KR100840979B1 - 각막 윤부에서 유도된 다능성 배아 유사 줄기 세포, 분리방법 및 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비배아 조직인 각막 윤부 조직에서 유도된 포유류 다능성 배아 유사 줄기 세포(ELSC)를 기술한다. 본 발명의 ELSC는 시험관 내 배양에서 증식할 수 있고, 배양에서 내배엽, 중배엽 및 외배엽 계통으로 분화하는 능력을 유지하며, 현탁 배양물에 넣었을 때 배아 유사체를 형성할 수 있다. 따라서, 이 세포는 다중 계통 분화 잠재력 및 자기재생능력을 보유한다. ELSC는 전망있는 치료 도구가 될 수 있으며, 다양한 질병, 상태 및 상해에 대하여 새로운 치료 대안을 제공할 수 있다.

각막 윤부, 배아 줄기 세포, 다능성.

Description

각막 윤부에서 유도된 다능성 배아 유사 줄기 세포, 분리 방법 및 이들의 용도{PLURIPOTENT EMBRYONIC-LIKE STEM CELLS DERIVED FROM CORNEAL LIMBUS, METHODS OF ISOLATION AND USES THEREOF}

본 발명은 포유류 다능성 줄기 세포, 바람직하게는 각막 윤부 조직에서 유도된 사람 다능성 줄기 세포의 정제된 제제에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 다능성 각막 윤부 줄기 세포주는 자기재생을 하고 세 가지 모든 배아 배엽(내배엽, 중배엽 및 외배엽)에서 유도된 조직으로 분화하는 능력을 가진다. 또한, 다능성 각막 윤부 줄기 세포주를 분리하는 방법 및 이들의 사용 방법을 개시한다.

초기 발생에서, 포유류 배아 또는 태아의 모든 조직의 궁극적 공급원은 줄기 세포이다. 배아 단계에서, 배아 줄기 세포(ES 세포)는 분화전능성이 있어서 완전한 개체의 모든 세포로 발생할 수 있다. 세포 발생은 세포 증식, 계통 설정 및 계통 진행을 포함한 몇 가지 단계를 거쳐 일어나 분화 세포 유형을 형성한다. 배아 배엽, 외배엽, 중배엽 및 내배엽에서 유도된 것은 세 가지 주요 계통이 있다. 외배엽층은 피부의 표피, 감각 기관, 신경계 및 척수를 형성한다. 중배엽층은 민무늬근, 연결 조직, 혈관, 심장, 혈액 세포 및 골수, 생식기관, 배설계, 가로무늬근 및 골격근을 형성한다. 마지막으로, 내배엽층은 기도 및 위장관의 상피 액피막, 인두, 식도, 위, 장 및 다른 연관 기관을 형성한다. ES 세포는 성체에서 거의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있기 때문에 다능성 줄기 세포로 언급된다.

지난 십 년 동안, 인체에서 대부분의 특성화된 세포로 발생할 수 있는 능력을 가질 뿐만 아니라 배양에서 불명확하게 분열하고 증식하는 능력을 가지는 ES 세포 및 세포주의 분리 및 사용에 관한 연구가 있어 왔다. ES 세포는 그것의 발생 가능성에 고정되지 않고, 시험관 내에서 많은 다른 세포 유형으로 분화할 수 있기 때문에 다능성 줄기 세포로 흔히 언급된다. 고도로 다능성인 배양된 ES 세포는 배양체(胚樣體)로 언급된 현탁 배양물에서 세포 집단을 형성할 수 있다. ES 세포를 비교적 최근에 사람으로부터 분리하였다(Thomson et al., (1998) Science 282:1145-1147; Gearhart, (1998) Science 282:1061-62). 사람 ES 세포에서 유도된 배양체에서, 다양한 세포 유형의 마커를 보유한 분화 세포를 구별하는 것이 가능하다.

사람 ES 세포의 분리는 신규 치료법의 주목할 만한 배열의 전망을 제공한다. 조직 재생 및 복구뿐만 아니라 유전 물질의 표적 전달을 통하여 이러한 세포들로부터 유도된 생물학적 치료는 넓은 범위의 의학 상태의 치료에서 효과적일 것이라고 기대된다. 그러나, 이러한 물질의 막대한 잠재력에도 불구하고, 사람 배아 또는 종결된 임신 기간에서 채취한 태아 조직에서 유도된 사람 다능성 줄기 세포의 사용과 연관된 심각한 윤리적 이슈가 줄기 세포 연구 및 치료를 문제이다. 또한, ES 세포의 사용과 연관된 기술적 이슈는 문제시된다. ES 세포에서 유도된 조직 또는 세포는 대체로 ES 세포가 궁극적으로 치료를 받게 될 환자로부터 유도된 것이 아니기 때문에 의학적 치료에서 사용하기에 이상적이지 않다. 조직 거부 문제를 피하기 위 해서 자가 조직의 사용이 줄기 세포에 기초한 치료에 바람직하다.

I. 성체 줄기 세포

사람 ES 세포와 연관된 문제는 많은 연구자로 하여금 그들의 관심을 태아 조직으로부터 유도된 ES 세포 또는 배아 세포의 것들과 유사한 특성을 가진 미분화 줄기 세포의 가능한 공급원인 성체 조직으로 돌리게 하였다. 출생 후 및 성인을 통틀어 적은 수의 분화된 줄기 세포가 세포의 대체 및 조직의 재생을 위하여 개체에 유지된다는 것이 알려졌다. 실제로, 성체 줄기 세포(또한, "조직 특이적 줄기 세포"로 언급됨)는 골수(Weissman, (2000) Science 287:1442-1446), 신경 조직(Gage, (2000) Science 287:1433-1438), 위장 조직(Potten, (1998) Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 353:821-830), 상피 조직(Watt, (1997) Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 353:831), 간 조직(Alison and Sarraf, (1998) J. Hepatol. 29:678-683) 및 중간엽 조직(Pittenger et al., (1999) Science 284:143-147)을 포함한 성체의 다양한 조직에서 매우 적은 수로 발견되었다.

그럼에도 불구하고, 성체 줄기 세포의 일부 잠재 공급원이 확인되는 동안, 오늘날까지 성체 줄기 세포는 ES 세포에 대한 적합한 대안인 것으로 알려지지는 않았다. 첫째, 성체 줄기 세포는 대체로 자주 용이하게 접근 가능하지 않은 조직에서 단지 소량으로 존재하고, 그 수가 노화됨에 따라 감소하는 것처럼 보이기 때문에 분리하기가 어려울 수 있다. 둘째, 성체 줄기 세포는 그것이 더 작은 수명과 자기 재생에 위한 더 적은 능력을 가지기 때문에 ES 세포보다 배양 조직의 덜 바람직한 공급원으로 여겨진다. 셋째, 성체 줄기 세포는 다능성이지 않고, 조직 특이적이어 서 대체로 자신의 유도된 조직과 밀접하게 연관된 소수 유형의 새로운 세포만을 발생시킬 수 있는 것으로 믿어진다.

ES 세포와 성체 줄기 세포 간에서 한 가지 특히 두드러진 차이점은 현탁 배양물에서 ES 세포는 배양체로 알려진 세포의 집단을 형성할 수 있다는 것이다. 대체로, 이 배양체는 다양한 계통 결정된(lineage-committed) 조직으로 분화하는 세 가지 모든 계통의 배아 세포를 함유한다. 따라서, 배양체는 배양에서 다른 유형의 분화된 세포의 제조에 유용할 수 있다. 현재까지, 배아 유사체와 유사한 구조를 형성할 수 있는, 다른 분리된 성체 줄기 세포주는 보고되지 않았다.

그러나, 최근에 일부 성체 줄기 세포가 다능성을 가진다고 제시되었다. 골수 기질세포 또는 중간엽 줄기 세포로 알려진 조혈모 줄기 세포가 가장 완전히 특성화되었다. 이들이 다능성 특성을 가진 것으로 알려진 최초의 성체 줄기 세포였다(Jiang et al., (2002) Nature 418:41-48). 또한, 다능성 성체 줄기 세포는 간(미국 특허공보 제2003/0186439호), 마우스 내이(Li and Heller, (2003) Nat. Med. 9:1293-1299), 및 양수(Prusa et al., (2003) HuM. Reprod. 18:1489-1493)에서 분리되었다. 또한, 다능성 성체 줄기 세포는 최근에 골격근, 뇌 및 장 상피(Howell et al., (2003) Ann. N. Y. Acad. Sci. 996:158-173.)와 같은 많은 조직에서 기술되었다. 이 논문들은 분리되거나 동정된 성체 줄기 세포가 다능성이라고 보고하였지만, 여전히 이러한 "다능성" 성체 줄기 세포는 ES 세포와는 달리 불과 소수의 계통으로만 분화한다. 또한, 현재까지 보고된 분리된 줄기 세포 중 어느 것도 ES 세포와 유사한 방식으로 배양물에서 배아 유사체를 형성할 수 있는 것으로 보이지 않는다.

II. 각막공막 윤부

상기에서 인용한 성체 줄기 세포의 다른 공급원과 유사하게, 성체 줄기 세포는 눈의 각막공막 윤부에 존재한다고 알려져 있다. 이 세포는 각막 표면의 동적 평형에 참여하고 눈을 깜박거리는 동안 벗겨지고 탈피된 표면의 상피 세포를 대체한다. 화학화상 또는 열화상, 컨택트 렌즈, 중증 미생물 감염, 복합 수술 과정, 냉동요법 또는 안구 반흔성 유천포창과 같은 질병에서 기인한 윤부 줄기 세포에 대한 심각한 손상은 비정상 각막 표면, 광선공포증, 감소된 시력을 야기할 수 있는 윤부 줄기 세포의 파괴 및 윤부 줄기 세포 결핍증을 야기할 수 있다(Anderson et al., (2001) Br. J. Opthalmol. 85:567-575). 이 손상은 윤부 줄기 세포 공급원의 재도입 없이는 복구될 수 없다(Tseng et al., (1998) Arch. Ophthalmol. 116:431-41; Tsai et al., (2000) N. Engl. J. Med. 343:86-93; Henderson et al., (2001) Br. J. Ophthalmol. 85:604-609). 따라서, 자신의 높은 증식 능력을 가진 윤부 줄기 세포는 그것이 각막 표면의 평형을 유지하기에 필요한 각막 상피 세포의 중단되지 않은 공급을 제공하기 때문에 생존가능한 안구 표면의 유지에 명백히 중요하다(Tseng, (1996) Mol. Biol. Rep. 23:47-58).

1980년대에 수행된 실험은 최초로 각막 상피에서 윤부 세포의 존재를 나타내었다(Schermer et al., (1986) J. Cell Biol. 103:49-62; Cotsarelis et al., (1989) Cell 57:201-209). 전사 인자 P-63은 사람 각막 줄기 세포에 대한 특이적 마커인 것으로 후에 제시되었음에도 불구하고, 이 마커는 피부와 같은 다른 상피 세포에서도 발현되므로 각막 줄기 세포에 특이적이지 않다. 또한, P-63 발현은 원칙적으로 사람 각막의 기저 윤부 영역에 한정되는 것으로 나타났음에도 불구하고(Moore et al., (2002) DNA Cell Biol. 21:443-51), 마우스에서 이 전사 인자의 발현은 윤부보다는 중심주위 각막 조직에서 최대였다(Moore et al., (2002) DNA Cell Biol. 21:443-451). 따라서, 현재 윤부 상피 줄기 세포에 대한 공지된 완전 줄기 세포 마커는 없다.

배양에서 자기 재생할 수 있고, 다능성이 있으며, 그들의 세 가지 모든 주요 계통의 세포, 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 분화하는 능력 면에서 ES 세포 유사한 성체 줄기 세포의 공급원을 동정하는 것이 바람직하다. 또한, 이 성체 줄기 세포를 분리하고 배양하며 그것을 다양한 세포 유형으로 분화하도록 유도하는 것이 바람직하다.

발명의 개요

본 발명은 비배아 조직에서 유도된 포유류 다능성 배아 유사 줄기 세포(이하, ELSC; Embryonic-like stem cell), 바람직하게는 각막 윤부 조직의 분리를 설명한다. 특히, 본 발명은

(ⅰ) 시험관 내 배양물에서 증식할 수 있고,

(ⅱ) 배양물에서 내배엽, 중배엽 및 외배엽 계통의 세포로 분화하는 잠재력을 보유하며,

(ⅲ) 현탁 배양물에 넣었을 때 배아 유사체를 형성할 수 있는, 분리된 포유류 다능성 ELSC를 제공한다.

바람직한 구체예에서, 분리된 ELSC는 사람 ELSC이다. 연관된 바람직한 구체예에서, ELSC는 각막공막 윤부 조직, 바람직하게는 사람 조직에서 유도된다. 다른 바람직한 구체예에서, 분리된 ELSC는 배양물에서 20 계대 이상, 더 바람직하게는 50 계대 이상 그리고 가장 바람직하게는 100 계대 이상 동안 시험관 내 배양물에서 실질적으로 미분화 상태로 있다. 바람직하게는, 배양물에서 다중 계대 배양 후, 실질적으로 미분화 ELSC는 정상 핵형 및 고 텔로머라제 활성을 유지한다. 다른 구체예에서, 분리된 ELSC는 최종적으로 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 계통의 세포 또는 조직으로 분화하는 잠재력을 가진다.

또한, 본 발명은

(ⅰ) 각막공막 윤부에서 분리되고,

(ⅱ) 시험관 내 배양에서 증식할 수 있으며,

(ⅲ) 운명 결정된 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포로 분화하는 잠재력을 보유하는, 분리된 포유류 다능성 ELSC를 제공한다.

바람직한 구체예에서, 분리된 ELSC는 사람 ELSC인데, 더 바람직하게는 SSEA-4 양성이다. 관련된 구체예에서, 각막공막 윤부는 사람 피험자로부터 분리된다. 바람직하게는, 분리된 ELSC는 현탁 배양물에 넣었을 때 배아 유사체를 형성할 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 분리된 ELSC는 배양물에서 20 계대 이상, 더 바람직하게는 50 계대 이상, 그리고 가장 바람직하게는 100 계대 이상 시험관 내 배양물에서 실질적으로 미분화 상태로 있다. 바람직하게는, 배양물에서 다중 계대 배양 후, 실질적으로 미분화 ELSC는 정상 핵형 및 고 텔로머라제 활성을 유지한다. 다른 구체예에서, 분리된 ELSC는 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 계통의 세포 또는 조직으로 종국적으로 분화하는 잠재력을 가진다.

또한, 본 발명은

(a) 공여자로부터 각막 윤부 조직을 분리하는 단계;

(b) 배양물에서 각막 윤부 세포를 증량하기 위하여 각막 윤부 조직을 배양하는 단계;

(c) 하나 이상의 미분화 세포 특이적 표면 마커를 선별하기 위하여 각막 윤부 세포를 분류함으로써 배양된 각막 윤부 세포로부터 다능성 ELSC 집단을 분리하는 단계

를 포함한, 포유류 다능성 배아 유사 줄기 세포(ELSC)의 집단을 분리하는 방법을 제공한다.

바람직한 구체예에서, 다능성 ELSC의 분리된 집단은 사람 ELSC인데, 더 바람직하게는 SSEA-4 양성이다. 다른 구체예에서, 각막 윤부 조직의 공여자는 사람이다. 특정 구체예에서, 각막 윤부 조직은 영양소 혈청 및 디메틸 술폭시드(DMSO), 재조합 사람 상피 성장인자(rhEGF), 인슐린, 아셀렌산 나트륨, 트랜스페린, 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 백혈병 억제 인자(LIF)로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 가용성 인자로 더 보충되는, DMEM 또는 F12와 같은 배양 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 각막 윤부 조직은 배양 중인 각막 윤부 세포가 컨플루언트될 때까지 배양된다. 특정 구체예에서, 각막 윤부 조직은 세포외 매트릭스, 예를 들면 Matrigel^TM, 라미닌, 콜라겐-IV, 폴리-L-리신, 젤라틴, 폴리-L-오르니틴, 피브로넥틴 및 이들의 조합 또는 포유류 양막에서 배양된다. 각막 윤부 조직이 세포외 매트릭스에서 배양될 때, 상기 방법은 바람직하게는 다능성 ELSC를 분리하기 전에 배양된 각막 윤부 세포를 세포외 매트릭스로부터 분리하는 단계를 더 포함한다.

바람직한 구체예에서, 각막 윤부 세포는 다능성 ELSC 집단을 분리하기 위한 당업계 주지의 방법, 예를 들면 자기 친화성 세포 분류법(MACS) 또는 형광 활성형 세포 분류법(FACS)을 사용하여 분류된다. 다른 구체예에서, 다능성 ELSC를 분리하기 위하여 선택된 하나 이상의 미분화 세포 특이적 마커는, 한정하는 것은 아니지만, SSEA-4, SSEA-3, CD73, CD105, CD31, CD54 및 CD117를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 각막 윤부 세포는 SSEA-4 양성 ELSC를 선별하기 위하여 분류된다. 특정 구체예에서, 분류된 ELSC는 SSEA-4 양성인 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 다능성 ELSC를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 다능성 ELSC의 분리된 집단은 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 다능성 ELSC를 포함한다. 바람직하게는, 다능성 ELSC의 분리된 집단을 더 배양하여 배양 유사 줄기 세포를 생성한다. 특정 구체예에서, 다능성 ELSC는 영양소 혈청 및 DMSO, rhEGF, 인슐린, 아셀렌산 나트륨, 트랜스페린, bFGF 및 LIF로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 가용성 인자로 더 보충된, DMEM 또는 F12와 같은 배양 배지에서 배양된다.

대안적 구체예에서, 본 명세서에서 개시한 방법에 의하여 분리된 다능성 ELSC는 증식하여 내배엽, 중배엽 또는 외배엽의 세포 또는 조직으로 시험관 내 또는 생체 내에서 분화하는 잠재력을 보유할 수 있다. 바람직하게는, 또한 분리된 다능성 ELSC는 예를 들면 현탁 배양물에 넣었을 때 배아 유사체를 형성할 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 분리된 ELSC는 배양물에서 20 계대 이상, 더 바람직하게는 50 계대 이상 그리고 가장 바람직하게는 100 계대 이상 동안 시험관 내 배양에서 실질적으로 미분화 상태에 있다. 바람직하게는, 다중 계대 후, 배양물 내 실질적으로 미분화 ELSC는 정상 핵형 및 고 텔로머라제 활성을 유지한다. 다른 구체예에서, 분리된 ELSC는 종국적으로 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 계통의 세포 또는 조직으로 분화하는 잠재력을 가진다.

다른 구체예에서, 분리된 다능성 ELSC, 바람직하게는 사람 ELSC는 배양물에서 내배엽 계통 결정 세포 또는 조직, 중배엽 계통 결정 세포 또는 조직, 또는 외배엽 계통 결정 세포 또는 조직으로 더 분화된다. 대안적으로, 분리된 다능성 ELSC는 생체 내에서 내배엽 계통 결정 세포 또는 조직, 중배엽 계통 결정 세포 또는 조직, 또는 외배엽 계통 결정 세포 또는 조직으로 더 분화된다. 다른 구체예에서, 이 ELSC는, 한정하는 것은 아니지만, 산성 섬유아세포 성장인자, bFGF, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 인슐린, 레티노산, 트랜스페린, 인슐린-트랜스페린-셀렌산(ITS), 덱사메타손, 부티르산 나트륨, DMSO, 신경 성장인자(NGF), 시토신 베타-d-아라비노 푸라노시드(AraC), 아교 세포주 유래 향신경성 인자 유전자(GDNF), 형질전환 성장인자 β3(TGF-β3), 아스코르브산, N-아세틸 시스테인, 디부타릴 환상 AMP, 뉴투린, 형질전환 성장 인자 β1(TGF-β1), 인슐린 유사 성장인자 I 또는 II(IGF-I 또는 IGF-II), 상피세포 성장인자(EGF), 골 형성 단백질 2(BMP-2), β 글리세로포스페이트, 아스코르브산 2 인산염, 5-아자-데옥시-시티딘, 온코스타틴, 간세포 성장인자(HGF), 프로게스테론, 니코틴아미드 또는 이들의 임의의 조합을 포함한, 다능성 배아 줄기(ES) 세포의 분화를 유도하는 것으로 알려진 하나 이상의 제제에 ELSC를 노출시킴으로써 더 분화된다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양태를 더 설명하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 있는 특정 구체예의 상세한 설명과 조합하여 하나 이상의 이 도면들을 참고함으로써 잘 이해될 수 있다.

도 1은 윤부 복합이식편술(LCG)이다: (a) H & E 염색된 LCG (전체 고정); (b) SSEA-4 항원에 대한 면역형광법을 사용하여 탐침된 LCG; (c) 양성 대조군으로서 GAPDH뿐만 아니라 다능성 줄기 세포 마커 Oct-4, Nanog 및 Rex 1의 발현에 대하여 RT-PCR에 의한 LCG 분석; 및 (d) 유체 세포측정법에 의하여 LCG에서 분리된 SSEA-4 양성 세포.

도 2는 ELSC의 면역표현형 분석이다: 20 계대 동안 배양된 ELSC는 SSEA-4, CD105, CD73, CD54, CD45, CD34, CD123, CD133, CD 123 및 HLA-DR에 대한 FITC 결합 항체로 표지되었다. ELSC는 SSEA-4, CD105, CD73 및 CD54 항체와 양성 표지를 나타내었는데, 이는 상기 세포가 20 계대 배양 후에 다능성을 유지하고, ELSC가 원래의 조혈모세포가 아님을 나타낸다.

도 3은 분리된 ELSC의 5, 10, 15 및 20 계대 배양 후, 미분화 줄기 세포 마커 Oct-4, Nanog, Rexl 및 TDGF1의 RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일이다. 또한, GAPDH 발현은 양성 대조군으로 분석되었다. hEF(human Elongation Factor;인간 연장인자) 발현 세포는 미분화 줄기 세포 마커의 발현에 대한 음성 대조군으로 사용된 반면, NTERA(NT) 세포는 이 마커의 발현에 대한 양성 대조군으로 사용되었다.

도 4는 ELSC의 핵형 분석이다. 13 계대 배양 후에 분리된 ELSC는 정상 핵형을 유지하였다(CYTOVISION 소프트웨어에 의한 분석).

도 5는 ELSC 및 ELB(Embryoid-Like Body; 배아 유사체)의 위상 콘트라스트 현미경사진(1OX)이다: (a) 15 대 ELSC의 현미경사진; (b) 현탁 배양 4일 후 ELSC로부터 형성된 ELB의 현미경사진; 및 (c) ELSC로부터 형성된 ELB로부터 분화의 개시를 증명하는 현미경사진.

도 6은 ELB 형성의 2일(2d), 4일(4d), 8일(8d), 12일(12d) 및 14일(14d)에 수집한 ELSC(UD) 및 ELB에서 미분화 줄기 세포 마커 Oct-4, Nanog, Rexl 및 TDGF1의 RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일이다. 또한, GAPDH 발현은 양성 대조군으로 분석되었다. hEF 세포는 미분화 줄기 세포 마커의 발현에 대한 음성 대조군으로 사용되었다.

도 7은 ELB 형성의 2일(2d), 4일(4d), 8일(8d), 12일(12d) 및 14일(14d)에 수집한 ELSC(UD) 및 ELB에서 계통 마커 NFH 및 케라틴(신경외배엽 계통 마커); c-액틴(중배엽 계통 마커); 및 AFP 및 알부민(내배엽 계통 마커)의 RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일이다. 각 마커에 대한 양성 대조군(PC)는 하기와 같다: NFH 및 케라틴에 대하여는 태아 뇌 조직 추출물; c-액틴에 대하여는 태아 심장 조직 추출물; 및 AFP 및 알부민에 대하여는 태아 간 조직 추출물. 음성 대조군(NC)은 (-) RT 산물이다.

도 8은 ELB 형성의 2일(2d), 4일(4d), 8일(8d), 12일(12d) 및 14일(14d)에 수집한 ELSC(UD) 및 ELB에서 하기 마커의 RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링이다: 내피 계통 마커인 PECAM; 기질 세포 마커인 KGF 및 콜라겐 I; 및 각막 내피 줄기 세포 마커인 p63. 각 마커에 대한 양성 대조군(PC)은 하기와 같다: PECAM에 대하여는 태아 심장 조직 추출물; KGF 및 콜라겐 I에 대한 hEF 세포; 및 p63에 대하여는 윤부 조직 추출물. 음성 대조군(NC)은 (-) RT 산물이다.

도 9는 ELB의 형성을 통하여 ELSC로부터 분화된 신경세포의 면역형광 분석(10X)이다. ELSC로부터 분화된 신경세포의 면역학적 특성화는 신경세포 마커 β-투불린 III, 신경미세섬유, O4, 글루타민산염, GABA, 티로신 히드록실라제, 세로토닌, 네스틴에 대한 양성 면역형광을 나타내었다.

도 10은 ELB의 형성을 통하여 ELSC로부터 다양하게 분화된 세포 유형의 세포 및 기능 특성화이다: (a) ELB로부터 분화의 개시; (b) 조골세포의 폰 코사(Von Kossa) 염색; (c) 연골세포의 알시안 블루(Alcian Blue) 염색; (d) 지방세포의 Oil Red-O 염색; (e) 항-미오게닌 항체를 가진 근세포의 면역형광; (f) 박동하는 심근세포의 위상 콘트라스트 현미경사진(10X); (g) 항-cTnT 항체를 가진 심근세포의 면역형광; (h) ELSC에서 유도된 성숙한 간세포의 위상 콘트라스트 현미경사진; (i) 항-알부민 항체를 가진 간세포의 면역형광; (j) 불용성 글리코겐 저장소를 나타내는 성숙한 간세포의 PAS 염색; (k) 항-PDX-1 항체를 가진 췌장 베타-섬 세포의 면역형광.

도 11은 RT-PCR에 의한 ELSC에서 유도된 다양한 계통의 분화 세포의 유전자 발현 프로파일이다. 하기 마커의 양성 발현이 발견되었다: c-액틴(심장 세포 마커); NCS(기능성 심근세포 마커); 미오게닌(근세포 마커); 알파-태아단백질(AFP)(초 기 중내배엽 마커); 알부민(간세포 마커); PECAM(내피 세포 마커); 인슐린(췌장 섬 세포 마커); 소마토스타틴(췌장 섬 세포 마커); β-투불린(신경세포 마커); 및 티로신 히드록실라제(TH)(도파민 작용성 신경세포 마커). 또한, GAPDH 발현은 양성 대조군으로 분석되었다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 비배아 세포 또는 조직에서 포유류 다능성 배아 유사 줄기 세포(ELSC)의 분리에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 ELSC의 공급원으로서 포유류 안구 구조, 바람직하게는 각막 윤부 조직을 사용한다. 바람직한 구체예에서, ELSC는 사람 공여자의 각막공막 또는 각막 윤부 조직에서 유도된다. 본 발명의 ELSC는 특히 이들 세포의 몇 가지 유일한 특성에 때문에 이점이 있다: (1) ELSC는 세 가지 모든 배엽, 내배엽, 외배엽 및 중배엽에서 유도된 세포 및 조직을 포함한, 다양한 다른 계통 결정 또는 분화 세포 및 조직 유형의 세포로 분화할 수 있다; (2) ELSC는 다능성, 고 텔로머라제 활성 및 정상 핵형을 유지하면서, 적어도 약 20 내지 약 100 집단 이상으로 배가하는 동안 자기 재생하고 배양물에서 증식할 수 있다; 그리고 (3) ELSC는 배아 유사체(ELB)를 형성할 수 있다.

본 발명의 다능성 ELSC는 거의 모든 세포 유형으로 분화하는 잠재력을 가지는 미분화 또는 실질적으로 미분화 세포이다. 미분화 세포의 형태학적 특징은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 사람 ES 세포는 종종 구별되는 세포 테두리 및 종종 마우스 ES 세포보다 더 편평한 콜로니와 함께 높은 핵 대 세포질 비율, 현저한 핵소체 및 조밀한 콜로니 형성에 의하여 형태학적으로 확인될 수 있다. 또한, 사람 ES 세포는 바람직하게는 사람 다능성 ES 세포, 예를 들면 문헌(Thomson et al. Science 282:1145-1147, 1998 및 Reubinoff et al. Nature Biotech. 18:399-403, 2000)에 기재된 SSEA-3, SSEA-4, GCTM-2 항원 및 TRA 1-60에 대한 마커와 면역반응성이 있다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같이, "비배아 세포 또는 조직"은 배아 세포, 배아 조직, 태아 원시 생식 세포 또는 태아 생식 융기 조직보다는 다른 세포 또는 조직에서 유도된 세포 또는 조직을 가리킨다. 특히, 비배아 세포 또는 조직은 성체 포유동물에서 유도된 세포 또는 조직을 포함하고, 또한 유생 포유동물에서 유도된 세포 또는 조직을 포함할 수 있다. ELSC는 특정 배아 계통으로 결정된 세포로 분화할 수 있지만 그 계통 내에서 다른 세포 유형의 다양한 자손 세포뿐만 아니라 종국적으로 분화된 세포를 야기할 수 있다.

본 발명의 ELSC는 세 가지 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽) 각각의 유도체인세포로 분화할 수 있는 시험관 내 배양물에서 증식될 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같이, 용어 "분화"는 미분화 다능성 줄기 세포 또는 전구 세포가 더 특성화된 운명을 획득하는 과정을 가리킨다. 예를 들면, 내배엽 세포는, 한정하는 것은 아니지만, 상피 세포(예, 각막 상피 세포), 간세포, 베타 섬 세포, 췌장 세포(예, 섬, 포상 및 도관 세포), 기관의 실질 세포, 기관지, 폐, 위장 도관, 방광, 인두, 갑상선, 흉선, 부갑상선, 고실, 인두고막관, 편도선 등을 포함하고; 중배엽 세포는, 한정하는 것은 아니지만, 근세포(예, 민무늬근, 골격근, 심장근, 심근세포), 지방세포(예, 흰색 지방 및 갈색 지방세포), 연골세포, 조혈모세포(예, 적혈구), 림프구, 단핵구, 대식세포, 원형질 세포, B 세포, 자연 킬러 세포 및 비만 세 포, 내피 세포, 미세교세포, 수지상 세포, 거핵 세포, 조골세포, 파골세포, 연골파괴세포, 림프구형 세포 및 편도선, 비장, 신장, 수뇨관, 방광, 정소, 난소, 자궁의 세포 등을 포함하며; 외배엽 세포는, 한정하는 것은 아니지만, 뉴런(도파민 작용성, GABA 작용성, 세로토닌 작용성, 글루탐산 작용성 및 운동 뉴런), 아교 세포(예, 올리고덴드로사이트, 성상세포), 상피세포, 뇌실막 세포, 망막 세포, 송과체 세포, 뇌하수체 후엽 세포, 신경절, 말초 신경세포, 슈반 세포, 감각 신경 말단, 부신 수질, 멜라닌 생성세포, 중간엽 세포, 부여 "C"(칼시토닌 분비) 세포, 장크롬 친화성 세포 및 심장 혈관, 심장 유출관, 표피, 머리카락, 손톱, 땀샘, 침샘, 피지선, 유선, 뇌하수체 전엽, 내이, 눈의 렌즈 세포 등을 포함한다.

또한, ELSC는 배양물, 예를 들면 현탁 배양물에서 배아 유사체(ELB)를 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같이, 용어 "배아 유사체(이하, ELB;Embryoid-Like Body)" 또는 "ELB"는 다능성 ELSC가 현탁 배양물에서 성장하거나 단층막 배양물에서 과성장 했을 때, 발생된 분화 세포 집단을 가리킨다. 또한, ELB는 세포 집단에서 미분화 세포를 가질 수 있다. 통상적으로, ELB는 세 가지 모든 배엽, 외배엽, 중배엽 및 내배엽에서 유도된 세포를 함유한다. 기능적으로, ELB는 ES 세포, 예를 들면 사람 ES 세포의 배양물에서 생성된 배양체와 유사하거나 동일할 수 있다. 배양체와 ELB는 본 개시에서 일차적으로 공급원에 의하여 서로 구별되는데, 즉 배양체는 ES 세포에서 유도되는 반면, ELB는 ELSC에서 유도된다.

본 발명은 다능성 ELSC의 분리 및 이 세포주의 사용을 더 기술한다. 다능성 줄기 세포의 공급원으로서 ELSC의 사용은 많은 이점이 있다. 첫째, ELSC의 사용은 배아 또는 태아 세포 및 조직에서 유도된 세포를 사용하는 연구와 연관된 윤리적 문제 중 많은 것을 제기하지 않는다. 둘째, ELSC의 사용은 클로닝의 중간 단계없이 분화 세포 및 조직의 공급원으로서 의학 치료용으로 사용가능한 자기의 다능성 줄기 세포를 만들 수 있다. 대체로, 이식된 세포 또는 조직은 조직 거부 문제를 피하기 위하여 이식의 수용자와 유전적으로 일치하는 것이 바람직하다. 그러나, 치료가 필요한 환자와 유전적으로 일치하는 ES 세포를 획득하는 대체로 가능하지 않다. ELSC의 사용은 ELSC의 공여자가 또한 ELSC에서 유도된 이식 세포 또는 조직의 수용자라면 이 문제를 극복할 수 있다.

이전에 성체 줄기 세포가 분리되는 동안, 이 성체 줄기 세포주 중 어느 것도 본원 개시의 ELSC의 특징을 가지지 않았다. 예를 들면, 대체로 이전에 분리된 성체 줄기 세포주는 본원 개시의 ELSC와는 다르게 소수의 세포 유형으로만 분화될 수 있었다. 본원 개시의 바람직한 구체예에서, ELSC는 다능성 ELSC의 안전하고, 단순하며, 효율적인 공급원인 각막 윤부 조직에서 유도된다. 따라서, 본 발명은 다능성 줄기 세포의 종래 공급원과 연관된 문제를 미연에 방지한다.

ELSC의 공급원으로서 각막 윤부 조직의 사용의 중요한 이점은 공여자로부터 각막 윤부 조직을 획득하는 것이 상대적으로 용이하다는 데 있다. 상기 과정은 성체 줄기 세포의 다른 유형을 획득하기 위하여 사용될 수 있는 보다 침습성 과정과는 다르게, 가벼운 수술만을 필요로 한다. 각막 윤부 조직은 전방 안구의 외부 표면에 위치한 무혈성 조직인, 투명한 각막에서 발견된다. 그것은 환경적 손상으로부터 보호해주고 빛이 안구로 효율적으로 전달되게 한다. 각막은 두 주요 구획으로 구성된다: (1) 전 비각질 층화 편평 상피층 및 (2) 그 밑에 있는 고유질. 사람 각 막은 세 가지 알려진 세포 유형을 가진다: 각막 상피 세포; 기질 핵형(각막 섬유아세포); 및 기질 연관 각막 상피 세포의 하부층. 각막 상피는 5 내지 7개 세포 두께이고 각막 전면을 덮는 세포 멀티플레이어이다. 원래, 각막 상피 세포의 자연적 뒤집힘이 발생하는데, 이때 얕은 상피 세포는 상피면에서 떨어지고 그 밑에 있는 것으로 대체된다. 주변으로부터 안으로 이동하는 바닥 상피 세포는 더 깊은 각막 상피 세포 집단을 공급한다.

각막 윤부(또한 각막공막 윤부로 알려짐)는 각막과 안구 결막과 공막 사이에 약 1mm 폭의 환상 전환 영역이다. 이것은 투명한 각막과 공막 사이에 선을 표지하는 작은 홈으로 안구의 외면에 나타난다. 이것은 매우 혈관이 많고, 각막의 물질대사에 관여한다. 안정한 전 안구 눈물 필름과 함께 윤부와 결막 상피 세포는 각막의 통합을 유지한다. 공급되는 각막 상피세포의 공급원은 성체 줄기 세포라는 것이 알려진 반면, 이 세포의 정확한 위치와 특성은 알려지지 않았다. 이전에 눈에서 분리된 성체 줄기 세포는 P-63 양성이고, 각막 통합 유지를 책임진다(Pellegrini et al., (2001) Proc. Acad. Natl. Sci. USA, 98:3156-61). 최근에, 이러한 각막 줄기 세포의 형성성은 문헌(Seigel et al., Mol. Vis. 9:159-63, 2003)에 보고되었다. 다능성이 있고 ES 세포와 유사한 특성을 가지는 줄기 세포의 제2 집단의 존재는 알려지지 않았다. 본 발명은 눈의 ELSC의 위치를 각막공막 윤부로 기술한다. 각막 윤부 조직을 분리하기 위한 통상적 과정은 수술에 의하여 공여자 눈의 각막 표면의 상 또는 이면에서 2-3 mm의 윤부 조직으로 구성된 소 생검물을 떼어내는 것이다. 이 생검물을 각막 윤부에서 채취하는 과정은 당업자에게 공지되어 있다.

윤부 조직을 공여자로부터 생검한 후, 배양물, 바람직하게는 세포외 매트릭스 또는 생코팅 표면, 예를 들면 세포외 매트릭스 또는 생코팅 페트리 접시에 놓는다. 윤부 조직을 배양하기에 유용한 세포외 매트릭스의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 단독 또는 다른 세포외 매트릭스 물질과 조합하여 Matrigel^TM과 그것의 균등물, 포유류 양막, 라미닌, 콜라겐-IV, 폴리-L-리신, 젤라틴, 폴리-L-오르니틴, 피브로넥틴 또는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)를 포함한다. Matrigel^TM과 사람 양막은 생검 윤부 조직을 배양하는데 특히 바람직하다. 바람직한 세포외 매트릭스 물질의 사용방법은 하기 실시예에서 설명한다. 생코팅 표면과 함께, 바람직한 윤부 조직 배양 방법은 생코팅 조직 배양 플레이트에 몇 분 동안 외식편(explant)을 건조 인큐베이션하는 것이다. 그 후, 외식편은 그것들이 생코팅 조직 배양 표면에 부착되도록 적은 양의 배양 배지가 있는 조직 배양 접시에 고정된다. 수 시간 내지 1일 후, 배지를 원만하게 첨가하고, 격일마다 배지를 바꿔주면서 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 약 4-5일 동안 세포를 인큐베이션한다.

윤부 조직 세포를 배양하기 위해 사용되는 바람직한 배지는 바람직하게는 성장 인자뿐만 아니라 영양소 혈청, 예를 들면 세포의 성장 및 생존을 유지하는 데 효과적인 영양소를 공급하는 혈청 또는 혈청계 용액(예, 녹아웃 혈청 또는 열 불활성화 사람 혈청)으로 보충된 둘베코 변성 이글 배지(DMEM) 또는 DMEM:F-12 (1:1)이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "성장 인자"는 세포 증식과 분화의 활성화의 일차적 결과로 세포 표면의 수용체에 결합하는 단백질을 가리킨다. 윤부 조직을 배양하는 데 사용되는 성장 인자는 바람직하게는 표피 성장 인자(EGF), 기초 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 인슐린, 아셀렌산 나트륨, 사람 트랜스페린 또는 사람 백혈병 억제 인자(hLIF)뿐만 아니라 이들의 조합에서 선택된다. 그러나, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 배양 배지는 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 윤부 세포는 ELSC가 바람직하게는 배양물에서 증식하도록 야기하는 사이토카인 또는 다른 성장 인자로 처리된다.

윤부 세포가 수일, 바람직하게는 7 내지 21일 동안 또는 세포가 컨플루언트될 때까지 배양된 후, ELSC는 배양물에서 분리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 윤부 세포는 바람직하게는 예를 들면 트립신-EDTA 또는 디스파제 용액을 사용한 효소 분해를 통하여 세포외 매트릭스에서 분리된다. 다능성 ELSC는 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들면 면역표지 및 형광 분류법, 예를 들면 고체상 흡착, FACS, MACS 등을 사용하여 배양하는 다른 윤부 세포에서 분리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, ELSC는 분류법, 예를 들면 특정 세포 표면 마커의 면역형광 분류법을 통하여 분리된다. 당업자에게 잘 알려진 분류법 중 두 가지 방법은 자기 친화성 세포 분류법(MACS) 및 형광 활성화 세포 분류법(FACS)이다.

면역형광 염색 기술과 같은 분류 기술은 ELSC를 배양중인 다른 세포로부터 분리하기 위한 적합한 줄기 세포 마커의 사용에 관한 것이다. ELSC를 배양된 윤부 세포에서 분리하는 데 사용될 수 있는 적합한 줄기 세포 마커는, 한정하는 것은 아니지만, SSEA-4, SSEA-3, CD73, CD105, CD31, CD54 및 CD117를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 다능성 ELSC는 SSEA-4와 같은 세포 표면 마커의 사용을 통하여 MACS에 의하여 분리된다. 이 수단에 의하여, 세포 표면 마커 양성 ELSC의 풍부한 집단이 윤부 세포의 혼합 집단에서 획득된다. 대안적으로, 상기 세포는 다능성 ELSC에서 발견되지 않는 세포 표면 마커를 선별함으로써 바람직하지 않은 세포를 제거하도록 분류될 수 있다. 윤부 조직에서 분리된 ELSC의 경우, ELSC는 하기 세포 표면 마커에 대하여 음성인 것으로 확인되었다: CD34, CD45, CD14, CD133, CD106, CD11c, CD123 및 HLA-DR.

분류법에 의하여 획득된 풍부한 ELSC 배양물은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 다능성 ELSC를 가진다. 바람직한 구체예에서, 분리된 세포는 약 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 SSEA-4 양성 ELSC 세포이다. 대안적인 구체예에서, 다능성 ELSC를 함유한 혼합 세포 배양물은 특정 유전자 마커를 발현하는 ELSC의 존재에 대하여 스크리닝된다. 혼합 윤부 세포 배양물의 경우에, 다능성 ELSC 집단은 예를 들면 OCT-4, Nanog, TDGF, UTX-1, FGF-4, Sox 2, Rex 1와 같은 유전자 마커 뿐만 아니라 미분화 세포의 다른 유전자 마커의 발현에 의하여 확인될 수 있다.

윤부 세포 배양물에서 분리된 ELSC는 ELSC가 실질적으로 미분화 상태로 있도록 적합한 배지에서 배양되거나 계대 배양된다. 집단 내 미분화 ELSC 콜로니가 분화된 인접 세포에 가까이 있을 수 있다고 하더라도, ELSC의 배양물은 그 집단이 적당한 조건 하에 배양되거나 계대 배양되고, 각 미분화 ELSC가 세포 집단의 실질적 부분을 구성할 때 실질적으로 미분화 상태에 있게 될 것이다. 실질적으로 미분화된 ELSC 배양물은 약 20% 이상의 미분화 ELSC를 함유하고, 약 40%, 60%, 80% 또는 90% 이상의 ELSC를 함유할 수 있다. 예를 들면, ELSC는 적당한 세포 밀도로 유지하고, 반복적으로 떼어내고, 세포의 분화를 방지하기 위하여 배양 배지를 자주 교환하는 동안 계대 배양을 하여야 한다. ELSC가 계대 배양될 때, 그것은 소 군집 또는 단일 세포 현탁물로 흩어질 수 있다. 통상적으로, 세포의 단일 세포 현탁물이 획득된 후 다른 조직 배양용 플라스틱 접시에 시딩한다.

세포 배양 및 ELSC를 배양하기 위하여 적용될 수 있는 ES 세포 배양에 관련된 일반적 기술로서, 실시자는 표준 텍스트북 및 리뷰(예를 들면, E.J. Robertson, "Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach" ed., IRL Press Ltd. 1987; Hu and Aunins (1997), Curr. Opin. Biotechnol. 8:148-153; Kitano (1991), Biotechnology 17:73-106; Spier (1991), Curr. Opin. Biotechnol. 2:375-79; Birch and Arathoon (1990), Bioprocess Technol. 10:251-70; Xu et al. (2001), Nat. Biotechnol. 19 (10): 971-4; 및 Lebkowski et al. (2001) Cancer J. 7 Suppl. 2:S83-930)를 참조할 수 있으며, 각각은 본 명세서에서 참고 인용한다.

분리된 ELSC는 바람직하게는 성장 인자뿐만 아니라 영양 혈청, 예를 들면 세포의 성장 및 생존 가능성을 유지시키는 데 효과적인 영양분을 공급하는 혈청 또는 혈청계 용액(예를 들면, 녹아웃 혈청 또는 열 비활성화 사람 혈청)으로 보충된 DMEM 또는 DMEM:F-12 배지와 같은 적당한 세포 배양 배지에서 배양된다. 바람직한 구체예에서, 배지는 성장 인자, 예를 들면 EGF, 염기성 FGF, LIF, 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산 나트륨 및 피브로넥틴으로 보충된다. 일부 구체예에서, ELSC는 피더층에서 배양된다. 피더층에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제5,843,780호, WO 99/20741호). 다른 구체예에서, ELSC는 세포외 매트릭스에서 배양된다. 세포외 매트릭스은 예를 들면 피더 세포에 의하여 제공되는 조건에 유사한, 세포 성장을 지지하기 위한 조건을 제공한다. 또한, ELSC는 예를 들면 피더가 없는 배양물에서 ELSC 세포의 성장을 지지할 수 있는 적합한 배지의 존재 하에 성장할 수 있다. 적합한 배지는 실질적 분화없이 ELSC의 배양을 지지하는 "상태 조절된" 배지를 생산하기 위하여 배지에서 충분한 시간 동안 첫 번째 집단의 세포를 배양함으로써 준비된다.

분리된 ELSC는 실질적으로 분화되지 않으면서 20, 40, 60, 80, 100 이상의 계대 동안 연속적으로 계대 배양시킬 수 있다. 또한, ELSC는 분화 능력의 손실없이 다양한 시점에서 더 사용하기 위하여 냉동시킬 수 있는데, 즉 세포는 적합한 조건에서 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 계통의 유도체로 분화하는 능력을 보유할 것이다. 바람직한 구체예에서, 분리된 ELSC는 20, 40, 60, 80, 100 이상의 계대 동안 고 텔로머라제 활성 및 정상 핵형을 보유한다.

다른 구체예에서, 분리된 다능성 ELSC는 동정되고, 배양물, 예를 들면 현탁 배양물에서 ELB를 형성하는 능력의 특징을 가진다. 바람직하게는, ELB는 외배엽, 중배엽 및 내배엽 계통의 세포로 분화하기 위하여 더 배양할 수 있다. 배양체를 발생시키기 위한 다능성 줄기 세포 배양 방법은 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제 6,602,711호에서 개시한다. 또한, 본 명세서에서 개시하는 ELSC에서 ELB를 발생시키기 위하여 동일한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, ELSC는 트립신을 사 용하여 떼어내고, 비점착성 표면을 가지는 세균학적 플레이트에서 배양함으로써, 플레이트 표면에 ELSC의 부착을 방지한다. 바람직하게는, ELSC는 적합한 세포 배양 배지, 예를 들면 바람직하게는 성장 인자뿐만 아니라 영양 혈청, 예를 들면 세포의 성장 및 생존가능성을 유지하는 데 효과적인 영양분을 공급하는 혈청 또는 혈청계 용액(예를 들면, 송아지 태아 혈청 또는 소 태아 혈청)으로 보충된 녹아웃 DMEM 또는 DMEM:F-12 배지에서 배양한다. 바람직한 구체예에서, 배지는 성장 인자, 예를 들면 인슐린, 트랜스페린 또는 아셀렌산나트륨으로 보충된다. 세포는 ELB를 형성할 때까지 배양한다. 바람직하게는, ELB는 그것이 예를 들면 배양 3-10일, 바람직하게는 4-14일 후 충분한 크기 또는 소정의 분화에 이를 때까지 배양한다. ELB가 특정 세포 유형으로 분화하도록 연속적으로 배양될 때, ELB는 선택된 세포 유형으로 분화를 촉진하기 위하여 충분한 크기로 성장시킬 수 있다. ELB는 기질, 예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 폴리-L-리신, 폴리-L-오르니틴, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, Matrigel^® 또는 이들의 조합을 포함한 세포외 매트릭스 성분으로 코팅된 기질에서 플레이트할 수 있다. ELB는 세포 분산의 유무 하에 기질에서 직접 플레이트할 수 있다.

본 명세서에 개시된 ELSC는 다양한 용도, 예를 들면 치료 및 진단 용도뿐만 아니라 다양한 화합물, 예를 들면 이 세포뿐만 아니라 ELSC에서 유도된 분화 세포에 대한 그것의 효과를 위한 소분자 약물의 시험관 내 및 생체 내 분석 및 스크리닝에 사용될 수 있다. 분화 세포는 계통 결정 전구체 세포이거나 최종 분화 세포일 수 있다. 다능성 ELSC에서 유도될 수 있는 분화 세포 유형의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 신경세포, 각막세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포, 베타-섬, 심근세포, 간세포 등을 포함한다. 본원 개시의 ELSC 및 이들에서 분화된 세포 및 조직은, 한정하는 것은 아니지만, 사람, 영장류 및 가축, 농장동물, 애완동물 또는 스포츠 동물, 예를 들면 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소, 래트, 마우스 등을 비롯한, 치료가 필요한 임의의 피험자를 치료하는 데 사용할 수 있다. 또한, 이 세포는 ELSC뿐만 아니라 이들에서 유도된 세포의 발현 패턴을 분석하고 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여, 사용된 특정 세포에 대한 마커에 특이적인 모노클론 또는 폴리클론 항체를 준비하기 위하여 cDNA 발현 라이브러리를 준비하는 데 사용할 수 있다.

또한, 이 세포는 예를 들면 사람 환자와 같은 피험자의 조직 재구성 또는 재생의 경우 쇠약하게 하는 질병, 상태, 상해 및 장애가 있는 개인의 이익에 따라 치료적으로 사용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료학적", "치료하는", "치료" 또는 "요법"은 치료적 처치와 예방 또는 방지 조치를 모두 의미한다. 치료적 처치는, 한정하는 것은 아니지만, 특정 질환, 상태, 상해 또는 장애의 증상 감소 또는 제거, 또는 기존의 질환 또는 장애의 진행을 서행 또는 경감 또는 치유를 포함한다. 그러한 치료가 필요한 피험자는 기능을 복구 또는 재생하기 위한 조직에 이 세포의 치료학적 유효량에 의하여 처치될 것이다. 본 명세서에서 사용되는, 세포 또는 조직의 "치료학적 유효량"은 특정 세포 유형 또는 조직 유형의 손실, 손상, 부전 또는 변성에 의하여 야기되는, 피험자에게서 생리학적 효과를 중지 또는 개선하는 데 충분한 양이다. 사용되는 세포 또는 조직의 치료학적 유효 량은 피험자의 필요성, 피험자의 연령, 생리학적 상태 및 건강, 소정의 치료 효과, 치료에 표적하고자 하는 조직 면적의 크기, 이식 부위, 병변 정도, 선택된 전달 경로 및 치료 전략에 의존한다. 이 세포 또는 조직은 세포 또는 조직이 의도된 조직 부위에 이식되고, 기능적으로 결함이 있는 부위를 재구성 또는 재생하는 방식으로 환자에게 투여될 수 있다.

하기는 간단하지만, 결코 ELSC 또는 이들에서 유도된 분화 세포 또는 조직의 투여를 통하여 잠재적으로 치료가능한 사람 질병 및 상태를 총망라하는 목록이 아니다: 신경변성 장애 및 신경 질환, 예를 들면 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 루이 소체 치매, 췌장 질환, 예를 들면 당뇨병 및 소아성 진성 당뇨병, 심혈관 및 심장 질환, 예를 들면 심장 경색, 후천성 면역결핍증(AIDS), 조혈모 질환, 예를 들면 림프종 및 백혈병, 소뇌성 실조증, 진행성 핵상 마비, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 간질, 다발성 경화증, 화상, 발작, 허혈, 신경계의 외상, 신경독성 손상 및 척수 손상.

본원 개시의 ELSC는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의하여 분화하도록 유도될 수 있다. ES 세포 또는 성체 줄기 세포를 특정 세포 유형, 예를 들면 본 명세서에서 이들 모두를 각각 참고 인용하는, 신경 전구세포, 신경세포 또는 신경로세포(미국 출원번호 제09/970,382호, WO 01/88104호, WO 03/000868호, WO 01/68815호, WO 01/83715호 및 미국 출원번호 제10/157,288호 및 제10/127,740호), 조혈모세포(미국 특허 제6,280,718호, WO 01/34776호), 심근세포(WO 03/006950호), 간세포(미국 특허 제6,458,589호 및 제6,506,574호), 상피세포(WO 03/40319호), 인 슐린 생산 세포(WO 02/92756호) 및 내분비세포(WO 02/59278호)로 분화시키기 위한 많은 방법이 당업자에게 잘 알려져 있다. 이 방법들이 원래 ES 세포 또는 성체 줄기 세포를 특정 세포 유형으로 분화하는 데 사용되었다 하더라도, 이들은 또한 본 명세서에 설명한 ELSC를 분화시키는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 콜로니, ELB 또는 다른 집합체의 형성을 통한 분화(WO 01/62899호, 본 명세서에서 각각 참고 인용) 뿐만 아니라 분화를 억제하는 혈청 또는 인자 및/또는 분화를 촉진하는 첨가제를 제거함으로써 특정 세포 계통으로의 분화를 촉진하는 방법을 포함할 수 있다. 또한, 세포의 분화는 특정 세포외 매트릭스, 예를 들면 폴리-o-오르니틴, 라미닌 또는 Matrigel^TM의 사용에 의하여 촉진될 수 있다. 또한, ELSC는 예를 들면 중간 단계로서 ELB를 형성하지 않고 결정된 전구체 세포 또는 완전 분화 세포로 직접 분화될 수 있다.

ELSC의 분화를 유도하는 바람직한 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 프로게스테론, 푸트레신, 라미닌, 인슐린, 아셀렌산 나트륨, 트랜스페린, 뉴투린, 소닉 헤지호그(SHH), 노긴, 폴리스타틴, 레티노산, 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자의 임의의 유형, 시토신 β-d-아라비노 푸라노시드(Ara-C), 성장 및 분화 인자 5(GDF-5), 뉴로트로핀족의 구성원(신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀 3(NT-3), 뉴로트로핀 4(NT-4), 뇌유래 신경영양성 인자(BDNF), 변형성 성장 인자 α(TGF-α), 변형성 성장 인자 베타-1(TGF β1), 변형성 성장 인자 베타-3(TGF β3), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1), 골 형성 단백질(BMP-2, BMP-4), 아교 세포 유래 신경영양성 인자(GDNF), 미드카인, 아스코르브산, 아스코르브산 2 인산, 디부티릴 cAMP, 도파민, gp130과 복합체를 형성하는 수용체의 리간드(예를 들면, LIF, CNTF, SCF, IL-11 및 IL-6), 인슐린-트랜스페린-셀렌산(ITS), 덱사메타손, 부티르산 나트륨, 디메틸 술폭시드(DMSO), N-아세틸-시스테인, 인슐린 유사 성장 인자 I 또는 II(IGF-I 또는 IGF-II), β 글리세로포스페이트, 5-아자-데옥시-시티딘, 온코스타틴, 간세포 성장 인자(HGF), 니코틴아미드 또는 이들의 조합을 비롯한 분화제의 사용을 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "섬유아세포 성장 인자" 또는 "FGF"는 이 인자 및 이것의 기능성 단편을 발현하는 임의의 개체에서 유도된 임의의 적합한 섬유아세포 성장 인자를 의미한다. 다양한 FGF는 당업자에게 공지되어 있으며, 한정하는 것은 아니지만, FGF-1(산성 섬유아세포 성장 인자), FGF-2(염기성 섬유아세포 성장 인자), FGF-3(int-2), FGF-4 (hst/K-FGF), FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8 및 FGF-9을 포함한다. 또한, 분화 영양 배지는 중성 세포 유지를 도와주는 첨가제, 예를 들면 N2 및 b-27 첨가제(Gibco)를 함유할 수 있다. 다능성 ELSC는, 한정하는 것은 아니지만, DMEM, DMEM-F-12, MCDB, 신경기초 배지, 뉴투린, N2, B27 등 또는 이들의 조합을 비롯한, 다양한 사용가능한 배양 배지에서 분화하도록 유도할 수 있다.

배양 배지에서 분화 세포의 존재는 당업자에게 공지된 많은 방법 중 임의의 하나에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 분화 세포의 결정은 세포 표면 마커, 단백질 또는 유전 마커의 다른 유형의 존재를 탐지하기 위하여 유체 세포측정법, 면역화학, 면역형광 염색법 또는 다른 염색 기술, 예를 들면 조골세포의 폰 코사 염색, 연골세포의 알시안 블루 염색 또는 지방세포의 Oil Red-O 염색과 같은 방법에 의하여 수행할 수 있다. 대안적으로, 분화 세포를 확인하는 것은 RT-PCR, HPLC 등을 사용하여 RNA 또는 단백질과 같은 특정 유전자 또는 유전자 산물의 발현을 검출함으로써 수행될 수 있다.

하기는 다능성 ELSC를 특정 세포 유형으로 분화시키기 방법의 대표적 목록이다. 이 목록은 결코 총망라한 것이 아니고, 단지 설명하기 위한 목적으로 의도된 것이다. 한 특정 구체예에서, 다능성 ELSC는 그 세포를 약 4 내지 14일 동안 B-27, N2, 인슐린-트랜스페린 및 레티노산 존재 하의 아셀렌산염, 염기성 FGF 및 Ara C로 보충된 신경기초 배지에서 배양함으로써 뉴런으로 분화하도록 유도할 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 다능성 ELSC는 직접 또는 ELB를 산성 GF, 염기성 FGF, HGF, 온코스타틴, 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린-셀렌산(ITS), DMSO, 5-아자시티딘, 부티르산 나트륨 또는 이들의 조합에 노출함으로써 간세포로 분화하도록 유도할 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 다능성 ELSC는 직접 또는 ELB를 TGF-β1, IGF-I, IGF- II, BMP-4, 염기성 FGF, FGF-4, PDGF-BB, 5-아자-데옥시시티딘, 인슐린, EGF 또는 이들의 조합에 노출함으로써 심근세포로 분화될 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 다능성 ELSC는 직접 또는 ELB를 N2, B27, 니코틴아미드, 염기성 FGF, TGF-β1 또는 이들의 조합에 노출함으로써 베타-섬으로 분화될 수 있다.

다른 특정 구체예에서, 다능성 ELSC는 직접 또는 ELB를 TGFβ, 아스코르브산 2 인산 또는 이들의 조합에 노출함으로써 연골세포로 분화될 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 다능성 ELSC는 직접 또는 ELB를 덱사메타손, β-글리세로포스페이트, 아스코르브산 2 인산, 히드로코르티손 또는 이들의 조합에 노출함으로써 조골세포로 분화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 다능성 ELSC는 직접 또는 ELB를 덱사메타손, 이소부틸메틸크산틴(IBMX), 인도메타신, 인슐린 또는 이들의 조합에 노출함으로써 지방세포로 분화될 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 다능성 ELSC는 직접 또는 ELB를 5-아자시티딘, PDGF-BB 또는 이들의 조합에 노출함으로써 근세포로 분화될 수 있다. 또한, 본 발명은 예를 들면 세포가 10% 디메틸 술폭사이드(DMSO) 또는 다른 적합한 배지에 냉동보존되고 액체 질소에 보관되는, 다능성 ELSC의 냉동보존 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 세포 기반 치료용 다능성 ELSC의 사용을 고려한다. 문헌에 보고된 바와 같이, 질환 또는 상해에 기인하여 실질적으로 손상된 사람 조직을 재생하는 능력은 성인의 경우 현저히 감소한다. 본 명세서에 개시된 다능성 ELSC는 종국적으로 적합한 세포 또는 조직 유형으로 분화하거나 적합한 계통 결정된 전구체 세포로 분화하도록 유도될 수 있고, 그 후 이것은 세포 대체 치료 또는 조직 재생을 위하여 포유류 피험체 내로 투여되거나 이식될 수 있다. 대안적으로, ELSC는 피험자에게 직접 투여될 수 있다. 따라서, 본원 개시의 방법은 많은 질환, 상해 또는 다른 해로운 상태의 치료에 사용될 수 있다. 본원 개시의 다능성 ELSC는 시험관 내 또는 생체 내 어디에서나 분화하도록 유도할 수 있다.

또한, 본원 개시에 따라서 생성된 ELSC는 발생의 세포 및 분자 생물학, 기능 유전체학뿐만 아니라 치료 또는 예방 이식, 처치, 약물 스크리닝 또는 시험관 내 약물 발견에 사용하기 위한 분화 세포의 생성의 연구에 사용될 수 있다. 예를 들 면, ELSC는 mRNA, cDNA 또는 게놈 라이브러리를 생산하고, 한정하는 것은 아니지만, 사람화 모노클론 항체(WO 01/51616호, 본 명세서에서 특별히 참고 인용함)를 포함한, 특이적 폴리클론 또는 모노클론 항체를 생산하며 또는 ELSC 및 이들에서 유도된 세포 또는 조직에 미치는 다른 시험 화합물 또는 생물학적 활성 분자, 예를 들면 약물 연구에서 약학적 화합물의 효과를 스크리닝하기 위하여 게놈 분석에 이용될 수 있다. 스크리닝되는 시험 화합물 또는 생물학적 활성 분자는 예를 들면 식물, 식물계 추출물 또는 합성 공급원에서 유래될 수 있다. 또한, ELSC는 배양하는 ELSC의 특성 및 다양한 특정 세포 및 조직 유형으로의 분화에 영향을 미치는 인자(예를 들면 소분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 등) 또는 조건(예를 들면 세포 배양 조건 또는 조작)을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.

ELSC에서 유도된 분화 세포, 예를 들면 신경세포, 베타-섬, 심근 세포, 간세포, 각막 세포, 조골세포, 연골세포 및 지방세포는 3-D 재구성에 의하여 사람 몸 기관을 발생시키는 데 사용될 수 있는데, 예를 들면 사람 뇌 조직은 사람 ELSC에서 유도된 뉴런의 3-D 배양에 의하여 재구성될 수 있다. 유사하게, 다른 사람 몸 기관 또는 부분, 예를 들면 간, 심장, 신장, 피부, 눈, 귀 등은 다능성 ELSC에서 유래하고 재구성될 수 있다. 또한, 본원 개시의 ELSC는 예를 들면 필요한 ELSC를 유전학적으로 조작하고 분화시켜, 그 세포 또는 조직을 유전자 치료용 공여자의 표적 부위에 전달함으로써, 다양한 치료적 활성 분자 또는 유전자를 사람 몸의 다양한 부위에 전달시키는 캐리어 비히클로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약학적 개입 및 약물 발견, 분석 및 시험용 사람 기반 세포 분석을 위한 세 가지 모든 배엽 계통의 세포로 분화하는 유일한 능력을 가진 다능성 ELSC의 사용 방법을 제공한다.

하기 실시예는 본원 개시의 바람직한 구체예를 설명하고자 하는 것이다. 당업자라면, 하기 실시예에서 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 본 발명자에 의하여 개발된 기술을 나타내고, 따라서 그 실시에 대한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 생각할 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 당업자는 본원의 개시에 비추어, 많은 변형이 개시된 특정 구체예에서 이루어질 수 있고, 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 여전히 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다.

실시예 1

1) 윤부 조직 생검물의 수집

사람 환자로부터 윤부 조직 생검물의 수집을 시작하기 전에, 임상시험 심사 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 얻었다. 고지된 동의서를 각각의 환자 및 공여자로부터 얻었으며, 모든 사람 피험자는 헬싱키 협정에 따라서 처리하였다. 공여자 눈의 2-3 mm 윤부 생검물을 층판 각막 절제술에 의하여 각막 표면의 상부 또는 측두 사분역으로부터 외과적으로 수집하였다. 절개 후, 생검물은 전달 배지로 채운 2 ml 전달 바아알에 즉시 넣었다. 절단 배지는 둘베코 변성 이글 배지(DMEM) 및 햄 F-12 배지로 구성되고(DMEM:F-12; 1:1), 5% 태아 소 혈청(FBS) 또는 제대혈에서 수집한 5% 사람 혈청, 0.5% 디메틸 술폭시드(DMSO), 2 ng/ml 재조합 사람 표피 성장 인자(rhEGF), 5 μg/ml 인슐린, 5 μg/ml 트랜스페린, 5 μg/ml 아셀렌산 나트륨, 0.5 μg/ml 히드로코르티손, 0.1 nmol/l 콜레라 독소 A, 50 μg/ml 겐타마이신 및 1.25 μg/ml 암포테리신 B로 보충된다. 또한, 혈액 샘플은 각각의 공여자로부터 수집하고, 각각의 윤부 조직 생검물과 함께 중앙에 위치한 cGMP 설비로 전달하였다. 혈액 샘플을 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 매독 및 CMV를 비롯한 감염 질환에 대하여 즉시 테스트하였다.

2) 윤부 생검물을 위한 세포외 매트릭스의 제조

본 명세서에 설명한 연구 전체에 걸쳐서, 적합한 세포외 매트릭스 담체, 예를 들면 Matrigel^TM, 피브리노겐, PDGF, 라미닌, EGF, 콜라겐 V 또는 사람 양막을 윤부 조직 생검물을 배양하는 데 사용하였다. 특정 연구에서, 세포외 매트릭스 담체는 성장 인자와 함께, 예를 들면 EGF, 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 인슐린 단독으로 또는 조합하여 부착 인자, 예를 들면 라미닌, 콜라겐 V, PDGF, EGF 또는 피브리노겐 단독으로 또는 조합하여 처리될 수 있다. 본 발명에서, Matrigel^TM(BD Biosciences)은 바람직한 세포외 매트릭스 캐리어이다.

Matrigel^TM 코팅된 조직 배양 플레이트를 준비하기 위하여, Matrigel^TM을 겔의 형성을 피하기 위하여 천천히 4℃에서 밤새 녹였다. 완전히 녹인 후, 차가운 녹아웃 DMEM 10 ml을 10 ml Matrigel^TM을 함유한 병에 첨가하고 혼합하였다. 혼합물을 얼음에 넣고, 잘 혼합하고, 1 ml 분액을 준비하여 코팅 플레이트가 필요할 때까지 -20℃에 보관하였다. 필요한 경우, 겔의 형성을 피하기 위하여 각 Matrigel^TM을 2시 간 이상 4℃에서 천천히 녹였다. 그 후, 분액을 차가운 녹아웃 DMEM에서 1:15로 희석하고, Matrigel^TM 용액 1 ml을 35 mm 또는 60 mm 플레이트 코팅을 위하여 첨가하였다. 상기 용액을 플레이트에 부은 후, 플레이트를 실온에서 1-2 시간 동안 또는 4℃에서 밤새도록 설정하였다. 설정 후, 사용 전에 임의의 잔여 Matrigel^TM 용액을 플레이트에서 제거하고, 사용 전에 플레이트를 녹아웃 DMEM으로 세척하였다.

3) 윤부 생검물을 위한 양막 배양의 제조

양막 배양은 사람 피험자에서 분리한 윤부 조직 생검물을 배양하는 데 사용된다. 이 양막 배양의 준비는 사람 태반막의 수집으로 시작된다. 태반막은 선택적 제왕절개 수술에서 수집되고, 50 유닛/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신, 50 μg/ml 네오마이신 및 2.5 μg/ml 암포테리신 B로 보충된, 둘베코 인산 완충 염수(DPBS)로 구성된 전달 배지의 실험실 설비로 전달되었다. 태반막을 수술 3 시간 내에 실험실로 전달하였다. 또한, 혈액 샘플을 각 공여자로부터 수집하고, 전술한 감염성 질환 진단 테스트에 보내었다.

접수하자마자, 태반을 세척하여 점액과 응혈을 제거하였다. 세척 배지는 50 유닛/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신, 100 μg/ml 네오마이신, 2.5 μg/ml 암포테리신 B로 보충된 둘베코 인산염 완충 염수(DPBS)로 구성되었다. 태반 조직을 멸균 가위를 사용하여 양막으로부터 제거하고, 양막을 7 회 이상 꼼꼼하게 세척하여 실질적으로 모든 응혈을 제거하였다. 그 다음, 융모막을 무딘 집게로 양막에서 박리하고, 양막의 상피층을 세척 배지로 5회 세척하였다. 그 후, 양막을, 멤브레인 의 상피층을 위로 향하게 멸균 니트로셀룰로스 멤브레인 상에 놓았다. 멤브레인을 5 cm x 5 cm 면적의 시편으로 전달하고, 각각의 시편을, DMEM 중의 50% 글리세롤로 구성된 냉동 배지로 채운 냉동 바이알에 넣었다. 가공된 양막의 각각의 뱃치를 멸균, 뿐만 아니라 사용 전에 윤부 배양에 사용되기 전에 미코플라스마 또는 내독소 오염의 부재에 대하여 확인하였다. 양막의 시편을 -80℃에서 각각 저장하였다.

윤부 조직 생검물을 배양하기 위한 양막 배양은 먼저 시편을 실온에서 20 분 동안 해당함으로써 양막의 이들 시편으로부터 제조하였다. 그 다음, 각각의 양막을, 바람직하게는 표면이 파열되지 않게 무딘 집게를 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로부터 신중하게 제거하고, 100 mm 페트리 플레이트 내 멸균 유리 슬라이드에 놓았다. 그 다음, 소부피의 트립신(0.05% 트립신-EDTA 1.0-1.5 ml)을 가하여 양막을 피복하고, 양막을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 양막의 상피층을 멸균 무균 조건 하에 세포 스크레이퍼로 벗겨내었다. 그 다음, 양막을 세척액으로 3 회 세척하였다. 배양물 내 세포외 캐리어 매트릭스로 기능하는 가공되고 처리된 양막을 0.4 μM 트랙 에칭된 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인 삽입물(Falcon, USA, 3090)을 가진 배양 플레이트 상에 놓았다. 양막을, 예를 들면 10호 에틸론 비흡수성 봉합선을 사용하거나, 또는 의료 등급 실리콘 O 링을 사용함으로써 PET 삽입물에 조였다.

수단과는 무관하게, 양막은 멤브레인의 노출된 상피 측이 삽입물의 내측을 대면하고, 멤브레인의 기질측이 삽입물을 반대로 대면하는 방식으로 멤브레인 상에 펼쳐져야 한다. 양막은, 예를 들면 실리콘 O 링을 양막의 저부에 삽입하거나, 또는 양막을 삽입물의 기부 멤브레인에 봉합함으로써 삽입물에 고정되기 전에 균일하게 연신하였다. 전체 셋업은 10% FBS(ES 시험)(Hyclone), 5 μg/ml 트랜스페린(Gibco), 0.1 μg/ml 콜레라 독소(Sigma), 50U/ml 페니실린-스트렙토마이신(Sigma), 5 μg/ml 겐타마이신(Sigma), 5 ng/ml Na-아셀렌산(Sigma), 10 ng/ml EGF(Sigma) 및 0.5% DMSO(Sigma)로 보충된, DMEM/F12(Gibco-BRL) 배지에서 2 시간 이상 배양 배지로 채운 6 웰 접시에서 인큐베이션하였다. 양막을 배양 배지로 2 회 세척하고, 배양 배지에서 30 분 동안 다시 인큐베이션한 후, 양막을 윤부 조직 생검물 배양을 위하여 준비하였다.

4) 윤부 복합 그라프트를 생산하기 위한 윤부 생검물의 배양

먼저 윤부 생검물에서 얻은 윤부 조직을 10% FBS(ES 시험)(Hyclone), 5 μg/ml 트랜스페린(Gibco), 0.1 μg/ml 콜레라 독소(Sigma), 50 U/ml 페니실린-스트렙토마이신(Sigma), 5 μg/ml 겐타마이신(Sigma), 5 ng/ml Na-아셀렌산(Sigma), 10 ng/ml EGF(Sigma) 및 0.5% DMSO(Sigma)로 보충된 배양 배지 DMEM/F12(Gibco-BRL) 배지로 수 회 세척하였다. 그 후, 생검물에서 임의의 공막 및 결막 조직을 잘라내고 6 내지 7 시편으로 나누었다. 이어서, 이 윤부 조직 시편을 전술한 바와 같이 제조된 Matrigel^TM 코팅된 플레이트 또는 양막 배양물에서 배양하였다. 윤부 조직 시편 중 일부를 30 분 동안 0.25% 트립신-EDTA(Gibco-BRL, USA)로 효소 처리하는 반면, 다른 것들은 밤새 4℃에서 0.25% 트립신-EDTA로 처리하였다. 각각의 생검물 시편의 상피층을 무딘 집게를 사용하여 제거하였고, 기질은 10% 녹아웃 혈청 또는 제대혈에서 수집한 10% 열 비활성화 사람 혈청, 0.5% 디메틸 술폭시드(DMSO), 2 ng/ml 재조합 사람 상피세포 성장인자(rhEGF), 5 μg/ml 인슐린, 5 μg/ml 트랜스페린, 5 μg/ml 아셀렌산 나트륨, 0.5 μg/ml 히드로코르티손, 4 ng/ml bFGF, 10 ng/ml hLIF, 50 μg/ml 겐타마이신 및 1.25 μg/ml 암포테리신 B로 보충된, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 및 F-12(DMEM:F-12; 1:1)로 구성된 배양 배지의 Matrigel^TM 코팅 35 mm 플레이트에서 배양한 세포이다. 윤부 복합 그라프트를 발생하는 전체 배양 과정을 격일마다 배양 배지를 교체해주면서 7 내지 21일 동안 또는 세포가 컨플루언트될 때까지 공기(5% CO₂) 중 37℃에서 수행하였다.

윤부 복합 그라프트(LCG)가 다능성 ELSC를 함유했는 지를 결정하기 위하여, LCG를 사람 다능성 ES 세포의 마커인 세포 표면 마커 SSEA-4의 존재를 검출하는 면역형광 및 유동 세포 분석법에 의하여 분석하였다. 도 1(a)은 LCG(온조직 표본)의 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색을 나타낸다. 헤마톡실린은 핵 및 리보솜과 같은 음 전하 핵산을 푸른색으로 염색하는 반면, 에오신은 단백질을 핑크색으로 염색한다. 도 1(b)에서 나타낸 바와 같이, LCG가 SSEA-4 항체(1:100 희석)에 노출될 때, LCG는 녹색 면역형광에 의하여 지정된 SSEA-4에 대하여 명백히 양성이다. 또한, LCG의 분자 특성화를 OCT-4, Nanog 및 Rex-1 발현을 검출하기 위한 RT-PCR를 사용하여 수행하였는데, 이들 각각은 분화시 하향 조절되는 다능성 마커이다. 도 1(c)는 GAPDH를 양성 대조군으로 하면서, 이 다능성 줄기 세포 마커 각각의 발현을 나타낸다. 마지막으로, 도 1(d)는 세포를 자기 친화성 세포 분류(MACS)로 수행한 후, 유동 세포 분석법에 의하여 LCG에서 SSEA-4 양성 세포(63%)를 분리한 것을 나타낸다(하기 참조).

5) 윤부 복합 그라프트로부터 다능성 배아 유사 줄기 세포의 분리

윤부 세포 배양 7 내지 21일 후, 배양된 세포를 자기 친화성 세포 분류법(MACS)를 행하여 다능성 ELSC를 분리하였다. 먼저, 배양된 세포를 0.05% 트립신-EDTA를 사용하여 분산시켰다. 트립신 저해제 또는 소 태아 혈청을 함유한 배양 배지의 동일한 양을 첨가함으로써 트립신을 중성화하였다. 이어서, 세포를 단일 세포 현탁액으로 피펫팅하고, 혈구계산기를 사용하여 계수하였다. 그 다음, 세포를 스핀다운시켜 PBS 200 μl 당 10⁷ 세포 농도로 재현탁하였다. 세포를 1차 항체 SSEA-4(DSHB, USA; 1:40) 1 μl로 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. SSEA-4 1차 항체로 인큐베이션한 후, 세포를 PBS로 2회 세척하여 임의의 미결합된 항체를 제거하였다. SSEA-4 1차 항체에 결합하는 2차 항체 비드(Miltenyi Biotech, Germany; 1:4) 20 μl 현탁액을 세포 현탁액에 첨가하고, 잘 혼합하여 4℃에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하여 임의의 미결합 2차 항체를 제거하였다.

그 후, 세포 현탁액을 제조업자의 지시(Miltenyi Biotech, Germany)에 따라서 MACS 자기 칼럼을 통과시켜 SSEA-4 양성 세포를 분리하였다. 먼저 음성 분획을 수집하고, 칼럼을 PBS로 2회 세척하였다. 그 후, 칼럼을 자석으로부터 제거하고, SSEA-4 양성 세포를 가진 양성 분획을 수집하였다. 또한 다능성 ELSC인 SSEA-4 양 성 세포를 2회 세척하고, 배양 배지의 세포외 매트릭스 캐리어에 시딩하였다. 바람직하게는, 세포외 매트릭스 캐리어는 Matrigel^TM 코팅 플레이트이고, 배양 배지는 10% 녹아웃 혈청 또는 제대혈에서 수집한 10% 열 비활성화 사람 혈청, DMSO (0.5%), rhEGF(2 ng/ml), 인슐린(5 μg/ml), 트랜스페린(5 μg/ml), 아셀렌산 나트륨 (5 μg/ml), 겐타마이신(50 μg/ml) 및 암포테리신 B(1.25 μg/ml), hLIF(lO ng/ml), 및 bFGF(4 ng/ml)으로 보충된 DMEM 및 F-12(DMEM:F-12; 1:1)였다. ELSC를 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 추가 1주일 동안 또는 배양물이 컨플루언트될 때까지 배양하였다.

컨플루언스 후, 배양물 중의 ELSC를 떼어내고 1:3 플레이팅 희석으로 새로 생코팅된 조직 배양에 재플레이팅하였다. 그 후, ELSC를 증량시키고, 적어도 100 집단 배가하는 동안 연속적으로 계대 배양하였다. 또한, 연속적으로 계대 배양한 ELSC를 분화 잠재력의 임의의 손실 없이 좀더 사용하기 위하여 냉동시킬 수 있다. 50 계대 배양 후, 텔로머라제 활성은 배양된 세포에서 여전히 검출되었다.

실시예 2

다능성 배아 유사 줄기 세포의 분석 및 특성화:

실시예 1에서 개략 설명한 바와 같이, 다능성 ELSC를 윤부 조직 생검물로부터 유도하였다. 임의의 특정 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 각막 윤부는 두 구역으로 분리된, 필수적으로 두 가지 줄기 세포 유형을 가지는 것으로 보인다. 윤부의 상층은 주로 P-63 양성인 각막 상피 줄기 세포로 구성되는 반면, 저층은 주로 기질 세포로 구성된다. 본 명세서에서 개시한 다능성 ELSC는 기질층에 우세하게 존재하고, 필요한 경우 상피 구역으로 이동할 수 있는 것으로 보인다.

윤부 조직으로부터 유도된 다능성 ELSC 및 이 세포의 미분화 상태의 성질을 더 잘 이해하기 위해서, 미분화 및 분화 세포에 대한 다양한 세포 마커의 존재 또는 부재 동안 유동 세포계 분석, 면역형광 및 분자 분석을 사용하여 ELSC를 분석하였다. 또한, 핵형 및 텔로머라제 활성을 다양한 계대 배양에서 분석하여 이 세포들이 연속적 계대 배양 후 미분화 상태를 유지하는지 여부를 결정하였다.

1) 유동 세포계 분석

다능성 배아 줄기 세포와 면역반응하는 소수의 세포 표면 마커만이 알려져 있다. 본 명세서에서 분리한 ELSC도 이 세포 표면 머커와 면역반응하는지를 결정하기 위하여, 대개 다능성 ES 세포에서 발현되는 다양한 세포 표면 군집 분화(CD) 마커 및 단계 특이적 배아 항원(SSEA) 마커의 존재 하에 ELSC를 분석하였다. 매 계대 배양 후에 분석을 수행하였다. 또한, 하기 마커의 존재를 유동 세포계 분석을 사용하여 분석하였다: SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, CD11c, CD14, CD34, CD45, CD54, CD73, CD105, CD106, CD123, CD133, 줄기 세포 인자(SCF) 및 HLA-DR 마커. SSEA-1, SSEA-3 및 SSEA-4, 및 CD 마커에 대한 항체는 유동 세포계 분석에 기존에 사용되고 있다.

실시예 1에서 분리한 다능성 ELSC를 증량한 후 2-3 분 동안 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 트립신화하였다. 트립신의 비활성화 후, 세포를 40 마이크론 필터 메쉬에 통과시켜 염색을 방해할 수 있는 임의의 잔여 세포 덩어리를 제거하였다. 그 후, 세포를 원심분리하고 1 x 10⁶ 세포/ml 농도의 세척 버퍼에 재현탁하였다. 세척 버퍼는 1% 태아 소 혈청으로 보충된 인산염 버퍼로 구성된다. 1 x 10⁵ 세포의 분액을 대조군 및 테스트 튜브에 첨가하고 하기 항체와 함께 인큐베이션하였는데, 이들 각각은 플루오레세인 아소티오사이아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE)으로 콘쥬게이션되어있다: SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, CDllc, CD14, CD31, CD34, CD45, CD54, CD73, CD105, CD106, CD117, CD123, CD133 또는 HLA-DR 항체. 튜브를 간단히 와동시키고, 4℃ 암실에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척 버퍼로 3-4 회 세척하고, 세척 버퍼 500 μl에 재현탁하였다. 유동 세포계 분석을 FACS 칼리버 유동 세포계 분석기(Becton-Dickinson) 상에서 수행하고, 세포를 광 산란기에 의하여 동정하였다. 대수 형광을 10,000 갇힌(gated) 추이에 기초하여 평가하였으며, 대조 샘플을 사용하여 백그라운드 형광을 조절하였다. 분석은 CELL QUEST 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 수행하였다. 양성 세포의 퍼센트는 대조군 튜브 추이에 대하여 결정하였다. 결과는 하기 표 1에서 요약한다:

표 1: 유동 세포계 분석에 의하여 다능성 배아 유사 줄기 세포에 대하여 분석된 다양한 줄기 세포 마커의 결과

20 계대 배양된 다능성 ELSC의 면역표현형의 결과는 도 2에서 나타낸다. 상기에서 개략 설명한 바와 같이, ELSC를 SSEA-4, CD105, CD73, CD54, CD45, CD34, CD123, CD133, CD 123 및 HLA-DR에 대한 FITC 결합 항체로 표지하였다. ELSC를 FACS-칼리버를 사용하여 분석하였다. 도 2의 결과는 표 1에 나타난 결과와 일치한다. 나타낸 바와 같이, ELSC는 SSEA-4, CD54, CD73 및 CD105 마커에 대하여 양성이고, CD34, CD45, CD106, CD 123, CD133 및 HLA-DR 마커에 대하여 음성이다.

다능성 ELSC는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유도된, 이전에 분리된 영장류 ES 세포와 유사한 특징을 가지는 것으로 나타났는데(미국 특허 제 6,200,806호), 다시 말하면 ELSC는 단계 특이적 배아 항원 마커 SSEA-3 및 SSEA-4에 양성이고, SSEA-1 마커에 음성이였다. 윤부 조직 유래 다능성 ELSC에서 SSEA-3 및 SSEA-4 의 발현 및 SSEA-1의 발현의 결핍은 사람 ES 세포의 그것과 유사한데, 이는 이 다능성 세포가 유사한 특성을 가질 수 있음을 나타낸다.

또한, 다능성 ELSC를 군집 분화 마커에 대하여 분석하였으며, CD11c, CD14, CD34, CD45, CD106, CD123, CD133 및 HLA-DR 마커에 대하여 음성인 것으로 나타났다. 이 데이터는 윤부 조직에서 분리된 ELSC는 이들이 CD34 및 CD45 마커에 대하여 음성이기 때문에 기원이 조혈모가 아님을 나타낸다. 분석된 나머지 CD 마커, CD11c, CD14, CD106, CD123, CD133 및 HLA-DR 마커는 분화된 세포에서만 발현되는 것으로 알려져 있다. 따라서, ELSC 상에 이들 마커의 부재는 이 세포가 미분화 상태이고 지시된 조건 하에 배양물에서 계대 배양하는 동안 분화된 계통의 세포를 발생하지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, 도 2에서 나타낸 발현 패턴은 ELSC가 20 계대 배양 동안 미분화 상태로 유지될 수 있고(즉, "줄기성(stemness)"을 유지), ELSC가 기원이 조혈모가 아님을 제시한다.

흥미롭게도, ELSC에 의한 CD73 및 CD105의 발현은 이 세포가 기원이 중간엽임을 제시한다. 따라서, ELSC는 상부 상피 세포층보다 중간엽 및 섬유아세포를 함유하는 윤부 조직의 하부 기질 세포층에서 유래한다는 가설이 세워진다. 그러나, 또한 ELSC는 상피 세포 마커로 공지된 CD 54 마커를 발현하였다. 이 사실을 좀더 이해하기 위하여, 세포를 다른 상피 마커, PECAM 유전자의 발현에 대한 RT-PCR에 의하여 분석하였다(도 11 참조).

다능성 ELSC를 마커 OCT-4, TRA-1-60, TRA-1-80 및 알칼린 포스파타제를 사용하여 이것의 다능성 및 미분화 상태에 대하여 좀더 분석하였다. 이 유전자들이 ELSC에 의하여 발현되었는 지를 결정하기 위하여, 배양된 ELSC를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18일에 수집하였고, 유전자 발현 분석을 행하였다. 이들 미분화 마커 각각의 강한 발현이 다능성 ELSC에서 관찰되었다. 이 유전자 프로파일의 결과는 본 발명의 다능성 ELSC가 미분화 줄기 세포임을 다시 한번 나타낸다.

2) 분자 분석

전술한 실험 및 결과에서 확인한 바와 같이, 윤부 조직에서 분리한 ELSC에서 발현되는 유일한 마커의 배열(array)이 발견되었다. ELSC를 더욱 특성화하기 위하여, 세포를 다능성 줄기 세포 마커 유전자, Oct-4, Nanog, Rex1 및 TDGF1의 발현에 대한 RT-PCR에 의하여 분석하였다. Oct-4, Nanog, Rex1 및 TDGF1의 발현은 분화시 하향 조절된다. 또한, 모든 세포에서 어디서나 발현되는 "하우스키핑(housekeeping)" 유전자 GAPDH의 발현을 양성 대조군으로서 분석하였다. RT-PCR 생성물의 동정은 시퀀싱에 의하여 확인하였다.

간단히, 다능성 ELSC의 총 RNA를 TRIzol 방법(Gibco-BRL)을 사용하여 계대 마다, 예를 들면 계대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20에서 분리하였다. 그 다음, RNase-OUT 리보뉴클레아제 저해제(Invitrogen Inc, USA)로 처리된 총 RNA 1 ug을 역전사효소(Invitrogen Inc, USA) 및 올리고 dT(Invitrogen Inc, USA)를 사용하여 반응물을 프라이밍함으로써 역전사에 의한 cDNA 합성에 사용하였다. 각각의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 경우, Abgene 2X PCR 마스터 믹스 및 적합한 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 cDNA 2 μl를 증폭하였다. PCR 프라이머를 선택하여 다른 엑손에 특이적인 각각의 프라이머를 사용함으로써 cDNA와 게놈 DNA 사이에 구별하였다. Oct-4, Nanog, Rex1 및 TDGF1 cDNA을 증폭하는 데 사용된 프라이머는 하기 표 2에 제시된다. PCR 생성물을 증폭하기 위하여 열 순환기(ABI Biosystem 9700)에 사용된 PCR 증폭 조건은 하기와 같다: (1) 94℃, 1 분; (2) 94℃, 30 초; 어닐링 Tm ℃, 45 초; 증폭 30 사이클 동안 72℃, 1 분; (3) 72℃, 5 분; 및 (4) 샘플을 분석할 때까지 4℃에서 최종 유지.

표 2

분리된 ELSC의 5 번째(P5), 10 번째(P10), 15 번째(P15) 및 20 번째(P20) 계대에서의 이 실험의 결과는 도 3에서 나타낸다. 또한, "줄기성"에 대한 Oct-4, Nanog, Rexl 및 TDGF1 마커의 발현은 각각 음성 및 양성 대조군인 hEF 및 NTERA 세포주에서 분석하였다. NTERA 세포주는 다능성 줄기 세포 마커를 발현하는 확립된 기형 암종 세포주이다. GAPDH 발현은 각 샘플에서 대략 동일한 것으로 나타났는데, 이는 각 RT-PCR에 사용된 RNA 양이 정량적으로 유사하였다는 것을 나타낸다. 동일한 데이터는 표 3에 평판 형식으로 재현된다.

표 3

다능성 미분화 세포의 네 가지 모든 마커의 현저한 발현이 다양한 계대 각각의 다능성 ELSC에서 관찰되었다. 다능성 마커 중 적어도 두 가지, Nanog 및 TDGF1의 발현이 시간에 따라 서서히 감소하는 것처럼 보인다. 이 감소는 이 유전자들의 발현이 분화된 세포에서 하향 조절된다고 알려져 있기 때문에 이들이 배양물에서 계대 배양됨에 따라 ELSC를 가진 분화 세포의 증가된 백분율에서 기인할 가능성이 있다. 그럼에도 불구하고, 이 결과는 윤부 조직에서 분리된 ELSC가 다능성이 있고, 배아 줄기 세포 유사 특성을 가지고 있음을 명백하게 나타낸다. hEF 세포주는 음성 대조군임에도 불구하고, Oct-4 및 Rex-1 모두의 발현이 그 세포주에서 발견되었다. 흥미롭게도, 특정 운명결정된 세포주(certain committed cell line)에서 발현되는 미분화 줄기 세포 마커의 보고가 있어왔다(Abeyta et al., (2004) HuM. Mol. Genet. 13:601-608).

3) 텔로머라제 활성 분석

다능성 줄기 세포주에서 텔로머라제 활성의 유지는 세포주의 장기간 다능성을 위하여 중요하다. 따라서, 본 발명에 개시된 ELSC의 텔로머라제 활성을 시간에 따라 평가하였다. 계대 5(P5), 10(P10), 15(P15) 및 20(p20)의 ELSC 추출물을 제조 하고, 각 추출물 중의 단백질 농도를 평가하였다. 그 다음, 추출물을 텔로머 반복 증폭 프로토콜(TRAP)을 사용하여 평가하였는데, 이는 텔로머라제 활성의 고 방응성 정성적 검출을 위하여 설계된 분석법이다. 그 후, 텔로머라제 활성을 광도측정 효소 면역분석에 의하여 검출하였다. 간단히 설명하면, 단백질 농도의 평가 후, 샘플을 열순환기에 넣고 프로토콜마다 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 후, 증폭된 생성물을 변성시켜 ELSA에 의하여 검출하였다.

텔로머라제 PCR ELISA를 제조업자의 프로토콜(Roche Molecular Biochemicals)에 따라서 수행하고, 키트에 제공된 모든 적합한 양성 및 음성 대조군을 사용하였다. 텔로머라제 PCR ELISA는 ELISA 프로토콜을 따르는 비방사성 검출과 조합된 텔로머라제 매개 신장 생성물의 고 특이적 증폭을 가능케 한다. 잘못된 부정적 결과를 가져올 수 있는, Taq 폴리머라제의 저해제를 제거하는 프로토콜 동안 주의를 기울였다. 프로토콜 제1 단계에서, 추출물 중의 텔로머라제는 텔로머 반복(TTAGGG)을 비오틴 표지된 합성 프라이머의 3' 말단에 첨가한다. 그 다음, 이 신장 생성물을 텔로머라제 특이적 6 뉴클레오티드 증가량을 함유하는 PCR 생성물을 발생시키는 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 증폭한다. PCR 생성물의 분액을 변성하고, 디곡시게닌(digoxigenin)-(DIG) 표지된, 텔로머 반복 특이적 검출 프로브에 하이브리드한다. 최종 생성물을 비오틴 표지된 프라이머를 통하여 스트렙타비딘 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 고정한다. 페록시다제에 콘쥬게이트된 항체로 검출한 후에, 착색된 생성물의 형성에 의하여 텔로머라제 활성을 검출한다. 텔로머라제 활성의 고 발현이 테스트한 모든 계대의 추출물에서 나타났는데, 이는 다능성 ELSC의 고 증식 능력을 나타낸다.

4) 핵형 분석

본 발명의 다능성 ELSC가 배양물에서 정상적 핵형을 유지하는지를 결정하기 위하여, 표준 G 분염법(Genetics Lab., Reliance Life Sciences Pvt. Ltd., Mumbai)을 사용하여 핵형 분석하였고, 공개된 사람 핵형과 비교하였다. CYTOVISION 소프트웨어를 사용하여 핵형분석을 하였다. 계대 13(P13)의 ELSC를 핵형 분석하여 '정상적 핵형'임이 확인되었는데, 즉, P13의 세포는 정배수체이고, 모든 사람 염색체가 존재하며, 염색체는 현저하게 변경되지 않았다(도 4). 또한, ELSC는 계대 20에서 정상적 핵형을 가지고 있음이 확인되었다.

실시예 3

다능성 배아 유사 줄기 세포의 분화 및 분석:

1) 다능성 배아 유사 줄기 세포로부터 배아 유사체의 발생

미분화 사람 다능성 ELSC가 배양물 중에서 배아 유사체(ELB)를 형성할 수 있는 지를 결정하기 위하여, 먼저 세포를 증식시키고, 세포 배양물을 증량할 수 있다. 그 다음, 세포를 ELSC의 부착을 방지하고 이 세포들의 분화를 촉진하는 비점착성 표면을 가진 세균학상의 플레이트에서 배양하였다. 간단히 설명하면, ELSC를 0.05% 트립신-EDTA 용액에 간단히 노출시킴으로써 떼어내고, 이어서 10-20% 소 태아 혈청, 제대혈 혈청 또는 녹아웃 혈청 대체물로 보충된 DMEM:F-12 또는 녹아웃 DMEM을 함유하는 ES 세포 배지에서 현탁 배양물과 같이 배양하였다. 또한, 배지는 β-머캅토에탄올, L-글루타민, 인슐린, 사람 트랜스페린, 아셀렌산 나트륨으로 보충되었지만, bFGF 또는 hLIF를 함유하지 않았다. 세포를 약 4일 동안 현탁 배양물에서 배양하고, 배지를 격일마다 교환하였다. 배지를 응집 현탁액을 원심분리 튜브에 운반하고, 응집물을 가라앉히며, 구 배지를 흡인기로 빨아내고, 이것을 새 배지로 대체하며, 응집물과 새 배지를 배양 접시에 반환함으로써 교환하였다.

4일 중 마지막날에, ELB를 저속(1000 rpm, 5분)으로 응집물을 스핀 다운하고 ELB를 전술한 동일한 ES 세포 배지에 재현탁함으로써 수집하였다. 도 5는 위상 콘트라스트 현미경 사진(10X)을 사용하여 분화 과정을 나타낸다. 첫 번째, 도 5(a)는 15 계대 후 배양물 중에서 성장한 ELSC를 나타낸다. 도 5(b)는 현탁 배양물에서 4일 동안 ELSC를 배양한 후에 형성된 ELB를 나타낸다. 마지막으로, 도 5(c)는 ELB로부터 분화의 개시를 나타낸다.

ELSC로부터 ELB로의 분화 과정을 더 특성화하기 위하여, 실시예 2에서 전술한 분자 분석 프로토콜을 현탁 배양물에서 분화 2일(EB2), 4일(EB4), 8일(EB8), 12일(EB12) 및 14일(EB14) 후 ELB 뿐만 아니라 미분화 ELSC(UD)에서 반복하였다. 세포를 다능성 줄기 세포 마커 유전자, Oct-4, Nanog, Rex1 및 TDGF1의 발현에 대한 RT-PCR에 의하여 분석하였는데, 이들의 발현은 분화시 하향 조절된다. Oct-4, Nanog, Rex1 및 TDGF1 cDNA를 증폭하기 위하여 사용된 프라이머는 표 2에 제시된다. 뿐만 아니라, "하우스키핑" 유전자 GAPDH의 발현 또한 양성 대조군으로 분석하였다. 또한, 이들 마커 각각의 발현을 음성 대조군으로 작용하는 hEF에서 분석하였다. RT-PCR의 동일성은 시퀀싱에 의하여 확인하였다.

이 실험의 결과는 도 6에 나타낸다. GAPDH 발현은 각각의 샘플에서 거의 동 일한 것으로 나타났는데, 이는 각 RT-PCR 반응에 사용된 RNA의 양은 정량적으로 유사하였다는 것을 의미한다. 동일한 데이터는 표 4의 평판 모양으로 재현된다.

표 4

4 가지 모든 마커의 발현은 미분화 ELSC에서 다시 확인되었고, 또한 유전자 각각의 발현은 미분화된 ELB 내의 세포와 같이 시간에 따라 서서히 감소하는 것으로 나타났다. Oct-4, Nanog 발현이 hEF 세포주에서 확인되었다는 것은 놀라운 일이지만, 특정 운명결정된 세포주에서 발현된 미분화 줄기 세포 마커의 보고는 있어 왔다. hEF 세포주는 음성 대조군이지만, Oct-4, Nanog 및 Rex-1의 발현은 그 세포주에서 확인되었다. 흥미롭게도, 특정 운명결정된 세포주에서 발현된 미분화 줄기 세포 마커의 보고가 있어 왔다(Abeyta et al., (2004) HuM. Mol. Genet. 13:601-608).

미분화 마커의 발현을 검사할 뿐만 아니라, 동일한 세트의 세포를 외배엽, 중배엽 및 내배엽 계통에 대한 다양한 유전자의 발현뿐만 아니라 상피 계통, 기질 세포 및 각막 표피 줄기 세포를 나타내는 유전자의 발현에 대하여 분석하였다. 하기 유전자 마커의 발현을 실시예 2에서 개략적으로 설명한 프로토콜을 사용한 RT-PCR에 의하여 다시 분석하였다: 신경미세섬유 중쇄(NFH) 및 케라틴(외배엽 계통 마 커); 심장-액틴(c-액틴)(중배엽 계통 마커); 알파-태아 단백질(AFP) 및 알부민(내배엽 계통 마커); PECAM(내배엽 계통 마커), 각질세포 성장 인자(KGF) 및 콜라겐 I(기질 세포 마커); 및 p63(각막 상피 줄기 세포 마커). 이들 마커 각각을 증폭하기 위하여 사용된 프라이머는 하기 표 5에 제시된다.

표 5

도 7 및 8은 배양 2, 4, 8, 12 및 14일 후에 수집된 ELSC(UD) 및 ELB에서의 다른 유전자 마커의 유전자 발현 패턴의 결과를 나타낸다. 각각의 RT-PCR에 사용된 양성 대조군은 (NFH 및 케라틴에 대한) 신경외배엽 계통 대조군으로서 태아 뇌 조직, (c-액틴 및 PECAM에 대한) 중배엽 및 내배엽 계통 대조군으로서 태아 심장 조직, (AFP 및 알부민에 대한) 내배엽 계통 대조군으로서 태아 간 조직 추출물, (콜라겐 I 및 KGF에 대한) 기질 세포 대조군으로서 hEF 세포, 그리고 (p63에 대한) 각막 표피 줄기 세포 대조군으로서 윤부 조직 추출물이였고, 반면에 음성 대조군은 (-) RT 생성물이였다. 도 7 및 8에서 나타낸 동일한 데이터는 표 6에 평판 방식으로 재현된다.

표 6

ELSC 및 ELB에서 케라틴, KGF, 콜라겐-1 및 P-63의 발현은 윤부 조직에서 유도된 세포를 나타낸다. 케라틴은 초기 외배엽 계통 마커인 반면에, KGF 및 콜라겐-I의 발현은 거의 모든 단계에서 예상되는데, 이는 두 가지 모두 섬유아세포의 마커이고, ELSC는 기질층에서 분리되기 때문이다. 왜 콜라겐 I의 발현이 ELB 형성의 8일 및 12일에 상향 조절되는 것처럼 보이고, ELB 형성의 14일에는 존재하지 않는 지는 불분명하다. P-63 발현은 미분화 ELSC 집단에서 확인되지 않았는데, 이는 이들 세포 또한 각막 윤부 줄기 세포 집단을 함유한다는 것을 나타낸다. P-63 발현은 ELSC가 ELB를 형성하는 동안 분화함에 따라서 감소하였다.

계통 마커 NFH, c-액틴, AFP 및 알부민은 ELSC에서 발현되는 것 같지 않지만, ELB에서 분화의 다양한 단계에서 발현된다. 초기 신경 외배엽 마커인 NFH는 미분화 ELSC에서 발현되지 않지만, ELB 형성 4일 및 8일에 발현된다. 그러나, NFH는 이 마커의 발현이 신경 세포의 성숙시에 하향 조절되기 때문에 ELB 형성의 후기 단계에서 발현되지 았았다. 중배엽 계통 마커인 c-액틴은 ELB 형성 12일까지 고 발현된다. 초기 중간중배엽 마커인 AFP는 ELB 형성 2일에 고 발현되지만, ELB가 분화함에 따라 서서히 하향 조절된다. 성숙 간 세포 마커인 알부민의 발현은 ELB가 분화함에 따라 서서히 상향 조절된다. PECAM은 배아 발생의 모든 단계에서 발현되는 것으로 예상되고, 보고된 세포의 다능성과 밀접하게 상호연관되어 있다(Furusawa et al., (2004) Biol. Reprod. 70:1452-57). 분화의 다양한 단계에서 ELB의 적합한 계통 마커의 다른 발현은 세 가지 모든 계통으로 분화하는 ELSC의 능력을 나타낸다.

2) 다능성 배아 유사 줄기 세포의 뉴런으로 분화

본 발명의 ELSC가 뉴런으로 분화할 수 있는 지를 결정하기 위하여, ELSC에서 유도된 ELB를 적합한 배지에서 약 4-10일 동안 배양하고, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들면 폴리오르니틴, 라미닌 또는 피브로넥틴을 갖는 적합한 기질에 직접 플레이트하였다. ELB를 신경전구세포로 세포의 분화를 촉진하도록 조절된 적합한 영양 배지에서 배양하였다. 그 후, 세포를 GABA 작용성 및 도파민 작용성 뉴런을 포함한 특이적 뉴런 표현형으로 분화 및 성숙을 촉진하는 조건 하에서 더 배양하였다.

GABA 작용성 뉴런의 유도

ELB를 신경 세포, 예를 들면 N2(1-15%) 및 B27(1-20%)의 배양물을 유지하도록 돕는 첨가제와 함께 기초 배지 DMEM:F12로 구성된 무혈청 신경 유도 배지에서 배양하였다. 또한, 배지를 레티노산(20-80 ng/ml), GDNF(1-10 μg/ml), Ara-C(10-50 ng/ml) 및 뉴로트로핀-3(5-20 μg/ml)에서 선택된 하나 이상의 성장 인자로 보 충되었다. 세포를 6일 동안 성장시켰는 데, 이는 신경전구 세포의 분화를 야기하였다.

그 다음, 신경전구 세포는 격일마다 교환된 배지와 함께 12일 동안 N2(1-15%), B27(1-20%) 및 인슐린(5-20 μg/ml), 트랜스페린(4-10 μg/ml), FGF-8(50-200 ng/ml) 및 Ara-C(10-50 ng/ml)으로 보충된 신경기초 배지를 함유한 신경 분화 배지에서 성장하였다. 성숙한 신경 유사 형태를 발생하기 위하여, 세포는 다른 신경 성장 인자, 예를 들면 뉴로트로핀-3 및 GDNF로 보충된 신경 분화 배지에서 성장하였다. 특히, 뉴로트로핀-3(5-20 μg/ml) 및 GDNF(1-10 μg/ml)을 분화 6일 내지 12일에 분화 배지에 첨가하였다.

도파민 작용성 뉴런의 유도

ELB는 신경 유도의 개시를 위하여 하나 이상의 항산화제, 예를 들면 DMSO (1-10%), 부틸화 히드록시아니솔(50-400 μM) 및 포르스콜린(5-20 μM)과 함께 N2(1-15%) 및 B27(1-20%)으로 보충된 DMEM:F12로 구성된 무혈청 한정 배지에서 배양하였다. 배양 4-7일 후, 성장 인자, 예를 들면 레티노산(20-80 ng/ml), GDNF(1-10 μg/ml), Shh(50-200 ng/ml), FGF-8(50-200 ng/ml) 또는 bFGF(10-50 ng/ml) 중 하나 또는 조합을 배지에 첨가하여 신경 분화를 촉진하였다. 세포는 추가 7-10일 동안 이 배지에서 성장하였다. 배양된 세포의 세포 형태의 변화를 48 시간 내에 관찰하였다. 반응 세포의 백분율은 항산화제 및 무혈청 조건 하에서 인큐베이션함에 따라 점진적으로 증가하였다. 그 다음, 신경전구 세포는 N2(1-15%), B27(1-20%), GDNF(1-10 μg/ml), 레티노산(20-80 ng/ml), db-cAMP(10-200 μM) 및 IL-1b(1-5 μ g/ml)으로 보충된 신경 기초 배지를 함유한 신경 성숙 배지에서 성장하였다. 이 배양 조건 하에서, 세포 중의 약 30-40%는 신경돌기 과정을 신장시켰고, β-투불린에 대하여 양성으로 염색되었는데, 이는 뉴런을 형성하는 능력을 입증해준다. 신경 유도 배지에 존재하는 성장 인자는 신경 세포의 백분율의 전체적 증가에 기여하고, 이들 전구 세포를 더 유도하여 도파민 작용성 표현형을 채택한다.

분화된 뉴런의 특성화

상기 프로토콜에 따라서 발생된 분화된 신경 세포 유형은 세포의 전체적 형태뿐만 아니라 면역형광에 의하여 확인되는 표현형에 의하여 평가하였다. 면역형광 분석은 각각 GABA 작용성 및 도파민 작용성 뉴런의 분화 12일 및 25일에 수행하였다. 첫 번째, 분리된 세포는 세포외 매트릭스로 사전 코팅되고, PBS로 세척하며, 실온에서 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정된 2 웰 챔버 슬라이드에서 성장하였다. 그 다음, 세포를 5분 동안 PBS에서 0.2% 트리톤 X-100로 투과시키고, 2 시간 동안 1% 소 혈청 알부민(BSA)/PBS로 차단하였으며, 4℃에서 밤새도록 1차 항체(항체 희석은 1% BSA/Tris-완충 염수에서 이루어졌다)와 함께 인큐베이션하였다.

세포를 하기 1차 항체로 염색하였다: 초기 신경 마커 β-투불린 III(1:500); 후기 신경 마커 미세소관 연관 단백질 2(MAP-2)(1:200); 감마 아미노부티르산(GABA)(1:200); 글루탐산염(1:500); 네스틴(1:50); 신경미세섬유(1:500); 티로신 히드록실라제(TH)(1:800); 세로토닌(1:500) 및 희소돌기아교세포(1:500). 모든 1차 항체는 미국에 소재하는 Chemicon Inc.에서 구입하였다. 그 다음, 세포를 적합한 FITC 표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 각 단계 후, 세포를 PBS로 3회 세 척하였다. 챔버 슬라이드를 형광 현미경으로 관찰하여 면역양성 영역을 평가하였다. 도 9에 도시한 바와 같이, 이 면역형광 분석은 분화된 세포 중 많은 수가 뉴런 특이적 마커 MAP-2, β-투불린 III 및 신경미세섬유 뿐만 아니라 표현형 특이적 마커 TH(도파민 작용성 뉴런에 대한 마커), GABA(GABA 작용성 뉴런에 대한 마커), 글루탐산염(글루탐산 작용성 뉴런에 대한 마커) 및 세로토닌(세로토닌 작용성 뉴런에 대한 마커)에 면역반응성이 있다는 것을 나타내었다. 극소수의 세포만이 비신경 마커 O4를 발현시켰는데, 이는 희소돌기아교세포(아교 세포)에 존재한다.

또한, 상기에서 발생된 ELSC 및 분화 신경 세포는 하기 프라이머를 사용하여 전술한 RT-PCR에 의하여 β-투불린 및 티로신 히드록실라제(TH)에 대하여 분석하였다.

표 7

c-액틴 및 NCX의 발현은 성체 심근 세포 형성을 나타낸다. cDNA를 증폭하기 위하여 사용된 PCR 프라이머는 각 유전자의 엑손 서열에 특이적이였으며, 따라서 유전자를 코딩하는 게놈 DNA가 아닌, cDNA만을 증폭시켰다. 도 11은 ELSC에서 심근 세포 특이적 마커 및 이들로부터 유도된 분화된 심근 세포의 발현에 대한 RT-PCR의 결과를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, c-액틴 및 NCX 모두 분화된 심근 세포에서는 발현되고 미분화된 ELSC에서는 발현되지 않는다. 하우스키핑 유전자 GAPDH는 전술 한 바와 같이 양성 대조군으로 사용되었다.

RP - HPLC 에 의한 도파민 작용성 뉴런의 기능적 특성화

도파민을 생산하는 ELSC 유도 도파민 작용성 뉴런의 기능적 용량을 역상 HPLC(RP-HPLC)를 사용하여 세포외 도파민 수준을 직접 측정함으로써 평가하였다. 배양 현탁액에서 검출된 도파민의 농도는 각 분석 전과 후 즉시 칼럼에 주입된 도파민의 표준 용액과 비교하여 결정하였다. 약 5x10⁶ 세포를 트립신 처리하여 원심분리로 펠렛을 만들었다. 그 후, 세포를 항산화제(0.2 g/l 메타중아황산나트륨)가 있는 차가운 1 N 과염소산에서 초음파 분해하였으며, 4℃에서 20분 동안 15,000 rpm/분으로 원심분리하였다. 그 다음, 배양 현탁액을 7.5% 오르토인산 및 메타중아황산나트륨으로 즉시 안정화시켰으며, RP-HPLC에 의하여 세포외 도파민 농도를 연속적으로 결정하는 동안 -70℃에 보관하였다. 분화 25일에 배양 현탁액에서의 도파민 수준(마지막 배지 교환 후 48 시간)은 약 70 μg/ml이였다.

ELSC에서 유도된 분화된 신경 세포(예를 들면, 글루탐산 작용성, GABA 작용성, 세로토닌 작용성 및 도파민 작용성 뉴런뿐만 아니라 희소돌기아교세포)는 다양한 용도, 예를 들면 치료적 용도뿐만 아니라 신경 세포에 대한 이들의 효과에 대하여 소분자와 같은 다양한 화합물의 시험관 내 및 생체 내 분석 및 스크리닝에 사용할 수 있다. 신경 세포는 예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 파킨슨병, 알츠하이머병, 루이 소체 치매, 다발성 경화증, 소뇌 운동 실조증, 진행성 핵상 마비, 척수 손상, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 간질, 발작, 허혈, 신경계의 손상 또는 외상, 신경독성 손상 등을 포함한 다양한 신경학상 또는 신경변성 장애를 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있는데, 상기 질환의 경우 신경 세포, 뉴런 또는 아교 세포는 중추 신경계 또는 척수에서 손상되거나 죽는다. 뿐만 아니라, 다능성 ELSC에서 유도된 신경 세포는 또한, 한정하는 것은 아니지만, 불안 장애, 기분 장애, 성격 장애, 강박 신경증 장애(OCD), 주의력 결핍 장애(ADD), 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD) 및 정신분열증을 포함한 인식 및 심리학과 연관된 신경학상 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.

3) 조골 세포로 다능성 배아 유사 줄기 세포의 분화

본 발명의 ELSC가 조골 세포로 분화할 수 있는 지를 결정하기 위하여, ELSC에서 유도된 ELB를 적합한 배지에 약 4-10일 동안 배양하였으며, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들면 폴리오르니틴, 라미닌 또는 피브로넥틴을 가진 적합한 기질 상에 직접 플레이트하였다. ELB를 조골 세포로 세포의 분화를 촉진하도록 조절된 적합한 영양 배지에서 배양하였다. 예를 들면, ELB를 덱사메타손(10-100 nM), 글리세로포스페이트(1-10 mM), 아스코르브산 2 인산(0.1-0.5 mM), 골 형성 단백질 2(BMP2)(1-10 ng/ml) 및 히드로코르티손(0.05-0.1 μM)의 존재 하에 10-15% 소 태아 혈청으로 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 약 28일 동안 배양하였다.

상기 배양 프로토콜에서 분리한 세포를 분석하여 배양물 중의 조골 세포의 존재를 확인하였다. 첫 번째, 분화된 세포를 칼슘 침전에 대하여 분석하였는데, 이는 폰 코사 염색에 의하여 조골 세포를 나타낸다(Pittenger et al., (1999) Science 284:143-147, 본 명세서에서 참고 인용). 도 10(b)는 분화 배양 17일 후 ELSC에서 유도된 조골 세포에서 풍부한 칼슘 침전의 폰 코사 염색(짙은 갈색체)을 나타낸다.

4) 연골 세포로 다능성 배아 유사 줄기 세포의 분화

본 발명의 ELSC가 연골 세포로 분화할 수 있는 지를 결정하기 위하여, ELSC에서 유도된 ELB를 적합한 배지에서 약 4-10일 동안 배양하였으며, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들면 폴리오르니틴, 라미닌 또는 피브로넥틴을 가진 적합한 기질 상에서 직접 플레이트하였다. ELB를 연골 세포로 세포의 분화를 촉진하도록 조절된 적합한 영양 배지에 배양하였다. 예를 들면, ELB를 10-15% 녹아웃 혈청으로 보충된 DMEM 및 TGF 베타-3(10-100 ng/ml), 아스코르브산(0.01-0.05 mM), 1X ITS 및 피루브산나트륨(1-5 mM)의 존재 하에서 배양하였다. 세포를 약 21일 동안 배양하였다.

상기 배양 프로토콜에서 분리한 세포를 분석하여 배양물 중의 연골 세포의 존재를 확인하였다. 분화된 세포를 글리코겐 침착물의 존재에 대하여 분석하였는데, 이는 알시안 블루 염색에 의하여 연골 세포를 나타낸다(Pittenger et al., (1999) Science 284:143-147). 도 10(c)는 분화 배양 17일 후 ELSC에서 유도된 연골 세포에서 황산화된 프로테오글리칸 침착물의 알시안 블루 염색을 나타낸다.

5) 지방 세포로 다능성 배아 유사 줄기 세포의 분화

본 발명의 ELSC가 지방 세포로 분화할 수 있는 지를 결정하기 위하여, ELSC에서 유도된 ELB를 적합한 배지에서 약 4-10일 동안 배양하였으며, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들면 폴리오르니틴, 라미닌 또는 피브로넥틴을 가진 적합한 기질 상에 직접 플레이트하였다. ELB를 지방 세포로 세포의 분화를 촉진하도록 조절된 적합한 영양 배지에 배양하였다. 예를 들면, ELB를 10-15% 녹아웃 혈청으로 보충된 DMEM 및 덱사메타손(1 μM-100 mM), 이소부틸메틸크산틴(IBMX)(10-50 ng/ml), 인슐린(10-20 ng/ml), 인도메탁(2-20 mM) 및 인슐린 유사 성장 인자(IGF)(10-100 ng/ml)의 존재 하에서 배양하였다. 세포를 약 14일 동안 배양하였다.

상기 배양 프로토콜에서 분리한 세포를 분석하여 배양물 중의 지방 세포의 존재를 확인하였다. 분화된 세포를 세포질의 지질 소적의 존재에 대하여 분석하였는데, 이는 Oil Red-O 염색에 의하여 지방 세포를 나타낸다(Pittenger et al., (1999) Science 284:143-147). 도 10(d)는 분화 배양 12일 후 ELSC에서 유도된 지방 세포에서 지질 소적의 풍부한 침착물의 Oil Red-O 염색을 나타낸다.

6) 간세포로 다능성 배아 유사 줄기 세포의 분화

본 발명의 ELSC가 간세포로 분화할 수 있는 지를 결정하기 위하여, ELSC에서 유도된 ELB를 적합한 배지에서 약 4-10일 동안 배양하였으며, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들면 폴리오르니틴, 라미닌 또는 피브로넥틴을 가진 적합한 기질 상에 직접 플레이트하였다. ELB를 간세포로 세포의 분화를 촉진하도록 조절된 적합한 영양 배지에 배양하였다. 예를 들면, ELB를 10-15% 녹아웃 혈청, EGF(10-100 ng/ml), 간세포 성장인자(HGF)(5-50 ng/ml), bFGF(5-20 ng/ml), FGF-4(5-50 ng/ml), IL-6(10-100 ng/ml), 산성 FGF(50-100 ng/ml), 사람 온코스타틴(10-50 ng/ml), 인슐린-트랜스페린-아셀렌산(ITS)(1X), 덱사메타손(10-100 nM), 부티르산 나트륨(1-5 mM), DMSO(0.5-1%) 및 5-아자시티딘(1-10 μM)으로 보충된 DMEM에서 배양하였다. 성장 인자를 초기 성장 인자, 중기 성장 인자 또는 후기 성장 인자로서 배양된 세포에 함께 또는 다른 시점에 첨가하였다. 세포를 20일 동안 배양하였다.

상기에서 발생한 분화된 간세포의 형태를 위상 콘트라스트 현미경(도 10(h)) 및 헤마톡실린-에오신 염색에 의하여 검사하였다. 또한, 간세포는 RT-PCR를 사용한 유전자 발현, 항알부민 항체를 사용한 면역형광에 의한 면역학적 특성화 및 과요오드산-쉬프 염색(PAS)에 의하여 검출된 세포에서 저장된 글리코겐의 증거에 의한 기능적 특성화에 대하여 분석하였다. 이러한 분석들은 분화된 단계 말기에, 바람직하게는 상기 프로토콜에서 개시된 간세포 분화 후 20일에 수행하였다. 도 10(d)는 PAS 염색에 의한 성숙한 간세포의 불용성 글리코겐 침전을 나타낸다. 더욱이, ELSC 유도된 간세포의 광범위한 기능적 특성화의 연속으로서, 예상되는 약물 스크리닝으로서 이들 간세포의 잠재력은 글루코스-6-포스파타제 활성, LDL 흡수 및 알부민 생산의 분석뿐만 아니라 시토크롬 p450 분석 및 분화된 세포의 요소 분석에 의하여 확인된다.

면역형광 분석에 대한 분화된 간세포를 준비하기 위하여, 먼저 21일된 간세포(타원형)를 20 분 동안 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich)로 고정하였다. 그 다음, 간세포를 실온(RT)에서 PBS로 1회 세척하고, 4℃에서 보관하거나 RT에서 5분 동안 0.2% 트리톤 X-100으로 직접 투과시켰다. 고정액을 흡인기로 빨아들인 후, 간세포를 PBS로 3회(각 5분) 세척하고, RT에서 1 시간 동안 1% BSA를 함유한 PBS로 차단하였다. 1X PBS로 2회 더 세척한 후에, 간세포를 RT에서 밤새도록 1X PBS-1% BSA에서 희석한 1차 항체 용액과 함께 인큐베이션하였다. 사용된 1차 항체는 시토케라틴 18(CK18), 1:200(Chemicon, Inc, USA)이였다. CK18는 간세포 원형질막 표면 에서 발현된다(Wells et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:28574-581). 그 다음날, 간세포를 로커에서 1X PBS로 3회(각 10분) 세척하였고, 로커에서 1 시간 동안 RT에서 1X PBS-1% BSA에 형광 표지 FITC를 함유한 2차 항체 희석물과 함께 인큐베이션하였다. PBS로 3회(각 5분) 세척한 후, 간세포를 1 mg/ml DAPI 용액에 노출시켰다. 간세포를 1X PBS로 2회(각 5분) 세척하고, DPX 표본제로 슬라이드에 표본 제작하였다. 도 10(e)은 ELSC에서 분화된 간세포가 항 CK18 항체에 대하여 양성 염색됨을 나타낸다.

또한, ELSC에서 분화된 간세포는 전술한 바와 같이 RT-PCR에 의하여 AFP 및 알부민의 발현에 대하여 분석하였다. 도 11은 초기 및 성숙한 간세포 형성 모두를 나타내는 AFP 및 알부민의 발현을 나타낸다.

7) 췌장 베타 섬 세포로 다능성 배아 유사 줄기 세포의 분화

본 발명의 ELSC가 췌장 베타 섬 세포로 분화할 수 있는 지를 결정하기 위하여, ELSC에서 유도된 ELB를 적합한 배지에서 약 4-10일 동안 배양하였으며, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들면 폴리오르니틴, 라미닌 또는 피브로넥틴을 가진 적합한 기질 상에 직접 플레이트하였다. ELB를 췌장 베타 섬 세포로 세포의 분화를 촉진하도록 조절된 적합한 영양 배지에 배양하였다. 예를 들면, ELB를 10-15% 녹아웃 혈청으로 보충된 DMEM 및 N2 보충물(1%), B27 보충물(2%), 포르스콜린(10 μM) 및 사이클로파민(10 μM)의 존재하에서 배양하였다. 세포를 약 12일 동안 배양하였다.

상기 배양 프로토콜에서 분리한 세포를 분화된 간세포에 대하여 전술한 바와 같이, 면역형광 분석을 사용하여 배양물에서 췌장 베타 섬 세포의 존재를 확인하기 위하여 분석하였다. 분화된 세포를 베타 섬 세포를 나타내는 항 PDX-1 항체로 염색하기 위하여 면역형광을 사용하여 분석하였다. 인슐린 촉진 인자-1(PDX-1)은 췌장의 베타 섬 세포에 의하여 발현되는 전사 인자이다. 도 10(k)는 항 PDX-1 항체와 염색한 후에 ELSC로부터 유도된 베타 섬 세포에서 양성 면역형광을 나타낸다. 또한 베타 섬 세포를 하기 프라이머를 사용한 전술한 RT-PCR을 사용하여 인슐린 및 소마토스타틴의 유전자 발현에 대하여 분석하였다:

표 8

도 11은 베타 섬 세포를 나타내는 분화된 세포에 의한 인슐린 및 소마토스타틴의 발현을 나타낸다.

8) 심근 세포로 다능성 배아 유사 줄기 세포의 분화

본 발명의 ELSC가 심근 세포로 분화할 수 있는 지를 결정하기 위하여, ELSC에서 유도된 ELB를 적합한 배지에서 약 4-10일 동안 배양하였으며, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들면 폴리오르니틴, 라미닌 또는 피브로넥틴을 가진 적합한 기질 상에 직접 플레이트하였다. ELB를 심근 세포로 세포 분화를 촉진하도록 조절된 적합한 영양 배지에 배양하였다. 예를 들면, ELB를 EGF(50 nm), TGF 베타-3(10 ng/ml), bFGF(50 ng/ml), PDGF-BB(50 ng/ml) 및 ITS(1X)의 존재하에서 15% 녹아웃 혈청 및 100 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM/F-12(1:1)에서 배양하였다. 사람 ES 세포에 대하여 잘 알려진 심근 세포 유도 인자, 5-아자디옥시시티딘(5-10 nM)은 ELSC를 심근 세포로 분화하는 데 유용한 것으로 확인되지 않았다. 심장친화성 인자를 초기 성장 인자, 중기 성장 인자 또는 후기 성장 인자로서 분화 배지에 함께 또는 다른 시점에 첨가하였다. 세포를 약 21일 동안 배양하고, 예를 들면 위상 콘트라스트 현미경을 통하여 수축하는 배아 유사체(즉, 박동하는 심장 세포)에 대하여 모니터하였다.

상기 분화 프로토콜에서 분리한 세포를 도 10(f)에 나타낸 바와 같이 ELSC 유도된 심근 세포의 존재를 확인하기 위하여 형태적으로 평가하였다. 또한, ELSC 유도 심근 세포는 항 cTnT 항체(Santacruz, USA)를 사용하여 심근 세포를 특징으로 하는 마커인 심장 트로포닌 T(cTnT)의 발현에 대하여 분석하였다. 도 10(g)은 이들 세포가 심근 세포를 나타내는 항 cTnT 항체에 의하여 인식된다는 것을 나타낸다. ELSC 및 ELSC에서 분화된 심근 세포를 하기 프라이머를 사용한 전술한 RT-PCR에 의하여 c-액틴 및 Na-Ca 교환기(NCX)의 발현에 대하여 분석하였다:

표 9

c-액틴 및 NCX의 발현은 성체 심근 세포 형성을 나타낸다. cDNA를 증폭하기 위하여 사용된 PCR 프라이머는 각 유전자의 엑손 서열에 특이적이여서, 유전자를 코딩하는 게놈 DNA가 아닌, cDNA만을 증폭시켰다. 도 11은 ELSC 및 이들로부터 유도된 분화된 심근 세포에서 심근 세포 특이적 마커의 발현에 대한 RT-PCR의 결과를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, c-액틴 및 NCX는 미분화 ELSC에서가 아니라, 분화된 심근 세포에서 발현된다. 또한, 심장 질환에 대한 세포 치료에서 이 ELSC 유도된 심근 세포의 잠재력은 전기생리학에 의한 심근 세포의 광범위한 기능적 특성화뿐만 아니라 생체 내 동물 모델을 사용한 테스트에 의하여 평가된다.

9) 근세포로 다능성 배아 유사 줄기 세포의 분화

본 발명의 ELSC가 근세포로 분화할 수 있는 지를 결정하기 위하여, ELSC에서 유도된 ELB를 적합한 배지에서 약 4-10일 동안 배양하였으며, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들면 폴리오르니틴, 라미닌 또는 피브로넥틴을 가진 적합한 기질 상에 직접 플레이트하였다. ELB를 근세포로 세포 분화를 촉진하도록 조절된 적합한 영양 배지에 배양하였다. 예를 들면, ELB를 10-15% 녹아웃 혈청으로 보충된 DMEM 및 5-아자시티딘(5-10 μM) 및 PDGF-BB(10-50 ng/ml)의 존재 하에서 배양하였다. 세포를 약 12일 동안 배양하였다.

상기 분화 프로토콜에서 분리한 세포를 분화 개시시에 근원세포에서 활성화된 근육 특이적 기초적인 헬릭스-루프-헬릭스(basic-helix-loop-helix) 전사 인자를 코딩하는 유전자 패밀리의 멤버인 미오게닌의 발현에 대하여 분석하였다. 미오게닌에 대한 항체(Santacruz, USA)를 배양물 중의 근세포의 존재를 확인하기 위하여 사용하였다. 도 10(e)은 이들 세포가 항 미오게닌 항체에 의하여 인식된다는 것을 나타낸다. 또한, ELSC 및 ELSC로부터 분화된 세포를 전술한 RT-PCR에 의하여 미오게닌의 발현에 대하여 분석하였다. 도 11은 분화된 세포에서 미오게닌의 발현을 나타내는데, 이는 근세포를 나타낸다.

10) 내피 세포로 다능성 배아 유사 줄기 세포의 분화

본 발명의 ELSC가 내피 세포로 분화할 수 있는 지를 결정하기 위하여, ELSC에서 유도된 ELB를 적합한 배지에서 약 4-10일 동안 배양하였으며, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들면 폴리오르니틴, 라미닌 또는 피브로넥틴을 가진 적합한 기질 상에 직접 플레이트하였다. ELB를 내피 세포로 세포 분화를 촉진하도록 조절된 적합한 영양 배지에 배양하였다. 예를 들면, ELB를 10-15% 녹아웃 혈청으로 보충된 DMEM 및 VEGF(20 ng/ml), bFGF(50 ng/ml) 및 BMP-4(1-10 ng/ml)의 존재 하에서 배양하였다. 세포를 약 21일 동안 배양하였다.

ELSC 및 ELSC에서 분화된 내피 세포를 전술한 RT-PCR에 의하여 PECAM의 발현에 대하여 분석하였다. 도 11은 ELSC 및 분화된 세포에서 PECAM의 발현을 도시하는데, 이는 내피 세포를 나타낸다.

본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시 내용에 비추어 부당한 실험없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구체예에 대하여 기술하였지만, 당업자라면, 본 발명의 개념, 사상 및 범주를 벗어나지 않고 본 명세서에 기재된 조성물 및/또는 방법과 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변경이 적용될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 또는 물리적으로 관련있는 특정한 제제가 본 명세서에 기재된 제제를 대체할 수 있더라도, 동일하거나 유사한 결과를 얻을 것이라는 것은 명백하다. 당업자에게 명백한 모든 그러한 유사한 치환 및 수정은 첨부된 특허 청구의 범위에 의하여 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범주 및 개념 내에 있는 것으로 간주한다.

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1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
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8. 삭제
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10. (ⅰ) 각막공막 윤부에서 유래되고, (ⅱ) 시험관 내 배양물에서 증식할 수 있으며, (ⅲ) 계통 결정된(lineage-committed) 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 유지하는 다능성 포유류 배아 유사 줄기 세포(ELSC)에 있어서, 상기 줄기 세포는 배양물에서 20 계대 배양 후 미분화된 상태인 것을 특징으로 하는 배아 유사 줄기 세포(ELSC; embryonic-like stem cell).
11. (ⅰ) 각막공막 윤부에서 유래되고, (ⅱ) 시험관 내 배양물에서 증식할 수 있으며, (ⅲ) 계통 결정된(lineage-committed) 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 유지하는 다능성 포유류 배아 유사 줄기 세포(ELSC)에 있어서, 상기 줄기 세포는 배양물에서 100 계대 배양 후 미분화된 상태인 것을 특징으로 하는 배아 유사 줄기 세포(ELSC).
12. 하기의 단계들로 구성되는, 치료용의 생체외(in vitro) 다능성 배아 유사 줄기 세포 집단의 생성방법:

    (a) 생코팅 조직 배양 접시(plate)상에, 비배아 기원의 각막 윤부 생검을 배양하는 단계;

    (b) 상기 각막 윤부 세포를 세포외 매트릭스 상에서 생체외 증량시키는 단계;

    (c) 배양 21일 후에, 4℃에서, 트립신 EDTA로 30분 또는 디스파제 용액으로 24시간 동안 처리하여, 상기 윤부 세포를 분리함으로써, 단일 세포 현탁액을 얻는 단계;

    (d) 형광 활성화 세포 분류법(FACS) 또는 자기 친화성 세포 분류법(MACS)을 사용하여, 다능성 배아 유사 줄기세포를 선별하는 단계;

    (e) 분화제를 사용하여, 상기 다능성 배아 유사 줄기세포를 다양한 계통으로 분화시키는 단계;

    (f) 유세포분류기(flow cytometry), 분자분석 및 세포분석을 이용하여, 상기 분화된 다능성 배아 유사 줄기세포를 동정하는 단계;

    (g) 핵형분석(karyotyping) 및 텔로머라제 활성 시험을 이용하여, 상기 다능성 배아 유사 줄기세포를 더 분석하는 단계;

    (h) 배양물을 함유하는 상기 다능성 배아 유사 줄기세포를, 증식 및 줄기세포성을 지지할 수 있는 배지에서 유지시키는 단계;

    (i) 상기 다능성 배아 유사 줄기세포를, 10%의 디메틸설폭시드(DMSO) 또는 액체질소에 냉동보관하는 단계;

    (j) 배양물을 함유하는 상기 냉동보관된 다능성 배아 유사 줄기세포를, 증식 및 줄기세포성을 지지할 수 있는 배지에서 유지시키는 단계; 및

    (k) 다능성 및 분화능을 보유하기 위하여, 상기 냉동보관된 다능성 배아 유사 줄기세포를 원하는 때에 실온에서 녹이는 단계.
13. 제12항에 있어서, 상기 선별단계(d) 전에 다음의 단계들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    (a) 생코팅 조직 배양 접시(plate)상에, 비배아 기원의 공여자로부터 얻어진 각막 윤부 생검을 배양하는 단계;

    (b) 세포외 매트릭스상에 21일 동안 상기 윤부 세포를 배양하는 단계;

    (c) 4℃에서, 트립신 EDTA로 30분 또는 디스파제 용액으로 24시간 동안 처리하여, 상기 윤부 세포를 분리함으로써, 단일 세포 현탁액을 얻는 단계; 및

    (d) 상기 각막 윤부 세포를 세포외 매트릭스 상에서 생체외 증량시키는 단계.
14. 제12항에 있어서, 상기 줄기 세포는 각막공막 윤부에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제12항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스는, 매트리겔(Matrigel), 인간 양막,라미닌, 콜라겐-IV, 폴리-L-리신, 젤라틴, 폴리-L-오르니틴, 피브로넥틴 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제12항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스는, 매트리겔(Matrigel)인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 배양을 위한 배지는, 성장인자로 보충된, DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)과 햄 F-12을 1:1의 비율로 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 성장인자는, 상피 성장인자(EGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 인슐린, 아셀렌산 나트륨, 인간 트랜스페린, 인간 백혈병 억제 인자(hLIF) 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제12항에 있어서, 상기 다능성 배아 유사 줄기세포는, CD73 및 CD105 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제12항에 있어서, 상기 다능성 배아 유사 줄기세포는, CD34, CD45, CD133, CD106, CD11c, CD123 및 CD14 음성인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제12항에 있어서, 상기 다능성 배아 유사 줄기세포는, HLA-DR 음성인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제12항에 있어서, 상기 줄기 세포의 46% 이상이 CD117 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제12항에 있어서, 상기 줄기 세포의 53% 이상이 CD54 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제12항에 있어서, 상기 줄기 세포의 98% 이상이 CD31 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제12항에 있어서, 상기 분화제는, 산성 FGF, 염기성 FGF, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 인슐린, 레티노산, 트랜스페린, 인슐린-트랜스페린-셀렌산(ITS), 덱사메타손, 부티르산 나트륨, DMSO, 신경 성장인자(NGF), 시토신 베타-d-아라비노 푸라노시드(AraC), 아교 세포주 유래 향신경성 인자 유전자(GDNF), 형질전환 성장인자 β3(TGF-β3), 아스코르브산, N-아세틸 시스테인, 디부타릴 환상 AMP, 뉴투린, 형질전환 성장 인자 β1(TGF-β1), 인슐린 유사 성장인자 I(IGF-I), IGF-II, 상피세포 성장인자(EGF), 골 형성 단백질 2(BMP-2), β 글리세로포스페이트, 아스코르브산 2 인산염, 5-아자-데옥시-시티딘, 온코스타틴, 간세포 성장인자(HGF), 프로게스테론, 니코틴아미드 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제12항에 있어서, 상기 다능성 배아 유사 줄기 세포는, FACS를 이용하여 동정한 결과 98%의 SSEA-4 양성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제12항에 있어서, 상기 다능성 배아 유사 줄기 세포는, OCT-4, Nanog, UTX-1, FGF-4, Rex-1, Sox-2 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미분화 줄기 세포 분자 표면 마커에 의한 분자 분석법을 이용하여 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제12항에 있어서, 상기 다능성 배아 유사 줄기 세포는, SSEA-4, SSEA-3, SSEA-1, OCT-4, TRA-1-60, TRA-1-80 및 알카라인 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 마커에 의한 세포 분석법을 이용하여 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제12항에 있어서, 상기 다능성 배아 유사 줄기 세포는, 정상 핵형 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 정상 핵형 세포는, 배양물에서 배가 계대수(population doublings)가 100이 될때 까지 배양하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 방법.
31. 제12항에 있어서, 배양물을 함유하는 상기 다능성 배아 유사 줄기세포는, 증식 및 줄기세포성을 지지할 수 있는 배지에서, 배가 계대수가 100이 될때 까지 배양하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 방법.
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