현은 나타나지 않은 점이 차이점이었다.
(2) 핵형분석(Karyotype analysis)
약 70%의 컨플루언시를 가지는 hPLC를 100㎜ 배양접시에 콜세미드(colcemid) 0.1㎍/㎖을 2시간 동안 노출시킨 후 채취하여 세척과정을 거쳐 37℃에서 75 mM 염화칼륨 용액에 20분간 처리하였다. 배양 후에 원심분리 과정을 통하여 저장 용액을 세척한 후 메탄올 과 아세트산 (acetic acid)을 3:1로 섞은 고정액 5㎖로 고정하였다.
고정한 세포는 채취하여 고정액 0.5㎖에 재부유시켰다. 부유액 한 방울을 30㎝ 높이에서 프로즌 슬라이드(frozen slide)에 떨어트렸다. 건조 후에 슬라이드를 0.025% 트립신에 30초간 노출시킨 후 PBS로 세척하였다. 염색체를 10% 김자 용액(Giemsa solution)으로 염색한 후 Applied Imaging사의 Cytovision으로 정상 인간염색체의 핵형을 분석하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. in vitro에서 눈에 띄는 핵형이나 형태학적 변화없이 90~150일 동안 지속적으로 증식하였다.
실시예 2 : 외배엽 전구세포로의 분화유도
실시예 1에서 확립된 hPLC를 ㎠당 약 1.0×105 cells를 0.1% 폴리에텔렌이민이 코팅된 배양 접시에 배양하였다. 한편, 다른 실시 예를 통해 ㎠당 약 1.0×105 cells를 폴리-D-라이신(10㎍/㎖)으로 코팅한 배양접시에 배양하였다. 2일 째, 각각의 배양접시에서 줄기 세포들이 배양 접시 표면에 부착하지 않고 서로 응집하여 구형상체(spheroid)를 형성하였다.
(1) 면역염색(Immunostaining) 분석
먼저, 상기 줄기 세포 구형상체에 대하여 네스틴 항체에 대해 면역염색(Immunostaining) 분석을 수행하였다.
상기 배양된 구형상체를 커버 슬립(cover slip) 위로 옮긴 후, 약 3일 동안 배양한 다음, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액으로 15분간 실온에서 고정한 후 PBS로 세척하였다. 고정된 세포는 5% 트리톤 X-100(Triton X-100)과 5~10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)을 첨가한 PBS 용액에 생산자가 지시한 비율대로 희석하고 시료에 첨가한 후 실온에서 1시간 또는 냉장 상태에서 밤새 반응시켰다.
다시 2% 트리톤 X-100과 3% 정상 염소 혈청을 첨가한 PBS 용액으로 세척한 후, 실온 또는 냉장 상태에서 TRITC(tetrarhodamine isothiocyanate) 또는 FITC(fluorescein isothiocyanate) 접합체의 2차 항체를 1차 항체와 같은 방법으로 처리하였다. 대조 염색으로 세포핵을 Hoechst 33342(10㎍/㎖, Sigma)로 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과를 도 3에 도시하였다. 분화되지 않은 인간태반세포는 NV, 구형상체를 형성한 경우는 Sph, 상기 구형상체를 일반 배양접시에 배양한 경우는 Adh, 그리고, 상기 구형상체를 5번째 계대 배양한 경우를 P5으로 표시하였다.
도 3의 A는 분화되지 않은 인간 태반세포의 30% 정도가 네스틴의 발현을 나타내는 사진이고, B는 구형상체의 형성 시 이미 네스틴의 발현이 증가하고 있음을 나타내는 사진이고, C는 구형상체를 일반 배양 접시에 배양하였을 때 모든 세포가 네스틴을 발현하고 있음을 나타내는 사진이고, D는 구형상체를 한 달 이상 계대 배양하였을 때 네스틴의 발현이 그대로 유지되고 있음을 나타내는 사진이다. 한편, 계대배양 후, 약 10,000개의 세포를 세어서 살펴본 결과, 모든 세포가 nestin을 발현하였다(도시않음).
또한, 도 3의 중간 사진들 Aa 내지 Da를 살펴보면, 우선 Aa는 도 3의 상단사진들 A 내지 D 중의 A에 나타난 세포를 Hoechst 염색하여 모든 세포의 핵을 나타내는 사진이고, Ba는 도 3의 상단 사진들 중 B에 나타난 세포를 Hoechst 염색하여 모든 세포의 핵을 나타내는 사진이고, Ca는 도 3의 상단 사진들 중 C에 나타난 세포를 Hoechst 염색하여 모든 세포의 핵을 나타내는 사진이며, Da는 사진 D에 나타난 세포를 Hoechst 염색하여 모든 세포의 핵을 나타내는 사진이다.
그리고, 도 3의 하단 사진들 Ab 내지 Db를 살펴보면, Ab는 도 3의 A와 Aa를 합친 사진이고, Bb는 도 3의 B와 Ba를 합친 사진이며, Cb는 도 3의 C와 Ca를 합친 사진이고, Db는 도 3의 D와 Da를 합친 사진이다.
이러한 결과들을 통해, 특히 도3에서 Db panel을 기준으로 볼 때, hPLC간 강화된 세포 상호작용에 의해 외배엽 전구세포로 100% 분화되었음을 확인할 수 있다.
(2) RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 분석
트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 추출하였으며, 슈퍼스크립트 II(Superscript II, Invitrogen)와 올리고-디티(olligo-d(T)20) 프라이머를 이용하여 42℃에서 한 시간, 72℃에서 15분 반응하여 cDNA를 합성하였다. cDNA로부터의 표적 서열은 I-taq premix kit(Invitron Biotechnology)를 사용하여 다음의 조건에서 증폭시켰다: 95℃에서 30분 동안 변성하였으며 그 이후 95℃에서 30초 동안 변성한 후 53~60℃에서 45초 동안 결합(anneal)하고 72℃에서 45초 동안 증폭하는 과정을 35회 반복하여 상기 합성한 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 cDNA는 2% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분리하고 에티움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다.
그 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4에서 분화되지 않은 인간태반세포는 NV, 구형상체를 형성한 경우는 Sph, 구형상체를 배양하여 로제트(rosette) 패턴을 나타낸 경우는 Ros, 그리고 상기 구형상체의 1계대(passage 1)의 세포는 P1, 3계대 세폰포는 P3, 5계대 세포는 P5으로 표시하였다.
도 4의 A 및 B에 도시된 바와 같이, 줄기세포에서 분화에 의하여 유도된 네스틴은 웨스턴블롯팅(western immunoblotting)에 의하여 재차 확인되었으며 RT-PCR에 의하여 DCX, Sox1 및 HuD의 발현을 확인하여 진정한 신경전구세포로 분화하였음을 확인하였다.
구체적으로, 도 4의 A는 각 세대별로 네스틴 발현을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 사진이고, 도 4의 B는 RT-PCR에 의하여 분화에 따라 Sox1, Dcx, HuD의 발현이 증가하였고 줄기세포에서만 특징적으로 나타나는 Oct4, Nanog, Tbn의 발현이 감소하였음을 보여주는 사진이다. 이렇게 분화된 세포에 있어서 네스틴의 발현, 형태, 전구세포의 성장률은 4주 동안 배양하는 동안 거의 변화하지 않았으며 두 달 이상 냉동보관 하였다가 해동시켰을 경우에도 표현형은 유지되었다(도시않음).
이러한 결과는 강화된 세포의 상호작용에 의해서 인간 태반 줄기세포가 외배엽성 세포로 분화(유도)되었음을 나타낸다.
비교예 1 : 외배엽 분화용 생화학 유도인자에 의한 경우와의 비교
Portmann-Lanz등은 (American J Obs Gyn 194; 664-673, 2006) 태반의 각기 다른 부분 즉 early chorion, late chorion 및 early villous에서 간엽줄기세포의 성격을 가지는 세포군을 분리하여 retinoic acid 등으로 분화 시켰을 때 집단의 20~30%가 외배엽성 세포로 분화됨을 확인하였다.
또한, Yen 등은 (Tissue Engineering 14;9-17, 2008) 태반에서 분리된 세포를 bFGF, EGF, mercaptoethanol, dimethyl sulfoxide, butylated hydroxyanisole 등으로 6일 동안 분화시킨 후 retinoic acid 처리하였을 때에는 약 10% 정도가 외배엽성 분화를 보였지만 IBMX (1-methyl-3-isobutylxanthine)를 처리하였을 때에는 40~60% 정도의 세포가 외배엽성 세포로 분화하였음을 확인하였다.
실험예 1 : 최대 분화효율을 위한 세포수
가장 효과적인 외배엽성 세포로의 분화효율을 나타내는 줄기세포의 접종량이 어느 정도인지 알아보았다. 즉, 줄기세포 간의 상호작용이 분화에 가장 효율적인 경우에 있어서의 세포밀도를 조사하였다.
이를 위하여 이하의 3그룹으로 나누어 실험하였다.
1그룹: 약 0.1×105 cells/㎠으로 접종
2그룹: 약 1.0×105cells/㎠; 2.0×105cells/㎠; 3.0×105cells/㎠으로 동일배지에 접종
3그룹: 약 7.0×105 cells/㎠으로 접종
그 결과를 도 5에 도시하였다. 제 2그룹의 경우에 구형상체가 가장 잘 형성되었으며(도 5의 B), 이 때, 구형상체의 직경은 대략 50~300㎛ 정도였다. 그러나 접종 농도가 낮아짐에 따라 형성되는 구형상체의 크기와 수가 작아지다가 약 0.2×105 cell/㎠보다 적은 양으로 접종한 제1그룹의 경우 구형상체를 형성하지 못하였다(도 5의 A). 한편, 2그룹에서 3.0×105 cell/㎠ 이상으로 접종한 경우에도 6.0×105 cell/㎠ 정도까지는, 형성되는 구형상체의 수는 점점 줄어드는 대신 구형상체의 크기가 점점 커지다가(도시 않음) 6.0×105 cell/㎠ 이상으로 접종하게 되면 3그룹에서와 같이 구형상체의 모양이 일정하지 않았고(도 5의 C), 크기도 너무 커져서 내부에 위치한 세포들은 분화를 하지 못하고 죽었다.
따라서, 상기 결과를 통해 본 발명의 구형상체 배양은 0.2×105~ 6.0×105개/㎠의 줄기세포를 배양 용기에 접종하여 응집시킴으로써 형성시키는 것이 바람직함을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 생화학적인 분화유도 물질을 전혀 쓰지 않고, 줄기세포의 응집으로 인한 세포간 상호작용 증가를 이용하여 외배엽성 세포로 분화시키므로, 분화방법을 단순화하였을 뿐만 아니라 분화에 소요된 시간을 현저히 단축하여 분화된 세포의 생존성을 증가시켰고, 분화유도 물질처리 또는 유전자 변환 과정을 없앰으로써 타 물질에 의한 오염의 위험성을 제거할 수 있다. 그러므로, 기존의 방법과 비교하여, 보다 간단하고 안전한 방법에 의해 줄기세포를 외배엽성 세포로 분화시킬 수 있게 됨으로써, 신경 질환 등에 대한 세포 치료제 개발에도 유용할 것이다.

Claims (13)

  1. 성체 줄기세포의 응집에 의해 형성된 구형상체를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 성체 줄기세포의 응집은 외배엽 분화유도용 생화학물질을 함유하고 있지 않은 배양용기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 성체 줄기세포의 응집은 폴리에틸렌이민 또는 폴리-D-라이신이 코팅된 배양용기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민은 0.01~1% 의 농도로 코팅된 것을 특징을 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 폴리-D-라이신은 0.1~100㎍/㎖ 농도로 코팅된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 구형상체는 0.2×105∼6.0×105개/㎠의 줄기세포를 배양 용기에 접종하여 응집시킴으로써 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 1.0×105∼1.5×105개/㎠로 접종되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 구형상체의 크기는 직경 50~400㎛인 것을 특징을 하는 줄기세포의 외배엽 분화 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 구형상체의 크기는 직경 100~200㎛인 것을 특징을 하는 줄기세포의 외배엽 분화 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 인간 유래 성체 줄기세포는 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 지방, 위장관, 태반, 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택된 인간조직 유래 인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 외배엽성 세포는 신경 전구세포 또는 신경세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 신경전구세포는 네스틴, DCX, Sox1 및 HuD로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2537922B1 (en) * 2010-02-18 2021-04-21 Kang Stem Biotech Co., Ltd. Cd49f promoting proliferation, multipotency and reprogramming of adult stem cells through pi3k/akt/gsk3 pathway
KR101490235B1 (ko) * 2011-05-31 2015-02-05 서울대학교산학협력단 조직 재생용 구조체 및 이의 제조 방법
WO2020079981A1 (ja) * 2018-10-17 2020-04-23 株式会社マンダム 皮脂腺の観察方法およびその利用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALAM, S. ET AL.: 'Cell Cycle Kinetics of Expanding Populations of Neural Stem and Progenitor Cells in Vitro' BIOTECHNOL. BIOENG. vol. 88, no. 3, November 2004, pages 332 - 347 *
PARENKKADAN, B. ET AL.: 'Cell-Cell Interaction Modulates Neuroectodermal Specification of Embryonic Stem Cells' NEUROSCI. LETT. vol. 438, no. 2, June 2008, pages 190 - 195 *
SANCHEZ-RAMOS, J. R. ET AL.: 'Neural Cells Derived from Adult Bone Marrow and Umbilical Cord Blood' J. NEUROSCI. RES. vol. 69, no. 6, September 2002, pages 880 - 893 *
SCHULTZ, S. S. ET AL.: 'Human Stem Cells Isolated from Adult Skeletal Muscle Differentiate into Neural Phenotypes' J. NEUROSCI. METHODS vol. 152, no. 1-2, April 2006, pages 144 - 155 *
WANG, T. Y. ET AL.: 'Dynamic Behavior of Cells within Neurospheres in Expanding Populations of Neural Precursors' BRAIN RES. vol. 1107, no. 1, August 2006, pages 82 - 96 *

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