JP4900587B2 - ヒト胚幹細胞由来の最終分化ドーパミン作動性神経細胞の誘導 - Google Patents
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Description
該当なし
連邦政府の委託研究または開発に関する言明
該当なし
マイクロフィッシュ添付物
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発明の背景
1.発明の分野
本発明は、ヒト胚幹細胞等の多能性胚幹細胞から最終分化神経細胞、例えばドーパミン作動性神経細胞およびセロトニン作動性神経細胞を生産する改善された方法に関する。本発明の開示にもとづいて生じたドーパミン作動性神経細胞およびセロトニン作動性神経細胞は、神経変性障害および神経疾患での細胞置換療法のための優れた供給源として用いることが可能である。
神経変性障害および神経疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー症、および統合失調症は、我々の社会でますます顕著になってきている。これらの神経障害の多くに、ドーパミン作動性もしくはセロトニン作動性の神経細胞がかかわっている。ドーパミン作動性神経細胞は、中脳の腹側面および腹外側面にあって、姿勢反射、運動、および報酬関連挙動を制御する。これらの神経細胞は、前脳にある多重構造を神経支配し、該神経の変性または異常機能はパーキンソン病、統合失調症、および薬物嗜癖に関連する(Hynes et al.,1995,Cell 80:95−101)。セロトニン作動性神経細胞は、後脳の腹側面および腹外側面に集中しており、大脳皮質、大脳辺縁系、および脊髄を含む中枢神経系の大部分を神経支配する。これらの神経細胞は、意識、覚醒、行動特性、および摂食行動のレベルを制御し、さらに異常機能が攻撃性、鬱病、および統合失調症に結び付けられていた(Jacobs and Gelperin,1981,Serotonin Neurotransmission and Behavior.The MIT Press,Cambridge,Mass.)。セロトニン作動性の機能障害は、種々の精神的疾患、神経的疾患、および他の疾患(例えば、精神の抑うつ(Asberg et al.,1986,J.Clin.Psychiatry 47:23−35)、自殺(Lester,1995,Pharmocopsychiatry 28(2):45−50)、および激しい攻撃行動)の病態生理学でも、ある種の役割を演じている可能性がある(Brown et al.,J.Clin.Psychiatry,1990,54:31−41;Eichelman,1990,Anon.Rev.Med.41:149−158)。
本発明の開示は、神経前駆細胞、最終的には分化した神経を、多能性の幹細胞(例えば、ヒト幹細胞等の多能性の幹細胞から生産するための改良された方法に関する。例えば、本発明の開示は、ヒト幹細胞の集団が高い割合で、ドーパミン作動性神経細胞の特異的マーカーであるチロシンキナーゼ(TH)に陽性の神経に分化にする(例えば、少なくとも約60%)。本発明の開示は、ヒト幹細胞の集団が高い割合でセロトニン作動性神経細胞に分化することも示す。本発明の開示の方法にもとづいて生ずるドーパミン作動性およびセロトニン作動性神経細胞の割合は、既に述べられた方法よりも高い。本明細書に開示される方法もまた、星状細胞およびオリゴデンドロサイトと同様に、ヒト胚幹細胞から、コリン作動性および感覚神経の表現型特徴を持つ細胞を生成するために用いられることが可能である。
(a)霊長類の多能性の幹細胞の培養を増殖させるステップと、
(b)多能性の幹細胞を培養して、ネスチンに陽性の神経前駆細胞を選択するステップと、
(c)NCAM陽性細胞をエンリッチするためのネスチン陽性神経前駆細胞を選別するステップと、
(d)分化培地でネスチン陽性NCAM陽性細胞を培養することで、ネスチン陽性NCAM陽性細胞を分化させて、分化した神経細胞集団を生成するステップと、
を含む、分化神経細胞集団を生成するための方法を提供する。
(a)霊長類の多能性の幹細胞の培養を増殖させ、
(b)多能性の幹細胞を培養して、ネスチンに対して陽性である神経前駆細胞を選択し、
(c)NCAM陽性細胞をエンリッチするための前記ネスチン陽性神経前駆細胞を選別し、
(d)分化培地中で、ネスチン陽性NCAM陽性細胞を培養し、該細胞を分化させることで、分化した神経細胞集団を生成し、
(e)治療上有効な量からなる分化した神経細胞集団を被検体の中枢神経系に投与する
好ましくは、上記分化培地はTGF−β3またはインターロイキン−1βあるいはそれら両方を含む。好ましい実施形態では、被検体は患者、より好ましくは、ヒト患者であり、霊長類の多能性の幹細胞がヒト胚幹細胞である。好ましくは、ヒト胚幹細胞は患者と組織適合する。例えば、使用した多脳性の幹細胞が本質的に患者のものと同一のゲノムを有する。特定の実施例において、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、コリン作動性、感覚神経細胞、またはその代わりとして神経膠星状細胞、あるいはオリゴデンドロサイトは、分化した神経細胞集団から分離されて、患者に投与される。これらの細胞は、例えば分化した神経細胞集団を含むもので、被検体に投与されることで、種々の神経変成障害または神経疾患、例えば限定されるものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン(舞踏)病、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、てんかん、脳梗塞、および虚血からなる群から選択される。好ましくは、上記細胞を移植によって、例えば所望の細胞を被検体の脳に移植することによって、投与する。
本発明の開示は、多能性の幹細胞から分化する神経血統の細胞の効果的な生成方法を提供する。本明細書中で生成される細胞として、限定されるものではないが、神経前駆細胞、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、コリン作動性、および感覚神経細胞、さらにまた星状細胞およりオリゴデンドロサイトの表現型の特徴を持つ細胞が挙げられる。本明細書で生ずる細胞は、そのような細胞の評価をおこなう当業者によって容易に理解される表現型の特徴、形態学的特徴、および/または細胞マーカーによって、同定される。本明細書で使用するように、「神経前駆細胞(neuroprogenitor cell)」という用語は、「神経前駆細胞(neural progenitor cell)」または「神経前駆細胞(neural precursor cell)」という用語と相互に置き換えることができ、神経前駆体もしくは神経細胞等の神経細胞あるいはグリア前駆体、星状細胞、もしくはオリゴデンドロサイト等のグリア細胞のいずれかである子孫を生成することができる。本明細書中に開示される方法は、細胞が神経系列の細胞に分化するのを促進する環境条件と可溶因子との組み合わせで、細胞を培養することを含む。さらに、物理的分離またはマニピュレーション技術を用いて、さらに所望の神経細胞型についてエンリッチすることができる。
1.多能性の幹細胞の母集団を単離する。多能性の幹細胞は、新規レーザー・アブレーション法を使用して誘導される好ましくはES細胞である。
多能性幹細胞の供給源
多能性幹細胞から神経系列の細胞を分化させるための本明細書に開示される方法は、著しく高い割合の多能性幹細胞を特定の神経細胞型に分化させることを目的とする特定の培養条件を用いることを伴う。多能性の幹細胞は、前胚、胚、または受精後の任意の時間の胎児の組織に由来するもので、適当な条件下で、いくつかの異なる細胞型に分化することが可能であり、該細胞型は全体で3つの胚葉(内胚葉、中胚葉、および外胚葉)の誘導体である。神経系列の細胞は、分化する能力を有する胎児または成体組織から単離される幹細胞に由来することもでき、あるいは神経系列の細胞に再プログラムされることもできる。多能性の幹細胞は、限定されるものではないが、哺乳類のES細胞およびEG細胞(望ましくは霊長類またはヒトES細胞およびEG細胞)を含む。望ましくは、未分化の多能性幹細胞は、培地中で分裂して際限なく増殖する能力を有する。本明細書で用いられるように、用語「分化(differentiation)」とは、未分化の多能性幹細胞または前駆体細胞がより特化した運命を獲得するプロセスのことをいう。例えば、分化細胞は特定の細胞型または組織に特徴的である表現型を有する。
神経前駆細胞の調製
単離した多能性の幹細胞を増殖し、該幹細胞を神経前駆細胞に分化させる培養条件にさらすことが可能である。多能性の幹細胞を神経分化経路に沿って進めるために、本明細書に開示した分化プロトコールに従って細胞の培養をおこなう。多能性幹細胞の培養を、分化剤(例えば可溶性因子および増殖因子)を含む分化栄養培地中の適当な基質上でおこなう。適当な基質として、限定されるものではないが、正電荷で被覆した固体表面(例えば、ポリ‐L‐リジンまたはポリオルニチン)、細胞外基質成分で被覆された基質(例えばフィブロネクチン、ラミニンまたはMatrigel(登録商標))、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい分化栄養培地は所望の神経細胞型の増殖、分化、および生存を支持するものであって、1種類以上の適当な分化剤を含むものであってもよい。本明細書で用いられるように、用語「増殖因子(growth factor)」とは、細胞の増殖および分化の活性化を主要な結果とする細胞表面上で受容体に結合するタンパク質のことをいう。適当な可溶性因子として、限定されるものではないが、ニューロトロフィン、マイトジェン(幹細胞因子)、増殖因子、分化因子(例えば、TGF−βスーパーファミリー)、TGF−βスーパーファミリー・アゴニスト、神経栄養因子、抗酸化剤、神経伝達物質、および生存因子が挙げられる。多くの可溶性因子はかなり用途が広く、他のものが特定の細胞型に対して特異的である一方で、数多くの異なる細胞型で細胞分裂を刺激する。
ドーパミン作動性およびセロトニン作動性神経細胞の分化
本明細書中に開示される方法によって調製される神経前駆細胞は、さらに分化して高い割合の成熟した神経細胞、例えばドーパミン作動性神経細胞およびセロトニン作動性神経細胞になる。神経前駆細胞は、星状細胞およびオリゴデンドロサイトにさらに分化することもできる。好ましくは、ネスチン陽性および/またはNCAM陽性神経前駆細胞は、最終的に分化した神経細胞または成熟した神経細胞への前駆細胞の分化を促す神経基本培地で5〜60日間増殖する。好ましい実施形態では、上記神経基本培地(Gibco)は、10%FBSもしくはDCS、B27、およびインターロイキン−1β、ジブチリル環状AMP(db−cAMP)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、形質転換増殖因子β3(TGF−β3)、形質転換増殖因子α(TGFα)、ニューチュリン、SHH、アスコルビン酸、BDNF、FGF−2、FGF−8、N−アセチル・システイン、C−キット・リガンド、レチノイン酸、NT−3、BMP−2、およびBMP−4が挙げられる。好ましい実施形態では、上記神経基本培地として、1種類以上の以下の因子、すなわちインターロイキン−1β、db−cAMP,GDNF、TGF−β3、ニューチュリン、SHH、アスコルビン酸、BDNF、FGF−8、およびN−アセチル・システインを含む。加えて、神経前駆細胞の分化、増殖、または両方を助長する因子のいくつかまたは全てを取り下げることで、分化が促進される場合もある。
神経前駆細胞および分化した神経細胞の用途
本明細書に記載する神経前駆細胞および分化した神経細胞(例えば、成熟した神経細胞、最上細胞、およびオリゴデンドロサイト)を種々の用途、例えば治療への応用、さらにまたそれらの細胞に作用する小分子薬等の種々の化合物の生体外評価およびスクリーニングに利用することができる。これらの細胞は、該細胞の発現パターンを分析するために、使用した特定の細胞に対するマーカーに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製と同様に、当業者に周知の技術を用いて、cDNA発現ライブラリーを調製するために用いることもできる。これらの細胞を、消耗性の神経変性障害および神経疾患を患っている個体の利益のために、治療として使用することもできる。
治療的な調製から多能性の幹細胞を除去するための1つの戦略は、ベクターで細胞をトランスフェクトすることであり、該ベクターは未分化細胞で優先して発現される遺伝子を有し、該発現は多能性の幹細胞に対して選択される。未分化細胞で優先して発現される適当なプロモータは、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)プロモータとOCT−4プロモータとである。ベクターで発現される遺伝子は、例えば細胞(例えば毒素)に対する溶解薬であってもよく、あるいは外部物質を適用することによって選択することができる。
以下の実施例は、本発明開示の出願人がヒト胚幹細胞からの機能的ドーパミン作動性神経細胞および セロトニン作動性神経細胞の誘導を説明する。
(1)ヒト胚幹細胞
まずはじめに、ヒトES細胞を、ヒト胚盤胞の内細胞塊から単離した。ヒト多能性ES細胞を、胚盤胞の試験的使用のために個体患者から同意を得た後に、過剰なヒト胚盤胞から誘導した。本明細書中に使用されるヒトES細胞系は、米国特許出願第10/226,711号に開示されるように、新規レーザー・アブレーション法を使用しているヒト胚盤胞の内細胞塊の細胞から誘導した。手短に言うと、透明帯、栄養外胚葉、および内細胞塊を有しているヒト胚盤胞を単離し、1.48μmの非接触型ダイオードレーザーを用いて、ヒト胚盤胞の透明体と栄養外胚葉を通る開口(アパーチャー)を形成した。次に、吸引ピペットを開口を通して導入して吸引によって内細胞塊の細胞を単離していた。これらの細胞を続いて、マイトマイシンC処理マウス支持細胞含有ES培地を有する0.1%ゼラチン化プレート上で培養し、内細胞塊由来の細胞塊を形成した。ES細胞培地は、ダルベッコ改質EaglES培地(DMEM)またはノックアウトDMEM(Gibco)からなるもので、10〜20%ES細胞制限ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone)または血清置換ノックアウト血清(ギブコ)、1%のMEM非必須アミノ酸溶液、2mMのL−グルタミン、0.1mMβ−メルカプトエタノール、4ng/mlの塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)(Sigma)、50U/mlのペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシンを補った。これらの内細胞塊から誘導した細胞塊を解離し、マウス支持細胞層含有ES培地で再び平板培養し、それをヒトES細胞系を誘導するために用いる。
(2)ヒト胚幹細胞の培養および発現
ヒトES細胞を培養し、凍結ストックから標準増殖条件下で増殖させた。凍結ストック・バイアルから得た未分化のヒトES細胞をLIF含有ES培地に再懸濁した。ES細胞培地は、ダルベッコ改質EaglES培地(DMEM)からなり、20%ES細胞制限胎仔ウシ血清(FBS)(Hyclone)、1%の非必須アミノ酸(NEAA)溶液、2mMのL−グルタミン、0.1mMβ−メルカプトエタノール、50U/mlのペニシリン、および1,000U/mLのLIFを補った。細胞をペレット化して、ES培地を用いて、ゲラチン被覆プラスチック培養皿上のマウス支持細胞層に、平板培養した。高グルコースのDMEMからなり、10〜20%FCS、2mML−グルタミン酸、1%MEM非必須アミノ酸溶液、0.1mMβ−メルカプトエタノール、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、1,000U/mlLIF、および4ng/mlbFGFを補ったES細胞培地からなり、Thomson et al.,1998,Science 282:1145−1147;Shamblott et al.,1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95:13726−13731;およびReubinoff et al.,2000.Nature Biotech.18:399−403 に記載された方法にもとづく。
(3)胚様体の生成
未分化ヒトES細胞を増殖して増やした後、該細胞を培養して胚様体を形成した。最初に、ES細胞を0.05%トリプシン−EDTAで分離した後、スクラップして細胞を小さなクラスターに破壊した。次に、これらのクラスターを約1x105細胞/mlで、支持細胞が無い細菌学的皿上に植え付けた。使用した細菌学的皿は、付着を阻む非粘着性の表面を有することから、ES細胞の分化および胚様体形成を刺激する。これらの細胞をLIFおよびbFGFを含まないES培地での懸濁培養として培養した。これらの細胞を培養するために使用したES培地は、高グルコースのDMEMまたはノックアウトDMEMであり、10〜20%FCSまたはノックアウト血清置換、同様に他のサプリメント(例えば、β−メルカプトエタノール、L−グルタミン酸、および抗体)で補われている。bFGFはいっさいES培地に加えられていない。胚様体を4〜8日間増殖させた。この時間のあいだ、ES培地は、沈殿法により2日毎に変えられた。この沈殿法は、凝集体の懸濁液を遠心管に移し、凝集体を遠心管の底に沈殿させ、培地を吸引し、さらにそれを新鮮な培地に置き換えた。新鮮な培地に含まれる凝集体をつぎに培養皿に移した。4〜8日後、胚様体を回収し、低速で遠心し、さらにES細胞培地に再懸濁した。約20〜30の胚様体を、LIF無しの0.1%ゲラチン含有ES培地で被覆された組織培養プレート上に植え付け、さらに24時間インキュベートした。
(4)ネスチン陽性神経前駆体の選択および増殖
24時間後、ネスチン陽性細胞(神経前駆細胞)を、ES培地の代わりにITSFn(ネスチン選択)無血清合成培地を用いることで、選択した。ITSFn培地は、DMEM:F12培地(Gibco)からなり、増殖因子インスリン(5〜25μg/ml)(Sigma)、亜セレン酸ナトリウム(10〜50nM)(Sigma)、トランスフェリン(1〜10gg/ml)(Gibco)、およびフィブロネクチン(1〜5μg/ml)で補った。
この培地はネスチン陽性細胞の選択を可能とし、2日毎に補充しているITSFn培地で、6〜10日間、通常8〜9日日にわたって実行した。選択が完了した後、上記神経前駆細胞を、免疫蛍光技術を用いてネスチン発現について特徴づけた。その結果、約95%の細胞がネスチンを発現した(図1A)。
(5)磁気選別によるNCAM陽性細胞の選別
次に、神経細胞接着分子(NCAM)陽性細胞をエンリッチするために、ネスチン陽性細胞を単離して増殖あるいは磁気細胞分離(MACS)かけた。NCAMは、神経細胞特異的表面マーカーである。NCAMを使用してMACSによるネスチン陽性細胞を選別するために、ネスチン陽性細胞を最初に組織培養細胞から、0.05%トリプシン−EDTAでインキュベートすることによって、組織培養プレートから収集した。次に、分離した生細胞をPBSで洗い、表面マーカーMCAMに対する抗体(Chemicon)で30分間染色した。次に、細胞をMACSゴースト抗ウサギIgGマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)で15分間インキュベートした。細胞をPBSで注意深く洗った後、磁気選別にかけた。細胞を選別するために、磁気標識細胞懸濁液(ほぼ2x108細胞)をピペットでMACS MS分離カラム(Miltenyi Biotec)に載せ、細胞を該カラムに流し、溶出液(負の分画)を回収した。NCAM陽性細胞による溶出で回収した。
単離NCAM陽性細胞を、0.05%トリプシン−EDTAで最初に分離し、次に該細胞を増殖培地を含んだポリ−L−オルニチン/ラミニン被覆プレートに植え付けた。このようにNCAM陽性細胞を培養することで、増殖培地でより良好な粘着および増殖がおこなわれる。増殖培地は、DME:F12、インスリン(10〜100μg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(10〜50nM)、トランスフェリン(1−10mg/ml)、プトレッシン(50〜200μM)、プロゲステロン(5−40nM)、およびラミニン(10〜50μg/ml)を含有した。2種類以上の増殖因子、例えばbFGF(10〜50ng/ml)、EGF(10〜50ng/ml)、BDNF(50〜200ng/ml)、FGF−8(50〜200ng/ml)および/またはSHH(200〜400ng/ml)を無血清増殖培地でインキュベートした。増殖培地に存在する種々の因子は、神経細胞の割合全体の増加に関与しており、またドーパミン作動性表現型を採用するために、さらにこれらの中脳神経前駆細胞を誘発する。増殖培地を2日ごと補充し、ネスチン陽性NCAM陽性細胞を6〜10日にわたって増殖させた(図1 B)。
(7)ドーパミン作動性神経細胞の分化:
生体内でのドーパミン作動性神経細胞の発現は、細胞外シグナル分子の調整された動作次第である。これらの分子は、系統制限発現で転写制御因子のカスケードを活性化させる。これらの転写制御因子は、ドーパミン作動性表現型の進展に関係する遺伝子の特異的なセットの発現を増加させる役割を果たす。機能的なドーパミン作動性神経細胞に上記プロトコールを使用して、増殖した神経前駆体細胞を促すために、増殖因子 bFGFとEGFとが最初に細胞から取り下げられた。次に、ドーパミン作動性神経細胞への神経前駆体細胞の分化を、30〜50日間にわたって該細胞を神経基本培地でインキュベートすることによって誘発した。神経基本培地は、神経基本A培地(Gibco)、FCS(10〜20%)(HYCLONE)、およびB27(2−10%)(Gibco)、さらに種々の増殖因子を同様に含んだ。この培地に含まれる増殖因子は、インターロイキン−1β(IL−1β)(1〜2μg/ml)(Sigma)、アスコルビン酸(50〜150mM)(Sigma)、N−アセチル・システイン(50〜150nM)(ICN)、ジブチリル環状AMP(500〜1000μM)(Sigma)、GDNF(1〜5μg/ml)(Sigma)、TGF−β3(1〜5μg/ml)(Sigma)、ニューチュリン(100〜500μg/ml)(Chemicon)、BDNF(50〜200ng/ml)(Sigma)、FGF−8(50〜200ng/ml)(R&D Systems)および/またはSHH(200〜400ng/ml)(R&D Systems)を含む。神経基本培地を0.22μミリポア・シリンジ・フィルターで滅菌濾過した。
表1:神経前駆細胞に対する分化条件
(8) 分化した神経細胞の特徴付け
本発明の開示によって生ずる分化した神経細胞の型を、細胞の全体的な形態と免疫蛍光検査法によって同定される表現型とによって評価した。当業者に周知の標準的なプロトコールを用いて、免疫蛍光分析を、神経前駆体増殖段階(NCAM陽性細胞の増殖)と、分化の種々の他の時点とでおこなった。第一に、単離された細胞を、細胞外マトリックスによってプレコーティングされた2−ウェル・チャンバー・スライドで増殖させ、PBSでリンスし、さらに10分間、室温で4%パラホルムアルデヒドによる固定をおこなった。次に、細胞を0.2%トリトンX−100含むPBSで5分間透過化処理し、1%牛血清アルブミン(BSA)/PBSで2時間阻害し、さらに一次抗体(抗体希釈は1%BSA/TBS)で4℃一晩おこなった。細胞を以下の一次抗体で染色した。すなわち、初期の神経マーカーであるβチューブリン、NCAM、神経繊維、遅延神経マーカー、微小管結合タンパク質2(MAP−2)、神経細胞表面抗原A2B5、Nurr−1、チロシン・ヒドロキシラーゼ、ドーパミン輸送体DAT、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ(DBH)、星状膠細胞マーカー・グリア線維酸性蛋白(GFAP)、GABA、オリゴデンドライト、セレトニン、およびシナプトフィシン(すべてCHEMICONから入手)。最後に、細胞をFITC標識二次抗体とインキュベートした。上記のステップの各々の後、細胞をPBSで3回洗った。
表3:未分化および分化型のES細胞の表現型特徴
異なる段階で集められる細胞の遺伝子発現プロフィールも、分析した。開示した方法の以下のステップの各々から細胞を逆転写ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)について分析するために細胞を回収した。未分化ES細胞、胚様体、ネスチン陽性神経前駆細胞、NCAM陽性細胞、および分化した細胞を、神経基本培地での分化の12、17、22、27、および37日後に単離した。細胞を回収した後、ペレットにして、全細胞RNAをこの細胞ペレットからRNアーゼQiagenキットを用いて抽出した。単離RNAを−20℃に保存した。
1.4℃、30分間によるテンプレートcDNAテンプレートの変性と、
2.使用したプライマーに依存した55ないし65℃、1分間によるプライマーのアニーリングと、
3.72℃で分間、反応をインキュベートし、ステップ1〜3(サイクル)を25ないし40回繰り返す。
表4:ドーパミン特異的遺伝子を増幅するために用いたプライマー・セット
(10)ドーパミン検出のための逆相HPLC
ドーパミン作動性神経細胞の1つの限定的な特徴は、ドーパミンの生産である。したがって、ドーパミンを生産する胚幹細胞由来ドーパミン作動性神経細胞の機能的能力(functional capacity)を、逆相HPLC(RPHPLC)を用いて細胞内ドーパミンレベルを直接測定することによって評した。各々の試料で検出されるドーパミンの濃度は,各々の実験の直前または直後のカラムに注入されたドーパミン標準液による比較によって決定した。
表5:HPLCによる細胞可溶化物中のドーパミン濃度(μg/ml)
Claims (22)
- 霊長類の多能性の幹細胞から、分化した神経細胞集団を生成する方法であって、
(a)霊長類の多能性の幹細胞の培養を増殖させるステップと、
(b)ITSFn無血清合成培地中で前記多能性の幹細胞を培養して、ネスチンに陽性の神経前駆細胞を選択するステップと、
(c)磁気細胞分離によってNCAM陽性細胞をエンリッチするための前記ネスチン陽性神経前駆細胞を選別するステップと、
(d)ウシ胎仔血清、B27、TGF−β3、インターロイキン−1β、アスコルビン酸、N−アセチル・システイン、グリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)、ジブチリル環状AMP(db−cAMP)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューチュリン、ソニック・ヘッジホッグ・タンパク質(SHH)、および線維芽細胞増殖因子−8(FGF−8)を補充した神経基本培地を含む分化培地でネスチン陽性NCAM陽性細胞を培養することで、前記ネスチン陽性NCAM陽性細胞を分化させて分化した神経細胞集団を生成するステップと、
を含み、前記分化した神経細胞集団が60%のドーパミン作動性神経細胞を含む、分化神経細胞集団を生成するための方法。 - 前記多能性の幹細胞が、レーザー・アブレーション法を用いて得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性の幹細胞がヒト胚幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒト胚幹細胞がレーザー・アブレーション法を用いて得られる、請求項3に記載の方法。
- 前記分化した神経細胞集団が30%のセロトニン作動性神経細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分化した神経細胞集団が25%のオリゴデンドロサイトを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)の前記多能性の幹細胞を培養して胚様体を形成することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記胚様体を培養して、ネスチンに対して陽性である神経前駆細胞を選択する、請求項7に記載の方法。
- 前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンからなる群から選択される1種類以上の可溶性因子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンを含む、請求項9に記載の方法。
- ネスチンに対して陽性である前記神経前駆細胞が、前記胚様体を無血清培地で培養することで、選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記無血清培地がITSFn無血清合成培地である、請求項11に記載の方法。
- 前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、塩基性線維芽細胞成長因子、トランスフェリン、およびフィブロネクチンからなる群から選択される1種類以上の可溶性因子を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記神経前駆細胞が、95%のネスチン陽性細胞を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記ネスチン陽性神経前駆細胞が、50〜60%のNCAM陽性細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)の前記ネスチン陽性NCAM陽性神経前駆細胞を増殖培地で増殖させることを、さらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記増殖培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ラミニン、プトレッシン、プロゲステロン、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、ソニック・ヘッジホッグ(SHH)、線維芽細胞増殖因子−8(FGF−8)、および脳由来神経栄養因子(BDNF)からなる群から選択される1種類以上の可溶性因子を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記細胞が6〜10日間にわたって前記増殖培地で増殖する、請求項18に記載の方法。
- 1種類以上の集団を倍加させるために、前記細胞を培養し、そして連続的に継代する、請求項18に記載の方法。
- 前記細胞が液体窒素中で凍結保存される、請求項18に記載の方法。
- 前記ネスチン陽性NCAM陽性細胞を分化培地で30〜50日間にわたり増殖させる、請求項1に記載の方法。
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