CN1747744A

CN1747744A - 使用otx2基因再生和新生视网膜感光细胞

Info

Publication number: CN1747744A
Application number: CNA2004800034638A
Authority: CN
Inventors: 古川贵久
Original assignee: Osaka Bioscience Institute; Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-02-03
Filing date: 2004-02-02
Publication date: 2006-03-15
Anticipated expiration: 2024-02-02
Also published as: WO2004069268A1; US20060122111A1; US20110097726A1; KR20080098451A; KR20050105448A; KR20090054480A; JPWO2004069268A1; US20100273265A1; EP1591127A1; EP1591127A4; KR100937614B1; KR100939469B1; EP1591127B1; JP4676332B2; US8137934B2; KR20090096561A; JP2011042656A; US7858346B2; CA2514971C; ES2428892T3

Abstract

本发明提供一种药物，包括(a)Otx2蛋白或其部分肽、或其盐，或(b)编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA。本药物用作预防、治疗或抑制视网膜疾病包括视网膜变性的发展的药剂。此外，本药物用作，例如，在患视网膜疾病的病人移植细胞到视网膜内时，诱导从视网膜干细胞分化成视网膜感光细胞的药剂。

Description

使用OTX2基因再生和新生视网膜感光细胞

技术领域

本发明涉及含有Otx2蛋白或编码Otx2蛋白的基因的诱导分化视网膜感光细胞的药剂，预防/治疗/抑制视网膜疾病发展的药剂，和视网膜疾病的诊断试剂。

背景技术

视网膜感光细胞是哺乳动物中仅有的一种光感受器，之前在生理学、生物化学、解剖学和临床方面对其进行过深入的研究(JP-A-2002-325571)。不过，对视网膜感光细胞的发育和分化机制还一无所知。作为由视网膜光感光细胞异常引起的人遗传性视网膜变性病变的潜在位点，至少已知145个位点，但目前还没有现成的治疗该疾病的方法，而患者正遭受严重视力障碍的困扰。因此，需要阐明导致视力丧失或严重视力障碍的视网膜变性病变的起因和建立治疗方法。此外，由于视网膜感光细胞变性病变或dyscrasia在很多视网膜疾病中都有发现，例如色素性视网膜炎，糖尿病性视网膜病和视网膜黄斑变性病变，所以为再生或新生视网膜感光细胞，重要的是阐明视网膜感光细胞发育和分化的分子机制。

发明公开

本发明的一个目的是提供预防、治疗或抑制包括视网膜变性病变的视网膜疾病发展的药剂。本发明的另一个目的是提供可用作药物的化合物的筛选方法。本发明的又一个目的是提供诊断视网膜疾病的试剂或方法。本发明的又一个目的是提供诱导分化的方法，或诱导分化成视网膜感光细胞的药剂，该细胞适合用于患视网膜疾病患者视网膜移植。

本发明人关注与转录因子Crx属于相同基因家族的Otx2蛋白，Crx之前被分析作为分化成视网膜感光细胞的关键因子，并分析Otx2蛋白在决定视网膜感光细胞的命运中的作用。小鼠活体水平的分析结果是，本发明发现Otx2蛋白对决定视网膜感光细胞的命运是非常重要的。即，当Otx2基因插入到病毒载体以感染带有重组载体的小鼠未分化视网膜干细胞，并在小鼠未分化视网膜干细胞表达Otx2蛋白时，绝大多数未分化的视网膜干细胞分化成视网膜感光细胞。根据上述发现，本发明人进一步研究完成了本发明。

即，本发明涉及：

(1)预防、治疗或抑制视网膜疾病发展的药剂，其包括Otx2蛋白或其部分肽或其盐，

(2)上述(1)的药剂，其中Otx2蛋白是含有与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示相同或基本相同的氨基酸序列的蛋白，

(3)预防、治疗或抑制视网膜疾病发展的药剂，其包括编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，

(4)根据上述(3)的药剂，其中DNA含有SEQ ID NO：2，SEQID NO：4或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，或与这些序列在高度严格条件下杂交的核苷酸序列，

(5)根据上述(3)的药剂，其包括含有编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA的重组载体，

(6)诱导分化成视网膜感光细胞的药剂，其包括Otx2蛋白或其部分肽或其盐，

(7)诱导分化成视网膜感光细胞的药剂，其包括编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，

(8)诱导分化成视网膜感光细胞的方法，其包括表达Otx2蛋白或提高Otx2蛋白的表达量，

(9)根据上述(8)的诱导分化成视网膜感光细胞的方法，包括表达Otx2蛋白，或在来自眼球组织的细胞、神经干细胞或神经前体细胞中提高Otx2蛋白的表达量，

(10)根据上述(8)的诱导分化成视网膜感光细胞的方法，其中编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA被导入到来自眼球组织的细胞、神经干细胞或神经前体细胞中，并培养得到的细胞，

(11)预防、治疗或抑制视网膜疾病发展的方法，包括对哺乳动物施用有效量的Otx2蛋白或其部分肽或其盐，

(12)预防、治疗或抑制视网膜疾病发展的方法，包括对哺乳动物施用有效量的编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，

(13)再生视网膜的方法，包括移植由Otx2蛋白诱导分化的视网膜感光细胞或其前体细胞到视网膜中，

(14)Otx2蛋白或其部分肽或其盐在制备预防、治疗或抑制视网膜疾病发展的药剂中的应用，

(15)编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA在制备预防、治疗或抑制视网膜疾病发展的药剂中的应用，

(16)视网膜疾病的诊断试剂，包括Otx2蛋白或其部分肽或其盐的抗体，

(17)视网膜疾病的诊断方法，包括使用Otx2蛋白或其部分肽或其盐的抗体，

(18)视网膜疾病的诊断方法，包括检测Otx2蛋白或其部分肽的表达量或突变，

(19)视网膜疾病的诊断试剂，包括(a)编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，或(b)含有与所述DNA或RNA的核苷酸序列互补或基本互补的核苷酸序列的反义多核苷酸，

(20)视网膜疾病的诊断方法，包括使用a)编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，或(b)含有与所述DNA或RNA的核苷酸序列互补或基本互补的核苷酸序列的反义多核苷酸，

(21)具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的化合物或其盐的筛选方法，包括使用作为指示的Otx2蛋白或其部分肽的表达或其表达量的增加，

(22)根据上述(21)的筛选方法，其中使用具有表达Otx2蛋白或其部分肽的能力的细胞，

(23)具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的化合物或其盐的筛选试剂盒，其含有具有表达Otx2蛋白或其部分肽的能力的细胞，

(24)具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的化合物或其盐，其可以使用上述(21)或(22)定义的筛选方法，或上述(23)定义的筛选试剂盒得到，

(25)药物，其包括上述(24)定义的化合物或其盐。

使用本发明的蛋白或本发明的DNA，来自眼球组织的细胞、胚胎干细胞，神经干细胞或神经前体细胞可以分化成视网膜感光细胞。因此，通过使用本发明的蛋白或本发明的DNA再生或新生成视网膜感光细胞，可以预防或治疗视网膜疾病如色素性视网膜炎、老年性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、视网膜脱落、青光眼和视网膜血管阻塞，或可以抑制这些疾病的发展。此外，由于Otx2基因的异常，视网膜感光细胞经历结构和功能异常，对这些视网膜疾病的诊断可以通过检测Otx2基因的异常，或Otx2蛋白表达的退化或降低来进行。

附图简述

图1显示对照病毒载体和Otx2病毒载体的结构。图中，AP代表来自胎盘的碱性磷酸酶基因，LTR代表病毒启动子。当Otx2病毒载体在Otx2和AP之间具有IRES序列时，载体可以共表达两种基因(Otx2和AP)。IRES序列是来自病毒的基因。

图2显示病毒感染测试的概述。图中，“Ratina”代表视网膜，“Pigment Epithelium”代表色素上皮细胞，“Virus”代表感染有病毒的范围，“去除视网膜”代表提取视网膜，“固定和染色”代表组织固定和染色，及“切片和分析克隆”代表冷冻切片及其分析。

图3显示碱性磷酸酶染色后的视网膜冷冻切片图像的例子。图中，“Bi”代表双极细胞，“A”代表无长突细胞，“R”代表视网膜感光细胞，“M”代表马勒神经胶质细胞，“R+Bi”代表视网膜感光细胞和马勒神经胶质细胞，以及“A+Bi”代表无长突细胞和双极细胞。

图4显示感染有对照病毒载体(LIA)或Otx2病毒载体(Otx2/LIA)的视网膜干细胞分化的各细胞相对于显微镜一个视野中总细胞数目的存活率。

本发明的最佳实施方式

本发明使用的Otx2蛋白的例子包括含有与SEQ ID NO：1，3或5所示相同或基本相同的氨基酸序列的蛋白。本发明中，Otx2蛋白不限于具有SEQ ID NO：1或3代表的氨基酸序列的来自人的Otx2蛋白，和具有SEQ ID NO：5代表的氨基酸序列的来自小鼠的Otx2蛋白，还可以具有来自其他动物的氨基酸序列，特别是，温血动物(如豚鼠、小鼠、鸡、兔、猪、羊、牛、猴等)，或与上述序列基本相同的氨基酸序列。

“与SEQ ID NO：1，3或5所示基本相同的氨基酸序列”的例子包括具有与SEQ ID NO：1，3或5代表的氨基酸序列相比不少于约50％，优选不少于约60％，更优选不少于约70％，进一步优选不小于约80％，优选不少于约90％，最优选不少于约95％的同源性的氨基酸序列。作为含有与本发明的SEQ ID NO：1，3或5所示基本相同的氨基酸序列的蛋白，例如，含有与SEQ ID NO：1，3或5所示基本相同的氨基酸序列并具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的蛋白是优选的。其中，优选转录活性和诱导分化成视网膜感光细胞的作用与具有SEQ ID NO：1，3或5代表的氨基酸序列的蛋白相当(如，约0.01到100倍，优选约0.5到20倍，更优选约0.5到2倍)，而这些活性或如蛋白的分子量的定量元素可以不同。可以根据已知的方法测量诱导分化成视网膜感光细胞的作用，例如，上述作用可以通过后面描述的筛选方法测量。可以使用已知的方法如报告分析和RT-PCR测量转录活性。

具体地，使用含有(a)SEQ ID NO：1，3或5代表的氨基酸序列中一个或两个或更多(优选，约1到30，更优选约1到10，进一步优选数个(1到5))个氨基酸被删除的氨基酸序列，(b)SEQ ID NO：1，3或5代表的氨基酸序列中一个或两个或更多(优选，约1到30，更优选约1到10，进一步优选数个(1到5))个氨基酸被添加的氨基酸序列，(c)SEQID NO：1，3或5代表的氨基酸序列中一个或两个或更多(优选，约1到30，更优选约1到10，进一步优选数个(1到5))个氨基酸被其他氨基酸替换的氨基酸序列，或(d)上述氨基酸序列的组合来作为本发明使用的Otx2蛋白。(b)中添加的氨基酸和(c)中被替换的氨基酸可以是基因编码的20种氨基酸之外的非天然氨基酸。更优选(a)到(d)描述的蛋白具有诱导分化成感光细胞的作用。

本发明的Otx2蛋白中，C末端可以是任何一种羧基(-COOH)，羧酸酯(-COO-)，酰胺(-CONH₂)和酯(-COOR)。此处，酯基中的R可以使用C_1-6烷基如甲基、乙基、n-丙基、异丙基和n-丁基；C_3-8环烷基如环戊基和环己基；C_6-12芳基如苯基和α-萘基；和C_7-14芳烷基如苯基-C_1-2烷基(如苄基和苯乙基)和α-萘基-C_1-2烷基(如α-萘基甲基)；和另外，通常用作口服酯(oral ester)的新戊酰氧基甲基。当本发明的Otx2蛋白在C末端以外的位置具有羧基(或羧酸酯)，则在本发明的Otx2蛋白中也包括羧基被酰胺化或酯化的蛋白。这样，例如使用上述C末端酯作为酯。此外，本发明的Otx2蛋白包括N末端甲硫氨酸残基被保护基团(如C_1-6酰基，如包括甲酰基和乙酰基的C_2-6烷酰基)保护的蛋白，在活体内通过在N末端切割产生的谷氨酰基被转化为焦谷氨酸的蛋白，分子中氨基酸侧链上可取代的基团(如-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被合适的保护基团(如C_1-6酰基如包括例如甲酰基和乙酰基的C_2-6烷酰基)保护的蛋白，和称作结合蛋白的蛋白，例如可结合糖链的糖蛋白。

只要是Otx2蛋白的部分肽，任一种都可以用作本发明的Otx2蛋白的部分肽(下文中一些情况下简称部分肽)。关于本发明的部分肽的氨基酸数目，含有Otx2蛋白的组成氨基酸序列中至少约不少于20，优选大约不少于50，或更优选约不少于100个氨基酸的肽是优选的。

在本发明的部分肽中，C末端可以是羧基(-COOH)，羧酸酯(-COO-)、酰胺(-CONH₂)和酯(-COOR)中的任意一种。此外，本发明的部分肽包括，像本发明的Otx2蛋白，N端甲硫氨酸残基的氨基被保护基团保护的部分肽，在活体内通过切割N末端侧链产生的Gln被转化为焦谷氨酸的部分肽，分子中氨基酸侧链上取代基被合适的保护基团保护的部分肽，和如结合糖链的称作糖肽的结合肽。

本发明的Otx2蛋白或其部分肽的盐的例子包括带有酸或碱的生理上可接受的盐。生理上可接受的酸加成盐是优选的。这些盐的例子包括无机酸(如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)的盐，或有机酸(如乙酸、甲酸、丙酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)的盐。

本发明的Otx2蛋白或其盐可以从动物细胞或组织制备，优选从温血动物，更优选人或大鼠，进一步优选人，特别优选人脑神经元、视网膜色素上皮细胞或视网膜感光细胞通过已知的方法纯化蛋白，或还可以通过培养下文所述的含有编码本发明的Otx2蛋白的DNA或RNA的转化子来制备。或者，这些蛋白可以用与下面描述的蛋白合成方法相同或相似的方式来制备。当蛋白从动物组织或细胞制备时，动物组织或细胞被匀浆，用酸抽提，提取物可以通过组合层析如反相层析和离子交换层析来纯化和分离。

为合成本发明的Otx2蛋白或其部分肽或其盐或其酰胺，通常可以使用可商购的蛋白合成树脂。这些树脂的例子包括氯甲基树脂，羟甲基树脂，二苯甲基胺树脂，氨甲基树脂，4-苄氧基苄醇树脂，4-甲基二苯甲基树脂，PAM树脂，4-羟甲基甲基苯基乙酰氨基甲基树脂，聚丙烯酰胺树脂，4-(2’，4’-二甲氧基苯基-羟甲基)苯氧基树脂，和4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基乙基)苯氧基树脂。使用这些树脂，α-氨基和侧链官能团被合适地保护的氨基酸在树脂上通过已知的各种缩合方法按照所需蛋白的顺序缩合。在反应最后，蛋白从树脂上切割同时除去各种保护基团，另外，在高度稀释的溶液中进行形成分子内二硫键的反应，从而获得所需的蛋白或其酰胺。考虑上述对保护的氨基酸的缩合，可以使用在蛋白合成中使用的各种活化剂。作为活化剂，碳二亚胺是特别优选的。作为使用的碳二亚胺，示例的为DCC，N，N’-二异丙基碳二亚胺，N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。在这些试剂产生的活化中，保护过的氨基酸可以在预先对保护的氨基酸进行活化后被添加到树脂上，方法是将保护的氨基酸与外消旋抑制剂添加剂(如HOBt，HOOBt)一起直接添加到树脂上，或将保护的氨基酸转化为对称的酸酐或HOBt酯或HOOBt酯。

保护的氨基酸的活化或与树脂缩合中使用的溶剂可以合适地从已知用于蛋白缩合反应中的溶剂中选取。这些溶剂包括，例如，酰胺如N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，和N-甲基吡咯烷酮；卤代烃如二氯甲烷，和氯仿；醇如三氟乙醇；亚砜如二甲亚砜；醚如吡啶，二噁烷和四氢呋喃；腈如乙腈和丙腈；酯如乙酸甲酯和乙酸乙酯，及其合适的混合物。反应温度合适地选自己知用于蛋白键形成的温度范围，通常合适地选自-20℃到50℃。活化的氨基酸衍生物通常以1.5到4倍过量使用。当使用水合茚三酮反应的测试结果发现缩合不足时，有可能通过不去除保护基团重复缩合反应而进行充分缩合。当即使重复反应后仍未达到充分缩合时，未反应的氨基酸可以使用乙酸酐或乙酰咪唑进行乙酰化。

用作原料的氨基保护基团的例子包括，例如，Z，Boc，t-戊氧基羰基，异冰片基氧基羰基，4-甲氧基苯甲氧基羰基，Cl-Z，Br-Z，金刚烷氧基羰基，三氟乙酰基，邻苯二甲酰基，甲酰基，2-硝基苯基亚磺酰基，二苯基硫膦基和Fmoc。羧基可以例如通过烷基酯化作用(如线性、分支或环状烷基酯化如甲基、乙基、丙基、丁基，t-丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基和2-金刚烷酯)，芳烷基酯化作用(如苄基酯、4-硝基苄基酯、4-甲氧基苄基酯、4-氯苄基酯、二苯甲基酯)，苯甲酰甲基酯化作用，苄氧基羰基酰肼形成，t-丁氧基羰基酰肼形成，或三苯甲基酰肼形成而被保护。丝氨酸的羟基可以通过例如酯化或醚化来保护。适合用于这种酯化的基团，例如可以使用低级烷酰基如乙酰基、芳酰基如苯甲酰基，和来自碳酸的基团如苄氧基羰基和乙氧基羰基。此外，适合用于醚化的基团是，例如苄基、四氢吡喃基、或t-丁基。作为用于酪氨酸的酚羟基的保护基团，例如使用Bzl，Cl₂-Bzl，2-硝基苄基，Br-Z，和t-丁基。作为用于组氨酸咪唑基的保护基团，使用例如Tos，4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基，DNP，苄氧基甲基，Bum，Boc，Trt和Fmoc。

作为原料的活化的羧基，例如，使用对应的酸酐、叠氮化物和活性酯[带有醇的酯(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基酚、氰甲基醇、p-硝基酚、HONB、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt)]。作为原材料的活化的氨基，例如使用对应的磷酰胺。作为去除保护基团(去保护)的方法，使用例如(a)在氢气流下在催化剂如钯黑或钯碳存在下催化还原，(b)用无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或其混合溶液进行酸处理，(c)用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪进行碱处理，或(d)用钠在液氨中还原。上述酸处理去保护通常在温度约-20℃到40℃进行，但在该酸处理中，优选加入阳离子的清除剂(scavenger)，如苯甲醚、苯酚、苯甲硫醚、m-甲酚、p-甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁烷二硫醇，和1，2-乙烷二硫醇。用于组氨酸咪唑保护基的2，4-二硝基苯基通过苯硫酚处理除去。用作酪氨酸吲哚保护基的甲酰基除了通过酸处理在1，2-乙烷二硫醇或1，4丁烷二硫醇存在的条件下去保护，也可以通过用稀释的氢氧化钠溶液、稀释的氨水等碱处理除去。

不应参与原料反应的的官能团的保护，及其保护基团和这些保护基团的去保护和参与反应的官能团的活化可以从已知的基团或已知的方法中合适地选择。作为获得蛋白酰胺的替代方法，例如，通过酰胺化首先保护羧基末端氨基酸的α-羧基，肽(蛋白)链在氨基侧延伸到所需的链长度，制备只有肽链的N端α-氨基的保护基团被除去的蛋白和只有C端羧基的保护基团被除去的蛋白，和在上述混合溶剂中缩合这两种蛋白。缩合反应的细节同上所述。在缩合得到的保护的蛋白纯化后，通过上述方法去除所有保护基团以获得所需的粗蛋白。该粗蛋白通过使用多种已知的纯化方法纯化，主要的级分被冻干，从而产生所需的蛋白酰胺。为获得蛋白的酯部分，羧基末端氨基酸的α-羧基与所需的醇缩合获得氨基酸酯，然后可以根据制备蛋白酰胺相似的方法获得所需的蛋白的酯。当按上述方法获得的蛋白是自由化合物时，其可以通过已知的方法转化为合适的盐，并且反过来，如果获得的蛋白是盐的形式，其可以通过已知的方法转化为自由的化合物。

本发明的Otx2蛋白的部分肽或其盐可以根据已知的肽合成方法制备，或通过合适的肽酶切割本发明的Otx2蛋白而制备。作为合成肽的方法，例如，可以使用任一固相合成方法和液相合成方法。即，所需的肽可以通过将构成本发明Otx2蛋白的部分肽氨基酸与剩余部分缩合，并在产品具有保护基团时去除保护基团而制备。已知缩合和保护基团去保护的方法的例子包括例如下列(a)到(d)描述的方法：(a)M.Bodanszky和M.A.Ondetti，肽合成，Interscience Publishers，NewYork(1966)，(b)Schroeder和Luebke，肽，Academic Press，New York(1965)，(c)Nobuo Izumiya等，碱和肽合成实验，Maruzen(1975)，(d)Haruaki Yajima和Shunpei Sakakibara，生物化学实验教程1，蛋白化学IV，205，(1977)，和(e)药的发展，vol.14，Sequel，肽合成，HaruakiYajima，Hirokawashoten主管。

此外，反应后，本发明的部分肽可以通过常规的纯化方法纯化和分离，例如组合溶剂抽提/蒸馏/柱层析/液相层析/重结晶。当按上述方法获得的部分肽是自由化合物，其可以通过已知的方法转化为合适的盐，并且反过来，如果获得的部分肽是盐的形式，其可以通过已知的方法转化为自由的化合物。

作为本发明使用的编码Otx2蛋白的DNA，可以使用基因组DNA，基因组DNA文库，来自上述细胞/组织的cDNA，来自上述细胞/组织的cDNA文库，和合成DNA中的任意一种。文库中所用的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒和噬菌粒中的任意一种。此外，DNA可以使用从上述细胞/组织制备的总RNA或mRNA级分通过反转录酶聚合酶链式反应(下文中简称为RT-PCR)直接扩增。具体地，编码Otx2蛋白的DNA的例子包括(a)含有SEQ ID NO：2，4或6代表的核苷酸序列的DNA，和(b)含有与SEQ ID NO：2，4或6代表的核苷酸序列在高度严格条件下杂交的核苷酸序列，并编码具有与本发明的Otx2蛋白基本相同的活性性质(如转录活性、视网膜光感受器分化诱导作用等)的Otx2蛋白的DNA。SEQ ID NOS：2和4是编码人Otx2蛋白的DNA(Kastury，K.等，“人EMX和OTX基因的染色体定位”“Chromosome locations of human EMX and OTX genes”，Genomics 22(1)，41-45(1994))，而SEQ ID NO：6是编码小鼠Otx2蛋白的DNA(Simeone，A.等，“发育的rostral脑四个同源盒基因的巢式表达结构域”“Nested expression domains of four homeobox genes in developingrostral brain”，Nature 358(6388)，687-690(1992))。作为能与SEQ ID NO：2，4或6代表的核苷酸序列杂交的DNA，例如，可以使用含有与SEQID NO：2，4或6代表的核苷酸序列具有不少于70％同源性，优选不少于80％同源性，更优选不少于90％同源性，最优选不少于95％同源性的核苷酸序列。杂交可以根据已知的方法或其相似的方法进行，例如，分子克隆第二版J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989描述的方法)。此外，如果使用可商购的文库，杂交可以根据随附的指导手册描述的方法进行。更优选，所述杂交可以在高度严格条件下进行。高度严格条件指，例如，钠浓度为约19到40mM，优选19到20mM，和温度为约50到70℃，优选约60到65℃的条件。具体地，最优选的条件是钠浓度为19mM和温度为65℃。

作为编码本发明所用的部分肽的DNA，可以使用任何含有编码上述本发明的部分肽的核苷酸序列的DNA。或者，可以使用基因组DNA，基因组DNA文库，来自上述细胞/组织的cDNA，来自上述细胞/组织的cDNA文库，和合成DNA中的任意一种。文库中使用的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒和噬菌粒。此外，DNA可以使用从上述细胞/组织制备的mRNA级分通过反转录酶聚合酶链式反应(下文中简称为RT-PCR)直接扩增。具体地，作为编码本发明的部分肽的DNA，例如，待用的多种DNA包括(a)含有SEQ ID NO：2，4或6所示核苷酸序列的DNA的部分核苷酸序列的DNA，和(b)含有在高度严格条件下与SEQ ID NO：2，4或6所示核苷酸序列的DNA杂交的部分核苷酸序列，并编码具有与本发明的Otx2蛋白基本相同的活性性质(如转录活性、视网膜光感受器诱导分化作用等)的Otx2蛋白的DNA，和含有(a)或(b)的部分核苷酸序列的DNA。

尽管本发明使用的编码Otx2蛋白或其部分肽的RNA不是特别限定的，只要其能通过反转录酶表达Otx2蛋白或其部分肽，其还可以通过已知的方法制备。

作为克隆完整编码本发明的Otx2蛋白或其部分肽(下文中一些情况下简称本发明蛋白)的方法，DNA能使用含有本发明蛋白的部分核苷酸序列的合成的DNA引物通过PCR方法扩增，或可以使用编码标记的本发明蛋白的部分或全部区域的DNA片段或合成的DNA通过杂交从整合到合适载体的DNA中选择。杂交的方法可以根据例如，分子克隆第二版J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989描述的方法进行。此外，当使用可商购的文库时，杂交可以根据随附的指导手册描述的方法进行。

DNA核苷酸序列的置换可以使用PCR或已知的试剂盒例如Mutan^TM-superExpress Km(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，或Mutan^TM-K(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)通过已知的方法如ODA-LAPCR方法、缺口双链方法和Kunkel方法或其相似的方法进行。编码本发明蛋白的克隆的DNA可以使用其原来形式，或根据需要通过限制性内切酶消化或添加接头(linker)使用。DNA在5’端具有翻译起始密码子，并在3’端具有TAA，TGA或TAG作为翻译终止密码子。这些翻译起始密码子和翻译终止密码子可以使用合适的合成DNA连接物添加。

编码本发明蛋白质的DNA或RNA(以下有时缩写成本发明DNA)，可以根据下列策略修饰，即，为了使本发明DNA在细胞中更稳定，提高本发明DNA的细胞透性，和减少本发明DNA的毒性，如果有的话。许多象这样的修改是现有技术已知的，并且公开于例如：J.kawakami等，Pharm Tech Japan，vol.8，pp.247，1992；vol.8.pp.395，1992；S.T.Crooke等编，Antisense Research and Applications，CRCPress，1993。本发明DNA可以DNA被胶囊包在脂质体或微球体内的特殊形式使用。此外，碱以外的其他物质可以被加到本发明DNA。其他物质的例子包括糖；酸或碱；例如起中和磷酸根电荷作用的聚赖氨酸的聚阳离子化合物；能够提高与细胞膜的相互作用，或增加核酸吸收的疏水性物质，如脂类(如磷脂、胆固醇等)。更优选的待添加的脂类的例子包括胆固醇和其衍生物(例如胆固醇基氯代甲酸酯，胆酸，等)。如上所述其他的物质可以附于核酸3’末端或5’末端，并且可以通过碱、糖或分子内的核苷键连接。本发明DNA可以在末端以化学方法修饰。这样的末端修饰的基团的例子包括具体安排在3’-端或5′-端的核酸上的加帽基团，其抑制由于核酸酶例如核酸外切酶和RNase引起的降解作用。这样的加帽基团的例子包括现有技术已知的羟基保护基，包括乙二醇例如聚乙二醇和四甘醇，尽管不限制于此。

作为用于本发明的包含编码Otx2蛋白或它的部分肽的DNA或RNA的重组载体，能够表达Otx2蛋白或其部分肽的表达载体是优选的。

本发明蛋白的表达载体可以通过下列方法制备(i)从例如cDNA切除包含编码本发明蛋白的DNA片段和(ii)在合适的表达载体的启动子下游方向连接该DNA片段。

作为上述表达载体，使用了大肠杆菌(Escherichia coli)衍生的质粒(例如pCR4，pCR2.1，pBR322，pBR325，pUC12，pUC13)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)-衍生的质粒(例如pUB110，pTP5，pC194)，酵母衍生的质粒(例如pSH19，pSH15)，噬菌体例如λ噬菌体，病毒例如逆转录病毒，腺病毒，慢病毒，痘苗病毒和杆状病毒和，另外，pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，和pcDNAI/Neo。其中，作为用于本发明的载体，病毒是优选的，并且逆转录病毒，腺病毒和慢病毒是更优选的。

作为如上所述的启动子，任何启动子都可使用，只要其是对应于用于基因表达的宿主的合适启动子。例如，当动物细胞被用作宿主时，这样的启动子的例子包括SRα启动子，SV40启动子LTR启动子时，CMV启动子，和HSV-TK启动子。其中优选的是使用LTR启动子，CMV启动子，或SRα启动子。当宿主是埃希氏杆菌属的细菌时，trp启动子，lac启动子，recA启动子，λP_L启动子，和lpp启动子是优选的。当宿主是杆菌属细菌时，SPO1启动子，SPO2启动子和penP启动子是优选的。当宿主是酵母时，PHO5启动子，PGK启动子，GAP启动子，和ADH启动子是优选的。当宿主是昆虫细胞时，多角体蛋白启动子，和P10启动子是优选的。

作为表达载体，可用的表达载体任选包含，除了上述元件之外，增强子，剪接信号，多聚腺苷酸附加信号，帽结构，蛋白质合成起始信号，选择性标识物，标记标识物，和SV40复制起点。

选择性标识物的例子包括二氢叶酸还原酶(以下有时缩写成dhfr)基因[氨甲蝶呤(MTX)抗性]，氨苄青霉素抗性的基因(以下有时缩写成Amp^r)，和新霉素抗性的基因(以下有时缩写成Neo^r，G418抗性)。特别地当使用dhfr基因缺陷的中国仓鼠细胞CHO时，dhfr基因被用作选择性标识物，目的基因可以在不包含胸腺嘧啶核苷的培养基上来选择。

作为标记标识物，碱性磷酸酶(以下有时缩写成AP)基因，和绿色荧光蛋白蛋白(GFP)基因可以是优选使用的。

此外，适合于宿主的信号序列可以任选被添加到表达载体上。当宿主是埃希氏杆菌属属的细菌时，可以使用PhoA信号序列，和OmpA信号序列。当宿主是杆菌属的细菌时，可以使用α-淀粉酶信号序列，和枯草蛋白酶信号序列。当宿主是酵母时，可以使用MFα信号序列，和SUC2信号序列。当宿主是动物细胞时，可以使用胰岛素信号序列，α-干扰素信号序列和抗体分子信号序列。

当病毒被用作载体时，为了提高翻译机制，优选安排IRES(内部核糖体结合部位)序列作为蛋白合成起始信号。

通过向宿主引入如此构建的包含编码本发明蛋白的DNA的表达载体，可以制备转化子。

作为宿主，例如使用埃希氏杆菌属细菌，杆菌，酵母，昆虫细胞，昆虫，和动物细胞。作为埃希氏杆菌属细菌的具体实施方式，使用大肠杆菌K12/DH1(Proc.Natl.Aced.Sci.USA，vol.60，160(1968))，JM103(Nucleic acids Research，vol.9，309(1981))，JA221(Journal of MolecularBiology vol.120，517(1978))，HB101(Journal of Molecular Biology，vol.41，459(1969))，C600(Genetics，vol.39，440(1954))，DH5α((InoueH.，Nojima，H.和Okayama H.，Gene，96，23-28(1990))，和DH10B(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.87，4645-4649(1990)。作为杆菌，例如使用枯草芽孢杆菌MI114(Gene，vol.24，255(1983))，和207-21(Journal of Biochemistry，vol.95，87(1984))。作为酵母，例如使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913，NCYC2036和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)。

作为昆虫细胞，例如当病毒是AcNPV时，使用来自甘蓝夜蛾(cabbage armyworm)幼虫的现成细胞(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞；Sf细胞)，来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)中肠的MG1细胞，来自粉纹夜蛾卵的High Five^TM细胞，来自甘蓝夜蛾(mamestrabrassicae)的细胞和来自estigmena acrea的细胞。当病毒是BmNPV时，使用来自蚕的现成细胞(家蚕Bombyx mori N；BmN细胞)。作为所述的Sf细胞，例如，使用Sf9细胞(ATCC CRL1711)，和Sf21细胞(Vaughn，J.L.等In Vivo，13，213-217，(1977))。作为昆虫，例如，使用蚕幼虫(Maeda等，Nature，vol.315，592(1985))。作为动物细胞，例如使用猴细胞(COS-7，Vero，中国仓鼠细胞CHO(以下缩写成CHO细胞)，dhfr基因-缺陷的中国仓鼠细胞CHO(以下缩写CHO(dhfr)细胞，小鼠L细胞，小鼠AtT-20小鼠骨髓瘤细胞，大鼠GH3，和人FL细胞。

为了转化埃希氏杆菌属细菌，转化可以根据例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.69，2110(1972)或Gere，vol.17，107(1982)描述的方法进行。为了转化杆菌，转化可以根据例如在Molecular & GeneralGenetics，vol.168，111(1979)描述的方法进行。为了转化酵母，转化可以根据例如在Methods in Enzymology vol.194182-187(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.75，1929(1978)描述的方法进行。为了转化昆虫细胞或昆虫，转化可以根据例如在Bio/Technology，vol.6，47-55(1988)描述的方法进行。为了转化动物细胞，转化可以根据例如在Cell Technology separate volume 8 New Cell Technology ExperimentalProtocol，263-267(1995)(published by Shujunsha)，Virology，vol.52，456(1973)描述的方法进行。象这样，获得转化有包含编码本发明蛋白的DNA的表达载体的转化子。当宿主为埃希氏杆菌或杆菌的转化子被培养，适合的培养基是液体培养基，其中包含碳源、氮源、无机物及其他转化子生长要求的添加剂。碳源的例子包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉和蔗糖，氮源的例子包括无机物或有机物例如铵盐、硝酸盐，玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆饼粉和马铃薯浸出物，和无机物的例子包括氯化钙、磷酸二氢钠、和氯化镁。此外，可以添加酵母浸出物、维生素，和生长促进因子。理想地，培养基pH是大约5到8。

作为培养埃希氏杆菌的培养基，例如，包含葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培养基(Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1972)是优选的。此处，为了使启动子有效地作用，例如，如果需要，可以添加药例如3-β吲哚基丙烯酸。当宿主是埃希氏杆菌时，培养通常是在大约15℃到43℃进行大约3到24小时，并且必要时，可以进行通气或搅拌。当宿主是杆菌时，培养通常在约30-40℃进行6-24小时，并且如果需要，可进行通气或搅拌。当培养宿主是酵母的转化子时，培养基的例子包括Burkholder基本培养基(Bostian，K.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.77，4505(1980))，和包含0.5％酪蛋白氨基酸的SD培养基(Bitter，G.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.81，5330(1984))。优选调节培养基pH到大约5到8。培养通常在20℃到35℃进行大约24到72小时，并且必要时可以任选进行通气或搅拌。

当培养宿主是昆虫细胞或昆虫的转化子时，使用其中添加剂例如固定的10％牛血清被适当地加到Grace氏昆虫培养基(Grace T.C.C.，Nature，vol.195，788(1962))的培养基作为培养基。优选调节培养基pH到大约6.2到6.4。培养通常通常在大约27℃进行大约3-5天，并且必要时可以任选进行通气或搅拌。当培养宿主是动物细胞的转化子时，使用例如包含大约5到20％胎牛血清的MEM培养基(Science，vol.122，501(1952))，DMEM培养基(Virology，vol.8，396(1959))，RPMI 1640培养基(The Journal of the American Medical Association，vol.199，519(1967))，和199培养基(Proceeding of the Society for theBiological Medicine，vol.73，1(1950))。优选的pH是大约6到8。培养通常在30℃到40℃进行大约15到60小时，并且必要时可以进行通气或搅拌。如上所述，本发明的蛋白可以在转化子的细胞，细胞膜或细胞外生产。

为了从培养液分离和纯化本发明的蛋白，例如，分离和纯化可以通过下列方法完成。当本发明的蛋白从培养的细菌细胞或细胞提取时，通过已知的方法在培养之后适当地使用收集细菌细胞的方法，将这些细胞悬浮在合适的缓冲液中，通过超声、溶菌酶和/或冻/融破裂这些悬浮的细胞，并通过离心作用或过滤获得蛋白的粗提物，等等。缓冲液中可以包含蛋白变性剂如尿素和盐酸胍，或表面活性剂如TritonX-100^TM。当蛋白分泌在培养液中，在培养完成以后，细菌细胞或细胞与培养上清液通过已知的方法分离，并且收集培养上清液。包含在所得提出物或培养上清液中的蛋白的纯化可以通过与已知分离/纯化方法的合适组合来完成。作为已知的分离或纯化方法，使用利用溶解度的方法例如盐析和溶剂沉淀法；主要地利用分子量差异的透析方法，超滤方法，凝胶过滤方法，和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法；利用电荷差异的方法例如离子交换色谱法；利用特异性亲合力的方法例如亲和色谱法；利用疏水性差异的方法例如反相高效液相色谱法；利用等电点差异的方法例如等电点电泳法。

当如此获得的蛋白以游离态生产时，其可以通过已知的方法或类似的方法转化成盐，并且反之，当获得的蛋白为盐，其可以通过已知的方法或类似的方法转化成游离态或其他的盐。通过在纯化前和纯化后对转化子产生的蛋白用合适的蛋白修饰酶作用，可以进行任意的修饰或可以部分地除去多肽。作为蛋白修饰酶，使用胰蛋白酶，糜蛋白酶，精氨酰肽链内切酶、蛋白激酶和糖苷酶。

通过表达Otx2蛋白，或通过增加Otx2蛋白的表达量，可以诱导分化成视网膜感光细胞。具体地，例如，在来自眼球组织细胞，胚胎的干细胞，神经干细胞或神经前体细胞中，上述的细胞可以通过表达Otx2蛋白或通过增加Otx2蛋白的表达量而诱导分化成视网膜感光细胞。为此，(a)Otx2蛋白或其部分肽、或其盐，或(b)编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA可以被用作诱导分化成视网膜感光细胞的药剂。

“诱导分化成视网膜感光细胞”可以在体内或离体发生。也就是说，本发明诱导分化成视网膜感光细胞的药剂可以对活体给药以体内诱导分化成视网膜感光细胞。或者，本发明的诱导分化成视网膜感光细胞的药剂可离体适用于，例如，在来自眼球组织细胞，胚胎的干细胞，神经干细胞或神经前体细胞，以及上述细胞可被诱导组成视网膜感光细胞。更具体地说，本发明的DNA被引入来自眼球组织的细胞，胚胎干细胞，神经干细胞神经的前体细胞，并且培养得到的细胞从而诱导细胞分化成视网膜感光细胞。在引入本发明DNA时，可以共同地引入其他的基因。其他基因的例子包括视网膜特异性同源盒基因。视网膜特异性同源盒基因的例子包括在眼区具有特异的表达模式，并调节该区域特异的模式形成的基因，和涉及在发育过程中差异表达的基因。具体的例子包括Crx，Chx10，Pax6，和Rax。

优选的“眼球组织”的例子包括视杯内层组织。这样的组织可以来源于成年人，或可以来源于胚胎期个体。“来自眼球组织的细胞”的例子包括胎儿神经视网膜，睫状体细胞例如睫状体色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞，睫状体上皮细胞，和虹膜细胞。

来自眼球组织的细胞可以例如通过处理用分散酶或EDTA以合适的方法分离的组织，随后用胰蛋白酶处理组织分成单个细胞，进一步在合适的培养基中培养细胞至汇合，并且将获得的细胞用胰蛋白酶和胶原酶处理。此处，当为收集细胞进行培养时，可以使用例如，包含碱性成纤维细胞生长因子的培养基，包含上皮细胞生长因子的培养基，和包含ILF(白细胞迁移抑制因子)的培养基。含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基的例子包括含bFGF的无血清培养基，更具体地说，是含N₂补充成分的DMEM/F12。这样的培养基中bFGF的含量不小于大约10ng/ml，优选不少于大约20ng/ml，更优选不少于大约40ng/ml。N₂补充成分的例子包括大约5μg/ml胰岛素，大约100μg/ml转铁蛋白，大约20nM黄体酮，大约100μM合适的培养基中趋于汇合的培养细胞，和大约30nM硒酸钠。培养条件例如温度、氧浓度和二氧化碳浓度可以恰当地设置，取决于细胞。

神经干细胞或神经前体细胞可以源于来自眼球组织的细胞，或胚胎的干细胞，或可以源于其他的细胞或组织。具体的例子包括来自胎儿视网膜的神经干细胞，来自成人睫状体的视网膜的干细胞，来自虹膜的视网膜的干细胞，来自脑的神经干细胞，视网膜前体细胞，和来自虹膜的神经前体细胞。

从来自眼球组织的细胞或胚胎干细胞或其他细胞或组织中诱导神经干细胞或神经前体细胞的方法可以根据已知的方法进行。例如，从胚胎干细胞中诱导神经干细胞或神经前体细胞方法的例子包括在例如，Kawasaki，Sasai等的参考文献(Kawasaki，H.，Sasai Y.，Neuron.，2000Oct；28(1)：31-40)描述的方法。关于培养和维持胚胎的干细胞的条件，例如，可以参考“Molecular Biology Protocol”(由Nankodo出版)。有时候，神经干细胞或神经前体细胞是作为包含这些细胞的神经球(neural sphere)而获得的，但是在本发明中，这样的神经球可以进行下列操作。

向来自眼球组织的细胞、胚胎干细胞、神经干细胞或神经前体细胞，优选神经干细胞或神经前体细胞中引入本发明的DNA和任选的其他基因的方法不是特别限定的，而是可以使用过已知的方法，这样的方法的例子包括借助于腺病毒载体引入基因的方法，借助于逆转录病毒载体引入基因的方法，借助于腺伴随病毒、脂质转染法和电穿孔引入基因的方法。从引入效率的角度，优选借助于腺病毒载体引入基因的方法和借助于逆转录病毒载体引入基因的方法。

其中引入有基因的细胞在适合于分化成视网膜感光细胞的分化诱导条件下培养。由于分化诱导的不同条件取决于其中引入有基因的细胞种类，该条件起初不能设定并且是可以恰当选择的。例如，分化诱导条件的例子包括在视黄酸和血清存在下培养。此处，可用于培养的培养基的例子包括上述的含N₂补充成分的DMEM/F12培养基。合乎需要是使用的视黄酸量不小于大约0.1μM，优选不少于大约0.5μM，和不超过大约10μM，优选不超过大约5μM。此外，合乎需要的是诱导分化时使用的血清量为大约1％。另外，培养条件例如温度，氧浓度，和二氧化碳浓度可以取决于引入有基因的细胞而恰当地设置。

按照本发明上述的分化诱导方法获得的视网膜感光细胞可以用于患视网膜退化病例如色素性视网膜炎，老年性黄斑变性，视网膜剥离，青光眼和视网膜血管阻塞病人的细胞移植。该移植细胞不但可以是已经完全地分化成视网膜感光细胞的细胞，而且可以是分化成视网膜感光细胞前的前体细胞。

为此，Otx2蛋白其部分肽或其盐，或编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA可以被用作药物，例如预防、治疗或抑制视网膜病发展的药剂。“视网膜病”的例子包括来源于系统性疾病如糖尿病、高血压、动脉硬化、贫血、白血病、系统性红斑狼疮，和结缔组织疾病如硬皮病的视网膜血管失调和视网膜的炎性和变性损伤；和先天代谢病例如Tay-Sack病和Vogt-Spielmeyer病，及包括视网膜血管失调的局部视网膜疾病例如视网膜病早熟、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞和视网膜静脉周炎；来源于视网膜剥离和外伤的视网膜的发炎和变性；衰老-有关视网膜变性疾病例如老年的黄斑盘状变性；和先天的视网膜变性疾病。特别地，本发明的预防，治疗或抑制视网膜疾病发展的药剂可以特别有效地用于先天的视网膜变性病、色素性视网膜炎、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、视网膜剥离、青光眼或视网膜的血管阻塞。

当本发明蛋白被用作预防/治疗/抑制上述视网膜疾病发展的药剂时，该蛋白可以用常规的方法配制成制剂。另一方面，当本发明的DNA被用作预防/治疗/抑制视网膜疾病的药剂时，本发明这样的DNA单独，或在DNA被插入到合适的载体例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺病毒相关的病毒载体中以后，可以根据常规的方法配制成制剂。本发明DNA利用基因枪或例如水凝胶导管的导管可以按照原样施用或与促进吸收的辅助物一起施用。

例如，本发明蛋白或本发明DNA可以作为优选有糖衣的药片、胶囊、酏剂或微胶囊口服，或可以以例如与水或其他药用液体的无菌溶液或悬浮液的注射剂形式肠胃外施用。本发明的制剂可以通过，例如将本发明蛋白或本发明DNA与生理可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、稳定剂或粘合剂混合而制备。

可以混合于药片或胶囊中的添加剂的例子包括粘合剂例如明胶、玉米淀粉、黄芪胶、和阿拉伯树胶；赋形剂例如晶状纤维素；膨胀剂例如玉米淀粉、明胶、和藻酸；润滑剂例如硬脂酸镁；甜味剂例如蔗糖、乳糖和糖精；调味剂例如胡椒薄荷、akamono(Gaultheria adenothrix)油、和樱桃酒。就胶囊而言，可以另外地包含液体载体如油和脂。注射用的无菌组合物可以根据常规的剂型例如活性成分在水溶液或油性溶液中形成的溶出或悬浮体系的方法进行配制。作为用于注射的水溶液，使用例如，包含生理盐水、葡萄糖及其他助剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等等)的等渗溶液，并可以共同使用合适的增溶剂例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、和非离子表面活性剂(例如polysorbate 80(商标)、HCO-50)。作为油性溶液使用，例如，芝麻油和豆油，也可以同时使用苯甲酸苄酯和苄醇增溶剂。另外，该无菌组合物可以包含，例如缓冲液(例如磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液)，抚慰剂(例如氯化苯甲烃铵、盐酸普鲁卡因)，稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇)，防腐剂(例如苯甲醇、苯酚)，和抗氧化剂。制备的该无菌组合物通常填充到合适的安瓿中，并且作为注射剂提供。

由于如此获得的制剂是安全的和低毒的，其可以施用到，例如，哺乳动物(例如人、大鼠、小鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。由于本发明蛋白或本发明DNA的剂量的变化取决于施用的对象、器官对象、症状和施用途径，其通常不能确定，但就肠胃外给药来说，剂量为大约每天0.01到10mg/kg，优选大约0.05到5mg/kg。

优选的是，本发明用于预防/治疗/抑制视网膜疾病发展的药剂局部地施用到眼。这样用于局部用药到眼的制剂剂型的例子包括滴眼剂、眼用软膏、粉末、颗粒、药片、胶囊和注射剂。特别地，适合的是该剂型是以滴眼剂(例如水状滴眼剂、滴眼剂的水悬浮液、非水的滴眼剂、或非水的滴眼剂悬浮液)、眼用软膏和注射剂的形式。这样的制剂可以是根据常规方法制备的。

用于制备滴眼剂的水溶液或悬浮液稀释剂的例子包括蒸馏水和生理盐水。此外，用于非水溶液或悬浮液的稀释剂的例子是植物油、液体石蜡、矿物油、丙二醇和p-辛基十二醇。此外，各种添加剂例如通常能够混合在滴眼剂中的缓冲液、等渗剂、防腐剂、增稠剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂和螯合剂可以恰当地混合在本发明的滴眼剂中。这样的滴眼剂制备通过无菌操作或通过灭菌处理在合适的阶段进行。

添加上述缓冲液是为了维持pH恒定，例如在大约5.0到8.0。例如，使用硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液。添加这些缓冲液是为了增加缓冲，也就是说，它们在维持pH恒定的范围内添加，例如在上述的范围之内。添加等渗剂是为了与泪液等渗，这样的等渗剂的例子包括糖类例如葡萄糖、甘露醇和山梨糖醇；多元醇例如甘油、聚乙二醇和丙二醇；以及盐例如氯化钠和柠檬酸钠。这些等渗剂以滴眼剂的渗透压力相当于泪液的量加入。此外，作为防腐剂，使用例如氯化苯甲烃铵、对羟苯甲酸和氯代丁醇。上述增稠剂的例子包括甘油、羧甲基纤维素和聚羧乙烯。上述稳定剂的例子包括亚硫酸钠，和丙二醇，上述抗氧化剂的例子包括抗坏血酸、抗坏血酸钠、生育酚和硫代硫酸钠，上述pH调节剂的例子包括盐酸、柠檬酸、磷酸、乙酸、酒石酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸氢钠，上述螯合剂的例子包括乙二胺四乙酸钠和柠檬酸钠。此外，滴眼剂可以冻干成为在使用前溶解于蒸馏水用于注射的形式。

眼用软膏可以在无菌条件下通过将活性成分混合到正常使用眼用软膏的基质中而制备，随后根据常规方法而制备。用于眼用软膏的基质的例子包括凡士林、zelen 50、plastibase和聚乙二醇，此外，为了增强亲水性，可以添加表面活性剂。而且，就眼用软膏而言，必要时，也可以混合上述的添加剂，例如防腐剂。

此外，局部的眼科用药的制剂使用在眼内控制Otx2蛋白或其部分肽或编码它们两者之一的DNA释放的缓释物质可以配制成为缓释制剂、DDS(药物递送)制剂或眼内植入制剂。控制释放的物质的例子包括通过非催化剂脱水缩聚作用从一种或多种α-羟基羧酸(例如glycholic acid、乳酸、羟丁酸等)、羟基二羧酸(例如苹果酸等)、和羟基三羧酸(例如柠檬酸等)合成的本身已知的聚合体，共聚物或其混合物，和可生物降解的聚合物例如聚α氰基丙烯酸酯、聚氨基酸(例如聚-γ-苯甲基-L-谷氨酸等)，和基于马来酐共聚物(例如苯乙烯-马来酸共聚物等)。

一般而言，不可能建议本发明用于局部眼科给药的制剂的剂量和给药频率，因为其变化取决于给药对象、症状、剂型和治疗的时期。通常，就滴眼剂来说，包含0.001到10.0w/v％，优选0.01到1.0w/v％的本发明蛋白或本发明DNA的制剂可以每天若干次施用到成人，优选每眼每天1到6次，每次数滴，优选每次使用1到4滴。就眼用软膏来说，含0.001到10.0w/w％，优选0.01到1.0w/w％的本发明蛋白或本发明DNA的制剂可以数次施用到成人，优选每天1到6次。

在本发明中，视网膜疾病的诊断可以通过在检测溶液中检测Otx2蛋白或其部分肽、或其盐(以下有时缩写成本发明蛋白)，或测量其量来完成。例如，当检测到本发明蛋白浓度减少时，可以诊断出，例如此人存在正患视网膜疾病，或将来可能患视网膜疾病的高可能性。由于Otx2蛋白或其部分的肽或其盐的抗体(以下有时候缩写成本发明抗体)可以特异性识别本发明蛋白，其可被用于测试溶液中本发明蛋白的的检测和定量。也就是说，本发明抗体能被用作视网膜疾病的诊断试剂。在诊断试剂中，可以使用抗体分子本身，或还可以使用抗体分子的F(ab’)₂、Fab’或Fab片段。或者，测试溶液中的本发明蛋白可以通过组织染色而检测。

本发明抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，只要它是能够识别本发明蛋白的抗体。本发明抗体可以使用本发明蛋白作为抗原根据已知的制备抗体或抗血清的方法制备。

用于制备本发明蛋白的单克隆抗体的方法如下所述。

(i)首先描述生产单克隆抗体的细胞的制备。本发明蛋白本身或与载体或稀释剂一起在可以产生抗体的位置施用到哺乳动物。为了增强施用后的抗体生产能力，可以施用完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。给药通常以每2到6周一次进行，总共2到10次。使用的哺乳动物的例子包括猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊和山羊，小鼠或大鼠是优选的。在制备生产单克隆抗体的细胞后，生产单克隆抗体的杂交瘤的制备方法是从温血动物，例如免疫过抗原的小鼠选择识别抗体滴度的个体，在最后一次免疫后2-5天收集脾或淋巴结，并且将其中含有的生产抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合。抗体血清中抗体滴度的测定可以，例如通过将后面描述的标记的蛋白与抗血清反应，并且测量结合到抗体的标记试剂的活性而完成。融合操作可以根据已知的方法进行，例如，Kohler和Milstein方法(Nature，vol.256，p.495(1975))。融合促进剂的例子包括聚乙二醇(PEG)和仙台病毒。优选使用PEG。骨髓瘤细胞的例子包括NS-1、P3U1和SP2/0，其中P3U1是优选的。抗体生产细胞(脾细胞)与使用的骨髓瘤细胞的数目比大约1∶1到20∶1，PEG(优选，PEG1000到PEG6000)以大约10到80％的浓度添加，并在大约20到40℃，优选大约30到37℃保温大约1到10分钟，从而有效地制备融合细胞。

为筛选生产单克隆抗体的杂交瘤，可以使用各种方法，包括(a)方法：将杂交瘤培养上清液加到其上直接吸附抗原，如本发明蛋白或与载体一起吸附的固相(例如微量培养板)上，随后加抗免疫球蛋白抗体(当用于细胞融合的细胞是小鼠时，使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或标记有放射性物质或酶的蛋白A，并检测结合到该固相的单克隆抗体，和(b)方法：将杂交瘤培养上清液加到其上吸附了抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相上，加入标记有放射性物质或酶的本发明蛋白，并检测结合到该固相的单克隆抗体。单克隆抗体的选择可以根据已知的方法或类似的方法完成，这样的选择通常在添加了HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)的动物细胞培养基上完成。作为选择和培养的培养基，可以使用任何培养基，只要可以生长杂交瘤。例如，可以使用含大约1到20％，优选大约10到20％胎牛血清的RPMI1640培养基，含大约1到10％胎牛血清(由Wako Pure Chemical Industries Co.，Ltd生产)的GIT培养基和杂交瘤培养的无血清培养基(SFM-101，由NissuiPharmaceutical Co.Ltd生产)。该培养温度通常大约20到40℃，优选大约37℃。培养时间为大约5天到3周，优选大约1周到2周。培养通常在5％二氧化碳条件下进行。杂交瘤培养上清液的抗体滴度可以如上述抗血清的抗体滴度测定方法进行测定。

(ii)然后分离和纯化单克隆抗体。单克隆抗体的分离和纯化可以根据分离和纯化免疫球蛋白的方法[例如盐析法、醇沉淀法、等电沉淀方法、电泳法、离子交换剂吸附和解吸附方法(例如DEAE)、超离心方法、凝胶过滤方法、和利用结合到固相的抗原或例如蛋白A或蛋白G的活性吸附剂只收集抗体，然后释放结合以获得抗体的特异性纯化方法]像传统的分离和纯化多克隆抗体一样完成。

下面描述制备本发明蛋白的多克隆抗体(以下有时候缩写成“本发明多克隆抗体”)。

本发明多克隆抗体可以根据已知的方法或其类似的方法制备。例如，抗体的制备方法是制备免疫抗原(本发明蛋白等)和载体蛋白的复合物，以上述的方法免疫的制备方法哺乳动物制备单克隆抗体，从免疫的动物收集含抗本发明蛋白成分的抗体，并分离和纯化抗体。关于用来免疫哺乳动物的免疫抗原与载体蛋白的复合物，载体蛋白的种类，和载体与半抗原的混合比例不是特别限定的，只要针对通过交联有载体而免疫的半抗原可以有效地生产抗体。例如，使用以相对于半抗原大约0.1到20，优选大约1到5偶联牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、匙孔血蓝蛋白的重量比的方法。此外，为使半抗原与载体偶联，可以使用各种的缩合剂，包括戊二醛、碳化二亚胺、顺丁烯二酰亚胺活性酯、和含硫醇基或二硫代吡啶基的活性酯试剂。来自半抗原和载体本身或与载体和稀释剂一起的缩合产物在能产生抗体的位置被施用到温血动物。为了增强给药后的抗体生产能力，可以施用完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。给药通常以大约每2到6周一次进行，总共大约3到10次。多克隆抗体可以从血液或腹水收集，优选从通过上述的方法免疫的哺乳动物血液收集。抗血清中多克隆抗体滴度可以如上述抗血清的抗体滴度测定方法测定。多克隆抗体的分离和纯化可以根据上述分离和纯化单克隆抗体相类似的分离和纯化免疫球蛋白的方法完成。

使用本发明的抗体定量测定本发明蛋白的方法不是特别限定的，但这样的方法的例子包括在检测溶液中通过化学的或物理的方法检测抗体的量、相当于抗原量(本发明蛋白量，等)的抗原或抗体-抗原复合物的量，利用含已知量的抗原的标准溶液产生标准曲线，并基于该标准曲线从检测值计算检测溶液中的抗原量。例如，nephrometry、竞争法、免疫测定法和夹心法是优选使用的，但从灵敏度和专一性的角度来看，特别优选使用后面描述的夹心法。用于使用标记物质的定量方法的标记试剂包括，例如放射性同位素、酶、荧光物质和发光物质。例如(¹²⁵I)、(¹³¹I)、(³H)和(¹⁴C)用作放射性同位素。作为酶，使用稳定的和具有大的比活性的酶是优选的，例如使用β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。作为荧光物质，使用例如荧光胺和异硫氰酸荧光素。作为发光物质，使用鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素和光泽精。此外，生物素-亲和素体系可以被用来结合带有标记试剂的抗体或抗原。

当上述的定量方法中抗原或抗体不溶解时，可以使用物理吸附方法，或可以使用通常被用来使蛋白或酶不溶/固化蛋白或酶的化学结合方法。作为载体，使用例如不溶解的多糖例如琼脂糖、右旋糖酐和纤维素；合成树脂例如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅树脂；以及玻璃。在夹心法中，测试溶液中本发明蛋白量的定量测定方法是将不溶解的本发明单克隆抗体与测试溶液反应(初级反应)，此外反应标记的本发明单克隆抗体(次级反应)，并测量不溶解的载体上标记的试剂活性。初级反应和次级反应可以以相反顺序进行，或可以同时进行。标记试剂和使之不溶解的方法同如上所述。此外，在通过夹心法免疫定量方法中，用于固相抗体或标记抗体的抗体不必是一种，当改善测量灵敏度的目的可使用两种或多种抗体的混合物。在通过夹心法定量本发明蛋白方法中，作为用于初级反应和次级反应的本发明单克隆抗体，优选使用具有与本发明蛋白不同的结合位点的抗体。也就是说，用于初级反应和次级反应的抗体是这样的抗体，例如，当用于次级反应的抗体识别本发明蛋白的一部分的C末端时，优选在初级反应中使用识别除了该C末端之外的部分，例如N-末端部分的抗体。

本发明单克隆抗体还可以用于除了夹心法之外的定量方法，例如竞争法、免疫测定法和nephrometry。在竞争法中，测试溶液中的抗原和标记抗原竞争性与抗体反应，分离未反应的标记抗原(F)和结合有抗体的标记抗原(B)(B/F分离)，测量B或者F的标记量，从而定量测试溶液中抗原的量。具体地，本发明方法的例子包括(a)可溶性抗体用作抗体，和使用聚乙二醇和该抗体的第二抗体完成B/F分离的液相方法，和(b)使用固相抗体作为第一抗体，或使用可溶性抗体作为第一抗体，和固相抗体作为抗体的固相方法。在免疫测定方法中，在测试溶液中的抗原和固相抗原竞争性对恒定量的标记抗体反应以后，分离固相和液相，或反应测试溶液中的抗原和过量的标记抗体，然后加入固相抗原以使未反应的标记抗体结合到固相，以及分离该固相和液相。然后，为了定量测量测试溶液中的抗原量，对任何阶段的标记抗体的量进行测量。此外，在nephrometry中，测量凝胶或溶液中作为抗原抗体反应结果产生的不溶性沉淀物的量。如果测试溶液中抗原的量小，并且仅获得少量的沉淀物，优选使用激光散射的激光nephrometry。

当个体免疫定量方法适用于本发明时，可以根据各方法的常规条件将本领域专业人员认为的一般技术加到操作方法中。这些通用技术方法的细节、综述和书可以参考(例如“Radioimmunoassay”由HiroshiIrie编(Kodansha，1974出版)；分册“Radioimmunoassay”由Hiroshi Irie编(Kodansha，1979出版)；“Enzyme Immunoassay”由Eiji Ishikawa等编(Igakushoin，1978出版)；“Enzyme Immunoassay”由Eiji Ishikawa编辑(第二版)(Igakushoin，1982出版)；“Enzyme immunoassay”由EijiIshikawa等编(第三版)(Igakushoin，1987出版)；“Methods inENZYMOLOGY”，Vol.70(Immunochemical Techniques(A部分))；同上Vol.73(Immunochemical Techniques(B部分)；同上Vol.74(Immunochemical Techniques(C部分))；同上Vol.84(ImmunochemicalTechniques(D部分：Selected Immunoassays)；同上Vol.92(Immunochemical Techniques(E部分：Monoclonal antibodies and GeneralImmunoassay Methods))；同上Vol.121(Immunochemical Techniques(I部分：Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(全部由Academic Press出版)。

本发明抗体还可以用于制备用来纯化本发明蛋白的抗体柱，在纯化的各级分检测本发明蛋白，或分析本发明蛋白在测试细胞中的行为。

由于本发明DNA，或含与本发明DNA的核苷酸序列互补或基本上互补的核苷酸序列的反义多核苷酸能被用作探针，因而可以在活体内检测编码本发明蛋白或其部分肽的DNA或mRNA的异常(基因异常)，特别地在哺乳动物的活体(例如人、大鼠、小鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)，它们用作例如DNA或mRNA损害，或突变或表达减少的遗传诊断的试剂。使用本发明DNA或反义多核苷酸的遗传诊断可以通过例如已知的Northern杂交或PCR-SSCP方法(Genomics，vol.5，p.874-879(1989)，Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA，vol.86，p.2766-2770(1989))完成。例如，当通过Northern杂交检测到编码本发明蛋白或其部分肽的mRNA表达减少时，可以诊断出对象有患视网膜疾病，或将来患视网膜疾病的高可能性。

“反义多核苷酸”是具有与本发明DNA的核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列，并能够与本发明DNA杂交的多核苷酸。因此，反义多核苷酸不但是包括与本发明DNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列的部分，而且是与本发明DNA的核苷酸序列基本互补的核苷酸序列的部分。反义多核苷酸的例子包括的部分包含与本发明DNA在高度严格条件下杂交的核苷酸序列。这些反义多核苷酸的例子包括除该上述多核苷酸之外的其他类型多核苷酸，比如包含2-脱氧-D-核糖的多脱氧核苷酸，含D-核糖的多核苷酸，和包含嘌呤或嘧啶碱基的N-葡糖苷的部分；其他具有非核苷酸骨架的聚合物(例如，可商购的蛋白核酸，和具有特定合成序列的核酸聚合物)；和其他具有特定键的核酸聚合物(假定该聚合物含允许DNA或RNA中发现的碱基配对或碱基插入的序列安排的核苷酸)。这些可以是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA或DNA/RNA杂合体，并可以是未修饰的多核苷酸(或未修饰的寡核苷酸)，或添加修饰的已知的修饰多核苷酸(或修饰的寡核苷酸)。修饰的多核苷酸的例子包括在现有技术中已知的具有标记物的多核苷酸、有帽多核苷酸、甲基化的多核苷酸、其中一个或多个天然的核苷酸被类似物置换的多核苷酸、分子内的核苷酸修饰的多核苷酸、具有非电荷键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等)的多核苷酸、带有电荷的键或含硫的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯)的多核苷酸、具有蛋白(核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸)或糖类(例如单糖)作为侧基的多核苷酸、具有嵌入(intercalent)化合物(例如吖啶、solarene等)的多核苷酸、包含螯合物(例如金属、放射性金属、硼、氧化的金属等)的多核苷酸、包含烷化剂的多核苷酸和具有修饰的键(例如-异头物类型的核酸)的多核苷酸。此处，“核苷”、“核苷酸”和“核酸”可以不仅包含嘌呤和嘧啶碱基，而且可以包含其他修饰的杂环碱基。这些修饰的部分可以包含甲基化的嘌呤和甲基化的嘧啶，酰化的嘌呤和酰化的嘧啶或其他杂环。具有糖作为侧链基团的修饰的多核苷酸可以是侧链的糖部分进一步被修饰，例如，糖的一个或多个羟基被卤素或脂肪族基置换，或转化为例如醚和胺官能团。

也就是说，本发明的反义多核苷酸是RNA、DNA、或修饰的核酸(RNA、DNA)。该修饰的核酸的例子包括核酸的硫衍生物和硫代磷酸盐衍生物，和抗多核苷酸氨化物或寡核苷酸氨化物的降解的核酸，其不限定于此。

使用Otx2蛋白或其部分肽的表达或表达量的增长作为指数，可以筛选具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的化合物或其盐。该筛选例如，利用具有表达Otx2蛋白或其部分肽能力的细胞来进行。

具体地，这样的筛选的例子包括用于筛选具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的化合物或其盐的方法，特征在于具有表达Otx2蛋白或其部分肽能力的细胞在存在测试化合物的情况下培养，并检测Otx2蛋白或其部分肽的表达，或测量它们的表达量。“具有表达Otx2蛋白或其部分肽能力的细胞”的例子包括具有上述的本发明DNA的转化细胞。或者，该细胞可以是原来具有而不是根据基因重组方法表达Otx2蛋白或其部分肽能力的细胞。本发明蛋白的表达量可以通过从培养的细胞以上述的方法分离并纯化本发明蛋白，再使用上述定量本发明蛋白的方法进行测量。

此外，本发明筛选法的其他方面包括用于筛选具有诱导分化成视网膜感光细胞的化合物或其盐的方法，特征在于具有表达otx2蛋白或其部分肽的能力的细胞在存在测试化合物的情况下培养，使用编码本发明蛋白的DNA或其互补DNA或其部分DNA来测量编码Otx2蛋白的mRNA(以下有时候缩写成Otx2 mRNA)的量。更具体地说，提供用于筛选具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的化合物或其盐的方法，特征在于在以下两者之间进行比较：(a)当培养具有表达Otx2蛋白或其部分肽能力的细胞时，Otx2 mRNA的表达量，和(b)在存在测试化合物的情况下培养具有表达Otx2蛋白或其部分肽能力的细胞时，Otx2mRNA的量。

为了完成通过杂交方法进行mRNA表达量的比较，这样的比较可以根据已知的方法或其类似的方法完成，例如，在MolecularCloning，第二版，J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989中描述方法。具体地，编码Otx2蛋白的mRNA的量的测量方法是将根据已知的方法从细胞提取的mRNA与编码本发明蛋白的DNA或其互补DNA或其部分DNA接触，并测量与编码本发明蛋白的DNA或其互补DNA或其部分DNA结合的mRNA的量。结合到编码本发明蛋白的DNA或其互补DNA或其部分DNA的Otx2 mRNA的量可以通过用例如，放射性同位素或色素标记编码本发明蛋白或其互补DNA或其部分DNA而容易地测量。作为放射性同位素，使用例如，32P和3H，和作为色素，使用荧光色素例如荧光素、FAM(PE Biosystems生产)、JOE(PE Biosystems生产)、TAMRA(PE Biosystems生产)、ROX(PEBiosystems生产)、Cy5(Amershan生产)和Cy3(Amershan生产)。或者，Otx2m RNA的量的测量方法还可以用反转录酶将从细胞提取的RNA转化为cDNA，并测量通过PCR已扩增的cDNA的量，该PCR使用编码本发明蛋白的DNA或其互补DNA或其部分DNA作为引物。

提供用于筛选具有调控编码Otx2蛋白的DNA的启动子或增强子活性作用的化合物或其盐的方法，进一步用于筛选具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的化合物或其盐的方法，特征在于编码Otx2蛋白的已知启动子或增强子区域是从基因组DNA克隆的，转化有上游连接合适的报告基因的重组DNA的细胞在存在测试化合物的条件下培养，用检测报告基因的表达代替检测Otx2蛋白的表达。作为报告基因，使用着色标记基因例如lacZ(β-半乳糖苷酶基因)。通过使用已知的方法测量报告基因产物的量(例如mRNA、蛋白)，报告基因产物量增加的测试化合物可以被选为具有Otx2基因的启动子或增强子的促进活性作用的化合物，那就是说，具有促进Otx2蛋白或其部分肽表达活性的化合物。

上述的筛选法中测试化合物的例子包括肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞抽提物、植物浸出液和动物组织提出物，这些化合物可以是新的化合物或已知的化合物。

为了完成上述的筛选法，本发明筛选试剂盒包含(a)具有表达Otx2蛋白或其部分肽的能力的细胞，(b)编码本发明蛋白的DNA或其互补DNA或其部分DNA，或(c)转化有DNA的细胞，其中编码Otx2蛋白的DNA的启动子或增强子连接到报告基因。

使用本发明筛选法或筛选试剂盒获得的化合物，或其盐可用作药物，例如上述用于预防、治疗或抑制视网膜疾病的发展的药剂，和用于诱导分化成视网膜感光细胞的药剂。化合物或其盐，包含其的用于预防、治疗或抑制视网膜疾病发展的药剂，或包含其的用于诱导分化成视网膜感光细胞的药剂可以在本发明蛋白或DNA中进行。

实施例

如图1所示，小鼠Otx2cDNA被插入到逆转录病毒载体LIA载体中。来自人胎盘的碱性磷酸酶基因被掺入到LIA载体(对照病毒载体)，而感染有来自该载体的病毒细胞表达作为标识物的碱性磷酸酶。感染来自其中包括Otx2基因的LIA载体的病毒的细胞表达Otx2蛋白和同时共表达碱性磷酸酶作为标识物。

使用用于生产逆转录病毒的培养细胞(Phoenix细胞系)，制备对照病毒载体和Otx2病毒载体，得到的病毒分别通过超速离心法(悬挂转子，21,000rpm，4℃，2小时)浓缩制备感染效率为1×10⁷pfu(空斑形成单位)/ml的病毒溶液。

然后如图2所示，幼大鼠在出生后立即(出生后0天)接受低温麻醉，用手术剪切除覆盖眼睛部分的皮肤。5μl对照病毒载体或Otx2病毒载体的病毒溶液使用注射器(Hamilton生产)注射在幼大鼠的视网膜下。注射后，幼大鼠在37℃保温20分钟以恢复体温，返回到母大鼠的饲养笼，随后饲养4到6周。

长大成年的大鼠通过施用戊巴比妥钠接受安乐死。从该大鼠取出眼，除去视网膜。视网膜在4℃用4％多聚甲醛溶液固定过夜。4％多聚甲醛溶液用PBS(磷酸盐缓冲液)替换，并洗涤固定的视网膜。该固定/洗涤操作重复三次。然后，用4％多聚甲醛溶液固定的视网膜在65℃热处理，并灭活内源的碱性磷酸酶。热处理的视网膜用碱性磷酸盐染色液染色(室温，3小时)以使只感染有上述病毒的视网膜细胞在品蓝中染色。染色的视网膜再次用4％多聚甲醛溶液固定过夜，用PBS洗涤，然后在30％蔗糖/PBS中浸泡过夜，转移到OTS化合物(SakuraFinetek)液体，并在干冰上制备视网膜的冷冻块。从冷冻块使用冷冻切片制备仪器(Karl Zeis)制备大约30μm冷冻切片，并在光学显微镜(KarlZeis)下观察。

通过其形式和位置(参见图3)识别视网膜的各种细胞。独立进行三次试验。一个视野中各细胞相对于全部细胞数量的存活率如图4所示。当Otx2病毒载体被引入到视网膜干细胞(或视网膜前体细胞)时，视网膜感光细胞的数量与引入对照病毒载体的情况比较增加大约10％。由此可见，通过Otx2基因的表达，强烈地抑制从视网膜干细胞分化成两极神经细胞，无长突细胞和Muller神经胶质细胞，以及几乎所有的视网膜干细胞分化成视网膜感光细胞。

根据上述结果，其证实通过引入Otx2基因到未分化的视网膜干细胞中，和Otx2基因在该细胞的表达，有可能有效地将大鼠未分化的视网膜干细胞分化为视网膜感光细胞。

工业实用性

本发明蛋白或本发明DNA可以用于预防、治疗或抑制视网膜疾病发展的药物，所述视网膜疾病例如色素性视网膜炎、老年性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、视网膜剥离、青光眼和视网膜血管阻塞。此外，由于Otx2基因的异常导致视网膜感光细胞结构或功能异常，通过检测Otx2基因的异常或变性或Otx2蛋白表达的减少，这些可以用于诊断上述的疾病。

序列表

<110>独立行政法人科学技术振兴机构

(Japan Science and Technology Agency)

<110>Osaka Bioscience Institute

(财团法人大阪生命科学研究所)

<120>使用OTX2基因再生和新生视网膜感光细胞

(Regeneration and neogenesis of retinal photoreceptor cell using Otx2

homeobox gene)

<130>SCT052830-47

<160>6

<210>1

<211>297

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Met Ser Tyr Leu Lys Gln Pro Pro Tyr Ala Val Asn Gly Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Thr Ser Gly Met Asp Leu Leu His Pro Ser Val Gly Tyr Pro

20 25 30

G1y Pro Trp Ala Ser Cys Pro Ala Ala Thr Pro Arg Lys Gln Arg Arg

35 40 45

Glu Arg Thr Thr Phe Thr Arg Ala Gln Leu Asp Val Leu Glu Ala Leu

50 55 60

Phe Ala Lys Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Phe Met Arg Glu Glu Val Ala

65 70 75 80

Leu Lys Ile Asn Leu Pro Glu Ser Arg Val Gln Val Trp Phe Lys Asn

85 90 95

Arg Arg Ala Lys Cys Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Asn Gly Gly

100 105 110

Gln Asn Lys Val Arg Pro Ala Lys Lys Lys Thr Ser Pro Ala Arg Glu

115 120 125

Val Ser Ser Glu Ser Gly Thr Ser Gly Gln Phe Thr Pro Pro Ser Ser

130 135 140

Thr Ser Val Pro Thr Ile Ala Ser Ser Ser Ala Pro Val Ser Ile Trp

145 150 155 160

Ser Pro Ala Ser Ile Ser Pro Leu Ser Asp Pro Leu Ser Thr Ser Ser

165 170 175

Ser Cys Met Gln Arg Ser Tyr Pro Met Thr Tyr Thr Gln Ala Ser Gly

180 185 190

Tyr Ser Gln Gly Tyr Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Phe Gly Gly Met Asp

195 200 205

Cys Gly Ser Tyr Leu Thr Pro Met His His Gln Leu Pro Gly Pro Gly

210 215 220

Ala Thr Leu Ser Pro Met Gly Thr Asn Ala Val Thr Ser His Leu Asn

225 230 235 240

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Ser Leu

245 250 255

Gly Phe Ash Ser Thr Thr Asp Cys Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ala

260 265 270

Ser Trp Lys Leu Asn Phe Asn Ala Asp Cys Leu Asp Tyr Lys Asp Gln

275 280 285

Thr Ser Ser Trp Lys Phe Gln Val Leu

290 295

<210>2

<211>2209

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

gagagcggga ccggcctcag ctccaacaca gcctccactg tgattaaaaa taaaaattgc 60

tagagcagcc ctcactcgcc acatctactt tgatagctgg ctatttggaa tttaaaggat 120

atttgacttt ttctaacctc ccatgaggct gtaagttcca ctgctccaaa cccacccacc 180

aaggactctg aacctgtcca ccccgggcgc atcaagatct tccagctggg tacccccgat 240

ttgggccgac tttgcacctc caaacaacct tagcatgatg tcttatctta agcaaccgcc 300

ttacgcagtc aatgggctga gtctgaccac ttcgggtatg gacttgctgc acccctccgt 360

gggctacccg gggccctggg cttcttgtcc cgcagccacc ccccggaaac agcgccggga 420

gaggacgacg ttcactcggg cgcagctaga tgtgctggaa gcactgtttg ccaagacccg 480

gtacccagac atcttcatgc gagaggaggt ggcactgaaa atcaacttgc ccgagtcgag 540

ggtgcaggta tggtttaaga atcgaagagc taagtgccgc caacaacagc aacaacagca 600

gaatggaggt caaaacaaag tgagacctgc caaaaagaag acatctccag ctcgggaagt 660

gagttcagag agtggaacaa gtggccaatt cactcccccc tctagcacct cagtcccgac 720

cattgccagc agcagtgctc ctgtgtctat ctggagccca gcttccatct ccccactgtc 780

agatcccttg tccacctcct cttcctgcat gcagaggtcc tatcccatga cctatactca 840

ggcttcaggt tatagtcaag gatatgctgg ctcaacttcc tactttgggg gcatggactg 900

tggatcatat ttgaccccta tgcatcacca gcttcccgga ccaggggcca cactcagtcc 960

catgggtacc aatgcagtca ccagccatct caatcagtcc ccagcttctc tttccaccca 1020

gggatatgga gcttcaagct tgggttttaa ctcaaccact gattgcttgg attataagga 1080

ccaaactgcc tcctggaagc ttaacttcaa tgctgactgc ttggattata aagatcagac 1140

atcctcgtgg aaattccagg ttttgtgaag acctgtagaa cctctttttg tgggtgattt 1200

ttaaatatac tgggctggac attccagttt tagccaggca ttggttaaaa gagttagatg 1260

ggatgatgct cagactcatc tgatcaaagt tccgagaggc atagaaggaa aaacgaaggg 1320

ccttagaggg gcctacaaac cagcaacatg aaatggacaa accaatctgc ttaagatcct 1380

gtcatagttt tagatcattg gttatcctga tttgcaaagt gatcaaaagc attctagcca 1440

tgtgcaacca aacaccacca aaaataaaat caaacaaaac taagttgtga aggaagggag 1500

ggaaggtcat agccttctta agcagaggtg ttccattgtt ttagccaatc cttggttgaa 1560

tcttaggaat gaacagtgtc tcaagctcat tcacgtttea tgaccaaetg gtagttggca 1620

ctgaaaaaac ttttcagggc tgtgtgaatt gtgtgactga ttgtcctaga tgcactactt 1680

tatttaaaaa ataatgttca taaggagtca atatgtagtt taagagacaa tcagtgtgtg 1740

tcttataaat ggtacatctg tggtttttaa tctgtgctag acttcaaaac tgtgatctcc 1800

tgttattgta tgcaaccttg aactccacct ctgcaggggt tcttctgtga ttaaataggt 1860

tataattata agcaaaattc agagcaactg agtactgatc taaaaagatt acctttggct 1920

ggaggtgagc tgcactgaaa ctttacgaca aaatgtctct ggacaaagag agtcagagaa 1980

gagaagcaaa aggacactaa ttcatctgta atttactgtt ggtaagccta gcagtaaaga 2040

gacattggtc aattgctctg accctgatga attattaaac tgagatcatt gtcgtttatg 2100

cttgcagatg ttaaatggaa aagttatata tgcataaacc ttttcttcct ggatttggca 2160

gatatgtata attatattaa aatggttcta gcacaaaaaa aaaaaaaaa 2209

<210>3

<211>289

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>3

Met Met Ser Tyr Leu Lys Gln Pro Pro Tyr Ala Val Asn Gly Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Thr Ser Gly Met Asp Leu Leu His Pro Ser Val Gly Tyr Pro

20 25 30

Ala Thr Pro Arg Lys Gln Arg Arg Glu Arg Thr Thr Phe Thr Arg Ala

35 40 45

Gln Leu Asp Val Leu Glu Ala Leu Phe Ala Lys Thr Arg Tyr Pro Asp

50 55 60

Ile Phe Met Arg Glu Glu Val Ala Leu Lys Ile Asn Leu Pro Glu Ser

65 70 75 80

Arg Val Gln Val Trp Phe Lys Asn Arg Arg Ala Lys Cys Arg Gln Gln

85 90 95

Gln Gln Gln Gln Gln Asn Gly Gly Gln Asn Lys Val Arg Pro Ala Lys

100 105 110

Lys Lys Thr Ser Pro Ala Arg Glu Val Ser Ser Glu Ser Gly Thr Ser

115 120 125

Gly Gln Phe Thr Pro Pro Ser Ser Thr Ser Val Pro Thr Ile Ala Ser

130 135 140

Ser Ser Ala Pro Val Ser Ile Trp Ser Pro Ala Ser Ile Ser Pro Leu

145 150 155 160

Ser Asp Pro Leu Ser Thr Ser Ser Ser Cys Met Gln Arg Ser Tyr Pro

165 170 175

Met Thr Tyr Thr Gln Ala Ser Gly Tyr Ser Gln Gly Tyr Ala Gly Ser

180 185 190

Thr Ser Tyr Phe Gly Gly Met Asp Cys Gly Ser Tyr Leu Thr Pro Met

195 200 205

His His Gln Leu Pro Gly Pro Gly Ala Thr Leu Ser Pro Met Gly Thr

210 215 220

Asn Ala Val Thr Ser His Leu Asn Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr

225 230 235 240

Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gly Phe Asn Ser Thr Thr Asp Cys

245 250 255

Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ala Ser Trp Lys Leu Asn Phe Asn Ala

260 265 270

Asp Cys Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ser Ser Trp Lys Phe Gln Val

275 280 285

Leu

<210>4

<211>2082

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>4

cctccgaagc agtaaaccag cccctctgtt tgtttgtttg ctttgccctt agttccactg 60

ctccaaaccc acccaccaag gactctgaac ctgtccaccc cgggcgcatc aagatcttcc 120

agctgggtac ccccgatttg ggccgacttt gcacctccaa acaaccttag catgatgtct 180

tatcttaagc aaccgcctta cgcagtcaat gggctgagtc tgaccacttc gggtatggac 240

ttgctgcacc cctccgtggg ctacccggcc accccccgga aacagcgccg ggagaggacg 300

acgttcactc gggcgcagct agatgtgctg gaagcactgt ttgccaagac ccggtaccca 360

gacatcttca tgcgagagga ggtggcactg aaaatcaact tgcccgagtc gagggtgcag 420

gtatggttta agaatcgaag agctaagtgc cgccaacaac agcaacaaca gcagaatgga 480

ggtcaaaaca aagtgagacc tgccaaaaag aagacatctc cagctcggga agtgagttca 540

gagagtggaa caagtggcca attcactccc ccctctagca cctcagtccc gaccattgcc 600

agcagcagtg ctcctgtgtc tatctggagc ccagcttcca tctccccact gtcagatccc 660

ttgtccacct cctcttcctg catgcagagg tcctatccca tgacctatac tcaggcttca 720

ggttatagtc aaggatatgc tggctcaact tcctactttg ggggcatgga ctgtggatca 780

tatttgaccc ctatgcatca ccagcttccc ggaccagggg ccacactcag tcccatgggt 840

accaatgcag tcaccagcca tctcaatcag tccccagctt ctctttccac ccagggatat 900

ggagcttcaa gcttgggttt taactcaacc actgattgct tggattataa ggaccaaact 960

gcctcctgga agcttaactt caatgctgac tgcttggatt ataaagatca gacatcctcg 1020

tggaaattcc aggttttgtg aagacctgta gaacctcttt ttgtgggtga tttttaaata 1080

tactgggctg gacattccag ttttagccag gcattggtta aaagagttag atgggatgat 1140

gctcagactc atctgatcaa agttccgaga ggcatagaag gaaaaacgaa gggccttaga 1200

ggggcctaca aaccagcaac atgaaatgga caaaccaatc tgcttaagat cctgtcatag 1260

ttttagatca ttggttatcc tgatttgcaa agtgatcaaa agcattctag ccatgtgcaa 1320

ccaaacacca ccaaaaataa aatcaaacaa aactaagttg tgaaggaagg gagggaaggt 1380

catagccttc ttaagcagag gtgttccatt gttttagcca atccttggtt gaatcttagg 1440

aatgaacagt gtctcaagct cattcacgtt tcatgaccaa ctggtagttg gcactgaaaa 1500

aacttttcag ggctgtgtga attgtgtgac tgattgtcct agatgcacta ctttatttaa 1560

aaaataatgt tcataaggag tcaatatgta gtttaagaga caatcagtgt gtgtcttata 1620

aatggtacat ctgtggtttt taatctgtgc tagacttcaa aactgtgatc tcctgttatt 1680

gtatgcaacc ttgaactcca cctctgcagg ggttcttctg tgattaaata ggttataatt 1740

ataagcaaaa ttcagagcaa ctgagtactg atctaaaaag attacctttg gctggaggtg 1800

agctgcactg aaactttacg acaaaatgtc tctggacaaa gagagtcaga gaagagaagc 1860

aaaaggacac taattcatct gtaatttact gttggtaagc ctagcagtaa agagacattg 1920

gtcaattgct ctgaccctga tgaattatta aactgagatc attgtcgttt atgcttgcag 1980

atgttaaatg gaaaagttat atatgcataa accttttctt cctggatttg gcagatatgt 2040

ataattatat taaaatggtt ctagcacaaa aaaaaaaaaa aa 2082

<210>5

<211>289

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>5

Met Met Set Tyr Leu Lys Gln Pro Pro Tyr Ala Val Ash Gly Leu Set

1 5 10 15

Leu Thr Thr Ser Gly Met Asp Leu Leu His Pro Ser Val Gly Tyr Pro

20 25 30

Ala Thr Pro rg Lys Gln Arg Arg Glu Arg Thr Thr Phe Thr Arg Ala

35 40 45

Gln Leu Asp Val Leu Glu Ala Leu Phe Ala Lys Thr Arg Tyr Pro Asp

50 55 60

Ile Phe Met Arg Glu Glu Val Ala Leu Lys Ile Asn Leu Pro Glu Ser

65 70 75 80

Arg Val Gln Val Trp Phe Lys Asn Arg Arg Ala Lys Cys Arg Gln Gln

85 90 95

Gln Gln Gln Gln Gln Asn Gly Gly Gln Asn Lys Val Arg Pro Ala Lys

100 105 110

Lys Lys Ser Ser Pro Ala Arg Glu Val Ser Ser Glu Ser Gly Thr Ser

115 120 125

Gly Gln Phe Ser Pro Pro Ser Ser Thr Ser Val Pro Thr Ile Ala Ser

130 135 140

Ser Ser Ala Pro Val Ser Ile Trp Ser Pro Ala Ser Ile Ser Pro Leu

145 150 155 160

Ser Asp Pro Leu Ser Thr Ser Ser Ser Cys Met Gln Arg Ser Tyr Pro

165 170 175

Met Thr Tyr Thr Gln Ala Ser Gly Tyr Ser Gln Gly Tyr Ala Gly Ser

180 185 190

Thr Ser Tyr Phe Gly Gly Met Asp Cys Gly Ser Tyr Leu Thr Pro Met

195 200 205

His His Gln Leu Pro Gly Pro Gly Ala Thr Leu Ser Pro Met Gly Thr

210 215 220

Asn Ala Val Thr Ser His Leu Asn Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr

225 230 235 240

Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gly Phe Asn Ser Thr Thr Asp Cys

245 250 255

Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ala Ser Trp Lys Leu Asn Phe Asn Ala

260 265 270

Asp Cys Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ser Ser Trp Lys Phe Gln Val

275 280 285

Leu

<210>6

<211>1737

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>6

caggtttatc tggtctcact ccatcccctc tagttttgga gctgctgggg ggtggggggg 60

acggcggggg tgggggacgc atctgcaact cctttaaaag cctgtgccca gcgtctcccg 120

ggttcttttt agttagtgct ggaacgtgga ggaagctgct ccctccgaag cagtaaacca 180

gcatttctgt ttgtttgttt gctttgccct tagttccgtc actccaaatc tacccaccaa 240

ggaccctgac cctgtccact ccaggcgaat cgagaccgtc cggctgggtc cccccaattt 300

gggccgactt tgcgcctcca aacaacctta gcatgatgtc ttatctaaag caaccgcctt 360

acgcagtcaa tgggctgagt ctgaccactt cgggtatgga cttgctgcat ccctccgtgg 420

gctaccccgc caccccccgg aaacagcgaa gggagaggac gacatttact agggcacagc 480

tcgacgttct ggaagctctg tttgccaaga cccggtaccc agacatcttc atgagggaag 540

aggtggcact gaaaatcaac ttgccagaat ccagggtgca ggtatggttt aagaatcgaa 600

gagctaagtg ccgccaacag cagcagcagc agcagaatgg aggtcagaac aaagtgaggc 660

ctgccaagaa gaagagctct ccagctcggg aagtgagttc agagagtgga acaagtggcc 720

agttcagtcc cccctctagt acctcagtcc caaccattgc cagcagcagt gctccagtgt 780

ctatctggag cccagcgtcc atctccccac tgtctgaccc cttgtccact tcctcctcct 840

gcatgcagag gtcctatccc atgacctata ctcaggcttc aggttatagt caaggctatg 900

ctggctcaac ttcctacttt gggggcatgg actgtggatc ttatttgacc cctatgcatc 960

accagcttcc tggaccaggg gccacactca gtcccatggg taccaatgct gttaccagcc 1020

atctcaatca gtccccagct tctctttcca cccagggata tggagcttca agcttgggtt 1080

ttaactcaac cactgattgc ttggattata aggaccaaac tgcctcttgg aagcttaact 1140

tcaatgctga ctgcttggat tataaagatc agacgtcctc atggaaattc caggttttgt 1200

gaagacctgt agaagctatt tttgtgggtg atttttaaat atgctgggct gaacattcca 1260

gttttagcca ggcattggtt aaaaaagtta gatggaacga tgctctcaga ctcctgatca 1320

aagttaccga gaggcataga aggaaaaagg aaggggcctt agaagggtcc atcaaccagc 1380

aacctgaaat ggacaaacca atctacttaa gattctgtta tagttctaga tcattggttt 1440

cctgatttgc aaatgattga tcaaatatat tctagcgaca tgcaaccaaa taccactcaa 1500

aacaaaaatc cagcaaaact gagttgtgag ggaagggagg gaaggtcatg gccttcaaag 1560

cagaggtgat ccggtgtttt agccaatctt tggttgaatc ttaggaatgg acaatgtccc 1620

aggctcattc acgtttcatg accaacaggt agttggcact gaaaaacttt tcagggctgt 1680

gtggattgtg cgactgattg tcctagatgc actactttat ttaaaaaaaa aaaaaaa 1737

Claims

1.一种药剂，用于预防、治疗或抑制视网膜疾病的发展，其包含Otx2蛋白或其部分肽，或其盐。

2.根据权利要求1的药剂，其中该Otx2蛋白是包含与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5代表的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的蛋白。

3.一种药剂，用于预防、治疗或抑制视网膜疾病的发展，其包含编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA。

4.根据权利要求3的药剂，其中该DNA包含SEQ ID NO 2、SEQID NO：4或SEQ ID NO：6代表的核苷酸序列，或与所述序列在高度严格条件下杂交的核苷酸序列。

5.根据权利要求3的药剂，其包括的重组载体含有编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA。

6.一种药剂，用于诱导分化为视网膜感光细胞，其包含Otx2蛋白或其部分肽，或其盐。

7.一种药剂，用于诱导分化成视网膜感光细胞，其包含编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA。

8.一种用于诱导分化成视网膜感光细胞的方法，其包括表达Otx2蛋白，或增加Otx2蛋白的表达量。

9.根据权利要求8的用于诱导分化成视网膜感光细胞的方法，其包括在来自眼球组织的细胞、胚胎干细胞、神经干细胞或神经前体细胞中表达Otx2蛋白，或增加Otx2蛋白的表达量。

10.根据权利要求8的用于诱导分化成视网膜感光细胞的方法，其中编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA被引入到来自眼球组织的细胞、胚胎干细胞、神经干细胞或神经前体细胞，并培养得到的细胞。

11.一种方法，用于预防、治疗或抑制视网膜疾病的发展，其包括对哺乳动物施用有效量的Otx2蛋白或其部分肽或其盐。

12.一种方法，用于预防、治疗或抑制视网膜疾病的发展，其包括对哺乳动物施用有效量的编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA。

13.一种方法，用于再生视网膜，其包括向视网膜移植被Otx2蛋白分化诱导的视网膜感光细胞或其前体细胞。

14.Otx2蛋白或其部分肽、或其盐在制备用于预防、治疗或抑制视网膜疾病发展的药剂中的应用。

15.编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA在制备用于预防、治疗或抑制视网膜疾病发展的药剂中的应用。

16.一种视网膜疾病的诊断试剂，其包括Otx2蛋白或其部分肽的或其盐的抗体。

17.一种诊断视网膜疾病的方法，其包括使用Otx2蛋白或其部分肽或其盐的抗体。

18.一种诊断视网膜疾病的方法，其包括检测Otx2蛋白或其部分肽的表达量或突变。

19.一种用于视网膜疾病的诊断试剂，其包括(a)编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，或(b)含有与所述的DNA或RNA互补的或基本上互补的核苷酸序列的反义多核苷酸。

20.一种用于诊断视网膜疾病的方法，其包括使用(a)编码Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，或(b)包括与所述DNA或RNA互补或基本上互补的的核苷酸序列的反义多核苷酸。

21.一种具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的化合物或其盐的筛选方法，其包括使用Otx2蛋白或其部分肽的表达或表达量的增加作为指标。

22.根据权利要求21的筛选方法，其中使用具有表达Otx2蛋白或其部分肽的能力的细胞。

23.一种试剂盒，用于筛选具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的化合物或其盐，其包括具有表达Otx2蛋白或其部分肽的能力的细胞。

24.一种具有诱导分化成视网膜感光细胞作用的化合物其盐，其可使用权利要求21或22的筛选方法，或权利要求23的筛选试剂盒获得。

25.一种药物，其包括权利要求24的化合物或其盐。