JP2005511083A - ヒト胚幹細胞由来の軟骨細胞前駆細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般に、細胞生物学、胚幹細胞、および細胞分化の分野に関する。軟骨の特徴を有する、新しい供給源由来の分化細胞を開示する。
本願は、2001年12月7日に出願された米国特許仮出願第60/339,043号の優先権を主張する。
軟骨破壊は2つの疾患群の顕著な特徴である:変性疾患である変形性関節症、および主に炎症に起因する関節リウマチ。破壊は、関節痛およびかなりの身体障害となり得る程度の運動機能障害を引き起こす。
本発明は、多能性細胞から軟骨細胞系譜の細胞に分化した霊長動物細胞を効率的に産生する系を提供する。研究および臨床療法に適した軟骨細胞が大幅に濃縮された細胞集団について説明する。
本発明は、多能性幹細胞からヒト軟骨細胞を効率的に分化させる方法を示すことにより、この細胞の大きな集団を産生する問題を解決する。
本開示の目的上、特記しない限り、「軟骨細胞」という用語は軟骨細胞経路由来の任意の細胞を意味する。これには、II型コラーゲンおよびアグリカンの合成により軟骨を形成し得る成熟細胞が含まれる。また、成熟軟骨細胞を形成するように拘束された、自己複製可能な前駆細胞も含まれる。
分子遺伝学および遺伝子工学における一般的な方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrookら、Cold Spring Harbor);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (MillerおよびCalos編);およびCurrent Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubelら編、Wiley & Sons) の現行版に記載されている。分子生物学、タンパク質化学、および抗体技術は、Current Protocols in Protein Science(J.E. Colliganら編、Wiley & Sons);Current Protocols in Cell Biology(J.S. Bonifacinoら、Wiley & Sons)、およびCurrent Protocols in Immunology(J.E. Colliganら編、Wiley & Sons)に見出すことができる。本開示で引用する遺伝子操作用の試薬、クローニングベクター、およびキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech、およびSigma-Aldrich Co.等の市販業者から入手可能である。
本発明は、様々な種類の幹細胞を用いて実施され得る。幹細胞のうち本発明での使用に適した細胞は、胚盤胞または妊娠中の任意の時点で採取される胎児もしくは胚組織等の、妊娠後に形成される組織由来の霊長動物幹(pPS)細胞である。限定されない例は、以下に例証するような、胚幹細胞または胚生殖細胞の初代培養または樹立株である。
胚幹細胞は、霊長動物種のメンバーの胚盤胞から単離され得る(米国特許第5,843,780号;Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844、1995)。ヒト胚幹(hES)細胞は、Thomsonら(米国特許第6,200,806号;Science 282:1145、1998;Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ページ以降、1998)およびReubinoffら、Nature Biotech. 18:399、2000の記載する技術により、ヒト胚盤胞細胞から調製することが可能である。hES細胞に相当する細胞種には、国際公開公報第01/51610号(Bresagen)に概説されるような、原始外胚葉様(EPL)細胞等のその多能性派生物が含まれる。
ヒト胚生殖(hEG)細胞は、最終月経期から約8〜11週間後に得られるヒト胎児物質中に存在する始原生殖細胞から調製することができる。適切な調製方法は、Shamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726、1998および米国特許第6,090,622号に記載されている。
pPS細胞は、分化を促進せずに増加を促進する培養条件を用いて培養し、連続的に増殖させることが可能である。血清を含む代表的なES培地は、80% DMEM(ノックアウトDMEM、Gibco等)、20%の既知組成ウシ胎仔血清(FBS、Hyclone)または血清代替品(国際公開公報第98/30679号)のどちらか、1%非必須アミノ酸、1 mM L-グルタミン、および0.1 mMβ-メルカプトエタノールから作製する。使用する直前に、ヒトbFGFを4 ng/mLになるように添加する(国際公開公報第99/20741号、Geron Corp.)
本発明の軟骨細胞は、所望の表現型を有する細胞を濃縮する特殊な増殖環境で幹細胞を培養、分化、または再プログラミングすることにより得られる(所望の細胞の増殖によるか、または他の細胞種の阻害もしくは死滅による)。これらの方法は、前項に記載した霊長類多能性幹(pPS)細胞を含む多くの種類の幹細胞に適用可能である。
pPS細胞から軟骨細胞を導出する効果的な方法は、非特異的な様式でpPS細胞の分化を開始し、同時にまたはその後開始細胞を軟骨細胞特異的分化因子と混合すると言うのが、本発明の仮説である。
培養物を軟骨細胞経路に方向づけるため、直前の項に記載したように開始させたpPS細胞を、軟骨細胞分化因子の混合物中で培養する。それぞれの因子は、単独でまたは組み合わせで、細胞を軟骨細胞経路に沿って分化させ、軟骨細胞表現型を有する細胞を増殖させ、他の細胞種の増殖を阻害し、または別の様式で軟骨細胞を濃縮する可能性がある。本発明を実施するために、軟骨細胞が濃縮される機構を理解する必要はない。
細胞は、多くの表現型基準に従って特徴づけされ得る。基準には、形態学的特徴の顕微鏡観察、発現する細胞マーカーの検出または定量、インビトロで測定可能な機能的基準、および宿主動物に注入した際の挙動等が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の細胞は、それらが軟骨細胞に特徴的な表現型マーカーを発現するか否かに従って特徴づけされ得る。
臨床応用に関して軟骨細胞の発達について持たれる多大な関心は、細胞集団が宿主内で軟骨を形成し関節機能を回復する能力である。軟骨細胞機能の再構成は、いくつかの確立した動物モデルを用いて試験され得る。
本発明の多くの軟骨細胞集団は、実質的な増殖能を有する。必要に応じて、内因性遺伝子からの転写を増加させることによって、または導入遺伝子を導入することによって、細胞中のテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)のレベルを増加させることにより複製能をさらに増強することができる。特に適切なのは、国際公開公報第98/14592号に提供されるヒトテロメラーゼ(hTERT)の触媒成分である。ヒト細胞におけるテロメラーゼのトランスフェクションおよび発現は、Bodnarら、Science 279:349、1998およびJiangら、Nat. Genet. 21:111、1999に記載されている。遺伝子改変細胞は、標準的な方法に従って、RT-PCR法、テロメラーゼ活性(TRAPアッセイ法)、hTERTの免疫細胞化学染色、または複製能により、hTERTの発現について評価することができる。myc、SV40ラージT抗原、またはMOT-2をコードするDNAで細胞を形質転換する等の、細胞を不死化する他の方法もまた意図している(米国特許第5,869,243号、国際公開公報第97/32972号、および国際公開公報第01/23555号)。
本発明は、様々な重要な研究、開発、および商業目的のために、多数の軟骨細胞を産生する方法を提供する。
本発明の細胞を用いて、軟骨細胞前駆細胞および成熟軟骨細胞の特徴に影響を及ぼす因子(溶媒、小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチド等)または環境条件(培養条件または操作等)をスクリーニングすることができる。
本発明はまた、そのような療法を必要とする患者において軟骨を含む筋骨格構造を保持または回復するための、軟骨細胞前駆細胞またはその派生物の使用を提供する。関節可動性の機能障害をもたらす任意の病態が考慮され得る。衝撃による外傷に起因する損傷およびスポーツ障害が含まれる。本発明の細胞はまた、変性を引き起こす主要な病態を十分に制御することを提供し、変形性関節症および関節リウマチ等の変性疾患の損失機能を回復するための治療にも考慮される。長吻(proboscis)の手術を含むがこれに限定されない、美容整形への本発明の細胞の使用も意図する。G.C. BurgetおよびF.J. MenickによるAesthetic Reconstruction of the Nose、Mosby Year Book 1994;Nikolay GogolらによるThe Nose、David R. Godine publisher、1993;およびYooら、J. Urol. 162:1119, 1999を参照されたい。
1. 少なくとも5%の細胞が内因性遺伝子からII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する、霊長動物多能性幹(pPS)細胞を分化させることによって得られる細胞集団。
2. エラスチン、I型コラーゲン、X型コラーゲン、またはオステオカルシンを合成する細胞が1%未満である、請求項1記載の細胞集団。
3. Koppelら、Biomaterials 22:1407, 2001に記載される動物モデルにおいて2ヶ月以内に6 mm穴を閉鎖する、霊長動物多能性幹(pPS)細胞を分化させることによって得られる細胞集団。
4. 霊長動物多能性幹(pPS)細胞を分化させることによって得られ、請求項1〜3記載の細胞の特徴を有する子孫を形成し得る、インビトロ培養において増殖する軟骨細胞前駆細胞の集団。
5. 含んでいる未分化pPS細胞が1%未満である、請求項1〜3記載の細胞集団。
6. テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)を高レベルで発現するように遺伝子改変した細胞を含む、請求項1〜5記載の細胞集団。
7. 霊長動物胚幹細胞の樹立株と同じゲノムを有する、前項のいずれか一項記載の細胞集団。
8. 前項のいずれか一項記載の分化細胞集団、およびそれが得られる元となった未分化pPS細胞株を含む、2つの細胞集団。
9. pPS細胞を分化させ、その後分化細胞を軟骨細胞分化因子の混合物と共に培養する段階を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の細胞集団を取得する方法。
10. pPS細胞を分化させて胚様体を形成する段階を含む、請求項9記載の方法。
11. 軟骨細胞分化因子の混合物が、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、増殖分化因子(GDF)、骨形成タンパク質(BMP)、ヘッジホッグタンパク質(HH)、L-アスコルビン酸、および副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTHrP)から選択される1つまたは複数の因子を含む、請求項9〜10記載の方法。
12. 細胞集団がII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する条件下で、請求項1〜7記載の細胞集団をインキュベートする段階を含む、軟骨を産生する方法。
13. 生理的適合性賦形剤中の請求項1〜7記載の細胞集団を含む、インビボで軟骨を産生、修復、または維持するための薬学的組成物。
14. インビボで再吸収される基質をさらに含む、請求項13記載の薬学的組成物。
15. 化合物を請求項1〜7記載の細胞集団と混合する段階、化合物と混合したことに起因する細胞集団における任意の表現型変化または代謝変化を判定する段階、およびその変化を化合物が軟骨細胞の増殖、分化、または軟骨成分の合成を調節する能力と関係づける段階を含む、軟骨細胞の増殖、分化、または軟骨成分の合成を調節する能力について化合物をスクリーニングする方法。
16. 請求項1〜7記載の細胞集団を被験者に投与する段階を含む、被験者において軟骨を再構築する方法。
17. 被験者において軟骨を再構築する医薬品の調製における、請求項1〜7記載の細胞集団の使用。
18. 関節の外傷、関節炎、もしくは変形性関節症の治療、または美容整形での使用のための医薬品の調製における、請求項1〜7記載の細胞集団の使用。
19. pPS細胞がヒト胚盤胞から得られる細胞の子孫である、前項のいずれか一項記載の細胞集団、組成物、方法、または使用。
20. pPS細胞がヒト胚幹細胞である、前項のいずれか一項記載の細胞集団、組成物、方法、または使用。
Claims (21)
- 少なくとも5%の細胞が内因性遺伝子からII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する、霊長動物多能性幹(pPS)細胞を分化させることによって得られる細胞集団。
- 少なくとも5%の分化細胞が内因性遺伝子からII型コラーゲンまたはアグリカンを合成し、
系が分化細胞が産生される元となった未分化pPS細胞系譜をさらに含む、
軟骨細胞系譜の細胞を産生する系の一部として霊長動物多能性幹(pPS)細胞を分化させることによって得られる細胞集団。 - 請求項1記載の分化細胞集団、および得られる元となった未分化pPS細胞を含む、膵臓ホルモン分泌細胞を産生する系。
- エラスチン、I型コラーゲン、X型コラーゲン、またはオステオカルシンを合成する細胞が1%未満である、前記請求項のいずれか一項記載の分化細胞集団。
- Koppelら、Biomaterials 22:1407、2001に記載される動物モデルにおいて2ヶ月以内に6 mm穴を閉鎖する、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
- 霊長動物多能性幹(pPS)細胞を分化させることによって得られ、請求項1〜3記載の分化細胞の特徴を有する子孫を形成し得る、インビトロ培養において増殖する軟骨細胞前駆細胞の集団。
- 含んでいる未分化pPS細胞が1%未満である、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
- テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)を高レベルで発現するように遺伝子改変した細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
- 霊長動物胚幹細胞の樹立株と同じゲノムを有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
- pPS細胞を分化させ、その後分化細胞を軟骨細胞分化因子の混合物と共に培養する段階を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団を取得する方法。
- pPS細胞を分化させて胚様体を形成する段階を含む、請求項9記載の方法。
- 軟骨細胞分化因子の混合物が、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、増殖分化因子(GDF)、骨形成タンパク質(BMP)、ヘッジホッグタンパク質(HH)、L-アスコルビン酸、および副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTHrP)から選択される1つまたは複数の因子を含む、請求項9記載の方法。
- 細胞集団がII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する条件下で、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団をインキュベートする段階を含む、軟骨を産生する方法。
- 生理的適合性賦形剤中の請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団を含む、インビボで軟骨を産生、修復、または維持するための薬学的組成物。
- インビボで再吸収される基質をさらに含む、請求項13記載の薬学的組成物。
- 化合物を請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団と混合する段階、化合物と混合したことに起因する細胞集団における任意の表現型変化または代謝変化を判定する段階、およびその変化を化合物が軟骨細胞の増殖、分化、または軟骨成分の合成を調節する能力と関係づける段階を含む、軟骨細胞の増殖、分化、または軟骨成分の合成を調節する能力について化合物をスクリーニングする方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団を被験者に投与する段階を含む、被験者において軟骨を再構築する方法。
- 被験者において軟骨を再構築する医薬品の調製における、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団の使用。
- 関節の外傷、関節炎、もしくは変形性関節症を治療する、または美容整形に使用する医薬品の調製における、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団の使用。
- pPS細胞がヒト胚盤胞から得られる細胞の子孫である、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
- pPS細胞がヒト胚幹細胞である、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
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