KR101789917B1

KR101789917B1 - 윤부줄기세포의 증식 및 줄기세포능을 증대시키는 방법

Info

Publication number: KR101789917B1
Application number: KR1020160037741A
Authority: KR
Inventors: 정소향; 이현정
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2016-03-29
Filing date: 2016-03-29
Publication date: 2017-10-26
Also published as: US10894945B2; KR20170111737A; US20170283773A1

Abstract

본 발명은 윤부유래상피세포판 배양액에 Wnt 억제제를 처리함으로써 윤부줄기세포의 증식 및 줄기세포능을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법을 이용하여 인체 윤부유래상피세포판을 배양할 경우, Wnt/β-catenin 신호전달을 억제함으로써 윤부줄기세포의 증식을 증대시키고, 윤부줄기세포의 줄기세포능을 증진시킴으로써 윤부줄기세포를 고효율로 확보할 수 있어, 윤부줄기세포 결핍 환자에게 윤부유래상피세포판 이식시 성공률을 높일 수 있다.

Description

윤부줄기세포의 증식 및 줄기세포능을 증대시키는 방법{Method for increasing the proliferation and stemness of limbal stem cells}

본 발명은 윤부유래상피세포판 배양액에 Wnt 억제제를 처리함으로써 윤부줄기세포의 증식 및 줄기세포능을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

각막은 안구의 가장 앞부분에 위치하는 구조로, 안구 앞쪽 표면 면적의 약 1/6을 차지하며 크기는 약 11mm, 두께는 보통 0.55mm 정도이고, 중심부가 가장 얇으며 주변부로 갈수록 두꺼워진다. 또한, 각막은 투명한 조직으로 빛의 굴절과 전달에 주요한 기능을 하며 신경이 잘 발달되어 있어 외부의 이물질에 민감하게 반응하는데, 각막상피, 보우만막, 각막실질, 뒤경계판(데스메막) 및 각막내피의 5개 층으로 구성되며, 정상적인 각막에는 혈관이 없고 눈물을 통해 대기에서 산소를 공급받고 각막 뒤 전방의 방수와 윤부에서 영양분을 공급받는다. 전 세계적으로 약 450만 명이 양안 실명이고, 이중 상기 각막과 관련된 질환으로 약 100만 명의 환자들이 실명에 이르게 된다고 보고되어 있다.

각막상피세포(corneal epithelial cell)의 생존은 윤부(limbus)에 존재하는 줄기세포에 의해 유지되며, 윤부줄기세포(limbal stem cell; LSC)는 각막상피로만 분화할 수 있는 단능 성체 줄기세포이다. 윤부줄기세포 결핍시 기저 각막상피세포의 표면으로의 이동과 주변부 각막상피세포의 중심부로의 이동이 감소하면서 각막상피세포의 증식보다 탈락이 많아지면 각막상피가 재생되지 못하게 된다. 그 결과 결막상피세포가 윤부를 넘어 각막으로 침투하게 되고, 이것을 결막화(conjunctivalization)라고 부른다. 새로운 환경에도 불구하고 결막상피세포는 고유의 표현형을 유지하면서 각막의 신생혈관을 만들게 되고, 결과적으로 각막혼탁이 발생하여 환자는 실명하게 된다.

각막이 외상을 받거나, 심한 염증을 앓거나 혹은 선천적인 이유 등에 의해서 그 투명성을 유지하지 못하고 혼탁이 생기면, 시신경을 비롯한 눈의 다른 모든 기능이 정상적이라 할지라도 심각한 시력장애를 일으키게 된다. 이러한 혼탁에 대하여 약물이나 레이저 등의 치료가 힘든 경우에는 각막을 절제해내고 기증받은 안구의 투명한 각막으로 대체하여 빛이 눈의 내부로 잘 들어갈 수 있도록 해야 하는데, 이러한 수술이 각막이식수술이다. 이러한 각막 자체의 병변으로 인한 실명은 각막이식으로 시력의 회복을 기대할 수 있는데, 윤부줄기세포 결핍(Limbal stem cell deficiency)으로 인한 각막(cornea)의 결막화 및 혼탁은 윤부줄기세포의 이식이 성공해야 시력회복을 기대할 수밖에 없다. 따라서 이러한 경우 줄기세포 이식 외에는 다른 대안이 없기 때문에 윤부줄기세포 결핍(Limbal stem cell deficiency)으로 인한 각막의 혼탁 및 실명은 난치성 질환으로 분류되고 있다.

윤부줄기세포 결핍 질환은 유전적 또는 외상, 감염, 자외선 손상, 수술적 손상, 콘택트렌즈 착용의 합병증 및 전신질환 등의 후천적 요인으로 윤부에 광범위한 손상이 야기되어 각막상피를 지속적으로 재생할 수 있는 윤부줄기세포가 결핍되어 발생하는 질환으로, 윤부줄기세포 결핍 환자는 위에 열거된 원인 외에도 건성안의 유병률과 중증도 증가 및 독성 안약의 사용 증가로 인해 지속적으로 증가하고 있는 추세이다.

윤부줄기세포 결핍의 치료방법으로는 자가 또는 동종 윤부조직 이식법이 사용되고 있는데, 자가 윤부조직 이식의 경우 반대안에서 같은 크기의 윤부 조직을 채취하여 이식하는 방법이 사용되나, 이 경우 반대안에 윤부줄기세포 결핍 질환을 초래할 위험성이 있다. 한편, 사체에서 기증받는 동종 윤부조직 이식의 경우에는 지속적인 전신 면역억제제의 사용으로 인한 부작용으로 환자들이 고통받고 있으며, 전신 면역억제제를 사용하는 경우에도 윤부 이식편 거부 반응으로 줄기세포의 상당비율이 사멸하는 경우가 빈번히 발생하는 문제점이 있다. 이처럼 윤부줄기세포 결핍질환은 지속적으로 증가하고 있으나 환자에게 효과적이고 합병증이 적은 치료방법은 제대로 개발되고 있지 않는 실정에 있다.

특히, 각막·결막 접점 부위인 윤부(limbus)에 존재하는 윤부줄기세포는 각막상피를 유지 보수하면서 각막상피를 재생시키는 중요한 역할을 하지만, 그 수가 1% 미만이고 다층의 윤부상피의 기저막에 파묻혀 있어 분리해 내기가 극히 어렵다는 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 종래 각막윤부에서 다능성 줄기세포를 분리 배양하는 방법들이 보고된 바 있으나(한국등록특허 제10-0931887호) 아직까지 임상 및 실용화가 가능할 정도로 효율적인 방법은 없는 실정이다.

따라서 치료 성공률을 높이고 치료효과를 높이기 위해 윤부줄기세포의 증식을 촉진시키고 자가재생능을 지속적으로 유지시킴으로써 윤부줄기세포를 대량으로 확보할 수 있는 효율적인 방법의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 윤부줄기세포를 대량으로 확보할 수 있는 방법을 예의 연구한 결과, 인체 윤부유래상피세포판 배양조건에서 배양액에 Wnt 억제제를 처리한 결과 윤부줄기세포의 증식이 증대되고, 윤부줄기세포의 줄기세포능 증진 및 분화 억제 효과를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 인체 윤부유래상피세포판 배양에서 윤부줄기세포의 증식을 증대시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 인체 윤부유래상피세포판 배양에서 윤부줄기세포의 줄기세포능을 증진시키는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 윤부줄기세포의 증식을 증대시키는 방법을 제공한다.

(a) 인체 윤부유래상피세포판을 배양액에 침지시키는 단계; 및

(b) 상기 배양액에 Wnt 억제제를 처리하는 단계.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 윤부줄기세포의 줄기세포능을 증진시키는 방법을 제공한다.

(b) 상기 배양액에 Wnt 억제제를 처리하는 단계.

본 발명의 일 구현예로, 상기 Wnt 억제제는 IWP2일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 Wnt 억제제는 세포 내 베타카테닌(β-catenin) 양을 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 윤부유래상피세포판은 윤부 조직의 상피 부분이 위를 향하도록 폴리에스터 멤브레인(polyester membrane) 삽입체 위에 올림으로써 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 방법은 윤부줄기세포의 콜로니 형성능을 증진시킬 수 있다.

본 발명에 따른 방법을 이용하여 인체 윤부유래상피세포판을 배양할 경우, Wnt/β-catenin 신호전달을 억제함으로써 윤부줄기세포의 증식을 증대시키고, 윤부줄기세포의 줄기세포능을 증진시킴으로써 윤부줄기세포의 비율을 높게 확보할 수 있어, 윤부줄기세포 결핍 환자에게 윤부유래상피세포판 이식시 치료 성공률을 높일 수 있다.

도 1은 인체 윤부유래상피세포판 배양액에 Wnt 억제제인 IWP2 또는 GSK3 억제제로 Wnt 신호전달 항진제인 CHIR99021을 처리한 후 배양 4일 및 8일째에 위상차현미경으로 상피세포판 증식속도를 관찰한 결과이다.
도 2a 내지 도 2d는 인체 윤부유래상피세포판 배양액에 Wnt 억제제인 IWP2 또는 GSK3 억제제로 Wnt 신호전달 항진제인 CHIR99021을 처리하여 배양한 후 윤부유래상피세포판 증식능을 비교한 결과로서, 도 2a는 상피세포판을 Commassie blue R 250으로 염색하여 관찰한 결과이고, 도 2b는 상피세포판 증식면적(Outgrowth areas), 도 2c는 세포 수(Cell yield), 및 도 2d는 단위면적당 세포 수(Cell densities)를 측정하여 정량화한 결과이다.
도 3은 인체 윤부유래상피세포판 배양액에 Wnt 억제제인 IWP2 또는 GSK3 억제제로 Wnt 신호전달 항진제인 CHIR99021을 처리하여 배양한 후 JC1^low 인 side population 비율을 측정함으로써 윤부유래상피세포판 내 윤부줄기세포 비율을 비교한 결과이다.
도 4는 인체 윤부유래상피세포판 배양액에 Wnt 억제제인 IWP2 또는 GSK3 억제제로 Wnt 신호전달 항진제인 CHIR99021을 처리하여 배양한 후 웨스턴 블롯을 통해 윤부유래상피세포판에서 윤부줄기세포 표지자 (p63α 및 ABCG2) 및 분화 표지자 (Krt3) 단백질의 발현량을 확인한 결과이다.
도 5는 인체 윤부유래상피세포판 배양액에 Wnt 억제제인 IWP2 또는 GSK3 억제제로 Wnt 신호전달 항진제인 CHIR99021을 처리하여 배양한 후 상피세포판 증식세포의 콜로니 형성능을 비교한 결과이다.
도 6은 인체 윤부유래상피세포판 (Explant) 또는 인체 윤부유래 단일세포 (Single cell)의 배양액에 Wnt 억제제인 IWP2 또는 GSK3 억제제로 Wnt 신호전달 항진제인 CHIR99021을 처리하여 배양한 후 생존 세포 수를 측정한 결과이다.

본 발명자들은 인체 윤부유래상피세포판 배양조건에서 배양액에 Wnt 억제제를 처리하여 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제시킨 결과, 단위 면적당 윤부유래상피세포판의 세포증식 촉진, 윤부줄기세포의 비율 증가, 및 윤부줄기세포의 줄기세포능 증진 및 분화 억제 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 윤부줄기세포의 증식을 증대시키는 방법을 제공한다.

(b) 상기 배양액에 Wnt 억제제를 처리하는 단계.

본 발명에서 사용되는 용어, “윤부줄기세포”는 윤부(limbus)에 존재하며 각막상피로만 분화할 수 있는 단능 성체 줄기세포를 의미하며, 각막상피 전구세포(limbal epithelial progenitor cell)라고도 한다.

상기 단계 (a)에서, 윤부유래상피세포판은 인체 윤부 조직의 상피 부분이 위를 향하도록 폴리에스터 멤브레인(polyester membrane) 삽입체 위에 올림으로써 제조될 수 있다. 이후 상기 윤부유래상피세포판은 DMEM/F-12 배지, human recombinant EGF(epidermal growth factor), 포스포에탄올아민(phosphoethanolamine), 및 ITS(Insulin-Transferrin-Selenium)가 첨가된 SHEM(supplemented hormonal epithelial medium) 배양액에서 10일 내지 20일, 더욱 바람직하게는 약 15일 동안 72시간 마다 배양액을 교체하면서 배양될 수 있으나, 상기 윤부유래상피세포판 배양에 적합한 조건이라면 멤브레인 종류 및 배양액 종류 등은 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 (b)에서, 상기 Wnt 억제제는 Wnt 단백질의 acylation에 관여하는 Porcupine의 아세틸기전이효소(acetyltransferase)의 활성을 저해하여 비활성화를 통해 Wnt 신호 전달을 억제하여 결국 세포 내 베타카테닌 양을 감소시킨다. 상기 Wnt 억제제는 윤부유래상피세포판에서 세포들이 증식하기 시작하면 상기 배양액에 5 내지 15 μM, 바람직하게는 10 μM의 농도로 처리할 수 있다. 이때, 사용할 수 있는 Wnt 억제제는 바람직하게는 IWP2(N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3- phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide)일 수 있으나, 세포 내 베타카테닌 양을 감소시킴으로써 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않고 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "Wnt/β-catenin 신호전달“은 canonical Wnt pathway라고도 하며, 배아 발달과정에서 축 결정(axis patterning), 세포 운명 결정(cell fate determination), 세포 증식(cell proliferation), 및 세포 이동(cell migration)의 조절을 통해 신체 장기 생성 및 발달에 중요한 역할을 하며, 성인에서도 조직의 항상성 유지 및 조직 재생에 관여한다. 세포질 내에 베타카테닌(β-catenin)이 축적되면, 이후 베타카테닌이 핵으로 이동하여 전사인자의 전사적 보조활성제(transcriptional coactivator)로 작용함으로써 유전자 발현을 조절하는 역할을 한다. Wnt 신호가 없으면 베타카테닌은 Axin, APC(adenomatosis polyposis coli), PP2A(protein phosphatase 2A), GSK3(glycogen synthase kinase 3) 및 CK1α(casein kinase 1α)로 구성된 복합체에 의해 분해되나, Wnt가 Fz 및 LRP5/6 수용체에 결합하면 상기 복합체의 기능이 저해되어 베타카테닌이 분해되지 않고 세포질 내에 축적되는 것이다.

본 발명자들은 윤부유래상피세포판 배양 조건에서 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제함으로써 윤부줄기세포의 증식을 증대시킬 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 윤부유래상피세포판 배양액에 Wnt 억제제인 IWP2 또는 GSK3 억제제로 Wnt 신호전달 항진제인 CHIR99021을 처리하여 배양한 결과 IWP2를 처리하여 Wnt/β-catenin 신호전달을 저해한 경우 상피세포판 증식, 증식면적, 세포 수는 대조군과 유사한 정도로 측정되었으나, 단위 면적당 세포 수는 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 이에 반하여 CHIR99021을 처리하여 GSK3에 의한 베타카테닌 분해를 억제함으로써 Wnt/β-catenin 신호전달을 활성화시킨 경우 상피세포판 증식이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(실시예 2 참고).

본 발명의 다른 실시예에서는, 실시예 2와 동일한 배양 조건에서 배양한 세포판 증식 세포들을 회수한 후 JC1^low 세포인 side population의 비율을 측정한 결과, IWP2 처리군에서 side population 비율이 가장 높은 반면, CHIR99021 처리군의 경우 가장 낮게 측정된 것을 확인하였다(실시예 3 참고).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인체 윤부유래상피세포판(Explant) 또는 윤부유래 단일세포(Single cell)의 배양 조건에서 각각 배양액에 IWP2 또는 CHIR99021를 처리하고 배양한 결과, 윤부유래 단일세포 배양 조건에서는 Wnt/β-catenin 신호전달 억제 시 상피세포판 배양 조건과 동일한 결과가 나타나지 않는 것을 확인하였으며, 모든 군에서 상피세포판 배양 조건에 비해 생존 세포 수가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(실시예 6 참고).

상기 결과로부터, 인체 윤부유래상피세포판 배양 시 배양액에 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제할 수 있는 Wnt 억제제를 처리하는 방법은 윤부줄기세포의 증식을 증대시키고 높은 효율로 윤부줄기세포를 확보하는데 이용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 실시예 2와 동일한 배양 조건에서 배양한 세포판 증식 세포들을 회수한 후 웨스턴 블롯을 수행한 결과, IWP2 처리군 세포에서 윤부줄기세포표지자인 p63α 및 ABCG2의 발현이 증가하고 분화 표지자인 Krt3는 거의 발현되지 않은 반면, CHIR99021 처리군에서는 분화표지자인 Krt3의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 4 참고), 또한, 콜로니 형성능을 분석한 결과, IWP2 처리군 세포에서는 콜로니 형성률이 현저히 증가한 반면, CHIR99021 처리군의 경우에는 이와 상반되는 결과가 나타남을 확인하였다(실시예 5 참고).

또한, 본 발명자들은 윤부유래상피세포판 배양 조건에서 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제함으로써 윤부줄기세포의 증식 증대뿐만 아니라, 증식된 윤부줄기세포의 줄기세포능도 증대시킬 수 있음을 규명하였다.

상기 결과로부터, 본 발명자들은 윤부유래상피세포판 배양 조건에서 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제함으로써 윤부줄기세포의 줄기세포능을 증진시키는 것을 알 수 있었다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 윤부줄기세포의 줄기세포능을 증진시키는 방법을 제공한다.

(b) 상기 배양액에 Wnt 억제제를 처리하는 단계.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 윤부 조직 준비

안은행으로부터 각막이식 수술이 끝난 사체로부터 각막윤부 조직을 공급받았으며, 상기 각막윤부 조직은 (1) 30-65세 연령의 공여자로부터 분리된 것, (2) 공여자 사망 후 12시간 이내에 분리된 것, (3) 조직 회수 후 48시간이 넘지 않도록 Optisol(Bausch & Lomb, USA)에 보관된 것, 그리고 (4) 인간 면역결핍 바이러스(HIV), hepatitis B 또는 C 바이러스, 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus), 및 매독에 감염되지 않은 공여자로부터 분리된 것에 한하여 실험에 사용하였다.

상기 조건을 만족하는 각막윤부 조직을 평평한 무균작업대에서 수술도구를 이용하여 동일하게 8조각으로 분리하고, 상기 각 조각의 결막 가장자리를 1% trypan blue(Sigma, USA)에 살짝 담궈 결막 기질이 염색되도록 한 후 결막 부분을 조심히 제거하였다. 이후 공막 조각을 잘라내고, 얇은 날을 이용해 각 윤부 조직 조각을 0.5 mm 두께로 잘라 준비하였다.

1-2. 윤부유래상피세포판 배양

먼저, 0.4 μm의 구멍이 있는 25 mm 직경의 폴리에스터 멤브레인 삽입체(Costar, NY)를 6 well plate에 넣고 SHEM(supplemented hormonal epithelial medium) 배양배지에서 밤새 배양하였다. 상기 SHEM 배양배지는 DMEM(Dulbecco’s modified minimal essential medium)과 Ham F12이 1:1 비율로 혼합되어 있는 DMEM/F-12 배지 950 ㎖, FBS(fetal bovine serum) 50 ㎖, human recombinant EGF(epidermal growth factor) 5 ng, 포스포에탄올아민(phosphoethanolamine) 28 mg, 1x ITS(Insulin-Transferrin-Selenium, Gibco), 및 1x 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 포함된 조성으로 하였다. 이후 상기 실시예 1-1의 방법에 따라 4 mm 길이의 8조각으로 자른 윤부 조직을 상피 부분이 위로 가도록 폴리에스터 멤브레인 위에 올리고 air-liquid interface 조건에서 배양하였다. 배양 72시간째에 윤부유래상피세포판 주위로 세포가 증식되는 것을 확인한 후, 72시간 마다 상피세포판 표면이 약간 잠길 정도의 배양배지로 교체하였다. 이때, 10 μM의 Wnt 억제제(IWP2) 또는 3 μM의 GSK3 억제제(CHIR99021)을 첨가하여 배양한 후 하기 실험들을 진행하였다.

1-3. 인체 윤부 유래 상피세포 배양

상기 실시예 1-1의 방법에 따라 분리한 윤부 조직에 KSFM(keratinocyte medium)(Invitrogen, Carlsbad, CA) 배지로 희석한 2 ㎎/㎖의 Dispase II(Roche, Indianapolis, IN)를 처리하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후 윤부 상피층을 기질층으로부터 분리하고, 상기 상피층에 TrypLE(GIBCO, Denmark)를 처리하여 10분 동안 배양한 후 파이펫(piptte)으로 단일세포로 분리되도록 하였다. 상기 분리된 단일세포를 human type I collagen(PureColR, Biomatrix, SanDiego, CA)이 코팅된 25T 플라스크에 2x10⁵ cells/flask의 밀도로 분주되도록 씨딩(seeding)하고, 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract)이 포함된 Cnt50 배지(Cell-N-Tec, Bern, Switzerland) 하에서 2주까지 배양하였다.

1-4. Flow cytometry

세포의 상대적 크기 및 ABCG2 배출 활성을 측정하기 위하여, 윤부유래상피세포판 배양을 통해 증식한 세포들에 트립신을 처리하여 세포를 회수하고 6 well plate에 각 well 당 2 x10⁴개의 세포를 씨딩한 후 250 nM JC1 염색시약을 처리하고 45분 동안 배양하였다. 이후 트립신을 처리하여 세포들을 다시 떼어내고, FACS 버퍼로 희석한 후 FACS 분석을 실시하였다. JC1은 세포 내 미토콘드리아에 결합하는 염색시약으로, ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member 2)를 높은 비율로 발현하는 side population 세포들은 JC1 시약을 세포 밖으로 방출시켜 미토콘드리아가 염색되는 것을 저해하게 된다. 따라서 JC1 염색시약을 처리한 세포들에 대하여 531(green)/585(orange) 방출파장에서 FACS Calibur(BD Biosciences)를 이용해 flow cytometry 분석을 수행한 후 JC1에 염색되지 않은 side population(JC1^low)의 비율을 측정하였다.

1-5. Western blot

윤부유래상피세포판 배양을 통해 증식한 세포들을 PBS로 헹구고 phosphatase inhibitor cocktail 2(Sigma-Aldrich) 및 protease inhibitor cocktail(Roche Diagnostics)이 포함된 lysis buffer를 처리하여 세포를 용해시켰다. 상기 용해물을 sample-loading buffer와 혼합하여 10분 동안 끓이고 원심분리하여 세포 내 단백질들이 포함된 상층액만을 분리한 후 BCA Protein Assay kit(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)를 이용해 단백질 농도를 정량하였다. 이후 동일한 농도의 단백질 샘플을 취하여 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행함으로써 단백질이 크기별로 분리되도록 한 후 트랜스퍼 과정을 통해 상기 폴리아크릴아마드 겔 내의 단백질들이 전기적인 흐름에 의해 PVDF 멤브레인(Millipore, Billerica, MA)으로 옮겨지도록 하였다. 다음으로, β-catenin(BD Biosciences), ABCG2(Abcam), Krt3(Abcam) 또는 p63α(Abcam)에 특이적인 1차 항체를 5% skim milk 용액에 희석한 후 상기 멤브레인에 처리하여 4℃에서 18시간 동안 반응시키고, 이어서 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)가 결합된 anti-mouse 또는 anti-rabbit 2차 항체를 멤브레인에 처리한 후 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 2차 항체와 반응시킨 멤브레인은 0.1% Tween 20이 포함된 PBS로 3번 헹구고, 화학발광 시약(chemiluminescence reagent)인 ECL 용액 (Amersham Biosciences, Sweden)을 멤브레인에 처리하여 감광시킴으로써 관찰하고자 하는 단백질의 발현량을 분석하였다. 또한, 각 샘플의 단백질 양을 보정하기 위해 멤브레인에 mouse monoclonal anti-β-actin 1차 항체를 반응시키고 이후 과정은 동일하게 수행하였다.

1-6. 콜로니 형성능 분석

윤부유래상피세포판 배양을 통해 증식한 세포들에 트립신 처리하여 세포를 떼어낸 후 human type I collagen(PureColR, Biomatrix, SanDiego, CA)이 코팅된 6 well plate에 100 cells/cm²의 밀도로 분주되도록 세포를 씨딩한 후 Cnt50 존재하에 배양하였다. Cnt50 (Cell-N-Tec, Bern, Switzerland)은 인체 윤부줄기세포의 콜로니 형성능, 줄기세포 형태, 및 세포 증식능을 유지시키는 역할을 한다. 세포를 씨딩한 후 4, 7, 10, 13일째에 배지를 교체하며 14일까지 배양한 후 차가운 메탄올을 처리하여 세포를 고정하고 Commassie blue R 250으로 염색하여 콜로니 형성정도를 관찰하였다.

실시예 2. 윤부유래상피세포판에서 Wnt /β- catenin 신호전달 조절에 따른 상 피세포판 증식능 비교분석

윤부유래상피세포판 배양에서 Wnt/β-catenin 신호전달이 상피세포판 세포증식에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기 실시예 1-1 및 1-2의 방법에 따른 인체 윤부유래상피세포판 배양 조건에서 배양 배지에 10 μM의 Wnt 억제제인 IWP2 또는 3 μM의 GSK3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제로 Wnt 신호전달 항진제인 CHIR99021를 첨가하여 배양하면서, 배양 4일 및 8일째에 위상차현미경을 통해 상피세포판의 세포증식 정도를 관찰하였다.

Wnt 억제제인 IWP2는 Wnt 단백질의 acylation에 관여하는 Porcupine의 아세틸기전이효소(acetyltransferase)의 활성을 저해하여 비활성화를 통해 Wnt 신호 전달을 억제하여 결국 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제하게 된다. 반면, GSK3 억제제인 CHIR99021는 세포 내에서 GSK3가 베타-카테닌(β-catenin) 단백질의 분해에 관여하는데, GSK3를 억제함으로써 세포 내 β-catenin의 양을 증가시켜 Wnt/β-catenin 신호전달을 활성화시키게 된다.

상기 방법에 따라 IWP2 또는 CHIR99021를 배양배지에 처리하고 윤부유래상피세포판을 배양한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상피세포판의 증식속도는 대조군(control)에서 가장 높았고, 이어서 IWP2 처리군 및 CHIR99021 처리군 순으로 나타났다.

다음으로, 윤부유래상피세포판을 Commassie blue R 250으로 염색한 후 육안으로 관찰한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 염색된 상피세포판 면적은 대조군, IWP2 처리군, CHIR99021 처리군 순으로 나타났으며, 도 2b의 정량적인 결과를 통해서 CHIR99021 처리군이 통계적으로 유의하게 면적이 적었다. (**P<0.01)

이에 더하여, 윤부유래상피세포판에 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 회수한 후 0.4% trypan blue 용액으로 염색하고 hemocytometer를 이용해 세포 수를 측정하여 세포 수(Cell yields) 및 단위면적당 세포 수(Cell densities)를 정량적으로 비교하였다. 그 결과. 도 2c 및 도 2d에 나타낸 바와 같이, 세포 수는 정상대조군과 IWP2 처리군에서는 거의 차이가 없고 CHIR99021을 처리한 경우 세포 수가 유의하게 감소한 반면, 단위면적당 세포 수는 IWP2 처리군에서 가장 높게 나타난 것을 확인하였다. (**P<0.01, ##P<0.05)

상기 결과를 통해 윤부유래상피세포판 배양에서 Wnt/β-catenin 신호전달을 활성화하는 경우 상피세포판 세포증식이 현저히 감소한 반면, Wnt/β-catenin 신호전달을 억제시키는 경우 단위면적당 세포 수가 유의하게 증가하는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 윤부유래상피세포판에서 Wnt /β- catenin 신호전달 조절에 따른 윤 부줄기세포 비율 비교분석

윤부유래상피세포판 배양에서 Wnt/β-catenin 신호전달이 상피세포판 내에 존재하는 윤부줄기세포에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기 실시예 1-1 및 1-2의 방법에 따른 인체 윤부유래상피세포판 배양 배지에 10 μM의 Wnt 억제제인 IWP2 또는 3 μM의 GSK3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제인 CHIR99021를 첨가하여 배양한 후 실시예 1-4의 방법에 따라 flow cytometry를 수행하여 상피세포판 내 JC1^low 세포인 side population의 비율을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, IWP2를 처리하여 배양한 상피세포판에서 JC1^low의 비율이 29.6±2.6%로 가장 높게 나타났으며, CHIR99021를 처리하여 배양한 경우 JC1^low 비율이 10.9±1.3%로 가장 낮게 나타난 것을 확인하였다. 또한, stem/precursor somatic cells의 특징을 나타내는 lower left quadrant (LLQ)의 비율도 IWP2를 처리하여 배양한 상피세포판에서 72.8±1.9%로 가장 높게 나타났으며, CHIR99021를 처리하여 배양한 경우 LLQ 비율이 50.7±10.1%로 가장 낮게 나타난 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 윤부유래상피세포판 배양에서 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제시키는 경우 윤부줄기세포의 비율이 증가하는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 윤부유래상피세포판에서 Wnt /β- catenin 신호전달 조절에 따른 윤 부줄기세포 분화 조절 확인

윤부유래상피세포판 배양에서 Wnt/β-catenin 신호전달이 윤부줄기세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기 1-5의 방법에 따른 웨스턴 블롯을 통해 상피세포판 증식세포에서 윤부줄기세포 표지자인 p63α와 ABCG2, 및 분화 표지자인 Krt3 단백질의 발현정도를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, IWP2를 처리하여 배양한 경우 상피세포판 증식 세포들에서 윤부줄기세포 표지자인 p63α와 ABCG2 단백질의 발현이 대조군에 비하여 현저히 증가되어 있는 것을 확인하였다. 반면에 CHIR99021를 처리하여 배양한 경우에는 상피세포판 세포들에서 윤부줄기세포 표지자인 p63α와 ABCG2의 발현량이 대조군에 비하여 현저히 감소하였으며, 분화 표지자인 Krt3의 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다. (*P<0.05, **P<0.01)

상기 결과를 통해, 윤부유래상피세포판 배양에서 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제시키는 경우 줄기세포능이 증가하고 분화가 억제되는 반면, Wnt/β-catenin 신호전달을 활성화시키는 경우 윤부줄기세포의 분화가 촉진되는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. 윤부유래상피세포판에서 Wnt /β- catenin 신호전달 조절에 따른 콜 로니 형성능 비교분석

윤부유래상피세포판 배양에서 Wnt/β-catenin 신호전달이 상피세포판에서 증식한 세포의 콜로니 형성능에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기 실시예 1-1 및 1-2의 방법에 따라 윤부유래상피세포판을 배양하고 실시예 1-6의 방법에 따라 대조군, IWP2 처리군, GSK3 억제제 처리군의 콜로니 형성능을 비교하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, IWP2를 처리하여 배양한 윤부유래상피세포판 증식 세포들의 경우 대조군에 비하여 콜로니 형성능이 현저히 높은 것을 확인하였다. 반면에 CHIR99021를 처리하여 배양한 경우에는 세포들이 콜로니를 거의 형성하지 않았으며 대조군에 비하여 콜로니 형성능이 현저히 감소한 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 윤부유래상피세포판 배양에서 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제시키는 경우 상피세포판 증식 세포들의 콜로니 형성능이 증가하는 반면, Wnt/β-catenin 신호전달을 활성화시키는 경우 콜로니 형성능이 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다.

실시예 6. 윤부 조직의 배양방법에 따른 Wnt /β- catenin 신호전달이 미치는 영향 비교분석

6-1. 윤부줄기세포 비율 측정

상기 실시예 2 내지 4를 통해 윤부유래상피세포판 배양에서 Wnt/β-catenin 신호전달이 단위면적 당 상피세포판 세포 증식 촉진, 윤부줄기세포의 줄기세포능 증진 및 분화 억제에 관여한다는 것을 확인하였는바, 실시예 1-3의 방법에 따라 윤부 상피조직을 분해하여 단일세포로 배양한 경우에도 동일한 결과가 유도되는지 확인해보고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 배양한 윤부유래상피세포판 증식 세포 및 실시예 1-3의 방법에 따라 배양한 윤부유래상피세포를 각각 회수한 후 FACS 분석을 실시하여 JC1^low 비율을 측정하였다.

그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 윤부유래상피세포판(Explant) 배양 조건 결과와 반대로, 윤부 조직을 단일세포로 배양한 윤부유래상피세포(Epithelial cells)의 경우에는 JC1^low 비율이 CHIR99021 처리군, 대조군, IWP2 처리군 순으로 나타난 것을 확인하였다.

		Control		IWP2		CHIR99021
		Mean	±SD	Mean	±SD	Mean	±SD
Epithelial cells	Cell count (1x10⁵)	5.7	0.5	4.1	0.7	7.0	0.8
Epithelial cells	% JC1^low	14.5	1.9	9.8	1.9	23.9	2.1
Explant	Cell count (1x10⁵)	4.8	0.2	4.3	0.2	0.8	0.1
Explant	% JC1^low	18.1	2.3	27.9	3.1	6.4	1.2

6-2. 세포 수율(cell yield) 측정

상기 실시예 6-1의 결과를 바탕으로, 상기와 동일한 방법으로 각각 배양한 세포들을 회수하여 생존세포 수를 측정함으로써 윤부유래상피세포의 수율을 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 윤부유래상피세포판 배양 시 Wnt/β-catenin 신호전달을 억제하는 IWP2를 처리한 경우 대조군과 거의 유사한 정도로 생존 세포를 수득하였으나, 윤부 조직의 단일세포 배양 조건의 경우에는 CHIR99021을 처리하였을 때 JC1^low의 비율이 증가하였음에도 불구하고 세포 수율은 매우 낮았으며, 대조군을 통해서도 상기 배양방법은 높은 효율로 윤부줄기세포를 얻을 수 있는 적절한 방법이 아님을 알 수 있었다.

따라서 윤부유래상피세포판 배양에서 Wnt 억제제 처리를 통한 Wnt/β-catenin 신호전달 억제는 윤부줄기세포의 분화를 억제시키고 콜로니 형성능을 증가시킬 뿐만 아니라 윤부줄기세포를 높은 효율로 얻을 수 있음을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 윤부줄기세포의 증식을 증대시키는 방법:
(a) 윤부 조직의 상피 부분이 위를 향하도록 폴리에스터 멤브레인(polyester membrane) 삽입체 위에 올림으로써 제조되는 인체 윤부유래상피세포판을 배양액에 침지시키는 단계; 및
(b) 상기 배양액에 Wnt 억제제로 IWP2(N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide)를 처리하여 세포 내 베타카테닌(β-catenin) 양을 감소시키는 단계.
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하기 단계를 포함하는, 윤부줄기세포의 줄기세포능을 증진시키는 방법:
(a) 윤부 조직의 상피 부분이 위를 향하도록 폴리에스터 멤브레인(polyester membrane) 삽입체 위에 올림으로써 제조되는 인체 윤부유래상피세포판을 배양액에 침지시키는 단계; 및
(b) 상기 배양액에 Wnt 억제제로 IWP2(N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide)를 처리하여 세포 내 베타카테닌(β-catenin) 양을 감소시키는 단계.
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제5항에 있어서,
상기 방법은 윤부줄기세포의 콜로니 형성능을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 윤부줄기세포의 줄기세포능을 증진시키는 방법.