JP2003033199A

JP2003033199A - スクリーニング方法

Info

Publication number: JP2003033199A
Application number: JP2002121813A
Authority: JP
Inventors: Akiyoshi Tani; 昭義谷; Susumu Honda; 進本多; Tsuneo Yasuma; 常雄安間
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-04-25
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2003-02-04

Abstract

(57)【要約】【課題】骨（または軟骨）形成や骨芽細胞（または軟
骨細胞）分化などの調節に関与する生体物質を同定し、
その生体物質の生理活性を調節し得る物質のスクリーニ
ング手段を提供し、それによって骨疾患に対して優れた
予防・治療効果を有する薬剤を提供する。【解決手段】ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ
２）、その部分ペプチドまたはその塩を用いることを特
徴とする骨に対する作用を有する化合物またはその塩の
スクリーニング方法、該方法により得られる化合物を含
有してなる骨作用剤を提供する。また、ＮＱＯ２の発現
もしくは活性を阻害もしくは促進することを含む、ヒト
や哺乳動物の骨疾患予防・治療方法を提供する。さら
に、ＮＱＯ２またはその部分ペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、あるいはＮＱＯ２、その部分ペプチドま
たはその塩に対して特異的親和性を有する抗体を含有し
てなる骨疾患診断薬を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＮＲＨ：キノン酸
化還元酵素（ＮＱＯ２）を用いる骨疾患治療薬のスクリ
ーニング方法などに関する。

【０００２】

【従来の技術】骨疾患には、骨折、骨変形・変形脊椎
症、骨肉腫、骨髄腫、骨形成不全、側弯症等の非代謝性
骨疾患、および骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、線維性骨
炎、腎性骨異栄養症、骨ぺーチェット病等の代謝性骨疾
患があるが、近年代謝性骨疾患が問題となっている。例
えば、代謝性骨疾患の一つである骨粗鬆症は、低骨量及
び骨組織の微細構造の変化によって生じる骨脆弱性およ
び易骨折症の増加を特徴とする全身性の疾患でありその
主な臨床症状は、後彎、腰背骨ならびに椎体、大腿骨頸
部、橈骨下端、肋骨、上腕骨上端などの骨折である。骨
組織では、常に骨形成と骨吸収による骨破壊とがバラン
スを保ちながら繰り返されており、骨形成では前駆骨芽
細胞を含めた骨芽細胞が、骨吸収では破骨細胞が中心的
な役割を担っており、その骨形成と骨吸収による骨破壊
とのバランスが崩れるときに骨の量的減少をともなう。
従来、骨粗鬆症の予防・治療薬としては、エストロゲン
剤、カルシトニン、ビスホスホネート等の骨吸収抑制物
質が主に使用されてきた。また、関節疾患は関節軟骨の
変性を主病変とする疾患（例えば、慢性関節リウマチま
たは変形性関節症等）である。軟骨はコラーゲンとプロ
テオグリカンによって構成される組織であるが、様々な
原因により、この軟骨組織からプロテオグリカン遊離が
促進され，かつ組織におけるプロテオグリカンの合成能
が低下し始める。同時にコラゲナーゼ−３などのマトリ
ックスメタロプロテアーゼの遊離・活性化が亢進し軟骨
組織のコラーゲンが分解される。これらの一連の反応に
よって軟骨組織の硬化および破壊が進み、次いで、病変
の進行により滑膜の増性、軟骨下骨の破壊、関節辺縁部
の軟骨肥大あるいは骨新生がおこり、関節の変形を経
て、重篤な場合には機能不全に至る。関節疾患は膝関節
に最も高頻度にみられるが、肘、股、足、指関節にもみ
られる。関節疾患のなかでも最も患者数の多い疾患は変
形性関節症であるが、本疾患の原因の一つとして加齢が
考えられているため、これからの高齢化社会においては
患者の増加が予想される。治療法としては、軟骨変性・
軟骨下骨硬化および破壊に伴う痛みを取る目的から鎮痛
消炎剤やヒアルロン酸製剤が用いられている。しかしな
がら、いずれも対症療法的に用いられているに過ぎず、
十分な効果はあげていない。軟骨形成促進、軟骨破壊抑
制および前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞の分化誘導促進
をはかることは、軟骨疾患の予防と治療に有効と考えら
れる。骨または関節疾患（例、軟骨疾患）の臨床におい
ては、その予防・治療に優れた効果を発揮する薬剤が今
なお望まれている。とりわけ、軟骨疾患に代表される関
節疾患に対する予防・治療に優れた薬剤が望まれてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、骨（または
軟骨）形成や骨芽細胞（または軟骨細胞）分化などの調
節に関与する生体物質を同定し、その生体物質の生理活
性を調節し得る物質のスクリーニング手段を提供するこ
とにより、骨疾患（以下、本明細書においては、骨また
は関節における疾患を包括して「骨疾患」と称する）に対
して優れた予防・治療効果を有する薬剤を提供すること
を目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、骨分化誘導
活性を示すクロモン誘導体が、予想外にもＮＲＨ：キノ
ン酸化還元酵素（ＮＱＯ２）の活性を阻害することを見
いだした。本発明者らは、これらの知見に基づき、ＮＱ
Ｏ２を用いることにより骨疾患に対する予防・治療効果
を有する物質を効率よくスクリーニングできることを見
いだした。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さ
らに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）ＮＲＨ：キノ
ン酸化還元酵素（ＮＱＯ２）、その部分ペプチドまたは
その塩を用いることを特徴とする骨に対する作用を有す
る化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２）骨
に対する作用が骨形成促進作用、骨芽細胞分化誘導作
用、骨芽細胞分化誘導促進作用、軟骨形成促進作用、軟
骨細胞分化誘導作用、軟骨細胞分化誘導促進作用または
ＢＭＰ作用増強作用である第（１）項記載のスクリーニ
ング方法、（３）骨に対する作用が骨形成阻害作用、骨
芽細胞分化阻害作用、骨芽細胞分化誘導阻害作用、軟骨
形成阻害作用、軟骨細胞分化阻害作用、軟骨細胞分化誘
導阻害作用またはＢＭＰ作用抑制作用である第（１）項
記載のスクリーニング方法、（４）（ｉ）ＮＱＯ２、そ
の部分ペプチドまたはその塩に基質を接触させた場合と
（ii）ＮＱＯ２、その部分ペプチドまたはその塩に基質
および試験化合物を接触させた場合の骨に対する作用の
比較を行なうことを特徴とする第（１）項記載のスクリ
ーニング方法、（５）ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（Ｎ
ＱＯ２）、その部分ペプチドまたはその塩を含有する、
骨に対する作用を有する化合物またはその塩のスクリー
ニング用キット、（６）第（１）項記載のスクリーニン
グ方法または第（５）項記載のスクリーニング用キット
を用いて得られる骨に対する作用を有する化合物または
その塩、（７）第（１）項記載のスクリーニング方法ま
たは第（５）項記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる化合物またはその塩を含有してなる骨作用剤、
（８）ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ２）阻害作
用を有する化合物またはその塩を含有してなる骨疾患の
予防・治療剤、（９）骨形成促進剤、骨芽細胞分化誘導
剤、骨芽細胞分化誘導促進剤、軟骨形成促進剤、軟骨細
胞分化誘導剤、軟骨細胞分化誘導促進剤またはＢＭＰ作
用増強剤である第（８）項記載の剤、（１０）骨折、再
骨折、骨変形・変形脊椎症、骨肉腫、骨髄腫、骨形成不
全、側弯症、骨欠損、骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、線
維性骨炎、腎性骨異栄養症、骨ぺーチェット病、硬直性
脊髄炎症、変形性関節症または慢性関節リウマチの予防
・治療剤である第（８）項記載の剤、（１１）ＮＲＨ：
キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ２）促進作用を有する化合
物またはその塩を含有してなる骨疾患の予防・治療剤、
（１２）ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ２）をコ
ードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはそ
の一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる
骨疾患の予防・治療剤、（１３）ＮＲＨ：キノン酸化還
元酵素（ＮＱＯ２）、その部分ペプチドまたはその塩に
対する抗体を含有してなる骨疾患の予防・治療剤、（１
４）ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ２）、その部
分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる骨
疾患の診断薬、（１５）哺乳動物体内におけるＮＲＨ：
キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ２）の発現もしくは活性
を、骨疾患の予防・治療に有効な程度阻害もしくは促進
することを含む、該哺乳動物の骨疾患の予防・治療方
法、（１６）ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ２）
の発現もしくは活性を阻害もしくは促進する化合物また
はその塩を、骨疾患の予防・治療に有効な量哺乳動物に
投与することを含む、該哺乳動物の骨疾患の予防・治療
方法、および（１７）骨疾患の予防・治療剤の製造のた
めの、ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ２）の発現
もしくは活性を阻害もしくは促進する化合物またはその
塩の使用を提供する。

【０００６】

【発明の実施の形態】［１］ＮＱＯ２蛋白質本発明のスクリーニング方法に用いられるＮＱＯ２（以
下、本発明の蛋白質という場合もある）は、配列番号：
２または４で表わされるアミノ酸配列またはそれと実質
的に同一のアミノ酸配列を含有し、ＮＲＨ：キノン酸化
還元作用を有する酵素であれば如何なるものであっても
よい。また、ＮＱＯ２は、ヒトや他の哺乳動物（例え
ば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツ
ジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細
胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メ
サンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮
細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪
細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基
球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨
細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは
間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしく
はガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞
が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位
（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下
部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭
葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂
体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、
骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小
腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢
血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関
節、骨格筋などに由来する蛋白質であってもよく、また
合成蛋白質であってもよい。

【０００７】配列番号：２または４で表わされるアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例え
ば、配列番号：２または４で表わされるアミノ酸配列と
約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましく
は約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なか
でも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％
以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：２または４で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例
えば、配列番号：２または４で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２ま
たは４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性
を有する蛋白質などが好ましい。実質的に同質の活性と
しては、例えば、ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素活性など
が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質
的に同質であることを示す。したがって、還元酵素活性
などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好まし
くは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２
倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋
白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。Ｎ
ＲＨ：キノン酸化還元酵素活性などの活性の測定は、自
体公知の方法に準じて行なうことができる。

【０００８】また、本発明のスクリーニング方法に用い
られるＮＱＯ２としては、配列番号：２または４で表
わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましく
は、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失
したアミノ酸配列、配列番号：２または４で表わされ
るアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜
３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好
ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミ
ノ酸配列、配列番号：２または４で表わされるアミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個
程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたア
ミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。これら
ＮＱＯ２は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末
端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）
である。配列番号：２または４で表わされるアミノ酸配
列を含有するＮＱＯ２をはじめとする、本発明のスクリ
ーニング方法に用いられるＮＱＯ２は、Ｃ末端が通常カ
ルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート
(−ＣＯＯ⁻）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ
_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。こ
こでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エ
チル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル
などのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、
シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例え
ば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール
基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ
_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα
−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラ
ルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバ
ロイルオキシメチル基などが用いられる。ＮＱＯ２がＣ
末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）
を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエ
ステル化されているものもＮＱＯ２に含まれる。この場
合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステ
ルなどが用いられる。さらに、ＮＱＯ２には、上記した
蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が
保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６
アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護さ
れているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグル
タミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミ
ノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミ
ノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基な
ど）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルな
どのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基な
ど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したい
わゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。本発
明のスクリーニング方法に用いられるＮＱＯ２の具体例
としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸
配列を含有するヒト由来ＮＱＯ２、配列番号：４で表わ
されるアミノ酸配列を含有するマウス由来ＮＱＯ２など
が用いられる。

【０００９】［２］部分ペプチドＮＱＯ２の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記す
る場合がある）としては、上記したＮＱＯ２の部分ペプ
チドであれば何れのものであってもよいが、例えば、Ｎ
ＲＨ：キノン酸化還元酵素活性を有するものなどが用い
られる。部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＮＱ
Ｏ２の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、
好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上の
アミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。実質的
に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約５
０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約
７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも
好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上
の相同性を有するアミノ酸配列を示す。ここで、「実質
的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的
に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができ
る。また、部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好
ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、また
は、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましく
は、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加
し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、
さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミ
ノ酸で置換されていてもよい。また、部分ペプチドはＣ
末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボ
キシレート（−ＣＯＯ⁻）であるが、上記した本発明の
蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）また
はエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、部
分ペプチドには、上記したＮＱＯ２と同様に、Ｎ末端の
メチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているも
の、Ｎ端側が生体内で切断され生成したGlnがピログル
タミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換
基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖
が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなど
も含まれる。また、部分ペプチドはＣ末端が通常カルボ
キシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−Ｃ
ＯＯ⁻）であるが、上記した本発明の蛋白質のごとく、
Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−Ｃ
ＯＯＲ）であってもよい。ＮＱＯ２またはその部分ペプ
チドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容さ
れる塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付
加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。

【００１０】［３］ＮＱＯ２またはその部分ペプチドの
合成ＮＱＯ２またはその塩は、上記したヒトや他の哺乳動物
の細胞または組織から自体公知のＮＱＯ２の精製方法に
よって製造することもできるし、後に記載するＮＱＯ２
をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養するこ
とによって、あるいは該ＤＮＡからウサギ網状赤血球抽
出液や小麦胚芽抽出液由来の無細胞翻訳系を用いたイン
ビトロ合成によっても製造することができる。また、後
に記載する蛋白質合成法またはこれに準じて製造するこ
ともできる。ＮＱＯ２またはその塩をヒトや他の哺乳動
物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや他の哺乳
動物の組織または細胞をホモジナイズした後、超音波処
理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこから
蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜
組み合わせることにより精製することができる。このよ
うな分離技術としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の
溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾
過、非変性ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）、
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等の分子量の差を利用する方法、
イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト
クロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニ
ティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する
方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差
を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用
する方法などが挙げられる。ＮＱＯ２もしくはその部分
ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、
通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そ
のような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒ
ドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミ
ノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール
樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹
脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミド
メチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，
４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノ
キシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆ
mocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることが
できる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官
能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の
配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で
縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと
同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子
内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質ま
たはそのアミド体を取得する。

【００１１】上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、
蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることが
できるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイ
ミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカ
ルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミ
ノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これら
による活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢ
t、ＨＯＯＢt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加
するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢtエステル
あるいはＨＯＯＢtエステルとしてあらかじめ保護アミ
ノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができ
る。保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる
溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知ら
れている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチ
レン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリ
フルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスル
ホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサ
ン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニト
リル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチ
ル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜
の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成
反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選
択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択さ
れる。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍
過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの
結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うこと
なく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なう
ことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られ
ないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを
用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂoc、
ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニル
オキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボ
ニル、Ｃl-Ｚ、Ｂr-Ｚ、アダマンチルオキシカルボニ
ル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２
−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノ
チオイル、Ｆmocなどが用いられる。カルボキシル基
は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エ
チル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロ
ペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオ
クチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしく
は環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化
（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエス
テル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベン
ジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシ
ルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド
化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、ト
リチルヒドラジド化などによって保護することができ
る。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエー
テル化によって保護することができる。このエステル化
に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル
化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、t-ブチル基などである。チロシンのフ
ェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂzl、Ｃ
l_２-Ｂzl、２−ニトロベンジル、Ｂr-Z、ターシャリー
ブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの
保護基としては、例えば、Ｔos、４-メトキシ-２，３，
６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジル
オキシメチル、Ｂum、Ｂoc、Ｔrt、Ｆmocなどが用いら
れる。原料のカルボキシル基の活性化されたものとして
は、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル
〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，
４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェ
ノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロ
キシフタルイミド、ＨＯＢt）とのエステル〕などが用
いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとして
は、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。保護
基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐd-黒あるい
はＰd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触
還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、ト
リフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるい
はこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピル
エチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラ
ジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリ
ウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱
離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれ
るが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノ
ール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾー
ル、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、
１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤
の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール
保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基は
チオフェノール処理により除去され、トリプトファンの
インドール保護基として用いられるホルミル基は上記の
１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール
などの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナ
トリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理に
よっても除去される。原料の反応に関与すべきでない官
能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、
反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公
知の手段から適宜選択しうる。

【００１２】蛋白質のアミド体を得る別の方法として
は、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カル
ボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペ
プチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペ
プチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた
蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去し
た蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記したような混
合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記
と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を精製し
た後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の
粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質は既知の各
種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥する
ことで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。蛋
白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端
アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と
縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質のアミド体と
同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得ることがで
きる。ＮＱＯ２の部分ペプチドまたはその塩は、自体公
知のペプチドの合成法に従って、あるいはＮＱＯ２を適
当なペプチダーゼで切断することによって製造すること
ができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合
成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、
ＮＱＯ２を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と
残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は
保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造する
ことができる。公知の縮合方法や保護基の脱離として
は、例えば、以下の〜に記載された方法が挙げられ
る。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptide),
Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、蛋白
質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合成
広川書店また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な
塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。

【００１３】［４］ＮＱＯ２をコードするポリペプチドＮＱＯ２をコードするポリヌクレオチドとしては、上記
したＮＱＯ２をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、好ましくはＤＮ
Ａ）を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。該ポリヌクレオチドとしては、ＮＱＯ２をコードす
るＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であって
も、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖Ｄ
ＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッ
ドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コ
ード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コ
ード鎖）であってもよい。ＮＱＯ２をコードするポリヌ
クレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新
ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載の方法またはそれ
に準じた方法により、ＮＱＯ２のｍＲＮＡを定量するこ
とができる。ＮＱＯ２をコードするＤＮＡとしては、ゲ
ノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤ
ＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライ
ブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、
プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであっ
てもよい。また、上記した細胞・組織よりtotalＲＮＡ
またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Revers
e Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、
ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもで
きる。具体的には、ＮＱＯ２をコードするＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：１で表される塩基配列の第１７
６番目〜第８６８番目の塩基配列（以下、塩基配列１と
いう）または配列番号：３で表わされる塩基配列の第１
５２番目〜第８４４番目の塩基配列（以下、塩基配列３
という）を含有するＤＮＡ、または塩基配列１または塩
基配列３とハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする塩基配列を有し、ＮＱＯ２と実質的に同質の活
性（例、還元酵素活性など）を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡであれば何れのものでもよい。塩基配列１また
は塩基配列３とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、
例えば、塩基配列１または塩基配列３と約７０％以上、
好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００１４】ハイブリダイゼーションは、自体公知の方
法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２nd Edition（J.
Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 19
89）に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好
ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なう
ことができる。該ハイストリンジェントな条件とは、例
えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは
約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましく
は約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度
が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：２で表わされるアミノ酸配
列を含有するヒト由来ＮＱＯ２をコードするＤＮＡとし
ては、塩基配列１を含有するＤＮＡなどが、配列番号：
４で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス由来ＮＱ
Ｏ２をコードするＤＮＡとしては、塩基配列３を含有す
るＤＮＡなどが用いられる。

【００１５】［５］アンチセンスヌクレオチドＮＱＯ２をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または
該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるヌク
レオチドとは、下記のＮＱＯ２の部分ペプチドをコード
するＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含す
る意味で用いられる。目的核酸の標的領域と相補的な塩
基配列を含むヌクレオチド、即ち、目的核酸とハイブリ
ダイズすることができるヌクレオチドは、該目的核酸に
対して「アンチセンス」であるということができる。一
方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含
むヌクレオチド（即ち、目的核酸が蛋白質をコードする
場合、その蛋白質の部分ペプチドをコードするヌクレオ
チド）は、該目的核酸に対して「センス」であるという
ことができる。本明細書で用いる用語「対応する」と
は、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸
の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であるこ
とを意味する。ここで「相同性を有する」または「相補
的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましく
は約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好
ましくは約９５％以上の同一性または相補性を有するこ
とをいう。また、ヌクレオチド、塩基配列または核酸と
ペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、そのペ
プチド（蛋白質）がヌクレオチド（核酸）またはその相
補体の配列から翻訳されるアミノ酸配列を有することを
通常指している。ＮＱＯ２遺伝子のアンチセンスヌクレ
オチド（核酸）は、クローン化した、あるいは決定され
たＮＱＯ２をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき
設計し、合成しうる。そうしたヌクレオチド（核酸）は
ＮＱＯ２遺伝子の複製または発現を阻害することができ
る。例えば、ＮＱＯ２遺伝子から転写されるＲＮＡとハ
イブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセ
ッシング）または機能（ＮＱＯ２への翻訳）を阻害する
ことができるか、あるいはＮＱＯ２関連ＲＮＡとの相互
作用を介してＮＱＯ２遺伝子の発現を調節・制御するこ
とができる。ＮＱＯ２関連ＲＮＡの選択された配列に相
補的なヌクレオチド、およびＮＱＯ２関連ＲＮＡと特異
的にハイブリダイズすることができるヌクレオチドは、
生体内および生体外でＮＱＯ２遺伝子の発現を調節・制
御するのに有用であり、また病気などの治療または診断
に有用である。

【００１６】ＮＱＯ２遺伝子のアンチセンスヌクレオチ
ドの標的領域は、アンチセンスヌクレオチドがハイブリ
ダイズすることにより、結果としてＮＱＯ２蛋白質の翻
訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はな
く、ＮＱＯ２ｍＲＮＡの全配列であっても部分配列で
あってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いもので
ｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合
成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３
０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに
限定されない。具体的には、例えば、ＮＱＯ２遺伝子の
５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピー
ト、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、
蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻
訳領域、３’端パリンドローム領域、エクソン・イント
ロン境界領域および３’端ヘアピンループが標的領域と
して選択しうるが、ＮＱＯ２遺伝子内の如何なる領域も
標的として選択しうる。ＮＱＯ２遺伝子のイントロン部
分を標的領域とすることもまた好ましい。さらに、ＮＱ
Ｏ２のアンチセンスヌクレオチドは、ＮＱＯ２ｍＲＮ
ＡもしくはＮＱＯ２遺伝子の初期転写産物とハイブリダ
イズしてＮＱＯ２蛋白質への翻訳を阻害するだけでな
く、二本鎖ＤＮＡであるＮＱＯ２遺伝子と結合して三重
鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し
得るものであってもよい。アンチセンスヌクレオチド
は、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているデオキ
シヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているデオキシ
ヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリ
コシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは
非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例え
ば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリ
マー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー
（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるよ
うな塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をも
つヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それら
は、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本
鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであるこ
とができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修
飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加さ
れたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、
キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上
の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内
ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例
えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホス
ホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷
を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例
えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビタ
ー、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リ
ジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）など
の側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物
（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、
キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、
ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル
化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例え
ば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで
「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」と
は、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでな
く、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなもの
を含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化された
プリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよび
ピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであっ
てよい。修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾さ
れていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンと
か、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテ
ル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。

【００１７】アンチセンスヌクレオチド（核酸）は、Ｒ
ＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮ
Ａ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫
黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレ
オシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗
性のものが挙げられるが、それに限定されるものではな
い。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ま
しく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス
核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞
透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和
性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるなら
アンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こう
した修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J.
Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247,
1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. e
d., Antisense Research and Applications, CRC Pres
s, 1993 などに開示がある。アンチセンス核酸は、変化
せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有して
いて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な
形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、
付加された形態で与えられることができうる。こうして
付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電
荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオ
ン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを
増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレ
ステロールなど）といった粗水性のものが挙げられる。
付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやそ
の誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コ
ール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の
３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、
糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることが
できうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは
５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソ
ヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分
解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャッ
プ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエ
チレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該
分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに
限定されるものではない。ＮＱＯ２ｍＲＮＡもしくは
ＮＱＯ２遺伝子の初期転写産物を、コード領域の内部
（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異
的に切断し得るリボザイムもまた、本発明のアンチセン
スヌクレオチドに包含され得る。「リボザイム」とは核
酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近で
は当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも
同様に核酸切断活性を有することが明らかになっている
ので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する
限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。
リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイ
ロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセル
フスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘ
アピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０
塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をと
る部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩
基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列に
することにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断する
ことが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡ
のみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することが
ないというさらなる利点を有する。ＮＱＯ２ｍＲＮＡ
が自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼ
と特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチー
フを連結したハイブリッドリボザイムを用いることによ
り、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さ
らに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発
現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞
質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列
をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることも
できる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (200
1)］。

【００１８】ＮＱＯ２ｍＲＮＡもしくはＮＱＯ２遺伝
子の初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写
産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖
オリゴＲＮＡもまた、本発明のアンチセンスヌクレオチ
ドに包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入す
るとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわ
ゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前か
ら線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現
象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されたことから
［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイム
の代替技術として注目されている。本発明のアンチセン
スオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、ＮＱＯ２のｃ
ＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列情報に基づい
てｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、
市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオ
システムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補
的な配列を合成することにより調製することができる。
ＲＮＡｉ活性を有する二本鎖オリゴＲＮＡは、センス鎖
及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれ
ぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、
約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜
約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることによ
り調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレ
オチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、
これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーショ
ンすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを
調製することもできる。本発明のアンチセンス核酸のＮ
ＱＯ２発現阻害活性は、ＮＱＯ２をコードするＤＮＡを
含有する形質転換体、生体内や生体外のＮＱＯ２遺伝子
発現系またはＮＱＯ２の生体内や生体外の翻訳系を用い
て調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方
法で細胞に適用できる。

【００１９】［６］ＮＱＯ２の部分ペプチドをコードす
るＤＮＡＮＱＯ２の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、
上記したＮＱＯ２の部分ペプチドをコードする塩基配列
を含有するものであればいかなるものであってもよい。
また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記
した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由
来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよ
い。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオフ
ァージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいず
れであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲ
ＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcri
ptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ
法と略称する）によって増幅することもできる。具体的
には、ＮＱＯ２の部分ペプチドをコードするＤＮＡとし
ては、例えば、（１）塩基配列１または塩基配列３を有
するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または
（２）塩基配列１または塩基配列３とハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、Ｎ
ＱＯ２ペプチドと実質的に同質の活性（例、還元酵素活
性など）を有するＮＱＯ２をコードするＤＮＡの部分塩
基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。塩基配列１ま
たは塩基配列３とハイストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、塩基配列１
または塩基配列３と約７０％以上、好ましくは約８０％
以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約
９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ
などが用いられる。

【００２０】［７］ＮＱＯ２またはその部分ペプチドを
コードするＤＮＡの製法ＮＱＯ２またはその部分ペプチド（以下、一括してＮＱ
Ｏ２と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡ
のクローニングの手段としては、ＮＱＯ２の部分塩基配
列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によ
って増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤ
ＮＡをＮＱＯ２の一部あるいは全領域をコードするＤＮ
Ａ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハ
イブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラ
ー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Samb
rook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）
に記載の方法などに従って行なうことができる。また、
市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書
に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩
基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、Muta
n^ＴＭ-super Express KmG（宝酒造（株））、Mutan^ＴＭ
-K（宝酒造（株））などを用いて、ODA-LA PCR法、Gupp
ed duplex法、Kunkel法などの自体公知の方法あるいは
それらに準じる方法に従って行なうことができる。クロ
ーン化されたＮＱＯ２をコードするＤＮＡは目的により
そのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リ
ンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮ
Ａはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを
有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡ
Ａ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの
翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡ
アダプターを用いて付加することもできる。

【００２１】［８］発現ベクターＮＱＯ２の発現ベクターは、例えば、（イ）ＮＱＯ２を
コードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出
し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロ
モーターの下流に連結することにより製造することがで
きる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド
（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵ
Ｃ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイル
ス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。プロモー
ターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適
切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例え
ば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモ
ーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、
ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが
挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲ
αプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシ
ェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａ
ｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモ
ーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属
菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロ
モーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母であ
る場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモータ
ー、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好
ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプ
ロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現
ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、
スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マ
ーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉ
と略称する場合がある）などを含有しているものを用い
ることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合があ
る）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アン
ピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^ｒと略称する場合が
ある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^ｒと略
称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特
に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子
を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミ
ジンを含まない培地によっても選択できる。また、必要
に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ＮＱＯ２のＮ
端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合
は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列など
が、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ
・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、
宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵ
Ｃ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合に
は、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロ
ン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれ
ぞれ利用できる。

【００２２】［９］形質転換体このようにして構築されたＮＱＯ２をコードするＤＮＡ
を含有するベクターを用いて、形質転換体を製造するこ
とができる。宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジー
ン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Bioch
emistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられ
る。酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キアパストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶ
の場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera fru
giperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由
来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five
^ＴＭ細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstig
mena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢ
ｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；
ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、
例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞
（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,1
3, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫として
は、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、
ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Vero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、
ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズ
ハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細
胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウ
スミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが
用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
cular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９
７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４
巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載
の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆
虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー
（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方
法に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換す
るには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロト
コール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、
ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)
に記載の方法に従って行なうことができる。このように
して、ＮＱＯ２をコードするＤＮＡを含有する発現ベク
ターで形質転換された形質転換体が得られる。

【００２３】［１０］組換えＮＱＯ２の製法宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、ア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としては、例え
ば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マ
グネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタ
ミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐ
Ｈは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する
際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を
含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・
エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティッ
クス（Journal of Experiments in Molecular Genetic
s），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laborator
y, New York１９７２〕が好ましい。ここに必要により
プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β
−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることが
できる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約
１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通
気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の
場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行な
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bo
stian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ
・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），
７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を
含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が
挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ま
しい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間
行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫
細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地と
しては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイ
チャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％
ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられ
る。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ま
しい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要
に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形
質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜
２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Sc
ience），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培
地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５
９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ
・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Jo
urnal of the American Medical Association）１９９
巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング
・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカ
ル・メディスン（Proceeding ofthe Society for the B
iological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが
用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養
は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必
要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形
質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外にＮＱＯ２を生
成せしめることができる。上記培養物からＮＱＯ２を分
離精製するには、例えば、下記の方法により行なうこと
ができる。ＮＱＯ２を培養菌体あるいは細胞から抽出す
るに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞
を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチ
ームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは
細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりＮＱＯ２の
粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中
に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリト
ンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよ
い。培養液中にＮＱＯ２が分泌される場合には、培養終
了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清と
を分離し、上清を集める。このようにして得られた培養
上清、あるいは抽出液中に含まれるＮＱＯ２の精製は、
自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうこ
とができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩
析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、
限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電
点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用
いられる。かくして得られるＮＱＯ２が遊離体で得られ
た場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法
によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場
合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によ
り、遊離体または他の塩に変換することができる。な
お、組換え体が産生するＮＱＯ２を、精製前または精製
後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意
に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去するこ
ともできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシ
ン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、
プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられ
る。かくして生成するＮＱＯ２またはその塩の活性は、
標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いた
エンザイムイムノアッセイなどにより測定することがで
きる。

【００２４】［１１］抗ＮＱＯ２抗体ＮＱＯ２もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す
る抗体は、ＮＱＯ２もしくはその部分ペプチドまたはそ
の塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体の何れであってもよい。特に、ＮＱ
Ｏ２もしくはその部分ペプチドまたはその塩の還元酵素
活性を中和する抗体が望ましく用いられる。ＮＱＯ２も
しくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、ＮＱＯ２
等と略記する場合がある）に対する抗体は、ＮＱＯ２等
を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造
法に従って製造することができる。

【００２５】〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製ＮＱＯ２等は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が
可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投
与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全
フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン
トを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ず
つ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物
としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、
マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウス
およびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗
体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動
物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択
し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取
し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合
させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定
は、例えば、後記の標識化ＮＱＯ２等と抗血清とを反応
させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定するこ
とにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、
例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー
（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従
い実施することができる。融合促進剤としては、例え
ば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィ
ルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられ
る。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ
１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好まし
く用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数
と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程
度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥ
Ｇ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約
２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０
分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を
実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、ＮＱＯ２等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着
させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ
培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識し
た抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞が
マウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられ
る）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノク
ローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したＮＱ
Ｏ２等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検
出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選
別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行な
うことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地な
どで行なうことができる。選別および育種用培地として
は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような
培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは
１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培
地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純
薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地
（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いること
ができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは
約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ま
しくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガ
ス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の
抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして
測定できる。（ｂ）モノクロナール抗体の精製モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。

【００２６】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法にしたがって製造することができる。例えば、免
疫抗原（ＮＱＯ２等の抗原）とキャリアー蛋白質との複
合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同
様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物からＮＱＯ２
等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行
なうことにより製造できる。哺乳動物を免疫するために
用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関
し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテ
ンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプ
テンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものを
どの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清
アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リン
ペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、
約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさ
せる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーの
カプリングには、種々の縮合剤を用いることができる
が、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド
活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有す
る活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温
血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体ある
いは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗
体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや
不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与
は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度
行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方
法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは
血液から採取することができる。抗血清中のポリクロー
ナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同
様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製
は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫
グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。

【００２７】［１２］骨疾患に対する医薬候補化合物の
スクリーニング方法・スクリーニング用キットＮＱＯ２、その部分ペプチドまたはそれらの塩の還元酵
素活性を阻害する化合物またはその塩は、骨形成促進作
用、前駆骨芽細胞を含めた骨芽細胞分化誘導および分化
誘導促進作用、軟骨形成促進作用、前駆軟骨細胞を含め
た軟骨細胞分化誘導および分化誘導促進作用、ＢＭＰ作
用増強作用などを有しているので、骨形成促進剤、前駆
骨芽細胞を含めた骨芽細胞分化誘導および分化誘導促進
剤、軟骨形成促進剤、前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞分
化誘導および分化誘導促進剤、ＢＭＰ作用増強剤として
有用である。また、当該化合物またはその塩は、例え
ば、骨疾患の予防・治療剤として、より具体的には、整
形外科領域における骨折、再骨折、骨変形・変形脊椎
症、骨肉腫、骨髄腫、骨形成不全、側弯症等の非代謝性
骨疾患；骨欠損、骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、線維性
骨炎、腎性骨異栄養症、骨ぺーチェット病、硬直性脊髄
炎等の代謝性骨疾患；または変形性関節炎、慢性関節リ
ウマチなどの軟骨疾患に代表される関節疾患の予防・治
療剤として使用できる。さらに、当該化合物またはその
塩は、多発性骨髄腫、肺癌、乳癌などの外科手術後の骨
組織修復剤として、また歯科領域においては、歯周病の
治療、歯周疾患における歯周組織欠損の修復、人工歯根
の安定化、顎堤形成および口蓋裂の修復などに使用でき
る。したがって、ＮＱＯ２、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩（以下、ＮＱＯ２等）は、ＮＱＯ２等の活性
（例、還元酵素活性など）を阻害する化合物またはその
塩のスクリーニングのための試薬として有用である。一
方、ＮＱＯ２の還元酵素活性を促進する化合物またはそ
の塩は、例えば、骨形成阻害作用、前駆骨芽細胞を含め
た骨芽細胞分化阻害および分化誘導阻害作用、軟骨形成
阻害作用、前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞分化阻害およ
び分化誘導阻害作用、ＢＭＰ作用抑制作用などを有して
いるので、骨形成阻害剤、前駆骨芽細胞を含めた骨芽細
胞分化阻害および分化誘導阻害剤、軟骨形成阻害剤、前
駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞分化阻害および分化誘導阻
害剤、ＢＭＰ作用阻害剤として有用である。さらに、当
該化合物またはその塩は、例えば、骨大理石病、骨軟骨
腫症などの骨疾患の予防・治療剤として使用できる。し
たがって、ＮＱＯ２等は、ＮＱＯ２等の還元酵素活性を
促進する化合物またはその塩をスクリーニングするため
の試薬として有用である。

【００２８】すなわち、本発明は、（１）ＮＱＯ２等を
用いることを特徴とするＮＱＯ２等の還元酵素活性を促
進する化合物もしくはその塩（以下、促進薬と略記する
場合がある）またはＮＱＯ２等の還元酵素活性を阻害す
る化合物（以下、阻害薬と略記する場合がある）のスク
リーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（２）（ｉ）ＮＱＯ２等に基質を接触させた場合と（i
i）ＮＱＯ２等に基質および試験化合物を接触させた場
合との比較を行なうことを特徴とする促進薬または阻害
薬のスクリーニング方法を提供する。具体的には、上記
スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（i
i）の場合における、ＮＱＯ２等の還元酵素活性を測定
して、比較することを特徴とするものである。本発明の
スクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。基質
としては、ＮＱＯ２、その部分ペプチドまたはそれらの
塩の基質となり得るものであれば何れのものでもよい。
例えば、dichlorophenol-indophenol、menadione、meth
yl redなどが用いられる。試験化合物としては、例え
ば、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽
出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であ
ってもよいし、公知の化合物であってもよい。上記のス
クリーニング方法を実施するには、ＮＱＯ２等をスクリ
ーニングに適したバッファーに懸濁することによりＮＱ
Ｏ２等の標品を調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜
１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファ
ー、トリス−塩酸バッファーなどの、ＮＱＯ２等と基質
との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよ
い。ＮＱＯ２等の還元酵素活性は、自体公知の方法、例
えば、Kebin Wuらの報告〔Archives of biochemistry a
nd biophysics、vol．347、pp221-228、1997〕などに記
載の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定するこ
とができる。例えば、上記（ii）の場合における還元酵
素活性が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好
ましくは５０％以上阻害する試験化合物をＮＱＯ２等の
還元酵素活性を阻害する化合物として、一方、上記（i
i）の場合における還元酵素活性等が上記（ｉ）の場合
に比べて、約２０％以上、好ましくは５０％以上促進さ
せる試験化合物をＮＱＯ２等の還元酵素活性を促進する
化合物として選択することができる。本発明のスクリー
ニング用キットは、ＮＱＯ２、その部分ペプチドまたは
その塩を含有するものである。本発明のスクリーニング
用キットの例としては、次のものが挙げられる。

【００２９】〔スクリーニング用試薬〕測定用緩衝液ｐＨ7.4のトリス−塩酸バッファー（塩化ナトリウム含有）タンパク質標品ＮＱＯ２基質 25μM dichlorophenolindophenol 電子供与体 50μM NRH (dihydronicotinamide riboside) 検出 600nmにおける吸光度の低下〔測定法〕ＮＱＯ２等にＮＲＨ（または他の電子供与
体）と基質、さらに試験化合物を加え、25℃で反応させ
る。反応後に600nmでの吸光度の低下を測定し、活性を
求める。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニ
ング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、
上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ＮＱＯ
２等の還元酵素活性を促進または阻害する化合物であ
る。該化合物の塩としては、とりわけ生理学的に許容さ
れる酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば
無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）と
の塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオ
ン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエ
ン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、
ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。

【００３０】［１３］ＮＱＯ２活性阻害剤・促進剤の用
途ＮＱＯ２等の還元酵素活性を阻害する化合物は、例え
ば、骨形成促進剤、前駆骨芽細胞を含めた骨芽細胞分化
誘導および分化誘導促進剤、軟骨形成促進剤、前駆軟骨
細胞を含めた軟骨細胞分化誘導および分化誘導促進剤、
ＢＭＰ作用増強剤として有用である。また、当該化合物
は、例えば、骨疾患の予防・治療剤として、より具体的
には、整形外科領域における骨折、再骨折、骨変形・変
形脊椎症、骨肉腫、骨髄腫、骨形成不全、側弯症等の非
代謝性骨疾患；骨欠損、骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、
線維性骨炎、腎性骨異栄養症、骨ぺーチェット病、硬直
性脊髄炎等の代謝性骨疾患；または変形性関節炎、慢性
関節リウマチなどの軟骨疾患に代表される関節疾患など
の各種骨疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤とし
て有用である。さらに、当該化合物は、多発性骨髄腫、
肺癌、乳癌などの外科手術後の骨組織修復剤として、ま
た歯科領域においては、歯周病の治療、歯周疾患におけ
る歯周組織欠損の修復、人工歯根の安定化、顎堤形成お
よび口蓋裂の修復などに使用できる。一方、ＮＱＯ２等
の活性を促進する化合物は、例えば、骨形成阻害作用、
前駆骨芽細胞を含めた骨芽細胞分化阻害および分化誘導
阻害作用、軟骨形成阻害作用、前駆軟骨細胞を含めた軟
骨細胞分化阻害および分化誘導阻害作用、ＢＭＰ作用抑
制作用などを有しているので、骨形成阻害剤、前駆骨芽
細胞を含めた骨芽細胞分化阻害および分化誘導阻害剤、
軟骨形成阻害剤、前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞分化阻
害および分化誘導阻害剤、ＢＭＰ作用阻害剤として有用
である。さらに、当該化合物は、例えば、骨大理石病、
骨軟骨腫症などの骨疾患に対する安全で低毒性な予防・
治療剤として有用である。本発明のスクリーニング方法
またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物
またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、
常套手段に従って実施することができる。例えば、該化
合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、
エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的
に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る
液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で
非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に
認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防
腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製
剤実施に要求される単位用量形態で混和することによっ
て製造することができる。これら製剤における有効成分
量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにする
ものである。

【００３１】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性
液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、
溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコー
ルなどと併用してもよい。また、上記予防・治療剤は、
例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリ
ウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通
常、適当なアンプルに充填される。このようにして得ら
れる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺
乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、骨粗鬆症患者
（６０ｋｇとして）に対してＮＱＯ２阻害薬を一日につ
き約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口
的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え
ば、注射剤の形では通常例えば、骨粗鬆症患者（６０ｋ
ｇとして）に対してＮＱＯ２阻害薬を一日につき約０．
０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与する
のが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たり
に換算した量を投与することができる。

【００３２】［１４］アンチセンスヌクレオチドの用途上記したＮＱＯ２をコードするポリヌクレオチドと相補
的な塩基配列またはその一部を含有してなるヌクレオチ
ド（即ち、アンチセンスヌクレオチド）は、ＮＱＯ２の
発現を阻害することができるので、上記ＮＱＯ２活性阻
害剤と同様、骨形成促進剤、前駆骨芽細胞を含めた骨芽
細胞分化誘導および分化誘導促進剤、軟骨形成促進剤、
前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞分化誘導および分化誘導
促進剤、ＢＭＰ作用増強剤として有用である。また、当
該アンチセンスヌクレオチドは、例えば、骨疾患の予防
・治療剤として、より具体的には、整形外科領域におけ
る骨折、再骨折、骨変形・変形脊椎症、骨肉腫、骨髄
腫、骨形成不全、側弯症等の非代謝性骨疾患；骨欠損、
骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨異栄
養症、骨ぺーチェット病、硬直性脊髄炎等の代謝性骨疾
患；または変形性関節炎、慢性関節リウマチなどの軟骨
疾患に代表される関節疾患などの各種骨疾患に対する安
全で低毒性な予防・治療剤として有用である。さらに、
当該アンチセンスヌクレオチドは、多発性骨髄腫、肺
癌、乳癌などの外科手術後の骨組織修復剤として、また
歯科領域においては、歯周病の治療、歯周疾患における
歯周組織欠損の修復、人工歯根の安定化、顎堤形成およ
び口蓋裂の修復などに使用できる。該アンチセンスヌク
レオチドを上記予防・治療剤として使用する場合は、該
ヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、
アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテ
ッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した
後、常套手段に従って実施することができる。該ヌクレ
オチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助
剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよう
なカテーテルによって投与できる。例えば、該ヌクレオ
チドは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、
エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的
に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る
液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で
非経口的に使用できる。例えば、該ヌクレオチドを生理
学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒク
ル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認めら
れた製剤実施に要求される単位用量形態で混和すること
によって製造することができる。これら製剤における有
効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよう
にするものである。錠剤、カプセル剤などに混和するこ
とができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーン
スターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、
結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼ
ラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸
マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッ
カリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油また
はチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位
形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさ
らに油脂のような液状担体を含有することができる。注
射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の
活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油
などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従
って処方することができる。注射用の水性液としては、
例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む
等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトー
ル、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解
補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリ
アルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベ
ート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。また、上記予防・治療剤
は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナ
トリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコ
ニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト
血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存
剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、
酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は
通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得
られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや
哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、
ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与する
ことができる。該アンチセンスヌクレオチドの投与量
は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差
異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、骨粗鬆
症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口
的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え
ば、注射剤の形では通常例えば、骨粗鬆症患者（６０ｋ
ｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍ
ｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ま
しくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合で
ある。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量
を投与することができる。

【００３３】［１５］抗ＮＱＯ２抗体の用途（ａ）診断薬ＮＱＯ２等に対する抗体は、ＮＱＯ２等を特異的に認識
することができるので、被検液中のＮＱＯ２等の定量、
特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用する
ことができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）該
抗体と、被検液および標識化ＮＱＯ２等とを競合的に反
応させ、該抗体に結合した標識化ＮＱＯ２等の割合を測
定することを特徴とする被検液中のＮＱＯ２等の定量
法、（ii）被検液と担体上に不溶化した該抗体および標
識化された該抗体とを同時あるいは連続的に反応させた
のち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特
徴とする被検液中のＮＱＯ２等の定量法を提供する。上
記（ii）においては、不溶化抗体と標識化抗体とが互い
にＮＱＯ２等との結合を妨害しないような抗原認識部位
を有することが好ましい（例えば、一方の抗体がＮＱＯ
２等のＮ端部を認識し、他方の抗体がＮＱＯ２等のＣ端
部に反応する等）。ＮＱＯ２等に対するモノクローナル
抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合
がある）を用いてＮＱＯ２等の測定を行なえるほか、組
織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目
的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体
分子のＦ(ａｂ')_２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を
用いてもよい。ＮＱＯ２等に対する抗体を用いる測定法
は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗
原量（例えば、ＮＱＯ２量）に対応した抗体、抗原もし
くは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段に
より検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて
作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれ
の測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競
合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適
に用いられるが、感度、特異性の点で、後に記載するサ
ンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用
いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射
性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられ
る。放射性同位元素としては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、
〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕などが用いられ
る。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好
ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質と
しては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイ
ソチオシアネートなどが用いられる。発光物質として
は、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェ
リン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体ある
いは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用
いることもできる。抗原あるいは抗体の不溶化に当って
は、物理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるい
は酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合
を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロ
ース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、
ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成
樹脂、あるいはガラス等が用いられる。

【００３４】サンドイッチ法においては不溶化したモノ
クローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さら
に標識化したモノクローナル抗体を反応させ（２次反
応）た後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること
により被検液中のＮＱＯ２量を定量することができる。
１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同
時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じるこ
とができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法に
おいて、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗
体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上
させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いても
よい。本発明のサンドイッチ法によるＮＱＯ２等の測定
法においては、１次反応と２次反応に用いられるモノク
ローナル抗体はＮＱＯ２等の結合する部位が相異なる抗
体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２
次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いら
れる抗体が、ＮＱＯ２のＣ端部を認識する場合、１次反
応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えば
Ｎ端部を認識する抗体が用いられる。モノクローナル抗
体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合
法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに
用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標
識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反
応の標識抗原と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）
とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を
測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、
抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレ
ングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを用いる
液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いる
か、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体
として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。

【００３５】イムノメトリック法では、被検液中の抗原
と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応
させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中
の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化
抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたの
ち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識
量を測定し被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロ
メトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の
結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中
の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場
合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリ
ーなどが好適に用いられる。これら個々の免疫学的測定
法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の
条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法
における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配
慮を加えて本発明のＮＱＯ２またはその塩の測定系を構
築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細につい
ては、総説、成書などを参照することができる〔例え
ば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭
和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセ
イ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素
免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治
ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５
７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３
版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン
・エンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 7
0 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol.
73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol.
74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vo
l. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected
Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immuno-chemical Tec
hniques (Part E: Monoclonal Antibodiesand General
Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemic
al Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Mo
noclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発
行)など参照〕。以上のように、ＮＱＯ２等に対する抗
体を用いることによって、ＮＱＯ２等を感度良く定量す
ることができる。

【００３６】さらに、該抗体を用いて、生体内でのＮＱ
Ｏ２等を定量することによって、ＮＱＯ２に関連する骨
疾患の診断をすることができる。例えば、該抗体を用い
ることによって、ＮＱＯ２等の濃度が正常値に比べて高
いまたは低いことが判明した場合、例えば、整形外科領
域における骨折、再骨折、骨変形・変形脊椎症、骨肉
腫、骨髄腫、骨形成不全、側弯症等の非代謝性骨疾患；
骨欠損、骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎
性骨異栄養症、骨ぺーチェット病、硬直性脊髄炎等の代
謝性骨疾患；または変形性関節炎、慢性関節リウマチな
どの軟骨疾患に代表される関節疾患、骨大理石病、骨軟
骨腫症などの各種骨疾患に罹患している、または罹患す
る可能性が高いと診断することができる。また、該抗体
は、体液や組織などの被検体中に存在するＮＱＯ２等を
特異的に検出するために使用することができる。また、
ＮＱＯ２等を精製するために使用する抗体カラムの作
製、精製時の各分画中のＮＱＯ２等の検出、被検細胞内
におけるＮＱＯ２の挙動の分析などのために使用するこ
とができる。

【００３７】（ｂ）骨疾患予防・治療薬ＮＱＯ２等に対する抗体は、ＮＱＯ２等を特異的に認識
してこれに結合することにより、ＮＱＯ２の還元酵素活
性を阻害することができる。したがって、該抗体は、骨
形成促進剤、前駆骨芽細胞を含めた骨芽細胞分化誘導お
よび分化誘導促進剤、軟骨形成促進剤、前駆軟骨細胞を
含めた軟骨細胞分化誘導および分化誘導促進剤、ＢＭＰ
作用増強剤として有用である。また、当該抗体は、例え
ば、骨疾患の予防・治療剤として、より具体的には、整
形外科領域における骨折、再骨折、骨変形・変形脊椎
症、骨肉腫、骨髄腫、骨形成不全、側弯症等の非代謝性
骨疾患；骨欠損、骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、線維性
骨炎、腎性骨異栄養症、骨ぺーチェット病、硬直性脊髄
炎等の代謝性骨疾患；または変形性関節炎、慢性関節リ
ウマチなどの軟骨疾患に代表される関節疾患などの各種
骨疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤として有用
である。さらに、当該抗体は、多発性骨髄腫、肺癌、乳
癌などの外科手術後の骨組織修復剤として、また歯科領
域においては、歯周病の治療、歯周疾患における歯周組
織欠損の修復、人工歯根の安定化、顎堤形成および口蓋
裂の修復などに使用できる。該抗体を上記予防・治療剤
として使用する場合は、そのまま液剤として、または適
当な剤形の医薬組成物として、あるいは摂取促進のため
の補助剤とともに投与できる。例えば、該抗体は、必要
に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、該抗体を生理学的に認められる公知
の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、
結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求さ
れる単位用量形態で混和することによって製造すること
ができる。これら製剤における有効成分量は指示された
範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠
剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤とし
ては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガン
ト、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースの
ような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸
などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのよう
な潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味
剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような
香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルであ
る場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液
状担体を含有することができる。注射のための無菌組成
物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、
椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸
濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することが
できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩
水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、
Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム
など）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、ア
ルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プ
ロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イ
オン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣ
Ｏ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例
えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤であ
る安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用し
てもよい。

【００３８】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例
えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。該抗体の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投
与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般
的に例えば、骨粗鬆症患者（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは
約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍ
ｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量
は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても
異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、骨粗鬆
症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与
するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当
たりに換算した量を投与することができる。さらに、Ｎ
ＱＯ２等に対する抗体は、ＮＱＯ２を特異的に認識する
ので、上記ＮＱＯ２活性阻害剤または促進剤と組み合わ
せてそれらの薬剤をＮＱＯ２に送達するためのターゲッ
ティング薬として使用することもできる。

【００３９】［１６］ＮＱＯ２等をコードするヌクレオ
チドの用途（ａ）診断薬ＮＱＯ２等をコードするヌクレオチドを含有するヌクレ
オチドは、プローブとして使用することにより、ヒトま
たは他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）における
ＮＱＯ２等をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常
（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、
該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現
低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過
多などの遺伝子診断剤として有用である。該ポリヌクレ
オチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知
のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ
法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７
９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ユーエスエー（Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America），第
８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などに
より実施することができる。例えば、該ポリヌクレオチ
ドを用いることによって、ＮＱＯ２等のＤＮＡまたはｍ
ＲＮＡ量が正常値に比べて高いまたは低いことが判明し
た場合、例えば、整形外科領域における骨折、再骨折、
骨変形・変形脊椎症、骨肉腫、骨髄腫、骨形成不全、側
弯症等の非代謝性骨疾患；骨欠損、骨粗鬆症、骨軟化
症、くる病、線維性骨炎、腎性骨異栄養症、骨ぺーチェ
ット病、硬直性脊髄炎等の代謝性骨疾患；または変形性
関節炎、慢性関節リウマチなどの軟骨疾患に代表される
関節疾患、骨大理石病、骨軟骨腫症などの各種骨疾患に
罹患している、または罹患する可能性が高いと診断する
ことができる。

【００４０】（ｂ）骨疾患予防・治療剤ＮＱＯ２またはＮＱＯ２酵素活性を有するその部分ペプ
チドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、
ヒトまたは他の哺乳動物細胞内で機能的なプロモーター
を含む発現ベクターに挿入して用いることにより、該ポ
リヌクレオチドが導入されたヒトまたは他の哺乳動物細
胞内のＮＱＯ２蛋白質合成能を増強させ、ＮＱＯ２蛋白
質量を富化させることができる。したがって、該ポリヌ
クレオチドは、ＮＱＯ２の発現量が低下するか、あるい
はＮＱＯ２遺伝子の変異によりＮＱＯ２欠損となった
り、活性の低下したＮＱＯ２しか産生されないために、
骨形成、骨芽細胞分化、軟骨形成、軟骨細胞分化、ＢＭ
Ｐ作用が異常亢進している動物において、これらの作用
を抑制するための骨形成阻害剤、前駆骨芽細胞を含めた
骨芽細胞分化阻害および分化誘導阻害剤、軟骨形成阻害
剤、前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞分化阻害および分化
誘導阻害剤、ＢＭＰ作用阻害剤として有用である。さら
に、当該ポリヌクレオチドは、例えば、骨大理石病、骨
軟骨腫症などの骨疾患の予防・治療剤として使用でき
る。該ポリヌクレオチドを上記予防・治療剤として使用
する場合は、該ポリヌクレオチドをレトロウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシ
エーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿
入した後、常套手段に従って実施することができる。該
ポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進の
ための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテー
テルのようなカテーテルによって投与できる。例えば、
該ポリヌクレオチドは、必要に応じて糖衣を施した錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤な
どとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学
的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤など
の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該ポリ
ヌクレオチドを生理学的に認められる公知の担体、香味
剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などと
ともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量
形態で混和することによって製造することができる。こ
れら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な
用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル
剤などに混和することができる添加剤としては、例え
ば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビア
ゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形
剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのよう
な膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、
ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパー
ミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤など
が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合に
は、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を
含有することができる。注射のための無菌組成物は注射
用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油な
どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させる
などの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ
糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビ
トール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）など
が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール
（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレン
グリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界
面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５
０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、
ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息
香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよ
い。また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例え
ば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化
剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインな
ど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアル
コール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合して
もよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充
填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）に対して投与することができる。該ポリ
ヌクレオチドの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、
投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一
般的に例えば、骨大理石病患者（６０ｋｇとして）にお
いては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好まし
くは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２
０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投
与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっ
ても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、骨
大理石病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につ
き約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２
０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を
投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋ
ｇ当たりに換算した量を投与することができる。

【００４１】［１７］ＮＱＯ２等の用途ＮＱＯ２もしくはＮＱＯ２酵素活性を有するその部分ペ
プチドまたはその塩は、上記ポリヌクレオチドと同様
に、投与された動物体内におけるＮＱＯ２活性を増強す
ることができるので、骨形成阻害剤、前駆骨芽細胞を含
めた骨芽細胞分化阻害および分化誘導阻害剤、軟骨形成
阻害剤、前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞分化阻害および
分化誘導阻害剤、ＢＭＰ作用阻害剤として有用である。
さらに、該ＮＱＯ２等は、例えば、骨大理石病、骨軟骨
腫症などの骨疾患の予防・治療剤として使用できる。該
ＮＱＯ２等を上記予防・治療剤として使用する場合は、
そのまま液剤として、または適当な剤形の医薬組成物と
して、あるいは摂取促進のための補助剤とともに投与で
きる。例えば、該ＮＱＯ２等は、必要に応じて糖衣を施
した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセ
ル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外
の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液
剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、
該ＮＱＯ２等を生理学的に認められる公知の担体、香味
剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などと
ともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量
形態で混和することによって製造することができる。こ
れら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な
用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル
剤などに混和することができる添加剤としては、例え
ば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビア
ゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形
剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのよう
な膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、
ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパー
ミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤など
が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合に
は、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を
含有することができる。注射のための無菌組成物は注射
用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油な
どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させる
などの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ
糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビ
トール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）など
が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール
（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレン
グリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界
面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５
０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、
ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息
香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよ
い。また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例え
ば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化
剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインな
ど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアル
コール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合して
もよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充
填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）に対して投与することができる。該ＮＱ
Ｏ２等の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方
法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に
例えば、骨大理石病患者（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは
約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍ
ｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量
は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても
異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、骨大理
石病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与
するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当
たりに換算した量を投与することができる。

【００４２】［１８］ＮＱＯ２等の発現量を変化させる
化合物のスクリーニング方法さらに、本発明は、ＮＱＯ２等の発現量を変化させる化
合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本
方法では、上記のＮＱＯ２等をコードする塩基配列を含
むヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして用
いることにより、ＮＱＯ２等の発現量を変化させる化合
物またはその塩をスクリーニングする。すなわち、本発
明は、例えば、（ｉ）ヒトや哺乳動物の血液、ＮＱ
Ｏ２を発現する特定の臓器、該臓器から単離した組織
もしくは細胞、または（ii）ＮＱＯ２もしくはＮＱＯ２
活性を有するその部分ペプチドをコードする塩基配列を
含むポリヌクレオチドを導入した形質転換体等に含まれ
るＮＱＯ２等のｍＲＮＡ量を、ＮＱＯ２等をコードする
塩基配列を含むヌクレオチドを用いて測定することによ
る、ＮＱＯ２等の発現量を変化させる化合物のスクリー
ニング方法を提供する。ＮＱＯ２等のｍＲＮＡ量の測定
は具体的には以下のようにして行なう。（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど、より具体的には骨粗鬆症マウス、
骨大理石病マウス、痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化
ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、酸
化剤、抗酸化剤、ビタミン類、重金属、抗痴呆薬、血圧
低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレ
ス（例えば、紫外線、浸水ストレス、電気ショック、明
暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血
液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓な
ど）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得
る。または、ヒトの血液、臓器、臓器から単離した組織
あるいは細胞を得る。得られた細胞等に含まれるＮＱＯ
２等のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等か
らｍＲＮＡを抽出し、例えば、TaqManPCRなどの手法を
用いることにより定量することができ、自体公知の手段
によりノザンブロットを行うことにより解析することも
できる。（ii）ＮＱＯ２等を発現する形質転換体を上記の方法に
従い作製し、該形質転換体に含まれるＮＱＯ２等のｍＲ
ＮＡを同様にして定量、解析することができる。ＮＱＯ
２等の発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対し
て、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間
前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２
時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは
一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜
２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、また
は薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投
与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ま
しくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２
４時間後）、細胞に含まれるＮＱＯ２等のｍＲＮＡ量を
定量、解析することにより行なうことができ、（ii）形
質転換体あるいはヒト由来細胞を常法に従い培養する際
に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１
日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好まし
くは２日後〜３日後）、該形質転換体等に含まれるＮＱ
Ｏ２等のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なう
ことができる。このスクリーニング方法を用いて得られ
る化合物またはその塩は、ＮＱＯ２等の発現量を変化さ
せる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）Ｎ
ＱＯ２等の発現量を増加させることにより、ＮＱＯ２活
性を促進する化合物、または（ロ）ＮＱＯ２等の発現量
を減少させることにより、ＮＱＯ２活性を阻害する化合
物である。

【００４３】該化合物としては、ペプチド、蛋白、非ペ
プチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げら
れ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公
知の化合物であってもよい。ＮＱＯ２等の発現量を増加
させる化合物またはその塩は、例えば、骨形成阻害剤、
前駆骨芽細胞を含めた骨芽細胞分化阻害および分化誘導
阻害剤、軟骨形成阻害剤、前駆軟骨細胞を含めた軟骨細
胞分化阻害および分化誘導阻害剤、ＢＭＰ作用阻害剤と
して有用である。さらに、当該化合物またはその塩は、
例えば、骨大理石病、骨軟骨腫症などの骨疾患の予防・
治療剤として有用である。ＮＱＯ２等の発現量を減少さ
せる化合物またはその塩は、例えば、骨形成促進剤、前
駆骨芽細胞を含めた骨芽細胞分化誘導および分化誘導促
進剤、軟骨形成促進剤、前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞
分化誘導および分化誘導促進剤、ＢＭＰ作用増強剤とし
て有用である。また、当該化合物またはその塩は、例え
ば、骨または関節疾患の予防・治療剤として、より具体
的には、整形外科領域における骨折、再骨折、骨変形・
変形脊椎症、骨肉腫、骨髄腫、骨形成不全、側弯症等の
非代謝性骨疾患；骨欠損、骨粗鬆症、骨軟化症、くる
病、線維性骨炎、腎性骨異栄養症、骨ぺーチェット病、
硬直性脊髄炎等の代謝性骨疾患；または変形性関節炎、
慢性関節リウマチなどの軟骨疾患に代表される関節疾患
などの各種骨疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤
として有用である。さらに、当該化合物またはその塩
は、多発性骨髄腫、肺癌、乳癌などの外科手術後の骨組
織修復剤として、また歯科領域においては、歯周病の治
療、歯周疾患における歯周組織欠損の修復、人工歯根の
安定化、顎堤形成および口蓋裂の修復などに使用でき
る。上記のスクリーニング方法を用いて得られるＮＱＯ
２の発現量を変化させる化合物またはその塩を医薬組成
物として使用する場合、常套手段に従って実施すること
ができる。例えば、上記したＮＱＯ２の還元酵素活性を
促進または阻害する化合物またはその塩を含有する製剤
と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすること
ができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）に対して投与することができる。該化合
物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症
状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場
合、一般的に、例えば、骨粗鬆症患者（６０ｋｇとし
て）に対してＮＱＯ２等の発現量を減少させる化合物を
一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０
〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇであ
る。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与
対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なる
が、例えば、注射剤の形では通常例えば、骨粗鬆症患者
（６０ｋｇとして）に対してＮＱＯ２等の発現量を減少
させる化合物を一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、
好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約
０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他
の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与す
ることができる。

【００４４】［１９］ＮＱＯ２プロモーターのプロモー
ター活性を変化させる化合物のスクリーニング方法さらに、本発明は、ＮＱＯ２プロモーターを用いたレポ
ーター遺伝子アッセイ方法において、試験化合物を投与
した場合と試験化合物を投与しない場合の当該プロモー
ター活性を測定することを特徴とする当該プロモーター
活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング法
を提供する。ＮＱＯ２は酸化ストレス応答や異物代謝に
関与する酵素であり、その遺伝子プロモーターの近傍に
は抗酸化剤応答エレメント（ＡＲＥ）および異物応答エ
レメント（ＸＲＥ）という２種のシスエレメントが配置
されている。本明細書におけるＮＱＯ２プロモーターと
は、これらのシスエレメントを含んだものも包含してよ
いものとする。レポーター遺伝子アッセイは、自体公知
の方法、例えば、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー(J.B.C.)、第272巻、22800-22808項、
1997年、デベロプメント、第124巻、793-804項、1997
年)などに記載の方法を用いることができる。試験化合
物としては、例えば、ペプチド、タンパク、生体由来非
ペプチド性化合物（糖質、脂質など）、合成化合物、微
生物培養物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液
などが挙げられ、これら化合物は新規化合物であっても
よいし、公知の化合物であってもよい。プロモーター活
性は、レポーター遺伝子の発現量を調べることによって
測定することができる。例えば、ノーザンブロッティン
グやReverse transcription-polymerase chain reactio
n(RT-PCR)やTaqMan polymerase chain reactionなどの
方法あるいはそれに準じる方法に従って、レポーター遺
伝子の発現量を測定することができる。この方法におい
て、試験化合物を投与しない場合に比べて、試験化合物
を投与した場合のレポーター遺伝子の発現量が、約２０
％上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％
以上増強する化合物を、ＮＱＯ２プロモーターのプロモ
ーター活性を促進する化合物として選択することができ
る。一方、試験化合物を投与しない場合に比べて、試験
化合物を投与した場合のレポーター遺伝子の発現量が、
約２０％上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約
５０％以上阻害する化合物を、ＮＱＯ２プロモーターの
プロモーター活性を阻害する化合物として選択すること
ができる。ＮＱＯ２プロモーターのプロモーター活性を
促進する化合物またはその塩は、例えば、骨形成阻害
剤、前駆骨芽細胞を含めた骨芽細胞分化阻害および分化
誘導阻害剤、軟骨形成阻害剤、前駆軟骨細胞を含めた軟
骨細胞分化阻害および分化誘導阻害剤、ＢＭＰ作用阻害
剤として有用である。さらに、当該化合物またはその塩
は、例えば、骨大理石病、骨軟骨腫症などの骨疾患の予
防・治療剤として有用である。ＮＱＯ２プロモーターの
プロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、例
えば、骨形成促進剤、前駆骨芽細胞を含めた骨芽細胞分
化誘導および分化誘導促進剤、軟骨形成促進剤、前駆軟
骨細胞を含めた軟骨細胞分化誘導および分化誘導促進
剤、ＢＭＰ作用増強剤として有用である。また、当該化
合物またはその塩は、例えば、骨疾患の予防・治療剤と
して、より具体的には、整形外科領域における骨折、再
骨折、骨変形・変形脊椎症、骨肉腫、骨髄腫、骨形成不
全、側弯症等の非代謝性骨疾患；骨欠損、骨粗鬆症、骨
軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨異栄養症、骨ぺー
チェット病、硬直性脊髄炎等の代謝性骨疾患；または変
形性関節炎、慢性関節リウマチなどの軟骨疾患に代表さ
れる関節疾患などの各種骨疾患に対する安全で低毒性な
予防・治療剤として有用である。さらに、当該化合物ま
たはその塩は、多発性骨髄腫、肺癌、乳癌などの外科手
術後の骨組織修復剤として、また歯科領域においては、
歯周病の治療、歯周疾患における歯周組織欠損の修復、
人工歯根の安定化、顎堤形成および口蓋裂の修復などに
使用できる。上記のスクリーニング方法を用いて得られ
るＮＱＯ２プロモーターのプロモーター活性を変化させ
る化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場
合、常套手段に従って実施することができる。例えば、
上記したＮＱＯ２の還元酵素活性を促進または阻害する
化合物を含有する製剤と同様にして、錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、
懸濁液剤などとすることができる。このようにして得ら
れる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺
乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に、例えば、骨粗鬆症患者
（６０ｋｇとして）に対してＮＱＯ２プロモーターのプ
ロモーター活性を阻害する化合物を一日につき約０.１
〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好
ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与す
る場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症
状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤
の形では通常例えば、骨粗鬆症患者（６０ｋｇとして）
に対してＮＱＯ２プロモーターのプロモーター活性を阻
害する化合物を一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、
好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約
０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他
の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与す
ることができる。

【００４５】［２０］ＮＱＯ２の発現または活性を調節
することによる骨疾患の予防・治療ＮＱＯ２は骨形成阻害作用、前駆骨芽細胞を含めた骨芽
細胞分化阻害および分化誘導阻害作用、軟骨形成阻害作
用、前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞分化阻害および分化
誘導阻害作用、ＢＭＰ作用阻害作用を示すので、骨疾患
に罹病したもしくは罹病する可能性の高いヒトまたは他
の哺乳動物体内におけるＮＱＯ２の発現もしくは活性を
促進もしくは阻害することにより、当該動物の骨疾患を
予防・治療することができる。したがって、本発明は、
哺乳動物体内におけるＮＱＯ２の発現もしくは活性を、
骨疾患の予防・治療に有効な程度阻害もしくは促進する
ことを含む、該哺乳動物の骨疾患の予防・治療方法を提
供する。ＮＱＯ２の発現もしくは活性を阻害する手段は
特に限定されず、例えば、上記［１８］のスクリーニン
グ方法により得られるＮＱＯ２の発現量を減少させる化
合物、上記［１９］のスクリーニング方法により得られ
るＮＱＯ２プロモーターのプロモーター活性を阻害する
化合物を動物に投与したり、あるいは上記［１４］に従
ってＮＱＯ２のアンチセンスヌクレオチドを投与する
他、ＮＱＯ２遺伝子プロモーター領域に存在するＡＲＥ
やＸＲＥを負に調節する化合物の投与もしくは物理的ス
トレスの負荷などが挙げられる。ＮＱＯ２の活性を阻害
する手段も特に制限されず、例えば、上記［１２］のス
クリーニング方法・スクリーニング用キットを用いて、
あるいは他のいずれかの手段により得られるＮＱＯ２の
活性阻害剤を上記［１３］の記載に従って動物に投与す
るか、上記［１５］の記載に従ってＮＱＯ２等に対する
抗体を投与する他、ＮＱＯ２発現細胞への変異原処理や
部位特異的変異誘発等の自体公知の手段を用いて作製さ
れる、基質キノン類に対する親和性を保持するが還元酵
素活性を欠損した変異ＮＱＯ２もしくはそれをコードす
るポリヌクレオチドを、上記［１６］および［１７］に
記載の方法に準じて動物に投与する方法、物理的ストレ
スの負荷によりＮＱＯ２を失活させる方法などが挙げら
れる。ＮＱＯ２の発現もしくは活性を阻害することによ
り、骨形成、前駆骨芽細胞を含めた骨芽細胞分化および
分化誘導、軟骨形成、前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞分
化および分化誘導、ＢＭＰ作用が促進もしくは増強され
るので、かかる処置は、上記作用により予防・治療効果
が期待される各種骨疾患、例えば、骨折、再骨折、骨変
形・変形脊椎症、骨肉腫、骨髄腫、骨形成不全、側弯
症、骨欠損、骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、線維性骨
炎、腎性骨異栄養症、骨ぺーチェット病、硬直性脊髄炎
症、変形性関節症または慢性関節リウマチの予防・治療
に有用である。ＮＱＯ２の発現もしくは活性を促進する
手段は特に限定されず、例えば、上記［１８］のスクリ
ーニング方法により得られるＮＱＯ２の発現量を増加さ
せる化合物、上記［１９］のスクリーニング方法により
得られるＮＱＯ２プロモーターのプロモーター活性を促
進する化合物を動物に投与したり、あるいは上記［１
６］の記載に従ってＮＱＯ２等をコードするポリヌクレ
オチドを投与する他、ＮＱＯ２遺伝子プロモーター領域
に存在するＡＲＥやＸＲＥを正に調節する化合物（例え
ば、酸化剤、抗酸化剤もしくはビタミン類、重金属、そ
の他の生体異物など）の投与もしくは物理的ストレス
（例えば、紫外線、酸化ストレスなど）の負荷などが挙
げられる。ＮＱＯ２の活性を促進する手段も特に制限さ
れず、例えば、上記［１２］のスクリーニング方法・ス
クリーニング用キットを用いて、あるいは他のいずれか
の手段により得られるＮＱＯ２の活性促進剤を上記［１
３］の記載に従って動物に投与するか、上記［１７］の
記載に従ってＮＱＯ２もしくはＮＱＯ２活性を有するそ
の部分ペプチドまたはその塩を投与する他、ＮＱＯ２発
現細胞への変異原処理や部位特異的変異誘発等の自体公
知の手段を用いて作製される、還元酵素活性が野生型よ
りも向上された変異ＮＱＯ２もしくはそれをコードする
ポリヌクレオチドを、上記［１６］および［１７］に記
載の方法に準じて動物に投与する方法などが挙げられ
る。ＮＱＯ２の発現もしくは活性を促進することによ
り、骨形成、前駆骨芽細胞を含めた骨芽細胞分化および
分化誘導、軟骨形成、前駆軟骨細胞を含めた軟骨細胞分
化および分化誘導、ＢＭＰ作用が阻害されるので、かか
る処置は、上記作用を抑制することにより予防・治療効
果が期待される各種骨疾患、例えば、骨大理石病、骨軟
骨腫症などの骨疾患の予防・治療に有用である。

【００４６】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＥＩＡ：エンザイムイムノアッセイＧｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸Ｍｅ：メチル基Ｅｔ：エチル基Ｂｕ：ブチル基Ｐｈ：フェニル基ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基

【００４７】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。〔配列番号：１〕ヒト由来ＮＱＯ２をコードするポリヌ
クレオチドの塩基配列を示す。〔配列番号：２〕ヒト由来ＮＱＯ２のアミノ酸配列を示
す。〔配列番号：３〕マウス由来ＮＱＯ２をコードするポリ
ヌクレオチドの塩基配列を示す。〔配列番号：４〕マウス由来ＮＱＯ２のアミノ酸配列を
示す。〔配列番号：５〕実施例１のＰＣＲに用いたプライマー
の塩基配列を示す。〔配列番号：６〕実施例１のＰＣＲに用いたプライマー
の塩基配列を示す。〔配列番号：７〕実施例２で用いたantisense S-oligo
DNAの配列を示す。〔配列番号：８〕実施例２で用いたsense S-oligo DNA
の配列を示す。

【００４８】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法はモレキュラ
ー・クローニング（Molecular cloning）に記載されて
いる方法に従った。実施例１化合物のNQO2活性への効果（１）GSTとNQO2の融合蛋白発現系の構築マウス骨芽細胞株MC3T3-E1から全RNAを調製し、oligo-d
T プライマーを用いてｃDNA合成を行った。このｃDNAを
鋳型とし、配列番号：５および配列番号：６でそれぞ
れ表される塩基配列を有する２の合成DNAをプライマー
としてPCRを行ない、制限酵素切断配列を付加した。得ら
れたDNA断片を制限酵素BamHIとSalIで切断し、plasmid
pGEX-4T-2（Amersham Pharmacia Biotech社）のBamHI-S
alI切断部位の間に挿入した。塩基配列を確認した後、こ
のplasmidを保持する大腸菌DH5α（GIBCO BRL社）をLB
培地で培養し、Amersham Pharmacia Biotech社の推奨す
る手順に従ってIPTGによる発現誘導を行ない、Glutathi
one-Sepharose（AmershamPharmacia Biotech社）での精
製を行った。２LのLB培地での培養液から、3.0mgの融合
蛋白が得られた。（２）NQO2の活性に対する化合物の効果骨形成促進作用を有する化合物ＡのNQO2の活性に対する
効果を、上記(1)で得られた融合蛋白を用いて調べた。こ
の化合物は骨芽細胞を用いた試験において１μMでalkal
in phosphatase誘導作用を有する。反応は50mM Tris・H
Cl pH7.4、200mM NaCl、50μM 1-carbamoylmethyl-3-
carbamoyl-1,4-dihydropyridine〔NRH(dihydronicotina
mide riboside)の構造類似化合物、R. J. Knoxらの文献
（Cancer Research, vol. 60, p.4179-4186, 2000）に
従って合成した〕、30μM methyl red(和光純薬社)を
含む水溶液に10nMの融合蛋白を加えて25℃で行ない、me
thyl redの還元を436nmにおける吸光度の減少で検出し
た。化合物Ａは1μMで38％の抑制作用を示した。

【化１】

【００４９】実施例２ Antisense DNA導入によるNQO2
発現抑制が引き起こす骨芽細胞の分化促進マウス骨芽細胞株MC3T3-E1を、10%牛胎児血清と100μg/
mlカナマイシンを含むMEMαを培地として48-well plate
に1.4x10⁴個ずつ播き、一晩培養した。100μlの無血清
αMEMに３μl FuGene６(Roche社)と配列７（マウスNQO2
ｍRNAに対するantisense配列）および配列８（同ｍRNA
に対するsense配列）に示した塩基配列を有するS-oligo
DNAそれぞれ1.5μg を加え、室温で15分間静置した
後、22μlずつ各wellに添加し、37℃、5%CO₂存在下で一
晩培養した。その後、終濃度50μg/ml ascorbic acidと
10mM β-glycerophosphateを添加して4日間培養し、Not
oyaらの文献（Journal of Bone and Mineral Research
9:395-400,1994）に従ってアルカリホスファターゼ活性
の測定を行った。各細胞破砕液の蛋白濃度を測定し、活
性の値を補正し、DNAを添加せずに同様の処置を行った
細胞での活性値を100％として図１に示した。Sense配列
のDNAを導入した細胞では、導入していない細胞との差
は認められなかったが、antisense配列のDNAを導入した
細胞では非導入細胞よりも有意に高い値が得られた（p<
0.05）。この結果は、NQO2の発現抑制が骨芽細胞の分化
を促進することを示している。

【００５０】

【発明の効果】本発明のスクリーニング方法を用いるこ
とにより、骨形成促進薬または骨形成阻害薬を効率良く
選択することができる。本出願は日本で出願された特願
２００１−１２８０７８を基礎としており、その内容は
本明細書にすべて包含されるものである。また、本明細
書において引用された特許および特許出願を含む文献
は、引用したことによってその内容のすべてが開示され
たと同程度に本明細書中に組み込まれるものである。

【００５１】

【配列表】 <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Screening Method <130> 182206 <150> JP 2001-128078 <151> 2001-04-25 <160> 8 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 976 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (176)..(868) <223> <400> 1 cccggaacct ggcgcaactc ctagagcggt ccttggggag acgcgggtcc cagtcctgcg 60 gctcctactg gggagtgcgc tggtcggaag attgctggac tcgctgaaga gagactacgc 120 aggaaagccc cagccaccca tcaaatcaga gagaaggaat ccaccttctt acgct atg 178 Met 1 gca ggt aag aaa gta ctc att gtc tat gca cac cag gaa ccc aag tct 226 Ala Gly Lys Lys Val Leu Ile Val Tyr Ala His Gln Glu Pro Lys Ser 5 10 15 ttc aac gga tcc ttg aag aat gtg gct gta gat gaa ctg agc agg cag 274 Phe Asn Gly Ser Leu Lys Asn Val Ala Val Asp Glu Leu Ser Arg Gln 20 25 30 ggc tgc acc gtc aca gtg tct gat ttg tat gcc atg aac ttt gag ccg 322 Gly Cys Thr Val Thr Val Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Glu Pro 35 40 45 agg gcc aca gac aaa gat atc act ggt act ctt tct aat cct gag gtt 370 Arg Ala Thr Asp Lys Asp Ile Thr Gly Thr Leu Ser Asn Pro Glu Val 50 55 60 65 ttc aat tat gga gtg gaa acc cac gaa gcc tac aag caa agg tct ctg 418 Phe Asn Tyr Gly Val Glu Thr His Glu Ala Tyr Lys Gln Arg Ser Leu 70 75 80 gct agc gac atc act gat gag cag aaa aag gtt cgg gag gct gac cta 466 Ala Ser Asp Ile Thr Asp Glu Gln Lys Lys Val Arg Glu Ala Asp Leu 85 90 95 gtg ata ttt cag ttc ccg ctg tac tgg ttc agc gtg ccg gcc atc ctg 514 Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu Tyr Trp Phe Ser Val Pro Ala Ile Leu 100 105 110 aag ggc tgg atg gat agg gtg ctg tgc cag ggc ttt gcc ttt gac atc 562 Lys Gly Trp Met Asp Arg Val Leu Cys Gln Gly Phe Ala Phe Asp Ile 115 120 125 cca gga ttc tac gat tcc ggt ttg ctc cag ggt aaa cta gcg ctc ctt 610 Pro Gly Phe Tyr Asp Ser Gly Leu Leu Gln Gly Lys Leu Ala Leu Leu 130 135 140 145 tcc gta acc acg gga ggc acg gcc gag atg tac acg aag aca gga gtc 658 Ser Val Thr Thr Gly Gly Thr Ala Glu Met Tyr Thr Lys Thr Gly Val 150 155 160 aat gga gat tct cga tac ttc ctg tgg cca ctc cag cat ggc aca tta 706 Asn Gly Asp Ser Arg Tyr Phe Leu Trp Pro Leu Gln His Gly Thr Leu 165 170 175 cac ttc tgt gga ttt aaa gtc ctt gcc cct cag atc agc ttt gct cct 754 His Phe Cys Gly Phe Lys Val Leu Ala Pro Gln Ile Ser Phe Ala Pro 180 185 190 gaa att gca tcc gaa gaa gaa aga aag ggg atg gtg gct gcg tgg tcc 802 Glu Ile Ala Ser Glu Glu Glu Arg Lys Gly Met Val Ala Ala Trp Ser 195 200 205 cag agg ctg cag acc atc tgg aag gaa gag ccc atc ccc tgc aca gcc 850 Gln Arg Leu Gln Thr Ile Trp Lys Glu Glu Pro Ile Pro Cys Thr Ala 210 215 220 225 cac tgg cac ttc ggg caa taactctgtg gcacgtgggc atcacgtaag 898 His Trp His Phe Gly Gln 230 cagcacacta ggaggcccag gcgcaggcaa agagaagatg gtgctgtcat gaaataaaat 958 tacaacatag ctacctgg 976 <210> 2 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gly Lys Lys Val Leu Ile Val Tyr Ala His Gln Glu Pro Lys 1 5 10 15 Ser Phe Asn Gly Ser Leu Lys Asn Val Ala Val Asp Glu Leu Ser Arg 20 25 30 Gln Gly Cys Thr Val Thr Val Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Glu 35 40 45 Pro Arg Ala Thr Asp Lys Asp Ile Thr Gly Thr Leu Ser Asn Pro Glu 50 55 60 Val Phe Asn Tyr Gly Val Glu Thr His Glu Ala Tyr Lys Gln Arg Ser 65 70 75 80 Leu Ala Ser Asp Ile Thr Asp Glu Gln Lys Lys Val Arg Glu Ala Asp 85 90 95 Leu Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu Tyr Trp Phe Ser Val Pro Ala Ile 100 105 110 Leu Lys Gly Trp Met Asp Arg Val Leu Cys Gln Gly Phe Ala Phe Asp 115 120 125 Ile Pro Gly Phe Tyr Asp Ser Gly Leu Leu Gln Gly Lys Leu Ala Leu 130 135 140 Leu Ser Val Thr Thr Gly Gly Thr Ala Glu Met Tyr Thr Lys Thr Gly 145 150 155 160 Val Asn Gly Asp Ser Arg Tyr Phe Leu Trp Pro Leu Gln His Gly Thr 165 170 175 Leu His Phe Cys Gly Phe Lys Val Leu Ala Pro Gln Ile Ser Phe Ala 180 185 190 Pro Glu Ile Ala Ser Glu Glu Glu Arg Lys Gly Met Val Ala Ala Trp 195 200 205 Ser Gln Arg Leu Gln Thr Ile Trp Lys Glu Glu Pro Ile Pro Cys Thr 210 215 220 Ala His Trp His Phe Gly Gln 225 230 <210> 3 <211> 999 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (152)..(844) <223> <400> 3 ccttctgaat catgcctgcc tggatactgc catgctccca ccttgatata atggactgaa 60 cctctgaacc tagtgctaca ataaccaagg agagtaacag taccgaaact tttggctgtt 120 ataccaaatc agagaatcta tctcctccaa c atg gca ggt aag aaa gtg ctc 172 Met Ala Gly Lys Lys Val Leu 1 5 atc gtc tat gca cac caa gaa ccc aag tcc ttc aat ggg tcc ctg aag 220 Ile Val Tyr Ala His Gln Glu Pro Lys Ser Phe Asn Gly Ser Leu Lys 10 15 20 aaa gtg gct gtt gaa gaa ctg agc aag cag gga tgc aca gtc act gtg 268 Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Ser Lys Gln Gly Cys Thr Val Thr Val 25 30 35 tct gat tta tat agc atg aac ttt gag cca agg gcc aca aga aat gat 316 Ser Asp Leu Tyr Ser Met Asn Phe Glu Pro Arg Ala Thr Arg Asn Asp 40 45 50 55 atc act ggt gcc ccc tct aat cct gac gtc ttc agt tat ggg ata gaa 364 Ile Thr Gly Ala Pro Ser Asn Pro Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ile Glu 60 65 70 acc cat gaa gcc tac aag aag aaa gct ctg acc agt gat ata ttt gaa 412 Thr His Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Ala Leu Thr Ser Asp Ile Phe Glu 75 80 85 gaa cag aga aag gtg caa gaa gct gat ctt gtg ata ttt cag ttt cca 460 Glu Gln Arg Lys Val Gln Glu Ala Asp Leu Val Ile Phe Gln Phe Pro 90 95 100 cta tac tgg ttc agc gtt cca gca atc cta aaa ggt tgg atg gat agg 508 Leu Tyr Trp Phe Ser Val Pro Ala Ile Leu Lys Gly Trp Met Asp Arg 105 110 115 gtg ctg tgc cga ggg ttt gcc ttt gat atc cca ggc ttt tat gac tct 556 Val Leu Cys Arg Gly Phe Ala Phe Asp Ile Pro Gly Phe Tyr Asp Ser 120 125 130 135 ggt ttt ctc aag ggt aaa tta gct ctc ctt tcc tta acc acg gga ggt 604 Gly Phe Leu Lys Gly Lys Leu Ala Leu Leu Ser Leu Thr Thr Gly Gly 140 145 150 aca gcg gag atg tac aca aaa gat ggg gtc agt gga gat ttc cgg tac 652 Thr Ala Glu Met Tyr Thr Lys Asp Gly Val Ser Gly Asp Phe Arg Tyr 155 160 165 ttc ctg tgg cca ctt cag cat ggt aca ctg cac ttc tgt gga ttt aaa 700 Phe Leu Trp Pro Leu Gln His Gly Thr Leu His Phe Cys Gly Phe Lys 170 175 180 gtc ctt gcc ccc cag atc agt ttt ggt ctt gat gtt tca tca gaa gaa 748 Val Leu Ala Pro Gln Ile Ser Phe Gly Leu Asp Val Ser Ser Glu Glu 185 190 195 gaa agg aaa gtg atg ctg gca tca tgg gcc cag cgg ctg aag agc atc 796 Glu Arg Lys Val Met Leu Ala Ser Trp Ala Gln Arg Leu Lys Ser Ile 200 205 210 215 tgg aag gaa gaa ccc atc cac tgc aca ccc cct tgg tac ttc caa gag 844 Trp Lys Glu Glu Pro Ile His Cys Thr Pro Pro Trp Tyr Phe Gln Glu 220 225 230 taacattttt gtgctctgag tacagctgac aagcaacaca gtgagagacc tacagcatgt 904 gcaaagagaa ggtggtgttg tatcctgaga tgtatttaac agtgcccacc aatgagtgtc 964 ttcagtttaa tacaactagt tcagatattt caaaa 999 <210> 4 <211> 231 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Ala Gly Lys Lys Val Leu Ile Val Tyr Ala His Gln Glu Pro Lys 1 5 10 15 Ser Phe Asn Gly Ser Leu Lys Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Ser Lys 20 25 30 Gln Gly Cys Thr Val Thr Val Ser Asp Leu Tyr Ser Met Asn Phe Glu 35 40 45 Pro Arg Ala Thr Arg Asn Asp Ile Thr Gly Ala Pro Ser Asn Pro Asp 50 55 60 Val Phe Ser Tyr Gly Ile Glu Thr His Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Ala 65 70 75 80 Leu Thr Ser Asp Ile Phe Glu Glu Gln Arg Lys Val Gln Glu Ala Asp 85 90 95 Leu Val Ile Phe Gln Phe Pro Leu Tyr Trp Phe Ser Val Pro Ala Ile 100 105 110 Leu Lys Gly Trp Met Asp Arg Val Leu Cys Arg Gly Phe Ala Phe Asp 115 120 125 Ile Pro Gly Phe Tyr Asp Ser Gly Phe Leu Lys Gly Lys Leu Ala Leu 130 135 140 Leu Ser Leu Thr Thr Gly Gly Thr Ala Glu Met Tyr Thr Lys Asp Gly 145 150 155 160 Val Ser Gly Asp Phe Arg Tyr Phe Leu Trp Pro Leu Gln His Gly Thr 165 170 175 Leu His Phe Cys Gly Phe Lys Val Leu Ala Pro Gln Ile Ser Phe Gly 180 185 190 Leu Asp Val Ser Ser Glu Glu Glu Arg Lys Val Met Leu Ala Ser Trp 195 200 205 Ala Gln Arg Leu Lys Ser Ile Trp Lys Glu Glu Pro Ile His Cys Thr 210 215 220 Pro Pro Trp Tyr Phe Gln Glu 225 230 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Oligonucleotide designed to act as primer for amplifying mNQO2 cDNA. <400> 5 ccggatccat ggcaggtaag aaagtgctc 29 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Oligonucleotide designed to act as primer for amplifying mNQO2 cDNA. <400> 6 ccgtcgactt actcttggaa gtaccaag 28 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Antisense oligonucleotide for mNQO2 mRNA. <400> 7 ctgccatgtt ggaggagata 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Sense oligonucleotide for mNQO2 mRNA. <400> 8 tatctcctcc aacatggcag 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例２で得られた、ＮＱＯ２ｍ
ＲＮＡに対するアンチセンス（antisense）あるいはセ
ンス（sense）ＤＮＡを導入した骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３
−Ｅ１で、アルカリホスファターゼ活性を測定した結果
を示す。アルカリホスファターゼ活性はコントロール
（no DNA）を１００とした相対活性（％）で示してい
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/00 Ａ６１Ｐ 19/00 19/02 19/02 19/08 19/08 19/10 19/10 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ 33/53 33/53 ＤＭ 33/566 33/566 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 4B063 QA18 QQ22 QQ61 QQ95 QR02 QR41 QR77 QX01 4C084 AA13 AA16 MA17 MA23 MA35 MA37 MA38 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA962 ZA972 ZB152 ZB262 ZC202 4C086 AA01 AA02 AA03 BC82 EA16 GA02 GA10 MA01 MA04 MA17 MA23 MA35 MA37 MA38 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA96 ZA97 ZB15 ZB26 ZC20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ
２）、その部分ペプチドまたはその塩を用いることを特
徴とする骨に対する作用を有する化合物またはその塩の
スクリーニング方法。
【請求項２】骨に対する作用が骨形成促進作用、骨芽
細胞分化誘導作用、骨芽細胞分化誘導促進作用、軟骨形
成促進作用、軟骨細胞分化誘導作用、軟骨細胞分化誘導
促進作用またはＢＭＰ作用増強作用である請求項１記載
のスクリーニング方法。
【請求項３】骨に対する作用が骨形成阻害作用、骨芽
細胞分化阻害作用、骨芽細胞分化誘導阻害作用、軟骨形
成阻害作用、軟骨細胞分化阻害作用、軟骨細胞分化誘導
阻害作用またはＢＭＰ作用抑制作用である請求項１記載
のスクリーニング方法。
【請求項４】（ｉ）ＮＱＯ２、その部分ペプチドまた
はその塩に基質を接触させた場合と（ii）ＮＱＯ２、そ
の部分ペプチドまたはその塩に基質および試験化合物を
接触させた場合の骨に対する作用の比較を行なうことを
特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ
２）、その部分ペプチドまたはその塩を含有する骨に対
する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング
用キット。
【請求項６】請求項１記載のスクリーニング方法また
は請求項５記載のスクリーニング用キットを用いて得ら
れる骨に対する作用を有する化合物またはその塩。
【請求項７】請求項１記載のスクリーニング方法また
は請求項５記載のスクリーニング用キットを用いて得ら
れる化合物またはその塩を含有してなる骨作用剤。
【請求項８】ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ
２）の発現もしくは活性を阻害する作用を有する化合物
またはその塩を含有してなる骨疾患の予防・治療剤。
【請求項９】骨形成促進剤、骨芽細胞分化誘導剤、骨
芽細胞分化誘導促進剤、軟骨形成促進剤、軟骨細胞分化
誘導剤、軟骨細胞分化誘導促進剤またはＢＭＰ作用増強
剤である請求項８記載の剤。
【請求項１０】骨折、再骨折、骨変形・変形脊椎症、
骨肉腫、骨髄腫、骨形成不全、側弯症、骨欠損、骨粗鬆
症、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨異栄養症、
骨ぺーチェット病、硬直性脊髄炎症、変形性関節症また
は慢性関節リウマチの予防・治療剤である請求項８記載
の剤。
【請求項１１】ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ
２）の発現もしくは活性を促進する作用を有する化合物
またはその塩を含有してなる骨疾患の予防・治療剤。
【請求項１２】ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ
２）をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列
またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有
してなる骨疾患の予防・治療剤。
【請求項１３】ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ
２）、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含
有してなる骨疾患の予防・治療剤。
【請求項１４】ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ
２）、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含
有してなる骨疾患の診断薬。
【請求項１５】哺乳動物体内におけるＮＲＨ：キノン
酸化還元酵素（ＮＱＯ２）の発現もしくは活性を、骨疾
患の予防・治療に有効な程度阻害もしくは促進すること
を含む、該哺乳動物の骨疾患の予防・治療方法。
【請求項１６】ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ
２）の発現もしくは活性を阻害もしくは促進する化合物
またはその塩を、骨疾患の予防・治療に有効な量哺乳動
物に投与することを含む、該哺乳動物の骨疾患の予防・
治療方法。
【請求項１７】骨疾患の予防・治療剤の製造のため
の、ＮＲＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ２）の発現も
しくは活性を阻害もしくは促進する化合物またはその塩
の使用。