JP5548972B2 - 退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
例えば、関節疾患では、変形性関節症、関節リウマチ等の予防、治療が重要であるが、これらの関節疾患の病因、病態には、関節にかかる荷重や過大な力学的ストレスが関節に影響を与え、特に、力学的負荷により関節軟骨の変性、損傷、摩耗等が、関節の退行性変性、破壊を引き起こし、関節疾患が進行することが知られている。
活動的な生活やスポーツ活動が盛んになるに従い、健康な関節機能の維持が社会的な要請であり、関節疾患の予防用又は治療用の薬剤が求められているが、この種の薬剤で現在用いられているものは、鎮痛剤、消炎剤等の関節疾患の副次的症状である炎症を緩和するものが大多数である。つまり、これらの薬剤は、関節軟骨の変性、損傷、摩耗等の予防又は治療を目的としたものはなく、新薬の開発が待たれているのが現状である。
しかしながら、in vitro(体外実験)で力学的負荷による軟骨の生物反応を観察できるシステムが存在しないため、力学的刺激により発生する関節軟骨の変性、損傷、摩耗等を予防、治療する薬剤をスクリーニングすることができなかった。
なお、従来の関節疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングには、in vitroでは培養軟骨細胞等を用いて細胞レベルでサイトカイン等の生理的活性分子を用いて生化学的な刺激を与えた上で薬剤の薬効を評価する方法や関節疾患モデル実験動物を用いる方法があるが、前者は力学的負荷刺激による関節の退行性変性、破壊を評価することができない点で問題があり、後者は、実験動物を用いるものであり、数万種類以上といわれる多数の候補物質のスクリーニングには適切でないという問題があった。
上記目的を達成するため、本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法は、軟骨に関連した退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法であって、培養容器に載置した複数片の軟骨細胞組織に、スクリーニング対象の薬剤を添加するとともに、力学的負荷刺激として前記軟骨細胞組織ごとに対応して上下方向に移動できるように、ピストン上下移動用ステージに載置したピストン載置用ステージに支持されるように配設した複数の荷重負荷用ピストンの重量を細胞組織にかけることにより行う鉛直方向の荷重負荷刺激を付与したときの前記細胞組織の変化を測定することにより、前記薬剤の評価を行うことを特徴とする。
これによって、関節疾患を始めとする疲労性疾患等の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングを容易に行うことができるとともに、その信頼性を高めることができるため、これらの予防用又は治療用の薬剤の開発スピードを飛躍的に速めることが可能となる。
具体的には、次の(1)〜(3)の工程により、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングを行う。
(1)軟骨細胞、間葉系幹細胞、筋細胞(心筋細胞)、血管細胞等を含む力学的強度をもつ細胞組織、好ましくは、三次元形状をもつ細胞組織を多数個作製し、培養容器としてマルチウェルプレート培養皿を用いて独立して培養を行う。
(2)培養したそれぞれの細胞組織(サンプル)にスクリーニング対象の薬剤(薬剤候補物質)を添加するとともに、各細胞組織に種々の条件の力学的負荷刺激を付与することにより力学的負荷を与える。
(3)一定期間の(2)の力学的負荷培養を行った後に、各細胞組織の培養上清(うわずみ)の蛋白分析、培養細胞の遺伝子発現、組織学的な細胞組織の力学的解析等を行い、力学的負荷刺激の細胞組織の分解に対する抑制効果を評価し、薬剤(薬剤候補物質)の絞り込み、選択を行う。
なお、力学的負荷刺激付与装置2の操作は、すべて炭酸ガスインキュベーター1の外から行えるようにし、これにより、炭酸ガスインキュベーター1内の滅菌状態を保って長時間に亘っての培養を可能にすることができる。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を細胞組織Cに付与することができるようにしている。
そして、制御用コンピューター4の指令で電動アクチュエーター22aを操作することにより、ピストン上下移動用ステージ21をワイヤー22bを介して、ガイド部材20に沿って上下方向に移動できるようにしている。
この場合、ピストン上下移動用ステージ21は、ピストン載置用ステージ23を載置するためのものであるので、中央部に荷重負荷用ピストン5が自由に上下方向に移動できるようにするための孔部21aを形成するようにする。
これにより、種々の荷重負荷用ピストン5の支持を簡易に行うことができる。
なお、ピストン載置用ステージ23を省略して、ピストン上下移動用ステージ21に荷重負荷用ピストン5を直接支持するようにすることもできる。
これにより、図2(a)に示すように、ピストン載置用ステージ23に荷重負荷用ピストン5を支持した状態から、ピストン上下移動用ステージ21を下方向に移動させ、図2(b)に示すように、ピストン上下移動用ステージ21の降下時に、荷重負荷用ピストン5の大径部53によるピストン載置用ステージ23への支持が解除されるようにして、荷重負荷用ピストン5の重量が培養容器3内の細胞組織Cに直接かかるようにする。
その後、ピストン上下移動用ステージ21を上方向に移動させることによって、図2(a)に示すように、ピストン載置用ステージ23に荷重負荷用ピストン5を支持した状態に復帰させる。
この荷重負荷用ピストン5による鉛直方向の荷重負荷刺激は、制御用コンピューター4の操作で荷重サイクル、荷重時間を自由に操作できる。
また、追加荷重重鎮55は、必要に応じて、重鎮装着部54に装着することができ、また、その重さも自由に設定できることから、細胞組織Cに付与する鉛直方向の荷重負荷刺激の大きさを簡易に調節することができる。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を細胞組織Cに正確に付与することができる。
具体的には、ピストン載置用ステージ23に形成した孔部23aを多角形に形成し、ガイド軸部52をこの多角形の孔部23aに適合した多角形の断面形状を有するように形成する。
これにより、荷重負荷用ピストン5の下端部51Bに細胞組織Cに対応した形状(円形以外)の加圧体51Aを装着するようにした場合等でも、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を細胞組織Cに正確に付与することができる。
これにより、種々の培養容器3の装着を簡易に行うことができる。
また、培養容器3には、必要に応じて、培地槽(注入用)32と、培地槽(排出用)33とを接続し、培地の注入及び排出を制御用コンピューター4によって制御するようにすることもできる。
具体的には、培養容器固定ステージ24上に、培養容器固定ステージ24に対して水平面内で移動可能に剪断応力ステージ25を配設し、この剪断応力ステージ25上に培養容器3を装着するようにするとともに、剪断応力ステージ25を、剪断応力負荷機構26により水平面内で移動又は振動させるようにする。
なお、水平面内で移動又は振動の方向は、1方向に限定されず、X、Y方向の2方向や円運動等、任意の方向とすることができる。
剪断応力負荷機構26としては、例えば、電動アクチュエーターや永久磁石と電磁石を組み合わせた移動機構又は振動機構を用いることができ、この剪断応力負荷機構26の駆動は、制御用コンピューター4によって制御するようにする。
これにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激、例えば、膝関節に屈曲、伸展の運動時に加わる刺激と同様の刺激を細胞組織Cに付与することができる。
この場合、荷重負荷用ピストン5による培養容器3内の細胞組織Cへの鉛直方向の荷重負荷刺激の付与方法を調整しながら、剪断応力負荷機構26によって培養容器3を水平面内で移動又は振動させることにより、斜め方向の剪断応力刺激を付与するようにすることもできる。
図3に示す荷重負荷用ピストン5の加圧体51A及び図4に示す内部培養容器30の受容基31は、細胞組織Cに適した形状とすることができ、細胞組織Cに鉛直方向の荷重負荷刺激と、横方向の剪断応力刺激を、それぞれ付与することができるようにしている。
[実験方法]
図5に示すように、ヒト膝関節由来滑膜をコラゲナーゼ処理し、10%FBS(fetal bovine serum)添加DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養液にて単層培養を行い、接着細胞を幹細胞として継代した培養細胞(1×107個)をコラーゲン溶液とともにスポンジ状のコラーゲン細胞担体(collagen scaffold)(直径9mm、高さ4mm)に播種し、三次元形状の細胞組織を作製し、光顕、電顕にて形態学的観察を行った。
5日間培養した後、図6に示すように、上記力学的負荷刺激付与装置を用いて、最大負荷量10kPa又は30kPa、0.5Hzの鉛直方向の荷重負荷刺激を1時間/日×5日間与えた(10kPa、30kPa負荷群)。
細胞組織の変化は、負荷前、無負荷を対照群とし、4群で組織学的観察、TUNEL染色、Total DNA量、IL−1β、IL−6、IL−8、MMP−1、MMP−3、MMP−9等の遺伝子発現を、RT−PCR法を用いて検出することにより測定することができる。
この場合、上記遺伝子発現の検出方法には、ノーザンブロット法やリアルタイムRT−PCR法等を用いることもできる。
また、細胞組織の変化は、同様に、IL−1β、IL−6、IL−8、MMP−1、MMP−3及びMMP−9等の蛋白発現を、ウエスタンブロット法、ELIZA法、免疫組織化学法等を用いて検出することにより測定したり、発現酵素活性、組織学的変化、力学的強度変化、細胞死(アポトーシス)等の各種指標を用いて測定することができる。
図7〜図9に示すように、滑膜由来幹細胞は、単層培養で紡錘形又は多角形を示し、電顕にて細胞内にオスミウム濃染封入体を多数認めた。
三次元形状の細胞組織内では、細胞は均一に分布し、電顕にてゲル内の細胞は丸く突起も短く、コラーゲン細胞担体と接した細胞は接着面が広がっていた。
力学的負荷刺激にて組織内DNA量は変化なく、TUNEL陽性細胞は4群とも10%以下で有意差はなかった。
MMP−1、MMP−3、IL−8、IL−6、TIMP−1のmRNA発現を認め、前3者では10kPa負荷群での発現上昇をみた。
ヒト滑膜由来幹細胞とコラーゲン細胞担体よりなる三次元形状の細胞組織は、鉛直方向の繰り返し荷重負荷刺激を与えることにより遺伝子発現に変化が認められた。
これらの遺伝子発現の変化は、変形性関節症でみられる変化に類似したものであった。
このことから、細胞組織にスクリーニング対象の薬剤を添加することにより、当該薬剤の評価を行うことができるものと考えられる。
ヒアルロン酸は、骨髄由来幹細胞の軟骨細胞の分化を促進することや、抗炎症作用、軟骨保護作用等があること、さらには、間葉系幹細胞からの軟骨修復に対して効果があること等が知られており、臨床的に変形性関節症に対して既に用いられている。
そこで、ここでは、ヒト滑膜由来培養細胞を用いた三次元培養組織への力学刺激下での軟骨分化にヒアルロン酸を添加し、その作用を検討することにより、ヒアルロン酸の評価と併せて、本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法の評価を行うこととした。
1.ヒト滑膜由来幹細胞と三次元培養組織の構築方法
ヒト滑膜組織を用いて、0.2%コラゲナーゼ酵素処理により得られた細胞を、10%FBS(fetal bovine serum)添加DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養液にて培養した接着細胞を6継代増殖培養した幹細胞を用いた。このようにして培養した1×107個の細胞を2%アテロコラーゲン溶液0.5mLに氷上で混和し、別に作製したアテロコラーゲン溶液を凍結乾燥して架橋を導入した細胞が入るポア構造をもつ直径9mm、高さ4mmのディスク状のコラーゲンスキャフォールドに細胞播種し、37℃に加温してゲル化し、最終細胞濃度1×107/mLの三次元組織を作製した。このヒト滑膜由来細胞からなる三次元培養組織を10%FBS添加DMEM培養液中で5日間、48ウェル培養皿を用いて静置培養を行った。
2.繰り返し力学刺激培養方法
上記の三次元培養組織を力学刺激下で培養するため、上記力学的負荷刺激付与装置を用いて、変形を伴う鉛直圧縮刺激を与えた。
与えた刺激は、5kPa又は20kPaの荷重を0.5Hzで、1日1時間、連続して5日間又は15日間培養を行った。ここで、5kPa又は20kPaの荷重量は、三次元培養組織に対し、それぞれ約5%又は約15%の変形を与える荷重量であり、比較的軽い負荷及び過負荷として用いた。なお、培養液は、毎日、力学刺激を与える前に交換した。
3.ヒアルロン酸添加下の力学刺激培養方法
分子量600〜1、200kDaのヒアルロン酸ナトリウムを培養液に最終濃度1000μg/mLとなるように溶解し、三次元培養組織作製直後から培養液に加えた群(HA添加群)と、ヒアルロン酸を添加しない群(HA非添加群)を作製し、それぞれ5日間静置培養後に5日間の力学刺激(10日培養群)又は5日間の静置培養後に15日間の力学刺激(20日培養群)を行った。各群3個の培養組織を作製した。
4.力学刺激による効果の評方法価
繰り返し力学刺激を与えることによる効果をみるために、力学刺激終了後直ちに培養上清を採取し、凍結保存した後に、ヒアルロン酸濃度とGAG含量を測定した。
三次元培養組織は、ヘマトキシリン・エオジン染色による組織学的観察と、DNA含量及び組織からmRNAを抽出して逆転写酵素を用いてcDNAを作製し、RT−PCR法にてmRNAを検出した。mRNA量は、G3PDHに対するバンド濃度を画像解析ソフトを用いて半定量化した。
1.ヒアルロン酸添加による組織学的変化
ヒト滑膜由来幹細胞は、コラーゲンゲルとコラーゲンスキャフォールドにより三次元組織内に比較的均一に分布した。細胞は、球状の形態を示し、ヒアルロン酸添加群では、培養10日、20日群ともにヒアルロン酸非添加群に比して、大きな細胞が集簇するのがみられた(図10)。細胞周囲のヘマトキシリンに濃く染色される細胞外マトリックスが多かった。力学刺激によるコラーゲンスキャフォールドの物理的破断はみられなかった。
2.力学刺激とヒアルロン酸添加によるDNA含量の変化
1つの三次元培養組織当たりのDNA含量はヒアルロン酸添加群とヒアルロン酸非添加群、また、10日培養群と20日培養群ともに、有意な差を認めなかった(図11)。
3.遺伝子発現
力学刺激によるアグリカンの遺伝子発現は、ヒアルロン酸非添加群では5kPaでは変化なかったが、20kPaにて約2.7倍に上昇した。一方、ヒアルロン酸添加により、5kPa負荷群、20kPa負荷群ともに、5倍から7倍上昇した。Sox9の遺伝子発現は、ヒアルロン酸添加群で5kPa負荷群でわずかに上昇し、20kPa負荷群ではヒアルロン酸添加群、非添加群ともに遺伝子発現量が充進した(図12)。さらに、real time RT−PCRによる定量的遺伝子発現解析により、CD44、TGF−β1は、5kPa負荷群で、HAS(ヒアルロン酸合成酵素)2遺伝子発現は20kPa負荷群にて、mRNA量が上昇していた(図13)。
4.培養上清中のヒアルロン酸濃度及びGAG含量計測
培養上清中のヒアルロン酸濃度は、ヒアルロン酸非添加で力学刺激無負荷、5kPa負荷群では変化はなかったが、20kPa負荷群で培養10日目から20日にかけて上昇した。ヒアルロン酸を添加することにより、20kPa負荷群では培養20日に有意に上昇した(図14)。培養上清中のグリコサミノグリカン(GAG)量は、ヒアルロン酸非添加群では培養10日目と20日目に差は認められなかったが、ヒアルロン酸添加により、5kPa、20kPa群ともに上昇した(図15)。
ヒアルロン酸は、既に変形性関節症に対し関節内投与により臨床使用の実績がある薬剤であり、その薬理作用は、in vitroでは滑膜細胞への抗炎症作用や軟骨細胞の生化学的ストレスに対するNO産生抑制等が知られている。
そして、本実験により、今回、コラーゲンを担体とする滑膜由来幹細胞を用いて三次元培養を行い、細胞増殖や三次元組織の組織学的な破壊等に影響を与えない強度の繰り返し力学刺激を与えることにより、アグリカンやSox9等の軟骨分化に関する遺伝子発現が上昇し、CD44、TGF−β1、HAS2遺伝子発現が上昇し、培養上清中のヒアルロン酸量やGAG量が増大することを見出した。
このことは、ヒアルロン酸が軟骨に分化しうる幹細胞組織において、繰り返し力学刺激を与える環境下ではオートクリン(autocrine)、パラクリン(paracrine)のメカニズムにより、ヒアルロン酸産生を促進し、軟骨分化に促進的に働く可能性が考えられた。このことは、組織工学を用いた軟骨修復において、体外での間葉系幹細胞から軟骨分化において力学刺激とヒアルロン酸を用いた治療への応用のみならず、体内で幹細胞からの軟骨分化において力学刺激下にヒアルロン酸を用いることにより、よりよい軟骨治療に利用できる可能性を示していると考えられる。
また、薬効が確認されているヒアルロン酸を用いて行った本実験により、本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法が、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングに用いることができることが確認できた。
2 力学的負荷刺激付与装置
20 ガイド部材
21 ピストン上下移動用ステージ
21a 孔部
22 ステージ昇降機構
22a 電動アクチュエーター
22b ワイヤー
23 ピストン載置用ステージ
23a 孔部
23b ピストン載置用ステージ駆動機構
24 培養容器固定ステージ
25 剪断応力ステージ
26 剪断応力負荷機構
3 培養容器
30 内部培養容器
31 受容基
32 培地槽(注入用)
33 培地槽(排出用)
4 制御用コンピューター
5 荷重負荷用ピストン
5a 荷重負荷用ピストン
5b 荷重負荷用ピストン
51 加圧体
51A 加圧体
52 ガイド軸部
53 大径部
54 重鎮装着部
55 追加荷重重鎮
C 細胞組織
Claims (6)
- 軟骨に関連した退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法であって、培養容器に載置した複数片の軟骨細胞組織に、スクリーニング対象の薬剤を添加するとともに、力学的負荷刺激として前記軟骨細胞組織ごとに対応して上下方向に移動できるように、ピストン上下移動用ステージに載置したピストン載置用ステージに支持されるように配設した複数の荷重負荷用ピストンの重量を細胞組織にかけることにより行う鉛直方向の荷重負荷刺激を付与したときの前記細胞組織の変化を測定することにより、前記薬剤の評価を行うことを特徴とする退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
- 細胞組織に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しながら、細胞組織を載置した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方向の剪断応力刺激を付与するようにしたことを特徴とする請求項1記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
- 細胞組織が、三次元形状をもつことを特徴とする請求項1又は2記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
- 細胞組織の変化を、IL−1β、IL−6、IL−8、MMP−1、MMP−3及びMMP−9、アグリカン、Sox9、CD44、TGF−β1及びHAS2の少なくとも1種の遺伝子発現を検出することにより測定することを特徴とする請求項1、2又は3記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
- 細胞組織の変化を、IL−1β、IL−6、IL−8、MMP−1、MMP−3及びMMP−9の少なくとも1種の蛋白発現を検出することにより測定することを特徴とする請求項1、2又は3記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
- 細胞組織の変化を、アグリカン、Sox9、CD44、TGF−β1及びHAS2の少なくとも1種の遺伝子発現を検出することにより測定することを特徴とする請求項1、2又は3記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
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