CN107345897A - 一种视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选方法，筛选出感光细胞特异性表面蛋白、该表面蛋白特异性的表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜感光细胞膜表面，这将提供一种简单的方法用于人多能干细胞来源的视网膜感光细胞的纯化。通过表面蛋白筛选获得的纯化感光细胞，可以避免转基因或者应用多种小分子化合物为诱导剂所带来的潜在危险。这一关键科学问题的解决，将加快干细胞向临床转化的过程，符合医学研究的需要，为人类视网膜相关疾病(如青光眼、黄斑性眼病等)的细胞替代治疗奠定了基础。

Description

一种视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，涉及视网膜细胞方面，具体涉及一种视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选方法。
背景技术
视网膜是组成视觉系统的关键结构。临床上，针对屈光性视觉功能障碍，已有有效的治疗方法，但对视网膜病变，尤其是外伤、变性等原因引起的视觉障碍或失明，目前仍束手无策。由于视网膜来源于神经外胚层，具有典型的中枢神经组织结构特点，对损伤敏感，且难以再生，使其成为难治性眼病的症结所在，也是眼科研究的重点、难点和亟待攻克的领域。多年来，国内外众多的研究人员为此开展了广泛的探索，国家科技部也分别于2005年、2007年和2012年分别设立了三个“973”项目予以攻关。此外，因结构明晰、功能清楚，且便于操作和观察，视网膜也是研究中枢神经结构、功能，乃至再生的重要窗口。
尽管一些低等动物的视网膜具有一定的再生能力，但一般认为哺乳类动物，尤其是灵长类动物的视网膜是不具有这种能力。因此，如何激发视网膜内在的再生潜能或通过外源性细胞的植入，以达到修复视网膜结构甚至功能，成为近10多年来的研究热点。
纵观近十年来的视网膜再生研究，在干细胞来源、干细胞诱导分化、动物模型制备及干细胞移植方式上已经取得了一定的进展，但仍存在诸多问题有待解决。
目前通过干细胞诱导分化所获得的视网膜细胞通常是多种细胞的混合，而视网膜疾病的发病早期多数仅累及一种细胞，因此，如果能够获得某种纯化的细胞，且在视网膜疾病的发病早期将纯化的细胞移植到体内，则可以从两个方面对患者的视觉功能进行改善：首先，移植的纯化细胞可以改善患者局部的微环境，从而有利于患者自身残存细胞的生存；其次，移植的纯化细胞可以部分替代受损细胞，从而改善患者的视觉功能。
细胞替代疗法治疗神经元退行性疾病首要解决的问题是细胞纯度的问题。其原因显而易见，首先，将诱导分化的细胞在体外进行药物筛选或功能鉴定时，混杂的其它细胞将会影响结果的可靠性；其次，如果将混杂的细胞移植到模型动物体内，将会产生异常增生甚至致瘤的风险。虽然目前已经有很多研究致力于提高节细胞的诱导分化率，例如：将Math5转染到干细胞，然后通过FACS筛选来获得纯化的节细胞，然而，这些方法存在致命缺陷，即：将报告载体转染到干细胞内会导致干细胞基因组的改变，从而限制了其临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选方法，从而找到感光细胞特异性表面蛋白，用于人胚胎干细胞/人多能干细胞来源的视网膜感光细胞的纯化，从而加快临床利用细胞移植替代疗法治疗人类视网膜相关疾病(如青光眼、黄斑性眼病等)。
本发明的具体技术方案如下：
一种视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选方法，包括如下步骤：
(1)利用Talen技术，建立Crx-GFP的人胚胎干细胞系，将这种Crx-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，将诱导分化至第6周的视网膜细胞球在含有Ⅱ型胶原酶的Hanks溶液中消化过夜，得到细胞悬液；
(2)第二天，在细胞悬液中加入等体积的含有Ⅱ型胶原酶、牛磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的Hanks溶液进一步消化，获得单细胞；
(3)应用BD公司的表面蛋白筛选试剂盒对消化的单细胞进行筛选，筛选出感光细胞特异性表面蛋白。
如果细胞球过硬，不容易消化，为了充分分散细胞球，将步骤(2)得到的单细胞用0.25％胰酶/EDTA进一步消化，然后进行步骤(3)的操作。
步骤(1)中，Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml。
步骤(1)中，所述消化是在25℃的条件下进行消化。
步骤(2)中，Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml、牛血清白蛋白的质量浓度为1mg/ml，牛磺酸的物质的量浓度为10mM/ml、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的物质的量浓度为0.1mM/ml。
所述步骤(3)中具体筛选方法如下：a、对单细胞表面蛋白进行染色，然后用LSRII流式细胞仪进行分析，单细胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的PBS溶液中进行；b、选用BD公司的FACS Aria TMII细胞分选仪对106/ml的单细胞进行分选，分选过程中单细胞重悬液为含有6％胎牛血清的PBS溶液；c、选用Mitenyi MACS磁珠分选系统进行磁珠分选、分选出CD抗体，选用BD公司针对LSRII的高通量样品分析对于CD抗体的高通量细胞流式分析；d、所得到的数据应用流式分析软件Treestar进行分析，确定感光细胞特异性表面蛋白。
利用本发明所述方法可以对纯化的感光细胞前体细胞进行进行筛选，筛选出一种感光细胞所特异的表面蛋白，其特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜感光细胞膜表面；从而利用该特异性表面蛋白对诱导的人胚胎干细胞或人多能干细胞来源的感光细胞进行纯化。通过表面蛋白筛选获得的纯化感光细胞，可以避免转基因或者应用多种小分子化合物为诱导剂所带来的潜在危险。这一关键科学问题的解决，将加快干细胞向临床转化的过程，符合医学研究的需要，为人类视网膜相关疾病(如青光眼、黄斑性眼病等)的细胞替代治疗奠定了基础。
具体实施方式
本发明所述的“人胚胎干细胞诱导分化”采用申请号为201210301765.X，名称为“一种诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法”中提到的方法。本发明其他未提及部分均为现有技术。
报告细胞系构建技术：目前已有的报告细胞系构建技术包括传统的锌指蛋白技术、Talen技术和Cas9技术，我们采用Talen技术进行报告细胞系的构建。
一种视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选方法，包括如下步骤：
(1)利用Talen技术，建立Crx-GFP的人胚胎干细胞系，将这种Crx-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，将诱导分化至第6周的视网膜细胞球在含有Ⅱ型胶原酶的Hanks溶液中于25℃的条件下消化过夜，消化时在摇床轻摇，得到细胞悬液；Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml；
(2)第二天，在细胞悬液中加入等体积的含有Ⅱ型胶原酶、牛磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的Hanks溶液进一步消化，轻轻吹打以分散细胞，细胞分散后，1000r/m离心5min，筛网过滤后备用；如果细胞球过硬，不容易消化，则需要用0.25％胰酶/EDTA进一步消化，以充分分散细胞球，获得单细胞；Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml、牛血清白蛋白的质量浓度为1mg/ml，牛磺酸的物质的量浓度为10mM/ml、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的物质的量浓度为0.1mM/ml；
(3)应用BD公司的表面蛋白筛选试剂盒对消化的单细胞进行筛选，筛选出感光细胞特异性表面蛋白。
步骤(3)中具体筛选方法如下：a、对单细胞表面蛋白进行染色，然后用LSRII流式细胞仪进行分析，单细胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的PBS溶液中进行；b、选用BD公司的FACS Aria TMII细胞分选仪对106/ml的单细胞进行分选，分选过程中单细胞重悬液为含有6％胎牛血清的PBS溶液；c、选用Mitenyi MACS磁珠分选系统进行磁珠分选、分选出CD抗体，选用BD公司针对LSRII的高通量样品分析对于CD抗体的高通量细胞流式分析；d、所得到的数据应用流式分析软件Treestar进行分析，确定感光细胞特异性表面蛋白。
人胚胎干细胞的培养和诱导分化
Ⅰ.人胚胎干细胞的培养：将人胚胎干细胞接种在铺有0.65×105/ml MEFs的六孔板内；干细胞培液内含：DMEM/F12(1：1)、20％血清替代物、1mM L-谷氨酰胺、1％非必须氨基酸(MEM non－essential amino acids)、0.1mMβ-巯基乙醇、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；每5至7天传代一次，传代时将形态上已明显分化的细胞刮除。
Ⅱ.人胚胎干细胞的诱导：Dispase酶(1mg/ml)消化人多能干细胞约2min后，吸除Dispase酶，用干细胞培液(1ml/孔)漂洗一次，再次加入干细胞培液，用吸管将干细胞克隆吹下成小片状移入离心管中，800r/min离心1min后，用干细胞培液重悬细胞，将细胞重悬液移入非粘附的培养皿中，用干细胞培液培养4天，隔天换液，得到细胞球。将细胞球移入神经诱导培养基中(HNM)，HNM包含：DMEM/F12，1％N2复合物，1％非必须氨基酸(MEM non－essential aminoacids)，2ug/ml肝素(heparin)，1％L-谷氨酰胺，2天后，将细胞球移入粘附性培养皿中，为了促使细胞球贴壁，可以在HNM中加入10％的胎牛血清(FBS)，12h后更换新鲜的不含FBS的HNM。几天后，贴壁的细胞球会形成许多神经管样的结构，大约在贴壁的第9天，将贴壁后形成的神经管样结构吹下，移入视网膜诱导培养基中(RDM),RDM包含：DMEM/F12、15％血清替代物、1％L-谷氨酰胺、1％非必须氨基酸(NEAA)、10mM烟酰胺(Nicotinamide,NIC)。将形成的神经球悬浮培养，每2～3天换液。
Ⅲ.报告细胞系的建立：利用Talen的同源重组技术，将编码GFP的序列插入到H9人胚胎干细胞系的Crx基因位点，从而建立报告细胞系。上述Crx-GFP的人胚胎干细胞系中的Crx可以根据不同的视网膜疾病(如青光眼、黄斑性眼病等)进行确定，如：Brn3、Math5或者Tuj-1等。以Brn3报告细胞系的建立为例，利用Talen的同源重组技术，将编码GFP的序列插入到H9人胚胎干细胞系的Brn3基因位点，从而建立报告细胞系。
人胚胎以及成年人视网膜组织的收集
研究用经药物流产的4周至12周人胚胎共18例(Table 2.2)。胎龄的计算是根据当事人末次月经的日期减去2周的时间，即受孕时作为第0天。成年人视网膜取自捐献角膜后的眼球组织。人组织的获取及相关研究经相关伦理委员会批准，并在捐赠者签署知情同意书的情况下进行。
细胞流式及细胞分选
将诱导分化至第6周的视网膜细胞球在含有Ⅱ型胶原酶(1mg/ml；Worthington)的Hanks溶液(NaCl:136mM,NaHCO3:4.16mM,NaPO4:0.34mM,KCl:5.36mM,KH2PO4:0.44mM,dextrose:5.55mM,HEPES:5mM)中25℃消化过夜，消化时在摇床轻摇。第二天，在细胞悬液中加入等量的含有Ⅱ型胶原酶(1mg/ml；Worthington)、牛磺酸10mM、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸0.1mM、牛血清白蛋白1mg/ml的Hanks溶液进一步消化，轻轻吹打以分散细胞。细胞分散后，1000r/m离心5min，筛网过滤后备用。如果细胞球过硬，不容易消化，则需要用0.25％胰酶/EDTA进一步消化，以充分分散细胞球，获得单细胞。
应用BD公司的表面蛋白筛选试剂盒，对消化的单细胞进行分析。单细胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％saponin(sigma)的PBS溶液中进行，细胞染色后用LSRII流式细胞仪(BD公司)进行分析。对于细胞分选，我们选用FACS Aria TMII(BD公司)细胞分选仪(Sickkids-UHN Flow Cytometry Facility)对106/ml的细胞进行分选，细胞重悬液为含有6％胎牛血清的PBS溶液。为了防止细胞分选过程中由于压力和剪切力所导致的细胞死亡，我们选用100um的吹管进行分选。另外，我们选用Mitenyi MACS磁珠分选系统进行磁珠分选，分选出CD抗体；操作步骤和分选条件按照说明书进行。对于CD抗体的高通量细胞流式分析，我们选用BD公司针对LSRII的高通量样品分析(high-throughput sampler,HTS)进行操作，操作步骤参照说明书。所有数据应用流式分析软件Treestar进行分析。
免疫染色
免疫荧光染色的步骤按照常规进行，对于细胞球切片或组织切片，过程如下：取出-80℃冰箱内保存的冰冻切片，室温复温30分钟。0.01M PBS洗3次，每次10分钟。含有0.25％Triton X-100和10％驴血清的0.01M PBS孵育1小时。加一抗，湿盒内4℃冰箱孵育过夜。0.01M PBS洗3次，每次10分钟。加二抗，避光室温孵育1小时。0.01M PBS洗3次，每次10分钟。用抗荧光淬灭的封片液进行封片，避光晾干后，于荧光显微镜下进行观察和拍照。对于细胞爬片，所不同的是前面的固定过程，即：4％多聚甲醛固定30min,0.01M PBS洗3次，每次10分钟，-20℃甲醇固定10min,0.01M PBS洗3次，每次10分钟，后续封闭以及抗体孵育的步骤同前。如果染色的是细胞膜抗原，则封闭时不加Triton X-100。
RT-qPCR
用RNA提取试剂盒(Ambion)进行细胞RNA的抽提。用逆转录试剂盒(Invitrogen)对50ng～1ug的RNA进行逆转录。QPCR使用QuantiFast SYBR GreenPCR试剂盒(Qiagen)。表达量以管家基因TATA盒子(TBP)为标准参照，除此之外，基因组DNA作为DNA的参考标准。基因组DNA的靶基因拷贝数按照如下计算方式：人基因组大小2.7×109bp，对应于6.022×1023个单基因拷贝，1ug的基因组DNA对应于3.4×105个单基因拷贝。RT-qPCR图的Y轴代表被TBP拷贝数分隔开的目的基因的拷贝数，因此是一个随机的独立单位，可用于不同实验组之间的对比。

Claims (6)

1.一种视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)利用Talen技术，建立Crx-GFP的人胚胎干细胞系，将这种Crx-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，将诱导分化至第6周的视网膜细胞球在含有Ⅱ型胶原酶的Hanks溶液中消化过夜，得到细胞悬液；
(2)第二天，在细胞悬液中加入等体积的含有Ⅱ型胶原酶、牛磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的Hanks溶液进一步消化，获得单细胞；
(3)应用BD公司的表面蛋白筛选试剂盒对消化的单细胞进行筛选，筛选出感光细胞特异性表面蛋白。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于将步骤(2)得到的单细胞用0.25％胰酶/EDTA进一步消化，然后进行步骤(3)的操作。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(1)中，Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于步骤(1)中，所述消化是在25℃的条件下进行消化。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的筛选方法，其特征在于步骤(2)中，Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml、牛血清白蛋白的质量浓度为1mg/ml，牛磺酸的物质的量浓度为10mM/ml、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的物质的量浓度为0.1mM/ml。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(3)中具体筛选方法如下：a、对单细胞表面蛋白进行染色，然后用LSRII流式细胞仪进行分析，单细胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的PBS溶液中进行；b、选用BD公司的FACS Aria TMII细胞分选仪对106/ml的单细胞进行分选，分选过程中单细胞重悬液为含有6％胎牛血清的PBS溶液；c、选用Mitenyi MACS磁珠分选系统进行磁珠分选、分选出CD抗体，选用BD公司针对LSRII的高通量样品分析对于CD抗体的高通量细胞流式分析；d、所得到的数据应用流式分析软件Treestar进行分析，确定感光细胞特异性表面蛋白。
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