KR101490235B1

KR101490235B1 - 조직 재생용 구조체 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR101490235B1
Application number: KR20120058501A
Authority: KR
Inventors: 조재진
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2015-02-05
Also published as: US20140301987A1; EP2765186A1; KR20120134082A; WO2012165885A1; KR20150035684A; EP2765186A4

Abstract

본 발명은 조직 재생용 구조체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조직 재생용 구조체는 자가 조직을 이용할 수 있어, 안정적으로 이식이 가능하며, 추가적인 생체 고분자 등의 물질 없이 제조할 수 있다. 또한, 직경이 수 μm 내지 수 cm 사이의 원하는 크기로 제조할 수 있으며, 간편하게 대량으로 제조할 수 있고, 세포외기질인 GAG, 콜라겐 등을 다량으로 포함하고 있어, 피부과, 성형외과, 치과, 외과, 정형외과, 비뇨기과, 이비인후과 또는 산부인과 등 다양한 분야에서 조직 재생 또는 필러용으로 이용될 수 있다.

Description

조직 재생용 구조체 및 이의 제조 방법 {Construct for tissue-reconstruction and method for preparing the same}

본 발명은 중간엽 줄기세포의 분화 유도물을 포함하는 조직 재생용 구조체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

상처는 피부 표면의 파괴 유무에 따라, 피부나 점막이 손상되어 내부의 조직이 공기 중에 노출된 절상, 열상, 관통상, 찰과상 등의 개방성 상처(open wound), 및 피부나 점막의 파열은 없으나, 둔기로 인한 타박이나 비꼬임, 충격 당겨지거나, 꺾였을 때 발생할 수 있는 패쇄성 상처(closed wound)로 분류될 수 있다.

상처 치유(wound healing) 과정은 세포 내 인자에 의해 섬유아세포, 혈관내피세포(vascular endothelial cells), 케라티노사이트와 같은 외피세포(epidermal cells)가 증식을 개시하고, 상처 부위로 세포가 이동하여, 육아조직형성 (granulation tissue formation), 신생혈관형성 (angiogenesis) 및 재상피화 (reepithelization)의 과정을 거쳐 조직 재생이 이루어진다.

상처 치유효능을 갖는 인자로는 EGF(epithelial growth factor), aFGF(acid fibroblast growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor), TGF(transforming growth factors) 및 IGF(insulin-like growth factors)와 같은 성장인자, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 비트로넥틴(vitronectin)과 같은 유착인자(adhesion factor), 레티노이드(retinoid)와 같은 화합물을 들 수 있다 (Thiry et al., Exp. Cell Res., 164:1, 1986; McGee et al., J. Surg. Res., 45:145, 1988; JP Publication No.2-167231; Sporn et al., Science, 233:532,1986; Travis and Salvesen, Ann. Rev. Biochem., 52:665, 1983; Ubels et al., Am. J. Ophthalmol., 95:353, 1983; Kastl et al., Ann. Ophthal., 19:175, 1987).

상처가 회복되는 과정은 초기 창상 발생 후 동화(anabolic) 및 이화(catabolic) 과정이 6주 내지 8주간 균형적으로 일어나며, 이 단계에서 일반적으로 30% 내지 40%의 정상피부조직을 포함하는 회복 정도를 나타낸다. 상흔은 콜라겐 섬유가 점진적으로 교차 결합을 일으키면서 항장력(tensile strength)이 증가하여 충혈성의 융기된 상태로 형성되지만, 시간이 지나면서 점차 형태가 피부와 유사한 상태로 돌아간다. 상처 치유과정 중 동화 및 이화단계에서 상호 불균형이 발생한 경우에는 콜라겐이 분해되지 못하여 굳어져 흉터가 융기된 형태로 남아있게 되며, 이러한 조직은 융기형 흉터(hypertrophic scar) 또는 켈로이드(keloids)로 분류된다.

상처 치유에 대한 관심과 이에 따른 여러 시술 또는 약물의 개발은 궁극적으로 흉터 생성을 예방하고자 하는 미용의 목적이 가장 크다. 흉터는 수술적 또는 비수술적 수단을 통하여 치료할 수 있으며, 비수술적 수단은 실리콘 겔, Cordran 및 Scarguard와 같은 밀폐 드레싱(occlusive dressings), 압박을 이용한 치료법, 콜라겐 형성을 억제하는 스테로이드 치료법 등이 있으며, 수술적 수단으로는 냉동치료, 레이저, 수술적 절제방법 등이 사용되고 있다. 수술에 의한 방법은 일반적으로 25% 내지 100%의 흉터 재발률을 나타내기 때문에, 실효성은 없는 것으로 알려져 있다. 그 외에 흉터 부위에 국부적으로 인터페론 또는 베라파밀(verapamil), 블리오마이신(bleomycin), 5-FU(5-fluorouracil), 레티노산(retinoic acid), 이미퀴모드(imiquimod), 테크로리머스(tacrolimus) 또는 보튤리룸 톡신(botulinum toxin)을 주입하는 방법이 있으나, 이러한 방법 또한 치료 효율이 낮고, 흉터 재발률이 높으며, 약물투여에 의한 부작용 때문에 사용이 제한적인 단점이 있다.

최근, 조직 재생효능에 대해 골수 또는 지방조직 유래 다분화성 세포 또는 줄기세포를 조직공학적으로 이용하려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다 (Bi et al., J. Am. Soc. Nephrol., 18(9):2486, 2007; Wagatsuma A, Mol. Cell Biochem. 304(1-2):25, 2007; Song et al., Int. J. Impot. Res., 19(4):378, 2007).

일반적으로 다분화성 또는 줄기세포는 일반적으로 골수에서 획득하는 것이 가장 널리 알려져 있으나, 골수채취가 용이하지 않고, 타인의 줄기세포를 이식할 경우 면역 거부반응의 문제가 있기 때문에, 이런 문제를 해결하기 위하여 줄기세포의 대체 공급원으로 지방조직이 사용되고 있다 (Zuk et al., Tissue Eng., 7:211, 2001; Mizuno et al., Plast. Reconstr. Surg., 109:199, 2002; Zuk et al., Mol. Biol. Cel., 13:4279, 2002).

지방 조직은 지방 흡입술과 같은 비침습적 기술로 다량 확보할 수 있으며, 이러한 지방 흡입물에는 지방 기질세포 (adipose tissue-derived stromal cells)가 존재하는데, 상기 세포는 콜라게나아제에 의한 분해 및 차별적 원심분리방법에 의해 분쇄된 인간 지방조직으로부터 쉽게 얻어질 수 있다. 또한 세포 표면 단백질의 발현이 골수 줄기세포와 동일하지는 않으나 유사하기 때문에, 적절한 배양 조건 하에서 지방세포, 연골세포 및 모골세포 등으로 분화될 수 있음이 입증되어 있다 (Erickson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 290:763, 2002; Halvorsen et al., Tissue Eng., 7:729, 2001; Wickham et al., Clin. Orthop. Relat. Res., 412:196, 2003; Dragoo et al., J. Bone Joint Surg., Br., 85:740, 2003).

지방조직에 존재하는 기질세포는 지방조직 1 g당 8.6 x 10⁴개로 존재하여 줄기세포와는 달리 충분한 양을 얻을 수 있으며, 또한 체외에서 용이하게 배양될 수 있어 대량 공급이 가능하고, 저온 보존이 가능한 장점이 있기 때문에, 다분화능 세포를 이용한 조직 재건(tissue reconstruction)에 이용될 수 있다고 알려져 있다 (US Pat. 6673606).

조직 재건에는 세포의 분화뿐만 아니라, 이를 위한 원활한 신생혈관 형성과정이 필수적이다. 현재 허혈에 대한 치료방법으로 개발된 혈관신생 치료법(Therapeutic Angiogenesis)은 허혈부위 조직에 혈관 발달을 촉진하는 작용을 하기 때문에, 조직 재건 방법에 응용할 수 있다. 이와 같은 기술들은 보다 넓은 관점으로서 피부와 같은 조직의 복원에도 적용할 수 있을 것으로 예상되며, 탯줄 기원의 줄기세포를 이용하는 방안도 고려되고 있다.

이에, 본 발명자들은 조직재생용 구조체를 개발하기 위해 노력한 결과, 추가적인 생체 고분자 등의 물질 없이 중간엽 줄기세포에 물리적 자극을 주어 응집을 유도한 후, 배양하여 수득된 구조체가 우수한 조직 재생 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

국내특허공개번호 : 10-2010-0106905

본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포의 분화 유도물을 포함하는 조직 재생용 구조체 및 이의 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 중간엽 줄기세포의 분화 유도물을 포함하는 조직 재생용 구조체 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 조직 재생용 구조체는 자가 조직을 이용할 수 있어, 안정적으로 이식이 가능하며, 추가적인 생체 고분자 등의 이물질 없이 제조할 수 있다. 또한, 직경이 수 μm 부터 수 cm 사이의 원하는 크기로 제조할 수 있으며, 간편하게 대량으로 제조할 수 있고, 세포외기질인 GAG, 콜라겐 등을 다량으로 포함하고 있어, 피부과, 성형외과, 치과, 외과, 정형외과, 비뇨기과, 이비인후과 또는 산부인과 등 다양한 분야에서 조직 재생, 필러용, volumizer, 결손부위 수복제 등으로 이용될 수 있다.

도 1은 지방 유래 중간엽 줄기세포의 염색 사진을 나타낸 도이다 (H&E, SMA(smooth muscle actin), PDGFR 및 CD146 염색).
도 2는 계대 1 및 2 시기의 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 나타낸 도이다.
도 3은 지방 유래 중간엽 줄기세포의 TEM 사진을 나타낸 도이다.
도 4는 세포의 크기에 따른 세포 수의 분포를 나타낸 도이다.
도 5는 지방 유래 중간엽 줄기세포의 마커를 분석한 도이다.
도 6은 지방 유래 중간엽 줄기세포의 세포 표면 항원을 FACS를 통해 분석한 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 조직 재생용 구조체의 제조 방법을 나타낸 모식도이다.
도 8은 본 발명에 따른 조직 재생용 구조체의 다양한 크기를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 조직 재생용 구조체의 H&E, 알시안 블루, 사프라닌-O, 콜라겐 Ⅰ 및 콜라겐 Ⅱ 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 조직 재생용 구조체 내의 GAG 함량을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 조직 재생용 구조체 내의 유전자 분석 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 (a) 중간엽 줄기세포에 물리적 자극(mechanical stress)을 주어, 중간엽 줄기세포의 응집을 유도하는 단계; 및 (b) 상기 응집된 중간엽 줄기세포를 배양하여 구형(sphere form)의 분화 유도물 및 중간엽 줄기세포가 혼재된 구조체를 수득하는 단계;를 포함하는 조직 재생용 구조체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 조직 재생용 구조체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 (a) 단계는 중간엽 줄기세포에 물리적 자극을 주어 중간엽 줄기세포의 응집을 유도하는 단계로, 이때 물리적 자극은 1G 내지 500G인 것이 바람직하다.

상기 중간엽 줄기세포는 자가 중간엽 줄기세포 또는 동종 중간엽 줄기세포로서, 지방, 탯줄 또는 골수 유래일 수 있으며, 바람직하게는 지방 유래이다.

상기 지방 유래는 자가 혹은 동종 지방 조직 유래로서, 지방줄기세포와 중간엽 줄기세포를 포함하는 지방 조직 유래 세포일 수 있다. 상기 탯줄 유래는 자가 혹은 동종 탯줄 유래로서, 탯줄 주위 중간엽 줄기세포를 포함하는 탯줄 유래 세포일 수 있다. 상기 골수 유래는 자가 혹은 동종 전혈 세포로서 조혈모세포, 중간엽 줄기세포 및 혈관내피전구세포 등을 포함할 수 있다.

상기 (b) 단계는 상기 응집된 중간엽 줄기세포를 배양하여 구형(sphere form)의 분화 유도물 및 중간엽 줄기세포가 혼재된 구조체를 수득하는 단계로, 배양시 분화 유도를 촉진하기 위하여 생리활성물질을 추가적으로 첨가할 수 있다. 상기 생리활성물질은 FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), CTGF(connective tissue growth factor), BMPs(bone morphogenic proteins), LPS(lipopolysaccharide), TNF-α(tumor necrosis factor-α), TGF-α(transforming growth factor-α), TGF-β(transforming growth factor-β), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 덱사메타손(dexamethasone)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 첨가제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 (b) 단계에서 분화유도물은 섬유아세포를 포함한다.

상기 (a) 단계 이전에 중간엽 줄기세포의 응집(aggregation)을 활성화하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 조직 재생용 구조체는 이식 이후, 제거를 위해 MMPs(matrix metalloproteinase)를 추가적으로 처리하는 단계를 거칠 수 있다.

상기 방법에 의해 제조된 조직 재생용 구조체의 크기는 직경 1μm 내지 10cm인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 조직 재생용 구조체는 자가 조직을 이용할 수 있어, 안정적으로 이식이 가능하며, 추가적인 생체 고분자 등의 물질 없이 제조할 수 있고, 직경이 수 μm 내지 수 cm 사이의 원하는 크기로 제조할 수 있으며, 간편하게 대량으로 제조할 수 있고, 세포외기질인 GAG, 콜라겐 등을 다량으로 포함하고 있다.

따라서, 본 발명의 조직 재생용 구조체는 조직 노화로 인한 주름, 피부 처짐, 피부 노화, 볼륨감(volumizing) 등을 개선하기 위한 재료로 쓰일 수 있으며, 보다 구체적으로는 중증 비순주름, 여드름/외상 상처(infraorbital Acne/trauma scarring), 코 옆 주름 (nasolabial folds), 구강 교련 (oral commissure), 턱끝 주름(mental crease), 아래 턱선의 윤곽형성 (jaw line contouring), 미간 주름 (glabellar line), 코 결손 (nasal defects), 광대, 코 끝(nasal tip), 입가 주름 (marionette lines), 크레프트 (Cleft) 등 피부과, 성형외과, 치과, 외과, 정형외과, 비뇨기과, 이비인후과 또는 산부인과 등 다양한 분야에서 조직 재생, 필러용, volumizer, 결손부위 수복제 등으로 이용될 수 있다.

본 발명에서 '조직 재생'은 물리적 원인에 의해 손상된 조직, 노화 또는 상흔이 두드러진 부위를 정상 또는 정상에 가까운 상태로 복귀시키는 작용을 말하며, '조직 치유', '조직 재건' 또는 '조직 수복'의 의미를 포함한다. 본 발명에서 조직 손상은 개방성 상처 및 폐쇄성 상처를 포함하며, 사고로 인한 상처 및 피부이식으로 생긴 상처를 포함하는 인체 또는 동물의 외과적 수술로부터 기인한 상처를 포함할 수 있다.

본 발명에서 "조직재생용 구조체(construct for tissue-reconstruction)"는 체내의 손상된 조직 또는 그 주변에 이식되어 손상된 조직을 재생시킨 후 다시 분리되거나, 혹은 완전히 분해되어 없어지게 되는 구조체를 말한다. 상기 조직재생용 구조체는 체외에서 분화를 유도하여 생체내에 이식되거나, 혹은 별도의 분화 유도없이 생체내에 직접 이식되어 생체내에서 분화가 유도되도록 할 수 있다. 상기 조직재생용 구조체는 체내에 이식되어 신생 혈관이 형성될 때까지는 체액을 통하여 산소와 영양분을 공급받으며, 또한 혈관의 생성(angiogenesis)을 통하여 혈액의 공급이 이루어지면서 증식하여 새로운 조직이나 장기로 형성된다.

본 발명의 조직 재생용 구조체는 생체 적합성 운반체 (carrier)를 추가로 포함하여 조직 내 투여될 수 있다. 상기 운반체는 개체에 대해 독성, 거부반응 또는 자극성에 의한 부작용이 없는 물질로 구성되어 세포가 이식된 부위로부터 멀리 분산되지 못하도록 포집체 또는 지지체의 역할을 하며, 운반체의 성분 또는 구성비는 이식 시술을 수행하는 당업자가 용이하게 결정할 수 있다는 것은 당업계에서 자명하다. 상기 생체 적합성 운반체는 이에 제한되지 않으나, 세포 배양액, 히알루론산, 콜라겐, 트롬빈, 엘라스틴, 황산 콘드로이틴, 알부민 등을 포함한다.

본 발명의 조직 재생용 구조체는 당업계에서 해당 분야의 전문가에 의해 시술할 수 있으며, 조직 재건을 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용할 수 있다. 투여 경로는 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여(sub-dermal), 피내 투여(intra-dermal) 또는 국부 투여 등을 포함하는 비경구 투여가 바람직하고, 보다 바람직하게는 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 나아가 피부 도포로 투여할 수도 있다.

본 발명의 조직 재생용 구조체를 한 번 투여한 후에 조직 내에 원활하게 정착하도록 일정기간 무처치로 조직을 방치하고, 그 후 필요에 따라 조직 재생용 구조체를 재투여할 수 있으며, 상기 투여 및 무처치의 과정을 1회 내지 그 이상으로 반복할 수 있고, 이식 후 무처치로 유지하는 기간은 수일 내지 수개월일 수 있으나, 피험자의 상태에 따라 당업자의 전문적인 지식에 의해 횟수와 기간은 조정될 수 있다.

본 발명의 조직 재생용 구조체는 그 효율을 극대화하기 위하여, 조직 재생용 구조체를 형성하기 위한 물리적 자극을 가하고 72시간 이후에 개체에 적용하는 것이 바람직하다. 물리적 자극을 가하고 72시간 이후에는 세포외기질의 생산이 극대화되며, 섬유아세포의 생산이 유도되기 때문에 보다 우수한 조직 재생 효과가 나타날 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1. 지방 유래 중간엽 줄기세포 분리

피하지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하였다. 보다 구체적으로는, 피하지방 조직을 분리한 후, 세척과 원심분리를 수행하였다. 상기 피하지방 조직에 지방 중량의 1/2에 해당하는 HBSS(Hank`s balanced saline solution, WelGENE, Korea)에 용해된 소화 용액 (digestion solution, 0.1% collagenase type Ⅰ(GIBCO, USA), 0.001% DeoxyribonucleaseⅠ(DNaseⅠ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))을 넣은 후 가위를 이용하여 조직을 잘게 자르고, 주사기를 이용하여 전단 응력(shear stress)을 주었다. 이를 튜브에 분주한 후, 37℃ 항온조에서 30분간 교반 및 배양하였으며, 5분에 한번씩 흔들어주었다. 항온조에서 꺼낸 지방을 100㎛ 메쉬를 이용하여 공극 분포에 따른 상태 (pore-size dependent manner)로 걸러주었다(100, 70, 50, 20, BD Falcon, Bedford MA, USA). 상기 걸러낸 지방을 400g에서 5분간 원심분리하고 상층의 지방 조직을 제거하였다. 이에 10% FBS (fetal bovine serum, Hyclone, Canada)가 들어간 HBSS 용액를 넣어 소화 용액을 비활성화시킨 후, 400g에서 5분간 원심분리하고, 1% 항생제-항진균제 (Antibiotic-Antimycotic, GIBCO, Grand Island, NY) 용액과 20% FBS가 들어있는 DMEM(Dulbecco`s modified Eagle`s Medium, WelGENE, Korea) 배지를 이용하여 모아진 펠렛을 풀고, 35mm 디쉬(SPL, Korea)에 최종적으로 수득된 중간엽 줄기세포를 심었다.

실시예 2. 중간엽 줄기세포 증식

상기 실시예 1에서 수득된 중간엽 줄기세포를 20% FBS(Hyclone, Canada)와 1% 항생제-항진균제 용액이 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다. 증식 효율을 위해 FGF, EGF, PDGF 또는 TGF-β 중 하나 이상을 첨가하였다. 배지 교체는 2일에 한번씩 하였으며, 세포가 70% 컨플루언시(confluency)를 이룰 때, 0.25% trypsin-EDTA(GIBCO, Grand island, NY)를 사용하여 계대 배양하였다. 상기 과정을 통해 수득된 지방 유래 중간엽 줄기세포를 다양한 마커로 염색하였으며, 계대(passage) 1 및 2 시기의 지방 유래 중간엽 줄기세포를 관찰하였다. 상기 결과를 도 1 내지 도 4에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 지방 유래 중간엽 줄기세포는 SMA, PDGFR 및 CD146에 양성을 나타내었다. 또한, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 계대가 계속됨에 따라 정상적으로 증식함을 확인하였다. 또한, 도 4에 나타낸 배와 같이, 크기에 따른 세포의 수 분포를 확인하였다.

또한, 상기 지방 유래 중간엽 줄기세포의 표현형을 면역조직화학분석을 통해 확인하였으며, 세표 표면 항원을 FACS를 통해 분석하였다. 상기 결과를 도 5 및 도 6에 각각 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 지방 유래 중간엽 줄기세포는 비멘틴(vimentin), PDGFR, CD10에 양성을 나타냈으며, CD34, c-kit, Oct4, CD146에는 음성을 나타냄을 확인하였다. 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 중간엽 줄기세포 마커의 최소 요구치인 CD73, CD90, CD105가 높게 발현되었으며, 이 외에도 CD28 및 CD44가 높게 발현됨을 확인하였다. 이에 반해, 조혈모 세포 마커인 CD14, CD34, CD117 및 혈관내피세포 마커인 CD31, 혈액세포마커인 CD45 및 HLA-DR은 거의 발현되지 않음을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 실시예 1에서 분리한 지방 유래 중간엽 줄기세포는 중간엽 줄기세포로서의 고유한 특성을 가지고 있음을 검증하였다.

실시예 3. 중간엽 줄기세포 분화 유도를 통한 조직 재생용 구조체의 제조

상기 실시예 2에서 수득한 단일층으로 배양중인 계대 7 시기의 중간엽 줄기세포를 0.25% trypsin-EDTA를 처리하여 수득하였다. 상기 중간엽 줄기세포의 분화 (differentiation)를 유도하여 3차원 클러스터(구조체)를 제조하기 위하여, 하기와 같이 3가지 방법을 이용하였다.

첫 번째 방법은 1G 미만의 힘을 주기 위하여, 현적배양(Hanging drop)을 이용한 것이었다. 보다 구체적으로는, 세포를 25㎕의 배지에 풀어, 플레이트의 뚜껑 안쪽에 분주하고 조심스럽게 뒤집은 후, 현적 배양한 세포의 배지가 마르지 않도록 3차 증류수를 디쉬의 바닥에 담아두었다. 2-3일 후, 3차원 클러스터(구조체)가 형성되면 마이크로플레이트에 옮겨주었다. 두 번째 방법은 15ml 튜브에 세포를 넣고 50g에서 5분간 원심분리한 후, 감속 (deceleration)없이 정지하여 중간엽 응축 (mesenchymal condensation)을 유도한 후 배양하는 방법이었으며, 세 번째 방법은 15ml 튜브에 세포를 넣고 500g에서 5분간 원심분리한 후 배양하는 방법이었다.

상기 각 방법에 따른 구조체 (펠렛)는 목적하는 구조체의 크기에 따라 수일 내지 수 주동안 37℃, 5% CO₂의 배양기에서 배양하였고, 배지 교체는 3일에 한 번씩 하였다.

이상의 조직 재생용 구조체의 제조방법의 개략도를 도 7에 나타내었다.

상기 과정을 통해 수득된 중간엽 줄기세포의 분화 유도물로서의 조직 재생용 구조체의 형태를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 분화 유도물은 추가적인 생체고분자 등의 성분 없이도, 물리적인 힘의 조절 및 배양 기간 등의 조절을 통해, 구조체의 크기를 수 μm 내지 수 cm의 단위로 제조할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 중간엽 줄기세포 분화 유도를 통한 조직 재생용 구조체의 특성 분석

상기 실시예 3에서 수득한 지방 유래 중간엽 줄기세포의 분화 유도물의 특성을 분석하기 위하여, 수득된 구조체를 4% 포르말린 (Junsei, Japan)에 24시간 고정하고 파라핀에 담갔다. 그 후, 본 발명의 구조체의 성분을 확인하기 위하여 H&E (hematoxylin and eosin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 염색, 알시안 블루 (Alcian blue, Wako) 염색, 사프라닌-O (safranin-O/fast green, Fisher, New Jersey) 염색, 콜라겐 Ⅰ 및 콜라겐 Ⅱ 염색을 수행하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 분화 유도물로서 조직 재생용 구조체는 뮤신(mucin) 및 GAG 등 세포외기질을 포함하고 있으며 (알시안 블루 및 사프라닌-O 염색 결과), 콜라겐 Ⅱ에 비해 콜라겐 Ⅰ을 생산함을 확인하였다. 또한, 상기 염색을 통해 관찰한 중간엽 줄기세포의 분화 유도물의 병리학적 진단을 통해, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 분화 유도물을 수 주간 in vitro에서 배양할 경우, 약 10%의 세포가 섬유아세포(fibroblast)로 분화됨을 관찰하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 구조체를 in vivo에 이식할 경우, 구조체 내의 중간엽 줄기세포가 서서히 섬유아세포로 분화하여 필러, volumizer등으로 이용할 경우, 우수한 효과를 볼 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. GAG ( Glycosaminoglycan ) 어세이

상기 실시예 3에서 수득한 지방 유래 중간엽 줄기세포의 분화 유도물 내의 세포외기질인 GAG(glycosaminoglycan) 양을 측정하기 위해서, Blyscan Sulfate Glycosaminoglycan Assay(biocolor, Belfast, Ireland)를 수행하였다. 보다 구체적으로는, EP 튜브에 상기 구조체을 넣고 파파인 완충액 (papain buffer solution, 100ml of 0.2M sodium phosphate buffer, add 0.1M sodium acetate, 10nM EDTA, 5mM L-cysteine HCl, pH 6.4)에 파파인 (papain, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 10㎕/ml이 들어있는 용액을 500㎕ 넣고 60℃ 항온조에서 24시간 동안 배양한 후, 3300g에서 5분간 원심분리하였다. 상층액과 1mL의 건조 시약을 섞고 30분간 실온에 두었다. 그리고 10000g에서 10분 동안 원심분리 하여 상층액을 제거한 후, 펠렛을 실온에서 건조하였다. 1mL의 분리 시약 (dissociation reagent)을 넣어 펠렛을 용해시키고 96 웰 마이크로플레이트 (NUNC, Denmark)에 분주 후 ELISA 리더기를 이용하여 656nm에서 흡광도를 측정하였다. Chondroitin-4-sulfate를 표준물질로 사용하였고, GAG는 총 DNA 양에 대비하여 표준화 (normalization)하였다. 총 DNA 양은 Pico-green dsDNA assay kit (Invitrogen, USA)를 사용하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 분화 유도물로서 조직 재생용 구조체는 다량의 GAG를 포함하고 있음을 확인하였으며, 특히 G값이 증가함에 따라 GAG의 생산이 증가하였다.

실시예 6. 유전자 분석

상기 실시예 3에서 수득한 지방 유래 중간엽 줄기세포의 분화 유도물 내의 유전자 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 분화 유도물로서 조직 재생용 구조체 내에서 콜라겐 Ⅰ, SOX9, aggrecan등의 발현이 높게 관찰되었으며, 반면에 콜라겐 Ⅱ 및 콜라겐 Ⅹ의 발현은 낮게 관찰됨을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 분화 유도물이 분화 과정에서 세포외기질의 생산을 촉진하는 작용을 하는 것을 확인하였다.

Claims

(a) 지방유래 중간엽 줄기세포에 50 내지 500G의 원심분리를 통한 물리적 자극(mechanical stress)을 주어, 중간엽 줄기세포의 응집을 유도하는 단계; 및
(b) 상기 응집된 중간엽 줄기세포를 배양하여 직경 1μm 내지 10cm인 구형(sphere form)의, 지방유래 중간엽 줄기세포, 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 섬유아세포, 및 세포외기질이 포함된 구조체를 수득하는 단계;를 포함하는 조직 재생용 구조체의 제조 방법.
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제 1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 자가 또는 동종 기원인 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 구조체의 제조 방법.
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제 1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 배양시 생리활성물질을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 구조체의 제조 방법.
제 6항에 있어서,
상기 생리활성물질은 FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), CTGF(connective tissue growth factor), BMPs(bone morphogenic proteins), LPS(lipopolysaccharide), TNF-α(tumor necrosis factor-α), TGF-α(transforming growth factor-α), TGF-β(transforming growth factor-β), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 덱사메타손(dexamethasone)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 첨가제인 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 구조체의 제조 방법.
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