CN110106147B - 一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法及其在治疗视网膜退行性疾病中的应用。本发明提供了一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法，在适宜的条件下培养人羊膜上皮细胞，加入诱导组合物后诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化，诱导产生的细胞高表达Chx10、Rx、Crx、NRL等视网膜感光细胞的典型基因。收集诱导分化后的细胞进行视网膜下腔注射，通过ERG以及OCT检测发现眼睛电生理信号明显增强，眼底结构明显改善，视网膜厚度明显增加，显示可治疗和/或改善视网膜退行性疾病进展状况，在眼科疾病的临床应用上将具有广泛的前景。

Description

一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法及其在治疗视网膜退行性疾病中的应用。

背景技术

视网膜神经退行性疾病目前已经成为世界范围内不可逆致盲的主要原因，影响着数以千万人的视力健康，如视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)、年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration,AMD)及青光眼等。此类疾病引起视功能损害的病理基础是视网膜神经元细胞的不可逆性损伤，目前临床上对此缺乏行之有效的治疗手段。但近些年随着技术的发展，基因治疗、干细胞治疗以及人工视觉等方法给上述疾病提供了治疗的可能。

由于眼部较为特殊的生理以及解剖学特点，使其成为上述前沿治疗技术的先行者。首先，由于血-视网膜屏障的存在使眼部成为一个相对独立的器官，外来移植物不容易引起较大的机体免疫反应，存在一定程度的免疫赦免；其次，眼球的体积相对较小，因此治疗所需要的细胞数量比较少；再次，眼球位于身体的浅表层，绝大部分的眼部操作均为可视操作，非常利于相关疗法的进行；另外，眼睛的解剖结构及其生理功能容易观察及分析，可借助裂隙灯显微镜、超声波仪器、眼底照相机、光学相干断层扫描等直接观察眼部各组织的结构，也可应用视觉电生理、眼底荧光照影等技术，实时记录并客观评价视觉功能学改变；最后，两只眼睛可以作为实验的自身对照，便于进行治疗效果的验证。

AMD是一种由遗传、生活方式、环境等多种致病因素导致的视网膜变性疾病，是西方发达国家首要的致盲性眼部。随着我国人口老龄化的加剧和人均寿命的延长，AMD在我国的发病率逐年提高，发病人数越来越多多，严重危害50岁以上人群的视力，是严重危害50岁以上人群视力的致盲性眼病。

AMD主要是由视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)受损和视网膜退行性变引起的一种不可逆性视力下降或丧失的疾病。它发病的部位是在眼底一个特别重要的结构―黄斑。目前市场上用于黄斑病变治疗的抗VEGF制剂有雷珠单抗(Lucentis)、贝伐单抗(Avastin)、阿柏西普(Aflibercept)和康柏西普(Conbercept)，通过结合VEGF抑制血管生成，延缓疾病的进展，但是该类药物并不能根治AMD疾病。

干细胞治疗AMD可能是一个较好的选择。实际上，胚胎干细胞治疗AMD最早可以追溯到2012年，研究者们采用胚胎干细胞分化成RPE移植治疗两人，分别是AMD以及黄斑失养症，显示出了一定的效果(Akon Higuchi et al.Trends inBiotechnology.2017.)。而到了2017年，与胚胎干细胞类似的诱导多能干细胞(iPS)也用于AMD的治疗，这项工作发表到了著名医学期刊《新英格兰杂志》上(Autologous Induced Stem-Cell–Derived RetinalCells for Macular Degeneration.2017.)。但是，胚胎干细胞存在来源受限及伦理等问题，而诱导多能干细胞(iPS)则存在培养技术复杂等问题。

发明内容

针对现有技术和方法的不足，本发明提供了一种安全、经济、高效的体外诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法，同时将诱导后的细胞用于视网膜神经退行性疾病的治疗，为该类疾病提供一种新的治疗方案。

AMD的共同病理改变为视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelial，RPE)变性导致继发性感光细胞(Photoreceptor cell，)，故本发明以该疾病作为治疗的疾病模型。同时选取RCS(the Royal College of Surgeons)大鼠作为动物模型进行治疗，RCS大鼠是具有先天遗传性的视网膜退化的一种动物模型，广泛应用于遗传性视网膜营养障碍性疾病的研究，其自身的遗传缺陷导致视网膜色素上皮层(Retinal Pigment Epithelium,RPE)无法吞噬感光细胞分泌的外节段(Photoreceptor Outer Segments,POS)从而导致代谢产物积累毒害，视网膜相关细胞功能紊乱，视网膜色素上皮细胞以及感光细胞死亡，进而导致视觉损伤。该疾病在RCS大鼠上的发病进程为出生第12天可观察到视网膜形态上的变化，第18天感光细胞开始减少直到出生后3个月视力完全丧失，因此本发明选取在RCS大鼠出生后第18-21天进行细胞注射治疗。

另外，本发明选取人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell,hAEC)作为诱导分化的对象，人羊膜上皮细胞来源于新生儿产后废弃物胎盘上的羊膜。胎盘由羊膜、绒毛膜(胎儿部分)和蜕膜(母体部分)构成，其中蜕膜来自于母体的子宫内膜，羊膜和绒毛膜来源于胎儿，其中贴着母体蜕膜一侧为绒毛膜，羊膜位于胎儿绒毛膜的表面，与脐带和婴儿皮肤相连，包裹羊水和胎儿，因此也称作胎膜，是与发育中的胎儿联系紧密的胚胎发育早期产物，是母体与胎儿之间进行物质交流的重要组织。

从发生学上讲，羊膜上皮细胞产生于受精卵起始发育时形成的内细胞团。受精卵发育早期，未植入子宫之前(受精后3-4天)形成桑椹胚，大约由100多个细胞组成。外层的数十个细胞成为滋养层并最终形成绒毛膜，内层的数十个细胞就是内细胞群，未来发育为胚胎和羊膜。受精后大约8天，人类囊胚部分植入到子宫内膜基质。囊胚外层细胞(滋养层)分化成两层埋到基质内，内细胞团也分化成两层：上胚层和下胚层。上胚层是所有三个胚层的来源，最终形成发育的胚胎。同时，羊膜腔在上胚层内出现，相邻细胞滋养层的上胚层细胞被称为羊膜细胞。随着时间的推移羊膜腔扩大，在足月胎儿表面形成了厚约0.02-0.05mm，面积约700-1200cm²的，无血管、神经、肌肉和淋巴管，具有一定韧性和弹性，自内向外分为五层的羊膜。羊膜由羊膜上皮层(epithelium)、基底膜(basement membrane)、致密层(compact layer)、纤维母细胞层(fibroblast layer)、海绵层(spongy layer)五层组成，处于羊膜最里面的一层面向羊膜腔包裹着羊水的细胞为羊膜上皮细胞。

羊膜上皮细胞与胚胎干细胞具有同一发育组织来源，是由受精卵发育至第8天的囊胚内细胞团分化而来，因此保留胚胎干细胞特性，具有多能干性，有较强的分化能力及可塑性。hAECs通常表达多种胚胎干细胞有关的标记，包括阶段特异性胚胎抗原-3(stagespecific embryonic antigen，SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤排斥抗原-60(tumor rejection antigen，TRA1-60)和肿瘤排斥抗原-81(TRA1-81)。与此同时，还表达多潜能干细胞特异性转录因子OCT-4、SOX-2、Nanog、FGF4、REX-1。

在实际应用当中，人羊膜上皮细胞来源于新生儿产后废弃物胎盘上的羊膜，来源广泛，取材容易，价格便宜，没有应用限制，不会对婴儿或母亲产生任何伤害，显然没有胚胎干细胞应用所产生的伦理问题。同时人羊膜上皮细胞具有调节体内和体外免疫反应的能力，研究发现羊膜上皮细胞有HLA-Ib(HLA-E、HLA-G)的表达；MHCⅡ基因：HLA-DP、DQ、DR则低表达或不表达；不表达β₂微球蛋白；不表达共刺激因子CD80、CD86。由于hAECs在体外培养时能分泌多种免疫调节因子、抗血管生成蛋白或抗炎因子相关蛋白，因此人羊膜上皮细胞可以看作是免疫赦免细胞，无抗原呈递的功能，移植后可减少免疫细胞来源，避免免疫排斥反应的发生。基于以上这些考虑，在各种来源、各种种类的多潜能细胞中，人羊膜上皮细胞是最适合用于临床细胞治疗和再生医学的种子细胞来源与类型。

因此，一方面，本发明提供了一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法，所述方法包括如下的步骤：

(1)取人羊膜上皮细胞，在适宜的条件下培养12-48小时；

(2)将细胞培养液换为诱导组合物A继续培养3-14天，诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化，其中所述的诱导组合物A为含有1-10μM SB-431542、1-10μM CKI-7和5-50ng/ml human noggin的细胞培养基；

(3)将细胞培养液换为诱导组合物B继续培养3-10天，诱导人羊膜上皮细胞分化为视网膜感光细胞，其中所述的诱导组合物B为含有5-50ng/ml human noggin、10-100μM牛磺酸和1-10μM维A酸的细胞培养基。

上述方法中，本发明使用的细胞培养基的类型没有限制，只要可用于人羊膜上皮细胞培养的培养基即可，可以自行配制或者直接使用市场上已有的商用培养基。优选的培养基包括DMEM培养基和NPBM培养基。

在本发明的另一实施方案中，步骤(1)中所述的人羊膜上皮细胞为取P0或者P1人羊膜上皮细胞。

在本发明的另一实施方案中，步骤(1)中的P0或者P1人羊膜上皮细胞按照10⁴-10⁶/孔的细胞量接种于培养容器内培养12-30小时，之后添加诱导组合物A。更优选1×10⁵-5×10⁵细胞/孔的细胞量接种于孔板内培养12-24小时，之后添加诱导组合物A。

在本发明的另一实施方案中，步骤(2)中将细胞培养液换为诱导组合物A继续培养5-10天，诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化。其中，所述的诱导组合物A中的细胞培养基为DMEM培养基。所述的SB-431542的CAS号为301836-41-9，优选的商用产品为,Sigma,cat.no.S4317；所述的CKI-7的CAS号为1177141-67-1，商用产品为Sigma,cat.no.C0742；所述的human noggin的CAS号为928858-36-0，优选的,商用产品为PEPROTECH cat.no.120-10C)。

在本发明的另一实施方案中，步骤(2)中的诱导组合物A为含有3-7μM SB-431542、3-7μM CKI-7和10-30ng/ml human noggin的细胞培养基。

在本发明的另一实施方案中，步骤(3)中将细胞培养液换为诱导组合物B继续培养5-8天，诱导人羊膜上皮细胞分化为视网膜感光细胞。其中，所述的诱导组合物B中的细胞培养基为DMEM培养基。所述的human noggin的CAS号为928858-36-0，优选的商用产品为PEPROTECH cat.no.120-10C；所述的牛磺酸(taurine)的CAS号为107-35-7，优选的商用产品,Sigma,cat.no.T8691；所述的维A酸(Retinoic acid)的CAS号为302-79-4，优选的商用产品,Sigma,cat.no.R2625。通过诱导组合物B促使人羊膜上皮细胞产生高表达Chx10、Rx、Crx、NRL等视网膜感光细胞的典型基因，能够使羊膜上皮细胞定向诱导分化为视网膜感光细胞，后续可用于视网膜神经退行性疾病的治疗。

在本发明一个优选的实施方案中，步骤(2)中的诱导组合物A通过如下的方法制备：向含有15％KSR(Knockout Serum Replacement)，2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid)，1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)，100units/ml penicillin,100μg/ml streptomycin,1％B27supplement、1％N2supplement的DMEM/F12 1:1(1X)培养基中加入终浓度为1-10μM SB-431542(CAS号301836-41-9,Sigma,cat.no.S4317)、1-10μM CKI-7(CAS号1177141-67-1Sigma,cat.no.C0742)、5-50ng/mlhuman noggin(CAS号928858-36-0,PEPROTECH,cat.no.120-10C),即得到人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的诱导组合物A。

在本发明的另一实施方案中，步骤(3)中的诱导组合物B为含有10-30ng/ml humannoggin、30-50μM牛磺酸和3-7μM维A酸的细胞培养基。

在本发明一个优选的实施方案中，步骤(3)中的诱导组合物B通过如下的方法制备：向含有15％KSR(Knockout Serum Replacement)，2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid)，1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)，100units/ml penicillin,100μg/ml streptomycin,1％B27supplement、1％N2supplement的DMEM/F12 1:1(1X)培养基中加入终浓度为5-50ng/ml human noggin(CAS号928858-36-0,PEPROTECH,cat.no.120-10C)、10-100μM牛磺酸(taurine,CAS号107-35-7,Sigma,cat.no.T8691)、1-10μM维A酸(Retinoic acid,CAS号302-79-4,Sigma,cat.no.R2625)，即得到人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的诱导组合物B。

在本发明的另一优选实施方案中，步骤(3)的培养过程为：将细胞培养液换为诱导组合物B培养1-2天后，再传代到铺有纤连蛋白的培养容器中，用诱导组合物B继续培养3-8天诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化。加入纤连蛋白培养是为了更便于细胞贴壁生长。

在发明的另一实施方案中，提供了一种从羊膜组织中分离羊膜上皮细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；

(2)清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮细胞。

在本发明的另一实施方案中，所述的羊膜上皮细胞来源于人类。可从离体的人胎盘分离羊膜，采用生理缓冲液冲洗除去血细胞，机械剔除残留绒毛膜和血管。分离指的是从组织样品中移出细胞且与另外的组织分开。使用任何常规技术或方法从完整人羊膜上皮层组织分离出单细胞，这些技术或方法包括机械力(切碎力或剪切力)，用一种或组合的蛋白酶例如胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、释放酶(liberase)和胃蛋白酶进行酶消化或机械和酶方法的组合。

在本发明一个优选的实施方案中，人羊膜的获取应经产妇授权同意后，取健康产妇剖腹产后的胎盘组织，通过机械分离得到整张羊膜。

在本发明另一个优选的实施方案中，可对上述步骤(2)中获得人羊膜上皮细胞继续培养，优选的培养条件为：以1×10⁶-1×10⁸个细胞/平板的密度将细胞接种于培养皿中，放置于二氧化碳培养箱中培养，待人羊膜上皮细胞贴壁后换培养液，待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存，用于后续的诱导分化。

本领域技术人员可用已知的其它方法将分离的人羊膜上皮细胞或前述的使羊膜上皮细胞定向诱导分化为视网膜感光细胞的活性细胞群体进行浓缩。这些加工后洗涤/浓缩步骤可单独或同时施行。除了上述方法以外，还可在细胞洗涤后或培养后，进一步纯化或富集活性细胞群体，减少杂细胞和死细胞。分离悬浮液中的细胞可通过以下技术来实现：浮力密度沉降离心、有差别的与固相的粘着和从固相上洗脱、免疫磁性珠、荧光激光细胞分选(FACS)或其它技术。这些不同技术以及进行这些技术的装置的实例可参见现有技术和上市商品。

本发明的另一方面是公开了由人羊膜上皮细胞诱导分化的视网膜感光细胞或其细胞制剂在治疗和/或改善视网膜退行性疾病中的用途。

一方面，本发明公开了由人羊膜上皮细胞诱导分化的视网膜感光细胞或其细胞制剂在制备治疗和/或改善视网膜退行性疾病的药物中的用途。使用有效剂量的由人羊膜上皮细胞诱导分化的视网膜感光细胞或其细胞制剂可单独或者与其它药物联合使用进行治疗和/或改善视网膜退行性疾病。有效剂量是指足以改善或防止医学疾病的症状或病症的量。对具体受治疗者的有效量可视多种因素而变化，例如待治疗的疾病、患者的整体健康状况、给药的方法途径和剂量及副作用的严重性。有效量可为避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

在本发明另一实施方案中，所述的具有视网膜退行性疾病的动物是指哺乳动物。在更为优选的实施方案中，所述的动物为牛、马、羊、猴子、狗、大鼠、小鼠、兔子或人类。在最优选的实施方案中，所述的具有视网膜退行性疾病的动物是指人类。

在本发明另一个优选的实施方案中，所述的视网膜退行性疾病包括视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)、年龄相关性黄斑变性(Age-related MacularDegeneration,AMD)及青光眼等。

在发明的另一实施方案中，所述的细胞制剂包括由人羊膜上皮细胞诱导分化的视网膜感光细胞和药学可接受的载体。本发明所述的药学可接受的载体是指适合用于人和/或动物，无过度的不良副作用(如毒性、刺激性和过敏反应)的具有合适的有益/风险率的物质，例如药学可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂，有利于细胞存活，能递送所配制的细胞到人或动物。载体依合适地计划的给药方式而选择。本发明的载体包括但不限于各种生理缓冲液，如生理盐水、磷酸缓冲液、人工脑脊液或是全血清、脐带血清等。

在发明的另一实施方案中，在将人羊膜上皮细胞诱导分化为视网膜感光细胞后，收集诱导分化后的细胞，可以采用任意适合的方法将视网膜感光细胞给予患者。在发明的一个优选的实施方案中，对具有视网膜退行性疾病的动物进行视网膜下腔注射，以治疗和/或改善疾病进展状况。细胞给予可以重复或连续进行。一般而言，多重给药方式通常要间隔至少7-10天分别使用，以取得更好的疗效。诱导分化的视网膜感光细胞的适合用量将根据患者的年龄、性别、体重、健康状况以及其它因素而改变。通常，每次给予的剂量范围为大约10³-10⁹细胞，更优选的剂量范围为大约10⁵-10⁷细胞。

在本发明另一个优选的实施方案中，通过如下的步骤收集体外诱导分化后的细胞：向培养容器中胰蛋白酶，放入培养箱进行消化，待显微镜下观察细胞变为圆形后，向其中加入胎牛血清(FBS)，混匀后用移液枪轻轻吹打，将消化液移入离心管中离心，去掉上清液，用培养基重悬细胞沉淀，进行细胞计数。

在本发明另一个优选的实施方案中，通过如下的步骤收集体外诱导分化后的细胞：向培养容器中加入0.25％胰蛋白酶，放入37℃培养箱进行消化5-10min，待显微镜下观察细胞变为圆形后，向其中加入胎牛血清(FBS)，混匀后用移液枪轻轻吹打，将消化液移入离心管中离心，去掉上清液，用少量DMEM/F12 1:1(1X)培养基重悬细胞沉淀，进行细胞计数。

在本发明的另一实施方案中，将诱导分化的视网膜感光细胞与一种或多种药物联合施用给患者，所述的药物包括雷珠单抗、阿柏西普、康柏西普、Avastin和Brolucizumab等。

本发明涉及一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法及其在治疗视网膜退行性疾病中的应用，该方法为向人羊膜上皮细胞中添加诱导组合物A和诱导组合物B，诱导产生的细胞高表达Chx10、Rx、Crx、NRL等视网膜感光细胞的典型基因..将利用该方法诱导产生的视网膜感光细胞注射到具有视网膜退行性疾病视网膜下腔，以改善疾病的进展状况。在本发明的一个优选的实施方案中，将利用该方法诱导产生的细胞注射到RCS大鼠视网膜下腔，通过ERG以及OCT检测发现大鼠眼睛电生理信号明显增强，眼底结构明显改善，眼球切片HE染色显示其视网膜厚度明显增加，经过上述方案诱导分化后的细胞经注射后对大鼠的视力有一定程度的恢复。本发明中的诱导组合物能够用于人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞的分化以及治疗视网膜损伤相关的眼部疾病，特别是可用于人类的视网膜退行性疾病的治疗。该法简便易行，且羊膜上皮细胞来源广泛，取材容易，没有应用限制，不存在伦理问题，在眼科疾病的临床应用上将具有广泛的前景。

附图说明

图1：体外诱导分化后的细胞形态以及部分视网膜感光细胞特异性标志物的表达情况。(A-A’)细胞分化第8-12天明场形态图,A’显示细胞突触和连接；(B-B’)细胞分化到第12-14天明场形态图，B’显示细胞突触和连接。(C-F)原代hAECs种在含有圆形盖玻片的12孔细胞培养板中，待细胞长到50-60％，开始加含有诱导因子的培养液，隔天换液,第4-8天检测早期PRs标志物RX/CHX10,第8-14天检测PRs前体标志物CRX/NRL；(G-J)分化至第15-22天检测PRs成熟标志物Recoverin/Rhodopsin/Blue opsin/Red opsin.蓝色(DAPI)染核，标尺代表100μm(A-B),50μm(C-F),25μm(G-J).

图2：50ng/mL干扰素-γ刺激分化前后细胞表面HLA-DR和HLA-DQ的表达情况。(A-B)流式检测原代hAECs的HLA-DQ/HLA-DR表达情况；(C-D)流式检测hAECs-PRs的HLA-DQ/HLA-DR表达情况。

图3：注射细胞后RCS大鼠ERG检测结果。(A)治疗眼(右眼)与非治疗眼(左眼)在不同光强下ERG b波的代表性电生理图；(B)各组平均b波统计图，n＝6(**P<0.001,*P<0.05)

图4：移植后对视网膜结构的修复情况。(A)治疗眼代表性石蜡切片HE染色图(红色箭头所指部位为细胞注射部位)；(B)hAECs-PRs注射部位，可见ONL层(PRs)明显增厚；(C)非注射部位ONL层和视网膜整体厚度都变薄；(D)注射部位与非注射部位的视网膜整体厚度和ONL厚度统计图。标尺代表1000μm(A),100μm(B-C),n＝6(**P<0.001,*P<0.05)

图5：移植后细胞存活情况。双光子共聚焦显微镜拍照检测移植后3周PRs主要标记物Recoverin(A)/Rhodopsin(B)(红色)，GFP(hAECs-PRs)-绿色，DAPI(蓝色)染核，三个颜色合并后可以看到代表hAECs-PRs的GFP和Recoverin重合，说明注射进的细胞在视网膜中存活且发挥功能。标尺代表50μm.

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1羊膜细胞实验溶液的配制

步骤1：羊膜上皮细胞培液的配制：500ml的DMEM/F12 1:1(1X)里加入95ml KSR；6.5ml 100mM L-Glutamine；6.5ml 100mM Sodium Pyruvate；6.5ml 100mM MEM NEAA；2000×的EGF与100×的双抗(Penicillin-Streptomycin)使用前添加；

步骤2：2000×EGF的配制：向100ug EGF包装管中加入1ml无菌ddH₂O，静置5-10min使其溶解，再加入4ml稀释液(含5％海藻糖的PBS)，混匀然后分装至1.5ml EP管中，每管分装100μl；

步骤3：消化终止液配制：DMEM/F12 1:1(1X)+10％FBS；

步骤4：冻存液配制：40％FBS+50％培液+10％DMSO。

实施例2人羊膜上皮细胞的分离

1、人羊膜的来源

经产妇授权同意后，取健康产妇(HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝等血清学反应均显示为阴性)剖腹产后的胎盘组织，十字刀切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。

2、人羊膜上皮细胞的分离

步骤1：用加过双抗(P/S)的无菌PBS溶液清洗羊膜三遍，洗去血液及其他杂质，将羊膜转入50ml离心管。

步骤2：加入10ml的0.25％胰酶(提前37℃浴化)消化30s，颠倒20次，将羊膜移入另一个50ml离心管中。

步骤3：向离心管中加入15ml的0.25％胰酶(提前37℃浴化)，37℃水浴消化10min后，将羊膜移入另一个50ml离心管。

步骤4：向离心管中加入25ml的0.25％胰酶，37℃水浴消化40min，每隔10分钟摇晃10次，结束后用力颠倒10次，加等体积的消化终止液终止消化，转速500g，室温离心10min后收集细胞，用1ml培液重悬。

步骤5：将羊膜转移至另一个50ml离心管中，加入25ml的0.25％胰酶，37℃消化40min，每隔10分钟混匀10次，结束后用力颠倒10次，加等体积的消化终止液终止消化，转速500g，室温离心10min后收集细胞，用1ml培液重悬。

步骤6：将两次重悬细胞混合，加入18ml培液(培养液中提前加入双抗及EGF)混匀过200目筛后过400目筛。

实施例3人羊膜上皮细胞的接种培养及冻存

1、细胞计数培养：1×10⁷个细胞接种到15cm培养皿。待细胞贴壁后换培养液，之后三天换一次培养液。

2、细胞冻存：待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存：15cm dish加5ml胰酶，10min后镜下观察，细胞变圆且平面晃动平皿时细胞全变为悬浮状态时加等量消化终止液终止消化。用微量移液器按同一方向将培养皿上的细胞吹下，移入15ml离心管，800g离心3min后收集细胞然后进行细胞计数。在冻存管内加入冻存液，标明冻存日期、批次及细胞数量之后将细胞放入冻存管，然后立刻将冻存管放入冻存盒中并将冻存盒放进-80℃冰箱，12h后取出冻存盒，将细胞移入液氮罐中保存。

实施例4体外诱导视网膜感光细胞分化

1.促进人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化方法的具体步骤为：

诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化诱导组合物的制备：向含有15％KSR(Knockout Serum Replacement)，2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid)，1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)，100units/ml penicillin,100μg/ml streptomycin,1％B27supplement、1％N2supplement的DMEM/F12 1:1(1X)培养基中加入终浓度1-10μM SB-431542(CAS号301836-41-9,Sigma,cat.no.S4317)、1-10μM CKI-7(CAS号1177141-67-1Sigma,cat.no.C0742)、5-50ng/ml human noggin(CAS号

928858-36-0,PEPROTECH,cat.no.120-10C),即得到人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的诱导组合物A。加入终浓度为5-50ng/ml human noggin(CAS号928858-36-0,PEPROTECH,cat.no.120-10C)、10-100μM牛磺酸(taurine,CAS号107-35-7,Sigma,cat.no.T8691)、1-10μM维A酸(Retinoic acid,CAS号302-79-4,Sigma,cat.no.R2625)，即得到人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的诱导组合物B。

诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法：取P₀或者P₁人羊膜上皮细胞，按照1-2×10⁵细胞/孔的细胞量接种于六孔板内，12-48小时后添加诱导组合物A，隔天换液，放置于37℃含5.5％二氧化碳的培养箱中培养7-14天换组合物B，1-2天后按照1：3传代到铺有纤连蛋白(每孔加10μL1mg/ml Fibronectin(GIBCO,cat.no.33016-015)加900μLPBS)的六孔板培养皿中，加组合物B继续培养3-8天。

实施例5细胞免疫荧光

(1)细胞固定：从细胞培养箱取出细胞，观察细胞后弃培养液，1×PBS洗细胞2-3次，每孔加500-800μL 4％多聚甲醛，室温固定15min；

(2)细胞清洗：弃多聚甲醛溶液，用1×PBS清洗3次，每次5min；

(3)细胞透化：含0.25％Triton X-100的1×PBS室温透化1-10min(根据目的蛋白的细胞定位)；

(4)细胞清洗：弃透化液，用1×PBS清洗3次，每次5min；

(5)封闭：每孔加500-800μL封闭液(850μL PBS+100μL10％BSA+50μLHBS)，室温封闭1h(或4℃过夜)；

(6)一抗孵育：将抗体以1:50-1:200比例用1×PBS稀释，室温孵育2h(或4℃过夜)；

(7)细胞清洗：回收或弃掉一抗稀释液，1×PBS清洗3次，每次5min；

(8)二抗孵育：将荧光二抗以1:200-1:500比例用1×PBS稀释，室温避光孵育1h；(9)细胞清洗：弃掉荧光二抗稀释液，1×PBS清洗3次，每次5min；

(10)DAPI染色：DAPI用1×PBS以1:1000比例稀释，室温染色细胞1min；

(11)细胞清洗：弃掉DAPI稀释液，1×PBS清洗3次，每次5min；

(12)封片：从12孔板取出盖玻片，用无尘纸吸掉边缘的PBS，然后细胞生长一侧轻轻扣到封片液上(封片液预先滴加在载玻片上)；

(13)观察拍照：在荧光显微镜或双光子激光共聚焦显微镜下观察拍照。

图示(图1)结果显示分化后的感光细胞样细胞形态呈神经细胞样，突触明显；RX/CHX10等感光细胞早期标志物表达，Recoverin/Opsin/Rhodopsin等感光细胞成熟期标志物免疫荧光结果显示阳性率很高。因此，说明我们分化的细胞从形态到蛋白水平符合感光细胞的基本特征。

实施例6流式细胞术鉴定细胞表面标志

1、缓冲液的配制：

清洗缓冲液(含2％FBS的PBS溶液)：1ml FBS用1X PBS溶液定容至50ml

固定液(4％PFA溶液)：180ml双蒸水+20μl 5M氢氧化钠+8g PFA(多聚甲醛)加热至65℃，搅拌至完全溶解，冷却至室温，加入10ml 20X PBS，用双蒸水定容至200ml，分装-20℃冻存。

2、流式细胞术鉴定：

步骤1：分别取原代未经体外诱导分化的人羊膜上皮细胞以及经体外诱导向视网膜感光细胞分化后的细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化后4℃1000rpm离心5min，弃上清，加1ml PBS重悬细胞，平均分成四份装于1.5ml离心管中，4℃1000rpm离心3min后弃上清。

步骤2：加入800μl清洗缓冲液重悬细胞，4℃1000rpm离心3min后弃上清。重复步骤2两次。

步骤3：向细胞中加入50μl清洗缓冲液，每管中加入5μl HLA-DQ同型、HLA-DQ、HLA-DR同型、HLA-DR抗体，混匀后避光4℃放置30min。

步骤4：4℃1000rpm离心3min后弃上清，加入800μl清洗缓冲液重悬细胞。重复两次。

步骤5：每管加入500μl 4％PFA固定液，避光4℃过夜固定。

步骤6：取出后4℃1000rpm离心3min后弃上清，加入800μl清洗缓冲液重悬细胞。重复两次。

步骤7：加入500μl清洗缓冲液重悬细胞，移入流式管中上机检测。

图示(图2)显示hAECs分化后的感光样细胞和同批次hAECs流式检测结果显示HLA-DR/HLA-DQ结果均为阴性，表明细胞分化前后MHC-II抗原低表达，保持着低免疫原性，有利于细胞的体内移植。

实施例7大鼠眼部电生理检测(ERG)

1、暗适应

实验前将实验RCS大鼠放于完全黑暗环境，暗适应12小时以上，注意通风。

2、ERG检测

步骤1：氯胺酮麻醉，用量为0.02-0.03/70g，眼部滴加散瞳药进行散瞳。

步骤2：连接电极。记录电极与参考电极各2根，地电极1根。

步骤3：依次进行暗反应刺激，刺激强度分别为：-40db、-25db、-10db、0db、+5db。

步骤4：明适应10min。

步骤5：依次进行明反应刺激，刺激强度分别为：-10db、-5db、0db、+5db、+10db。图示(图3)为检测其治疗效果，对各组大鼠进行电生理检测，在细胞移植后3周左右进行ERG检测，注射时采用自身对照的方式(右眼注射细胞，左眼空白组或注射DMEM/F12)。结果如图所示，相对于对照眼，治疗眼的ERG b波在不同光强下的电生理反应显著提高。说明细胞移植后能明显改善视功能。

实施例8 RCS大鼠眼球石蜡切片及HE染色

1、大鼠眼球分离：

将颈椎脱臼法处死的大鼠的眼球取出，浸泡于1X PBS溶液中，去除眼球周围脂肪等其他杂质。

2、溶液配制：

4％PFA溶液配制方法同实施例4。

盐酸乙醇溶液：7ml HCl(37％)+252ml 70％乙醇。

稀氨水：200ml蒸馏水加100μl氨水，即为0.05％稀氨水。

3、眼球石蜡包埋、切片及HE染色

步骤1：脱水及透蜡：

将眼球放入包埋盒中依次通过装有下列溶液的脱水缸：

脱水：装有眼球的包埋盒依次通过70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇中各15min，然后在两个95％乙醇脱水缸中放置30min，两个100％乙醇脱水缸中放置30min；

透明：依次通过装有50％二甲苯和50％酒精的脱水缸中60min，两个二甲苯脱水缸中60min；

透腊：通过两个装有纯蜡的脱水缸中60min。

步骤2：包埋：

用镊子将包埋盒取出，与石蜡模子一起置于蜡缸中，用镊子夹取石蜡模子放在滴蜡处，滴一滴蜡后放在4℃处，将组织放在蜡上(切面朝下)，然后将模具放在滴蜡处，盖上包埋盒加石蜡，放在4℃处凝固后再补充石蜡。

步骤3：切片：

先将蜡块按组织部位修整，切除多余蜡块。调整切片机使刀片与蜡块的距离和角度合适。先将切片厚度调到50μm，切到样品后将切片厚度调到4μm，镜下检查是否切到想要的组织，之后按4μm的厚度切片。小心切取蜡带一定长度后，用刀片按5个样品的距离分割蜡带。

步骤4：展片、贴片、烘片：

打开展片仪使水温维持在42℃，用小镊子夹取蜡带放在水面上，切片在水中展开。取洁净的载玻片，小心捞起展开的切片，另一端磨面上标记日期与样品编号。将烘片机的温度调到37℃，切片放在烘片机上烘干，使切片贴服在玻璃片上。烘片4h后收起，切片可长期保存。

步骤5：HE染色：

将切好的眼球切片依次经过以下容器：

脱蜡：二甲苯10min×3；

水化：100％乙醇5min×2，95％乙醇2min；自来水缓慢水流冲洗5min；

染细胞核：苏木精(45秒至数分钟，根据染色情况决定，细胞核染成蓝色)；自来水缓慢水流冲洗5min；

分化：盐酸乙醇溶液2秒；自来水缓慢水流冲洗5min；

返蓝：放入稀氨水中8次；自来水缓慢水流冲洗6min；95％乙醇4min；

染细胞质：伊红(45秒，细胞质染成红色)；

脱水：95％乙醇2min×2，100％乙醇4min×2；

透明：二甲苯5min×3，完成染色之后将切片至于通风厨中风干残留的二甲苯，用中性树脂封片。

图示(图4)显示，细胞注射部位与非注射部位相比，视网膜的整体厚度和外核层厚度都明显改善，说明分化后细胞治疗能够保护视网膜结构，减缓感光细胞凋亡进程。

实施例9 RCS大鼠眼球冰冻切片及免疫组化实验

1、取样及眼球包埋

将颈椎脱臼法处死的大鼠的眼球取出后，迅速置于1X PBS中洗去血污，并将眼球周围脂肪等杂质清除干净后，置于装有冰冻切片包埋剂(OCT)的包埋盒中。将包埋盒置于干冰预冷的异戊烷中，直至OCT和组织完全冻结。

2、眼球样品冰冻切片

将包埋好的眼球固定于冰冻切片机，切为0.5μm的切片，并将切片贴于粘附性载玻片上。

3、眼球冰冻切片的免疫组化实验

步骤1：切片染色前需室温放置30min，以使切片与玻片充分粘附。

步骤2：将样品放于丙酮中，-20℃，固定10min(若组织在包埋前已固定，则直接进行后续操作)。

步骤3：切片取出，用PBS洗3次，每次5min。

步骤4：组织先用油性笔圈住，后在组织上滴加一抗(一抗用5％HBS+1％BSA的PBS稀释)，置于湿盒4℃过夜；

步骤5：切片取出，用PBS洗3次，每次5min；

步骤6：除去切片表明水分，滴加荧光偶联二抗(用5％HBS+1％BSA的PBS稀释)，置于湿盒室温避光孵育1h。(此步开始的后续操作均避光操作)

步骤7：切片取出，用PBS洗3次，每次5min。

步骤8：DAPI用PBS稀释后，滴加至切片上，室温孵育3min，后用PBS清洗2次，每次5min；

步骤9：封片液封片，荧光显微镜镜检。

图示(图5)冻切片后免疫荧光用双光子共聚焦显微镜拍照检测细胞存活情况并对感光细胞主要标志物进行检测。结果显示，细胞移植后3周存活状态良好，并表达Recoverin/Rhodopsin等感光细胞主要标志物，说明移植到视网膜下腔的感光样细胞能够长时间存活，并插入整合到原来的视网膜中，发挥感光功能。

本发明提供了一种新的体外诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法，诱导产生的细胞高表达部分经典的视网膜感光细胞标志物；另外，刺激因子刺激后其HLA-DR和HLA-DQ抗原的表达仍然维持很低水平，表明该细胞经过分化后仍具有很低的免疫原性，适合作为移植物进行细胞治疗。经视网膜下腔注射的RCS大鼠，其ERG电生理检测结果表示在光刺激下其眼部电信号强度较非治疗组有明显增强，眼球取样切片显示注射的细胞能够定位在视网膜下腔的特定位置并存活较长时间，HE染色显示经注射的RCS大鼠的视网膜结构有明显恢复。因此，发明人认为该体外分化方法能够将人羊膜上皮细胞以较高效率分化为视网膜感光细胞，并且经注射后能够使RCS大鼠的视力得到一定程度的恢复。根据该动物模型的实验结果，可望将该方法推广应用到人类视网膜退行性疾病的治疗。

在此说明书中，本发明已参照特定的实施例作了描述，实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。本发明的说明是说明性的而非限制性的，本领域的技术人员可以在不脱离本发明原理的前提下轻易的做出改进和修饰，但这些改进和修饰也都落入本发明权利要求保护的范围内。

Claims (32)

1.一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法，所述方法包括如下的步骤：

(1)取人羊膜上皮细胞，在适宜的条件下培养12-48小时；

(2)将细胞培养液换为诱导组合物A继续培养3-14天，诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化，其中所述的诱导组合物A为含有1-10μM SB-431542、1-10μM CKI-7和5-50ng/ml human noggin的细胞培养基；

(3)将细胞培养液换为诱导组合物B继续培养3-10天，诱导人羊膜上皮细胞分化为视网膜感光细胞，其中所述的诱导组合物B为含有5-50ng/ml human noggin、10-100μM牛磺酸和1-10μM维A酸的细胞培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中的细胞培养基为可用于人羊膜上皮细胞培养的培养基，可以自行配置或者直接使用市场上已有的商用培养基。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中的细胞培养基为DMEM培养基或NPBM培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中的人羊膜上皮细胞为P0或者P1人羊膜上皮细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中的P0或者P1人羊膜上皮细胞按照10⁴-10⁶/孔的细胞量接种于培养容器内培养12-30小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中的P0或者P1人羊膜上皮细胞按照1×10⁵-5×10⁵细胞/孔的细胞量接种于孔板内培养12-24小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中将细胞培养液换为诱导组合物A继续培养5-10天，诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中步骤(2)中诱导组合物A中的细胞培养基为DMEM培养基。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中的诱导组合物A为含有3-7μM SB-431542、3-7μM CKI-7和10-30ng/ml human noggin的细胞培养基。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中中的诱导组合物A通过如下的方法制备：向含有15％KSR(Knockout Serum Replacement)，2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid)，1mM丙酮酸钠(sodiumpyruvate)，100units/ml penicillin,100μg/ml streptomycin,1％B27 supplement、1％N2 supplement的DMEM/F12 1:1培养基中加入终浓度为1-10μM SB-431542、1-10μM CKI-7和5-50ng/ml human noggin,即得到人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的诱导组合物A。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中将细胞培养液换为诱导组合物B继续培养5-8天，诱导人羊膜上皮细胞分化为视网膜感光细胞。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(3)诱导组合物B中的细胞培养基为DMEM培养基。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中的诱导组合物B为含有10-30ng/ml human noggin、30-50μM牛磺酸和3-7μM维A酸的细胞培养基。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中的诱导组合物B通过如下的方法制备：向含有15％KSR(Knockout Serum Replacement)，2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，1mM非必需氨基酸(non-essentialamino acid)，1mM丙酮酸钠(sodiumpyruvate)，100units/ml penicillin,100μg/ml streptomycin,1％B27 supplement、1％N2 supplement的DMEM/F12 1:1培养基中加入终浓度为5-50ng/ml human noggin、10-100μM牛磺酸和1-10μM维A酸，即得到人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的诱导组合物B。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(3)的培养过程为：将细胞培养液换为诱导组合物B培养1-2天后，再传代到铺有纤连蛋白的培养容器中，用诱导组合物B继续培养3-8天诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化。

16.根据权利要求1-15任一项所述的方法，所述方法中的人羊膜上皮细胞由包括如下步骤的方法制备：

(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；

(2)清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：步骤(1)中人羊膜的获取应经产妇授权同意后，取健康产妇剖腹产后的胎盘组织，通过机械分离得到整张羊膜。

18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：步骤(2)中可使用任何常规技术或方法从完整人羊膜上皮层组织分离出单细胞，这些技术或方法包括机械力，用一种或组合的选自胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、释放酶和胃蛋白酶的蛋白酶进行酶消化或机械和酶方法的组合。

19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：对步骤(2)中获得人羊膜上皮根据细胞继续培养，培养条件为：以1×10⁶-1×10⁸个细胞/平板的密度将细胞接种于培养皿中，放置于二氧化碳培养箱中培养，待人羊膜上皮细胞贴壁后换培养液，待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存，用于后续的诱导分化。

20.由人羊膜上皮细胞诱导分化的视网膜感光细胞或其细胞制剂在制备治疗和/或改善视网膜退行性疾病的药物中的用途。

21.根据权利要求20所述的用途，其特征在于：使用有效剂量的由人羊膜上皮细胞诱导分化的视网膜感光细胞或其细胞制剂可单独或者与其它药物联合使用进行治疗和/或改善视网膜退行性疾病，有效剂量是指足以改善或防止医学疾病的症状或病症的量。

22.根据权利要求20所述的用途，其特征在于：所述的治疗和/或改善视网膜退行性疾病是指治疗和/或改善具有视网膜退行性疾病的动物，其为哺乳动物。

23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于：所述的具有视网膜退行性疾病的动物为牛、马、羊、猴子、狗、大鼠、小鼠、兔子或人类。

24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于：所述的具有视网膜退行性疾病的动物为人类。

25.根据权利要求20所述的用途，其特征在于：所述的视网膜退行性疾病包括视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)、年龄相关性黄斑变性(Age-related MacularDegeneration,AMD)及青光眼。

26.根据权利要求20所述的用途，其特征在于：在将人羊膜上皮细胞诱导分化为视网膜感光细胞后，收集诱导分化后的细胞，可以采用任意适合的方法将视网膜感光细胞给予患者。

27.根据权利要求26所述的用途，其特征在于：对具有视网膜退行性疾病的动物进行视网膜下腔注射，以治疗和/或改善疾病进展状况。

28.根据权利要求27所述的用途，其特征在于：对具有视网膜退行性疾病的动物进行视网膜下腔注射，细胞给予可以重复或连续进行，多重给药方式要间隔至少7-10天分别使用。

29.根据权利要求26所述的用途，其特征在于：每次给予的剂量范围为10³-10⁹细胞。

30.根据权利要求29所述的用途，其特征在于：每次给予的剂量范围为10⁵-10⁷细胞。

31.根据权利要求20所述的用途，其特征在于：将诱导分化的视网膜感光细胞与一种或多种药物联合施用给患者，所述的药物包括雷珠单抗、阿柏西普、康柏西普、Avastin和Brolucizumab。

32.根据权利要求20-31任一项所述的用途，其特征在于：所述的由人羊膜上皮细胞诱导分化的视网膜感光细胞或其细胞制剂根据权利要求1-15任一项所述的方法制备得到。

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