JPWO2004069268A1 - Otx2遺伝子を用いた網膜視細胞の再生と新生 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明者は、網膜視細胞への分化の鍵をにぎるとして今まで解析してきた転写因子Crxと同じ遺伝子ファミリーに属するOtx2タンパク質に注目し、Otx2タンパク質の網膜視細胞の運命決定における役割を解析した。マウスの生体レベルでの解析の結果、本発明者はOtx2タンパク質が網膜視細胞の運命決定に非常に重要であることを知見した。すなわち、Otx2遺伝子をウィルスベクターに組み込んで、当該組換えベクターをマウスの未分化網膜幹細胞に感染させ、マウスの未分化網膜幹細胞においてOtx2タンパク質を発現させたところ、ほとんどの未分化網膜幹細胞は網膜視細胞へと分化した。かかる知見に基づき、さらに検討を重ねて、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
(1) Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤、
(2) Otx2タンパク質が、配列番号:1、配列番号:3もしくは配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一または前記配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である前記(1)記載の剤、
(3) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有する網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤、
(4) DNAが、配列番号:2、配列番号:4もしくは配列番号:6で表される塩基配列または前記配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有する前記(3)記載の剤、
(5) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有する組換えベクターを含有する前記(3)記載の剤、
(6) Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする網膜視細胞への分化誘導剤、
(7) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有する網膜視細胞への分化誘導剤、
(8) Otx2タンパク質を発現させるか、またはOtx2タンパク質の発現量を上昇させることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導方法、
(9) 眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞において、Otx2タンパク質を発現させるか、またはOtx2タンパク質の発現量を上昇させることを特徴とする前記(8)に記載の網膜視細胞への分化誘導方法、
(10) 眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞に、Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを導入し、得られた細胞を培養することを特徴とする前記(8)に記載の網膜視細胞への分化誘導方法、
(11) Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする網膜疾患の予防、治療または進行抑制方法、
(12) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする網膜疾患の予防、治療または進行抑制方法、
(13) Otx2タンパク質により分化誘導された網膜視細胞またはその前駆細胞を網膜に移植することを特徴とする網膜の再生方法、
(14) 網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤の製造のためのOtx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の使用、
(15) 網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤の製造のためのOtx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAの使用、
(16) Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体を含有する網膜疾患の診断剤、
(17) Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体を用いることを特徴とする網膜疾患の診断方法、
(18) Otx2タンパク質、その部分ペプチドの発現量または変異を検出することを特徴とする網膜疾患の診断方法、
(19) (a)Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするDNAもしくはRNA、または(b)該DNAもしくはRNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス・ポリヌクレオチドを含有する網膜疾患の診断剤、
(20) (a)Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするDNAもしくはRNA、または(b)該DNAもしくはRNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス・ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする網膜疾患の診断方法、
(21) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドの発現または発現量の上昇を指標とすることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(22) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を用いることを特徴とする前記(21)記載のスクリーニング方法、
(23) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を含有することを特徴とする網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(24) 前記(21)もしくは(22)記載のスクリーニング方法、または前記(23)記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩、
(25) 前記(24)に記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
に関する。
本発明のタンパク質等または本発明のDNA等を用いれば、眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞を網膜視細胞に分化させることができる。ゆえに、本発明のタンパク質等または本発明のDNA等を用いて、網膜視細胞を再生または新生することにより、例えば網膜色素変性、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、網膜剥離、緑内障または網膜血管閉塞症など網膜疾患を予防、治療または進行抑制することができる。さらに、Otx2遺伝子の異常によって網膜視細胞は構造的または機能的異常をきたすので、Otx2遺伝子の異常またはOtx2タンパク質の変性もしくは発現低下を検出することにより、上記網膜疾患の診断も行うことができる。
第2図はウイルス感染実験の概要を示す図である。図中、Retinaは網膜、Pigment Epitheliumは網膜色素上皮、virusはウイルスが感染する範囲、Remove Retinaは網膜摘出、Fix and Stainは組織の固定と染色、Section and Analyse Clonesは凍結切片とその解析を表す。
第3図はアルカリホスファターゼ染色後の網膜凍結切片像の例を示す図である。図中、Biは双極細胞、Aはアマクリン細胞、Rは網膜視細胞、Mはミューラーグリア細胞、R+Biは網膜視細胞とミューラーグリア細胞、A+Biはアマクリン細胞と双極細胞を表す。
第4図はコントロールウイルスベクター(LIA)又はOtx2ウイルスベクター(Otx2/LIA)が感染した網膜幹細胞から分化した細胞それぞれの、顕微鏡一視野における全細胞数に対する存在率を示す図である。
「配列番号:1、3または5で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」としては、例えば、配列番号:1、3または5で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、より好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、なかでも好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。本発明の配列番号:1、3または5で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号:1、3または5で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、網膜視細胞への分化誘導作用を有するタンパク質などが好ましい。なかでも、転写活性や網膜視細胞への分化誘導作用が配列番号:1、3または5で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と同等(例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。網膜視細胞への分化誘導作用の測定は、公知の方法に準じて行うことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。転写活性の測定は公知の方法、例えばレポーターアッセイや、RT−PCRなどの方法を用いて行うことができる。
具体的に、本発明で用いるOtx2タンパク質としては、(a)配列番号:1、3または5で表わされるアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(b)配列番号:1、3または5で表わされるアミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(c)配列番号:1、3または5で表わされるアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(d)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などが用いられる。前記(b)において付加されるアミノ酸、前記(c)において置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる20種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。前記(a)〜(d)に記載のタンパク質は、網膜視細胞への分化誘導作用を有することがより好ましい。
本発明のOtx2タンパク質においては、C末端がカルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO−)、アミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)の何れであってもよい。ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピルもしくはn−ブチルなどのC1−6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明におけるOtx2タンパク質がC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明におけるOtx2タンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明におけるOtx2タンパク質には、上記したタンパク質において、N末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチルなどのC2−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など)で保護されているもの、N末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例えば、−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチルなどのC2−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いるOtx2タンパク質の部分ペプチド(以下、部分ペプチドと略記する場合がある)としては、上記したOtx2タンパク質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよい。本発明における部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したOtx2タンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約20個以上、好ましくは約50個以上、より好ましくは約100個以上のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが好ましい。
本発明の部分ペプチドにおいては、C末端がカルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO−)、アミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)の何れであってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、上記した本発明のOtx2タンパク質と同様に、N末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生体内で切断され生成したGlnがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のOtx2タンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩などが挙げられる。
本発明におけるOtx2タンパク質またはその塩は、動物、好ましくは温血動物、より好ましくはヒトまたはラット、さらに好ましくはヒトの細胞または組織、特に好ましくはヒトの脳のニューロン、眼の網膜色素上皮細胞または網膜視細胞から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載する本発明のOtx2タンパク質をコードするDNAまたはRNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。動物の組織または細胞から製造する場合、動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明におけるOtx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、4−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、活性化試薬としては、特にカルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロリル)カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤(例えば、HOBt、HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、保護アミノ酸を対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルに変換することにより予め保護アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、N,N−ジメチルホルムアミド,N,N−ジメチルアセトアミド,N−メチルピロリドンなどの酸アミド類;塩化メチレン,クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類;トリフルオロエタノールなどのアルコール類;ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類;ピリジン,ジオキサン,テトラヒドロフランなどのエーテル類;アセトニトリル,プロピオニトリルなどのニトリル類;酢酸メチル,酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−20℃〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Z、Boc、t−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl−Z、Br−Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化(例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、t−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、2−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化)、アラルキルエステル化(例えば、ベンジルエステル、4−ニトロベンジルエステル、4−メトキシベンジルエステル、4−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化)、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、t−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t−ブチル基などである。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2−Bzl、2−ニトロベンジル、Br−Z、t−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール(例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5−トリクロロフェノール、2,4−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N−ヒドロキシスクシミド、N−ヒドロキシフタルイミド、HOBt)とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去(脱離)方法としては、例えば、(a)Pd−黒あるいはPd−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元、(b)無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理、(c)ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、または(d)液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−20℃〜40℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4−ブタンジチオール、1,2−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2−エタンジチオール、1,4−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド(タンパク質)鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質とC末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。上記方法で得られるタンパク質が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明におけるOtx2タンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明におけるOtx2タンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、本発明のOtx2タンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の(a)〜(e)に記載された方法が挙げられる。
(a)M.BodanszkyおよびM.A.Ondetti、ペプチド シンセシス(Peptide Synthesis),Interscience Publishers,New York(1966年)、(b)SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),Academic Press,New York(1965年)、(c)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)(1975年)、(d)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座1、タンパク質の化学IV、205、(1977年)、(e)矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店。
また、反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明で用いるOtx2タンパク質をコードするDNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、上記した細胞・組織由来のcDNA、上記した細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。具体的には、Otx2タンパク質をコードするDNAとしては、例えば、(a)配列番号:2、4または6で表わされる塩基配列を含有するDNA、または(b)配列番号:2、4または6で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のOtx2タンパク質と実質的に同質の活性(例、転写活性や網膜視細胞分化誘導作用など)を有するOtx2タンパク質をコードするDNAなどが挙げられる。なお、配列番号:2および4は、ヒトのOtx2タンパク質をコードするDNA(Kastury,K.,et.al.,“Chromosome locations of human EMX and OTX genes”,Genomics 22(1),41−45(1994))であり、配列番号:6は、マウスのOtx2タンパク質をコードするDNA(Simeone,A.,et.al.,“Nested expression domains of four homeobox genes in developing rostral brain”,Nature 358(6388),687−690(1992))である。配列番号:2、4または6で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:2、4または6で表わされる塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。
本発明で用いる部分ペプチドをコードするDNAとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、上記した細胞・組織由来のcDNA、上記した細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、(a)配列番号:2、4または6で表わされる塩基配列を含有するDNAの部分塩基配列を含有するDNA、または(b)配列番号:2、4または6で表わされる塩基配列を含有するDNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のOtx2タンパク質と実質的に同質の活性(例、転写活性や網膜視細胞分化誘導作用など)を有するタンパク質をコードするDNA、以上(a)または(b)の部分塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
本発明で用いるOtx2タンパク質または部分ペプチドをコードするRNAも、逆転写酵素によりOtx2タンパク質または部分ペプチドを発現することができるものであれば特に限定されず、公知の手段により得ることができる。
本発明におけるOtx2タンパク質またはその部分ペプチド(以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある)を完全にコードするDNAのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質の部分塩基配列を含有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだDNAの中から、標識された本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを用いて、ハイブリダイゼーションさせることによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
DNAの塩基配列の置換は、PCRや公知のキット、例えば、MutanTM−superExpress Km(宝酒造)、MutanTM−K(宝酒造)等を用いて、ODA−LA PCR法、gapped duplex法、Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。クローン化された本発明のタンパク質をコードするDNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質をコードするDNAまたはRNA(以下、本発明のDNA等と略記する場合がある)は、次のような方針に基づき修飾されていてもよい。すなわち、細胞内での本発明のDNA等をより安定なものにする、本発明のDNA等の細胞透過性をより高める、そしてもし毒性があるなら本発明のDNA等の毒性をより小さなものにする。このような修飾は当該分野で数多く知られており、例えばJ.Kawakami et al.,Pharm Tech Japan,Vol.8,pp.247,1992;Vol.8,pp.395,1992;S.T.Crooke et al.ed.,Antisense Research and Applications,CRC Press,1993などに開示がある。本発明のDNA等は、リポゾームまたはミクロスフェアなどに内包された特殊な形態で用いてもよい。また、本発明のDNA等は、塩基以外の他の物質が付加されたものであってもよい。前記他の物質としては、糖;酸または塩基;リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体;または、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめたりするような脂質(例えば、ホスホリピド、コレステロールなど)といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体(例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など)が挙げられる。前記他の物質は、核酸の3’端あるいは5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。本発明のDNA等は、その末端が化学修飾されたものであってもよい。末端の修飾基としては、核酸の3’端あるいは5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
本発明で用いるOtx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有する組換えベクターとしては、Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現することができる発現ベクターが好ましい。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、(i)本発明のタンパク質をコードするDNAを含むDNA断片を例えばcDNAから切り出し、(ii)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
前記発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pCR4、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110、pTP5、pC194)、酵母由来プラスミド(例、pSH19、pSH15)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどのウイルスなどの他、pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoなどが用いられる。中でも、本発明で用いるベクターとしては、ウイルスが好ましく、レトロウイルス、アデノウイルスまたはレンチウイルスがより好ましい。
前記プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター、HSV−TKプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、LTRプロモーター、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、キャップ構造、蛋白質合成開始シグナル、選択マーカー、標識マーカー、SV40複製オリジンなどを含有しているものを用いることができる。
選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(以下、dhfrと略称する場合がある)遺伝子〔メソトレキセート(MTX)耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子(以下、Amprと略称する場合がある)、ネオマイシン耐性遺伝子(以下、Neorと略称する場合がある、G418耐性)等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHOを用いてdhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子を、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
標識マーカーとしては、アルカリホスファターゼ(以下、APと略称する場合がある。)遺伝子、縁色蛍光蛋白質(GFP)遺伝子などを好ましく用いることができる。
また、所望により、宿主に合ったシグナル配列を発現ベクターに付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、MFα・シグナル配列、SUC2・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
また、ベクターとしてウイルスを用いる場合には、翻訳機構を高めるため、蛋白質合成開始シグナルとしてIRES(内部リボゾーム結合サイト)配列を配することが好ましい。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするDNAを含有する発現ベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),60巻,160(1968)〕,JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research),9巻,309(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology),120巻,517(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,41巻,459(1969)〕,C600〔ジェネティックス(Genetics),39巻,440(1954)〕,DH5α〔Inoue,H.,Nojima,H.and Okayama,H.,Gene,96,23−28(1990)〕,DH10B〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),87巻,4645−4649(1990)〕などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔ジーン(Gene),24巻,255(1983)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),95巻,87(1984)〕などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R−,NA87−11A,DKD−5D,20B−12、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913,NCYC2036、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来株化細胞(Bombyx mori N;BmN細胞)などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCCCRL1711)、Sf21細胞(以上、Vaughn,J.L.ら、イン・ヴィボ(In Vivo),13,213−217,(1977))などが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー(Nature),315巻,592(1985)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞COS−7、Vero、チャイニーズハムスター細胞CHO(以下、CHO細胞と略記)、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO(以下、CHO(dhfr−)細胞と略記)、マウスL細胞、マウスAtT−20、マウスミエローマ細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),69巻,2110(1972)やジーン(Gene),17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行うことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular & General Genetics),168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology),194巻,182−187(1991)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行うことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ/テクノロジー(Bio/Technology),6巻,47−55(1988)などに記載の方法に従って行うことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊8新細胞工学実験プロトコール.263−267(1995)(秀潤社発行)、ヴィロロジー(Virology),52巻,456(1973)に記載の方法に従って行うことができる。このようにして、本発明のタンパク質をコードするDNAを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),431−433,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian,K.L.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),77巻,4505(1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter,G.A.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace’s Insect Medium(Grace,T.C.C.,ネイチャー(Nature),195巻,788(1962))に非動化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Science),122巻,501(1952)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(The Journal of the American Medical Association)199巻,519(1967)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the Society for the Biological Medicine),73巻,1(1950)〕などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンX−100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と培養上清とを分離し、培養上清を集める。このようにして得られた抽出液または培養上清中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製方法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法;透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法;イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法;アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法;逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法;等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、形質転換体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去したりすることもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
Otx2タンパク質を発現させるか、またはOtx2タンパク質の発現量を上昇させることにより、網膜視細胞への分化誘導を惹起することができる。具体的には、例えば、眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞において、Otx2タンパク質を発現させるか、またはOtx2タンパク質の発現量を上昇させることにより、前記細胞を網膜視細胞へ分化誘導することができる。そのゆえに、(a)Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩、または(b)Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするDNAもしくはRNAは網膜視細胞への分化誘導剤として使用することができる。
前記「網膜視細胞への分化誘導」は、生体内で起こってもよいし、生体外で起こってもよい。すなわち、本発明にかかる網膜視細胞への分化誘導剤を生体に投与し、生体内において網膜視細胞への分化誘導を惹起させてもよい。また、生体外において例えば、眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞に対し本発明にかかる網膜視細胞への分化誘導剤を適用し、前記細胞を網膜視細胞へ分化誘導させてもよい。より具体的には、眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞に、本発明のDNA等を導入し、得られた細胞を培養することにより前記細胞を網膜視細胞へ分化誘導することができる。本発明のDNA等を導入する際に、他の遺伝子もあわせて導入してもよい。他の遺伝子としては、例えば網膜特異的ホメオボックス遺伝子などが挙げられる。網膜特異的ホメオボックス遺伝子としては、発生過程において、眼の領域における特異的な発現様式を有し、かつ領域特異的な形態形成を制御する遺伝子、分化形質の発現に関与する遺伝子が挙げられる。具体的には、Crx、Chx10、Pax6、Raxなどが挙げられる。
前記「眼球組織」としては、眼胚内層組織などが好適な例として挙げられる。また、かかる組織は、成体由来であっても、胎生期の個体由来であってもよい。「眼球組織由来細胞」としては、例えば、胎児神経網膜、毛様体色素上皮細胞などの毛様体細胞または網膜色素上皮細胞、毛様体上皮細胞、虹彩細胞などが挙げられる。
前記眼球組織由来細胞は、例えば、適切な手段で摘出した組織を、DispaseまたはEDTAなどで処理し、ついで、トリプシン処理して単一の細胞まで分離し、さらに、適切な培地でコンフルエントになるまで培養し、得られた細胞をトリプシン処理およびコラゲナーゼ処理することにより採取されうる。ここで、細胞の採取に際して、培養を行う場合、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有した培地、表皮細胞成長因子を含有した培地、LIF(白血球遊走阻止因子)を含有した培地などの培地を用いることができる。前記塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含有した培地としては、例えばbFGFを含有した無血清培地が挙げられ、より具体的には、N2サプリメントを含有したDMEM/F12などが挙げられる。かかる培地における前記bFGFの含有量は、約10ng/ml以上、好ましくは、約20ng/ml以上、より好ましくは、約40ng/ml以上であることが望ましい。また、N2サプリメントとしては、インスリン5μg/ml程度、トランスフェリン100μg/ml程度、プロジェストロン20nM程度、プトレッシン100μM程度、セレン酸ナトリウム30nM程度が挙げられる。なお、培養における温度、酸素濃度、二酸化炭素濃度などの条件は、細胞に応じて適宜設定することができる。
神経幹細胞または神経前駆細胞は、眼球組織由来細胞由来であってもよいし、胚性幹細胞由来であってもよいし、他の細胞や組織由来であってもよい。具体的には、胎児網膜由来神経幹細胞、成体毛様体由来網膜幹細胞、虹彩由来網膜幹細胞、脳由来神経幹細胞、網膜前駆細胞、虹彩由来神経前駆細胞などが挙げられる。
眼球組織由来細胞もしくは胚性幹細胞または他の細胞や組織から神経幹細胞または神経前駆細胞を誘導する方法は、公知の方法に従えばよい。例えば、胚性幹細胞から、神経幹細胞または神経前駆細胞に誘導する方法としては、例えば、川崎、笹井らの文献[Kawasaki,H.,Sasai Y.,Neuron.,2000 Oct;28(1):31−40]などに記載の手法などが挙げられる。なお、胚性幹細胞の培養、維持などの条件は、例えば、「分子生物学プロトコール」(南江堂発行)などを参照できる。前記神経幹細胞または神経前駆細胞は、これを含むneural sphereとして得られる場合があるが、本発明においては、かかるneural sphereを以下の操作に供してもよい。
眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞、好ましくは前記神経幹細胞または神経前駆細胞に、本発明のDNA等および所望により他の遺伝子を導入する方法としては、特に限定されず、公知の方法を用いてよいが、例えば、アデノウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法、レトロウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法、アデノ随伴ウイルスを用いる遺伝子導入方法、リポフェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。導入効率の観点から、好ましくは、アデノウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法およびレトロウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法が望ましい。
遺伝子導入された細胞を網膜視細胞への分化に適した分化誘導条件下に培養する。分化誘導条件としては、遺伝子導入された細胞の種類などにより異なるので一概には言えず、適宜選択することができる。例えば、前記分化誘導条件としては、レチノイン酸と血清との存在下における培養などが挙げられる。ここで、培養に用いられうる培地としては、上述したN2サプリメントを含有したDMEM/F12培地などが挙げられる。前記レチノイン酸の使用量は、約0.1μM以上であり、好ましくは、約0.5μM以上であることが望ましく、約10μM以下であり、好ましくは、約5μM以下であることが望ましい。また、前記血清の使用量は、分化誘導時には約1%程度であることが望ましい。さらに、培養時の温度、酸素濃度、二酸化炭素濃度などの条件は、遺伝子導入された細胞に応じて適宜設定することができる。
以上のような本発明の分化誘導方法により得られた網膜視細胞は、例えば網膜色素変性、加齢黄斑変性、網膜剥離、緑内障または網膜血管閉塞症などの網膜変性疾患患者に対する移植用細胞として応用することができる。また、前記移植用細胞としては、網膜視細胞に完全に分化しているもののみならず、網膜視細胞に分化する前の前駆細胞であってもよい。
Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩、またはOtx2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするDNAもしくはRNAは網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤などの医薬として使用することができる。前記「網膜疾患」としては、糖尿病、高血圧症、動脈硬化症、貧血症、白血病、全身性エリテマトーデスや強皮症などの結合組織疾患、およびテイ−ザックス(Tay−Sacks)病やフォークト−シュピールマイヤー(Vogt−Spielmeyer)病などの先天代謝異常などの、全身疾患に起因する網膜の血管障害や炎症性および変性病変、ならびに、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜静脈周囲炎などの網膜血管の障害、網膜剥離や外傷に由来する網膜の炎症や変性、老人性円盤状黄斑変性症などの加齢に伴う網膜の変性疾患、および先天的な網膜変性疾患などの、網膜局所の疾患などが挙げられる。特に、本発明にかかる網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤は、先天的な網膜変性疾患、網膜色素変性、黄斑変性、糖尿病性網膜症、網膜剥離、緑内障または網膜血管閉塞症などに特に有効に使用することができる。
本発明のタンパク質を上記網膜疾患の予防・治療・進行抑制剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。一方、本発明のDNA等を上記網膜疾患の予防・治療・進行抑制剤として使用する場合は、本発明のDNA等を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。本発明のDNA等は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。
例えば、本発明のタンパク質または本発明のDNA等は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に投与することもできるし、または水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に投与することもできる。本発明の製剤は、例えば、本発明のタンパク質または本発明のDNA等を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤または結合剤などとともに混和することによって製造することができる。
錠剤、カプセル剤などにおいて混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤;結晶性セルロースのような賦形剤;コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤;ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤;ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤;ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが挙げられる。カプセル剤の場合には、さらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水性液または油性液に有効成分を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアルコール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(例、ポリソルベート80TM、HCO−50)などを併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。さらに、前記無菌組成物には、例えば、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などが配合されてもよい。調製された無菌組成物は通常、適当なアンプルに充填され、注射剤として供される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。本発明のタンパク質または本発明のDNA等の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより異なるので一概には言えないが、非経口投与の場合、1日あたり約0.01〜10mg/kg程度であり、好ましくは約0.05〜5mg/kg程度である。
本発明にかかる網膜疾患の予防・治療・進行抑制剤は、眼に局所的に投与することが好ましい。かかる眼局所投与用製剤の剤形としては、例えば点眼剤、眼軟膏剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、注射剤等が挙げられ、特に点眼剤(例えば、水性点眼剤、水性懸濁点眼剤、非水性点眼剤または非水性懸濁点眼剤など)、眼軟膏剤および注射剤の形態であることが好適である。かかる製剤は、常套手段に従って調製することができる。
点眼剤の調製に際して用いられる、水性の溶液剤または懸濁剤用希釈剤としては、蒸留水、生理食塩水等が挙げられる。また、非水性の溶液剤または懸濁剤用希釈剤としては、植物油、流動パラフィン、鉱物油、プロピレングリコール、p−オクチルドデカノール等が挙げられる。更に、本発明の点眼剤には、通常点眼剤に配合され得る緩衝剤、等張化剤、保存剤、増粘剤、安定化剤、抗酸化剤、pH調整剤またはキレート剤等の各種の添加剤を適宜配合することができる。点眼剤の調製は無菌操作法により行うか、あるいは適当な段階で滅菌処理を施すことにより行われる。
上記緩衝剤は、pHを例えば5.0〜8.0程度に一定に保持することを目的として添加され、例えば、ホウ酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、酒石酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液等が用いられる。これらの緩衝剤の添加量は、当該緩衝剤の添加目的、即ち、pHを例えば上記の範囲で一定に保持し得る範囲で添加される。上記等張化剤は涙液と等張にすることを目的として添加され、例えば、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類;グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類;塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の塩類等が挙げられる。これら等張化剤の添加量は、点眼剤の浸透圧が涙液と同じになる量で添加される。更に上記保存剤としては、例えば塩化ベンザルコニウム、パラベン類、クロロブタノール等が用いられる。上記増粘剤としては、例えばグリセリン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー等が挙げられ、上記安定化剤としては、例えば亜硫酸ナトリウム、プロピレングリコール等が挙げられ、上記抗酸化剤としては、例えばアスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、トコフェロール、チオ硫酸ナトリウム等が挙げられ、上記pH調整剤としては、例えば塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸、酒石酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられ、上記キレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。また、上記点眼剤は凍結乾燥し、用時注射用蒸留水などで溶解して用いる形態としてもよい。
眼軟膏は、通常用いられる眼軟膏用基剤中に有効成分を混和し、常法に従って製剤化することによって無菌的に調製することができる。眼軟膏用の基剤としては、ワセリン、ゼレン50、プラスチベース、マクロゴール等が例示され、更に親水性を高めることを目的として界面活性剤を加えることができる。また、眼軟膏についても必要に応じて前記の例えば保存剤等の添加剤を配合することもできる。
さらに、眼局所投与用製剤は、眼内でOtx2タンパク質もしくはその部分ペプチド、あるいはそれらをコードするDNAなどの放出を制御できる放出制御物質と共に徐放性製剤、DDS(ドラッグデリバリー)製剤、眼内埋め込み型製剤とすることもできる。該放出制御物質としては、自体公知の例えばα−ヒドロキシカルボン酸類(例、グリコール酸,乳酸,ヒドロキシ酪酸等),ヒドロキシジカルボン酸類(例、リンゴ酸等),ヒドロキシトリカルボン酸(例、クエン酸等)等の1種以上から無触媒脱水重縮合で合成された重合体、共重合体あるいはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸(例、ポリ−γ−ベンジル−L−グルタミン酸等)、無水マレイン酸系共重合体(例、スチレン−マレイン酸共重合体等)等の生体内分解性高分子物質が挙げられる。
本発明の眼局所投与用製剤の投与量および投与回数は、投与対象、症状、投与形態、処置期間等により異なるので一概には言えないが、通常、点眼剤の場合、本発明のタンパク質等または本発明のDNA等を0.001〜10.0w/v%、好ましくは0.01〜1.0w/v%含有する製剤を、成人に対し1日一眼あたり数回、好ましくは1〜6回、1回数滴、好ましくは1〜4滴投与することができる。また、眼軟膏剤の場合、本発明のタンパク質等または本発明のDNA等を0.001〜10.0w/w%、好ましくは0.01〜1.0w/w%含有する製剤を、成人に対し1日あたり数回、好ましくは1〜6回塗布することができる。
本発明においては、被検液中のOtx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩(以下、本発明のタンパク質等と略記する場合がある)を検出するか、またはその量を測定することにより、網膜疾患の診断を行うことができる。例えば、本発明のタンパク質等の濃度減少が検出された場合は、例えば、網膜疾患を罹患している可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体(以下、本発明の抗体と略称する場合がある)は、本発明のタンパク質等を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質等の検出および定量などに使用することができる。つまり、本発明の抗体は、網膜疾患の診断剤として用いることができる。前記診断剤においては、抗体分子そのものを用いてもよく、抗体分子のF(ab’)2、Fab’、あるいはFab画分を用いてもよい。また、被検液中の本発明のタンパク質等は、組織染色等によっても検出することができる。
本発明の抗体は、本発明のタンパク質等を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の抗体は、本発明のタンパク質等を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造方法に従って製造することができる。
本発明のタンパク質等に対するモノクローナル抗体の作製方法の一例を以下に述べる。
(i)まず、モノクロナール抗体産生細胞の作製について述べる。本発明のタンパク質等は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジまたはヤギが挙げられるが、マウスまたはラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法(ネイチャー(Nature)、256巻、495頁(1975年))に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、NS−1、P3U1、SP2/0などが挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PEG(好ましくは、PEG1000〜PEG6000)が10〜80%程度の濃度で添加され、約20〜40℃、好ましくは約30〜37℃で約1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を作製できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、(a)本発明のタンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、(b)抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明のタンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができるが、通常はHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加した動物細胞用培地などで行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、約1〜20%、好ましくは約10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI 1640培地、約1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光純薬工業株式会社製)またはハイブリドーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬株式会社製)などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃程度、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間程度、好ましくは1週間〜2週間程度である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(ii)ついで、モノクロナール抗体を分離精製する。モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製方法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体(例、DEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインAもしくはプロテインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行うことができる。
本発明のタンパク質等に対するポリクローナル抗体(以下、「本発明のポリクローナル抗体」略称する場合がある。)との作製方法の一例を以下に述べる。
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原(本発明のタンパク質等)とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造方法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば特に限定されないが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステルまたはチオール基もしくはジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。ハプテンとキャリアーの縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行うことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液または腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製方法に従って行うことができる。
本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質等を定量する方法は、特に制限されず、例えば、被検液中の抗原量(本発明のタンパク質等の量)に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、検出された値から既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線に基づいて、被検液中の抗原量を算出する方法などが挙げられる。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度および特異性の点で、後に記載するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用いる定量方法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。前記放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。前記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。前記蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。前記発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
上述の定量方法において抗原または抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類;ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂;またはガラス等が用いられる。サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ(1次反応)、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応(2次反応)させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行ってもよく、また、同時に行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記と同一である。また、サンドイッチ法による免疫定量方法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。サンドイッチ法による本発明のタンパク質等の定量方法においては、1次反応と2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は本発明のタンパク質等との結合部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、1次反応および2次反応に用いられる抗体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質等のC端部を認識する場合、1次反応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例えばN端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の定量方法、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(F)と抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B/F分離)、BまたはFいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本方法として具体的には、(a)抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、および、(b)第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが挙げられる。イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識化抗体量を測定し被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中での抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にはレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的定量方法を本発明において適用するにあたっては、それぞれの方法における通常の条件に従い、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和49年発行)、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「メソッズ・イン・エンザイモノジー(Methods in ENZYMOLOGY)」Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同書Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
本発明の抗体は、本発明のタンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質等の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することもできる。
本発明のDNA等、または本発明のDNA等の塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス・ポリヌクレオチドは、プローブとして使用することにより、生体内、特に哺乳動物(例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)の生体内における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはmRNAの異常(遺伝子異常)を検出することができるので、例えば、該DNAまたはmRNAの損傷、突然変異あるいは発現低下などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のDNA等またはアンチセンス・ポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやPCR−SSCP法(ゲノミックス(Genomics),第5巻,874〜879頁(1989)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA),第86巻,2766〜2770頁(1989))などにより実施することができる。例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするmRNAの発現低下が検出された場合は、網膜疾患を罹患している可能性が高いかまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
前記「アンチセンス・ポリヌクレオチド」は、本発明のDNA等の塩基配列と相補的な塩基配列を少なくとも一部に有し、本発明のDNA等とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドであればよい。ゆえに、アンチセンス・ポリヌクレオチドは、本発明のDNA等の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するもののみならず、実質的に相補的な塩基配列を含有するものであってよい。例えば、本発明のDNA等とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有するものなどが挙げられる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、2−デオキシ−D−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、D−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN−グリコシドを含有しているなど前記以外の他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー(例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー)または特殊な結合を含有するその他のポリマー(但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する)などが挙げられる。これらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、さらにDNA:RNAハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド(または非修飾オリゴヌクレオチド)であっても、公知の修飾の付加された修飾ポリヌクレオチド(または非修飾オリゴヌクレオチド)であってもよい。修飾ポリヌクレオチドとしては、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を持つもの、タンパク質(ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジンなど)や糖(例えば、モノサッカライドなど)などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を持つもの、キレート化合物(例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの(例えば、αアノマー型の核酸など)などが挙げられる。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。糖を側鎖基として有する修飾ポリヌクレオチドは、側鎖の糖部分がさらに修飾されていてよく、例えば、糖の1個以上の水酸基がハロゲンもしくは脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテルもしくはアミンなどの官能基に変換されていたりしてよい。
つまり、本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、RNA、DNA、あるいは修飾された核酸(RNA、DNA)である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。
Otx2タンパク質またはその部分ペプチドの発現または発現量の上昇を指標として、網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングは、例えば、Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を用いて行うことができる。
具体的には、Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に培養し、Otx2タンパク質またはその部分ペプチドの発現を検出するか、またはそれらの発現量を測定することを特徴とする、網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。前記「Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞」としては、上述した本発明のDNA等を有する形質転換細胞が挙げられる。また、遺伝子組換え技術によらず、元来Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞であってもよい。本発明のタンパク質の発現量は、培養された細胞から上述の方法で本発明のタンパク質を分離精製し、上述した本発明のタンパク質の定量方法を用いて、測定することができる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様として、Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に培養し、本発明のタンパク質をコードするDNAもしくはその相補DNAまたはそれらの部分DNAを用いてOtx2タンパク質をコードするmRNA(以下、Otx2mRNAと略称する場合がある。)の量を測定することを特徴とする、網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。より具体的には、(a)Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を培養した場合のOtx2mRNAの発現量と、(b)Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に培養した場合のOtx2mRNAの量との比較を行うことを特徴とする、網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
mRNAの発現量の比較をハイブリダイゼーション法によって行うには、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法等に従って行うことができる。具体的には、Otx2タンパク質をコードするmRNAの量の測定は、公知の方法に従って細胞から抽出したmRNAと本発明のタンパク質をコードするDNAもしくはその相補DNAまたはそれらの部分DNAとを接触させ、本発明のタンパク質をコードするDNAもしくはその相補DNAまたはそれらの部分DNAに結合したmRNAの量を測定することによって行われる。本発明のタンパク質をコードするDNAもしくはその相補DNAまたはそれらの部分DNAを、例えば放射性同位元素または色素などで標識することによって、本発明のタンパク質をコードするDNAもしくはその相補DNAまたはそれらの部分DNAに結合したOtx2mRNAの量が容易に測定できる。放射性同位元素としては、例えば32Pまたは3Hなどが用いられ、色素としては、例えばfluorescein、FAM(PE Biosystems社製)、JOE(PE Biosystems社製)、TAMRA(PE Biosystems社製)、ROX(PE Biosystems社製)、Cy5(Amersham社製)またはCy3(Amersham社製)などの蛍光色素が用いられる。また、Otx2mRNAの量は、細胞から抽出したRNAを逆転写酵素によってcDNAに変換した後、本発明のタンパク質をコードするDNAもしくはその相補DNAまたはそれらの部分DNAをプライマーとして用いるPCRによって、増幅されるcDNAの量を測定することによっても行うことができる。
Otx2タンパク質をコードするDNAの公知プロモーターやエンハンサー領域をゲノムDNAよりクローニングし、適当なレポーター遺伝子の上流に連結させた組換えDNAで形質転換した細胞を試験化合物の存在下で培養し、Otx2タンパク質の発現に代えてレポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする、Otx2タンパク質をコードするDNAのプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、ひいては網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。レポーター遺伝子としては、例えば、lacZ(β−ガラクトシダーゼ遺伝子)などの染色マーカー遺伝子等などが用いられる。レポーター遺伝子産物(例、mRNA、タンパク質)の量を公知の方法を用いて測定することによって、レポーター遺伝子産物の量を増加させる試験化合物をOtx2遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの活性を促進する作用を有する化合物、すなわちOtx2タンパク質またはその部分ペプチドの発現を促進する活性を有する化合物として選択できる。
以上述べてきた本発明のスクリーニング方法において試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング用キットには上記スクリーニング方法を実施するため、例えば、(a)Otx2タンパク質、その部分ペプチドを発現する能力を有する細胞、(b)本発明のタンパク質をコードするDNAもしくはその相補DNAまたはそれらの部分DNA、または(c)Otx2タンパク質をコードするDNAのプロモーターもしくはエンハンサーをレポーター遺伝子に連結させたDNAで形質転換した細胞などを含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上述した網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤や、網膜視細胞への分化誘導剤などの医薬として有用である。該化合物もしくはその塩、それらを含有する網膜疾患の予防、治療もしくは進行抑制剤、またはそれらを含有する網膜視細胞への分化誘導剤は、前記の本発明のタンパク質またはDNA等と同様にして実施することができる。
レトロウイルス産生用培養細胞(Phoenix cell line)を用いて、コントロールウイルスベクターとOtx2ウイルスベクターをそれぞれ作製し、得られたウイルスを、超遠心(スイングローター、2,1000rpm、4℃、2時間)によって濃縮し、1×107pfu(plaque forming unit)/mlの感染効率を持つウイルス液をそれぞれ作製した。
次に、第2図に示すように、出生直後(生後0日)の子ラットに低温麻酔を施し、眼部を覆う皮膚を手術用ハサミで切開した。子ラットの網膜下にインジェクションニードル(Hamilton社製)を用いて、上記のコントロールウイルスベクター又はOtx2ウイルスベクターのウイルス液を5μl注入した。注入後、子ラットを37℃で20分間程暖め体温を回復させた後、母ラットの飼育ケージに戻して引き続き4〜6週間飼育した。
成体に育ったラットにペントバルビタールNaを投与して安楽死させた。ラットより眼を摘出し、次に網膜を取り出した。網膜を、4%パラホルムアルデヒド溶液を用いて一晩、4℃にて固定した。4%パラホルムアルデヒド溶液をPBS(Phosphate Buffer Saline)に交換し、固定した網膜を洗浄した。この固定・洗浄操作を3回繰り返した。次に、4%パラホルムアルデヒド溶液で固定した網膜を65℃で熱処理し、内在性のアルカリホスファターゼを不活化させた。熱処理した網膜をアルカリホスファターゼ染色液で染色し(室温、3時間)、上記ウイルスに感染した網膜細胞のみを青紫色に染色した。この染色された網膜を4%パラホルムアルデヒド溶液にて一晩再固定後、PBSで洗浄し、次いで30%Sucrose/PBS溶液に一晩浸漬した後、OTScompound(Sakura Finetek社)液中に移してドライアイス上で網膜の凍結ブロックを作製した。凍結切片作製装置(カールツアイス社)を用いて、凍結ブロックから約30μmの凍結切片を作製し、光学顕微鏡(カールツアイス社)下にて観察した。
網膜の各細胞の種類を、その形態と位置によって同定した(第3図参照)。これを独立した試験で3回行った。一視野内に見られる全細胞数に対するそれぞれの細胞の存在率を第4図示す。Otx2ウイルスベクターを網膜幹細胞(あるいは網膜前駆細胞)に導入した場合、網膜視細胞数はコントロールウイルスベクターを導入した場合に比べて約10%増加した。このことから、Otx2遺伝子の発現により、網膜幹細胞から双極細胞、アマクリン細胞ならびにミューラーグリア細胞への分化は強く抑制され、網膜幹細胞はほとんど網膜視細胞に分化することが分かった。
以上の結果より、Otx2遺伝子を未分化の網膜幹細胞に導入し、該細胞内でOtx2遺伝子を発現させることにより、ラットの未分化網膜幹細胞を網膜視細胞に有効に分化させることが可能であることが確認された。
(1) Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤、
(2) Otx2タンパク質が、配列番号:1、配列番号:3もしくは配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一または前記配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である前記(1)記載の剤、
(3) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有する網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤、
(4) DNAが、配列番号:2、配列番号:4もしくは配列番号:6で表される塩基配列または前記配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有する前記(3)記載の剤、
(5) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有する組換えベクターを含有する前記(3)記載の剤、
(6) Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする網膜視細胞への分化誘導剤、
(7) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有する網膜視細胞への分化誘導剤、
(8) Otx2タンパク質を発現させるか、またはOtx2タンパク質の発現量を上昇させることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導方法、
(9) 眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞において、Otx2タンパク質を発現させるか、またはOtx2タンパク質の発現量を上昇させることを特徴とする前記(8)に記載の網膜視細胞への分化誘導方法、
(10) 眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞に、Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを導入し、得られた細胞を培養することを特徴とする前記(8)に記載の網膜視細胞への分化誘導方法、
(11) Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする網膜疾患の予防、治療または進行抑制方法、
(12) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする網膜疾患の予防、治療または進行抑制方法、
(13) Otx2タンパク質により分化誘導された網膜視細胞またはその前駆細胞を網膜に移植することを特徴とする網膜の再生方法、
(14) 網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤の製造のためのOtx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の使用、
(15) 網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤の製造のためのOtx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAの使用、
(16) Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体を含有する網膜疾患の診断剤、
(17) Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体を用いることを特徴とする網膜疾患の診断方法、
(18) Otx2タンパク質、その部分ペプチドの発現量または変異を検出することを特徴とする網膜疾患の診断方法、
(19) (a)Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするDNAもしくはRNA、または(b)該DNAもしくはRNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス・ポリヌクレオチドを含有する網膜疾患の診断剤、
(20) (a)Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするDNAもしくはRNA、または(b)該DNAもしくはRNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス・ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする網膜疾患の診断方法、
(21) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドの発現または発現量の上昇を指標とすることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(22) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を用いることを特徴とする前記(21)記載のスクリーニング方法、
(23) Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を含有することを特徴とする網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(24) 前記(21)もしくは(22)記載のスクリーニング方法、または前記(23)記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩、
(25) 前記(24)に記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
に関する。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、(i)本発明のタンパク質をコードするDNAを含むDNA断片を例えばcDNAから切り出し、(ii)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、キャップ構造、蛋白質合成開始シグナル、選択マーカー、標識マーカー、SV40複製オリジンなどを含有しているものを用いることができる。
標識マーカーとしては、アルカリホスファターゼ(以下、APと略称する場合がある。)遺伝子、縁色蛍光蛋白質(GFP)遺伝子などを好ましく用いることができる。
また、ベクターとしてウイルスを用いる場合には、翻訳機構を高めるため、蛋白質合成開始シグナルとしてIRES(内部リボゾーム結合サイト)配列を配することが好ましい。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),60巻,160(1968)〕,JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research),9巻,309(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology),120巻,517(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,41巻,459(1969)〕,C600〔ジェネティックス(Genetics),39巻,440(1954)〕,DH5α〔Inoue,H.,Nojima,H.and Okayama,H.,Gene,96,23-28(1990)〕,DH10B〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),87巻,4645−4649(1990)〕などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔ジーン(Gene),24巻,255(1983)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),95巻,87(1984)〕などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R−,NA87−11A,DKD−5D,20B−12、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913,NCYC2036、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。
sphere を以下の操作に供してもよい。
眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞、好ましくは前記神経幹細胞または神経前駆細胞に、本発明のDNA等および所望により他の遺伝子を導入する方法としては、特に限定されず、公知の方法を用いてよいが、例えば、アデノウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法、レトロウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法、アデノ随伴ウイルスを用いる遺伝子導入方法、リポフェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。導入効率の観点から、好ましくは、アデノウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法およびレトロウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法が望ましい。
(i)まず、モノクロナール抗体産生細胞の作製について述べる。本発明のタンパク質等は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジまたはヤギが挙げられるが、マウスまたはラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法(ネイチャー(Nature)、256巻、495頁(1975年))に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、NS−1、P3U1、SP2/0などが挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PEG(好ましくは、PEG1000〜PEG6000)が10〜80%程度の濃度で添加され、約20〜40℃、好ましくは約30〜37℃で約1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を作製できる。
1640培地、約1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光純薬工業株式会社製)またはハイブリドーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬株式会社製)などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃程度、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間程度、好ましくは1週間〜2週間程度である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原(本発明のタンパク質等)とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造方法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば特に限定されないが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステルまたはチオール基もしくはジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。ハプテンとキャリアーの縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行うことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液または腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製方法に従って行うことができる。
Otx2タンパク質またはその部分ペプチドの発現または発現量の上昇を指標として、網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングは、例えば、Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を用いて行うことができる。
以上述べてきた本発明のスクリーニング方法において試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上述した網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤や、網膜視細胞への分化誘導剤などの医薬として有用である。該化合物もしくはその塩、それらを含有する網膜疾患の予防、治療もしくは進行抑制剤、またはそれらを含有する網膜視細胞への分化誘導剤は、前記の本発明のタンパク質またはDNA等と同様にして実施することができる。
次に、第2図に示すように、出生直後(生後0日)の子ラットに低温麻酔を施し、眼部を覆う皮膚を手術用ハサミで切開した。子ラットの網膜下にインジェクションニードル(Hamilton社製)を用いて、上記のコントロールウイルスベクター又はOtx2ウイルスベクターのウイルス液を5μl注入した。注入後、子ラットを37℃で20分間程暖め体温を回復させた後、母ラットの飼育ケージに戻して引き続き4〜6週間飼育した。
第2図はウイルス感染実験の概要を示す図である。図中、Retinaは網膜、Pigment Epitheliumは網膜色素上皮、virusはウイルスが感染する範囲、Remove Retinaは網膜摘出、Fix and Stainは組織の固定と染色、Section and Analyse Clonesは凍結切片とその解析を表す。
第3図はアルカリホスファターゼ染色後の網膜凍結切片像の例を示す図である。図中、Biは双極細胞、Aはアマクリン細胞、Rは網膜視細胞、Mはミューラーグリア細胞、R+Biは網膜視細胞とミューラーグリア細胞、A+Biはアマクリン細胞と双極細胞を表す。
第4図はコントロールウイルスベクター(LIA)又はOtx2ウイルスベクター(Otx2/LIA)が感染した網膜幹細胞から分化した細胞それぞれの、顕微鏡一視野における全細胞数に対する存在率を示す図である。
Claims (25)
- Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤。
- Otx2タンパク質が、配列番号:1、配列番号:3もしくは配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一または前記配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である請求の範囲第1項に記載の剤。
- Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有する網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤。
- DNAが、配列番号:2、配列番号:4もしくは配列番号:6で表される塩基配列または前記配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有する請求の範囲第3項に記載の剤。
- Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有する組換えベクターを含有する請求の範囲第3項に記載の剤。
- Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする網膜視細胞への分化誘導剤。
- Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有する網膜視細胞への分化誘導剤。
- Otx2タンパク質を発現させるか、またはOtx2タンパク質の発現量を上昇させることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導方法。
- 眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞において、Otx2タンパク質を発現させるか、またはOtx2タンパク質の発現量を上昇させることを特徴とする請求の範囲第8項に記載の網膜視細胞への分化誘導方法。
- 眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞に、Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを導入し、得られた細胞を培養することを特徴とする請求の範囲第8項に記載の網膜視細胞への分化誘導方法。
- Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする網膜疾患の予防、治療または進行抑制方法。
- Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする網膜疾患の予防、治療または進行抑制方法。
- Otx2タンパク質により分化誘導された網膜視細胞またはその前駆細胞を網膜に移植することを特徴とする網膜の再生方法。
- 網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤の製造のためのOtx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の使用。
- 網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤の製造のためのOtx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAの使用。
- Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体を含有する網膜疾患の診断剤。
- Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体を用いることを特徴とする網膜疾患の診断方法。
- Otx2タンパク質、その部分ペプチドの発現量または変異を検出することを特徴とする網膜疾患の診断方法。
- (a)Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするDNAもしくはRNA、または(b)該DNAもしくはRNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス・ポリヌクレオチドを含有する網膜疾患の診断剤。
- (a)Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするDNAもしくはRNA、または(b)該DNAもしくはRNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス・ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする網膜疾患の診断方法。
- Otx2タンパク質またはその部分ペプチドの発現または発現量の上昇を指標とすることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
- Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を用いることを特徴とする請求の範囲第21項に記載のスクリーニング方法。
- Otx2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を含有することを特徴とする網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
- 請求の範囲第21項もしくは第22項に記載のスクリーニング方法、または請求の範囲第23項に記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩。
- 請求の範囲第24項に記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
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