DE102010033565B4 - Marker zur Bestimmung von Chondrozyten - Google Patents

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Abstract

Verwendung eines Markers zur in vitro Bestimmung der pharmazeutischen Identität, Reinheit oder Potenz von Chondrozyten, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ausgewählt ist aus zumindest einem der folgenden: FLT-1, BSP-2, Kollagen Typ I, und IL-1beta, wobei die Expression des Markers bestimmt wird.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Marker zur Verwendung der Bestimmung der pharmazeutischen Identität, Reinheit und/oder Potenz von Chondrozyten, bzw. ein Verfahren zur Bestimmung der pharmazeutischen Identität, Reinheit und/oder Potenz von Chondrozyten, bei dem solche Marker bestimmt werden.
  • Chondrozyten stellen aus Chondroblasten hervorgehende Zellen dar, die im Knorpelgewebe ansässig sind. Im ausgewachsenen Knorpel liegen Chondrozyten in isogenen Gruppen – bis ca. 10 – zusammen, umgeben von Extrazellularsubstanz; sie machen weniger als 10% des Knochenvolumens aus. Aufgrund ihrer hohen Syntheseleistung besitzen sie viele Organellen und große Golgi Komplexe. Im gesunden Knorpel besitzen Chondrozyten eine geringe Mitoserate; sie synthetisieren spezifische Matrixkomponenten und reichern diese als hyaline Knorpelsubstanz an, und ändern ihre Syntheserate bei einem veränderten Belastungsmuster.
  • Hyaliner Knorpel wird überall dort gefunden, wo hauptsächlich Druckbelastungen erfolgen, weshalb er meistens im Gelenkknorpel zu finden ist. Heutzutage gehören Knorpeldefekte und degenerative Gelenkerkrankungen zu den am weitesten verbreiteten Erkrankungen. Meist wird hierbei zwischen Erkrankungen des Knorpels unterschieden, bei welchen die Zerstörung der Gelenkflächen wahrscheinlich hauptsächlich auf Belastungseinwirkungen zurückzuführen ist, und Erkrankungen, bei welchen die Gelenkdegeneration durch Entzündung im Vordergrund stehen.
  • Abgesehen von den – teilweise sehr – schmerzhaften Begleiterscheinungen dieser Erkrankungen, spielen diese auch im Gesundheitswesen eine große Rolle, da die Behandlung von Gelenkdefekten sehr kostenintensiv ist, was nicht zuletzt auch auf die hohe Zahl der Erkrankungsfälle zurückzuführen ist.
  • Da die Kapazität des hyalinen Knorpels zur endogenen Regeneration von Natur aus eingeschränkt ist, stellt ein chirurgischer Eingriff zur Behandlung von Knorpeldefekten meist die einzige Alternative für eine zumindest ansatzweise erfolgreiche Therapie dar. Gemeinsam ist den gegenwärtig angewandten Therapieansätzen das Ziel der Wiederherstellung von Knorpelmasse, von kongruenter Gelenkoberfläche, von physiologischer Funktionalität und Schmerzfreiheit. In letzter Zeit hat sich insbesondere die autologe Chondrozyten Transplantation/Implantation (ACT oder ACI) als bevorzugte Maßnahme herausgestellt. Im Rahmen der ACT wird in einem ersten operativen Eingriff eine Knorpelbiopsie aus einem gesunden Areal fern der Hauptbelastungszone des Gelenkes entnommen. Aus dem Matrixverbund der Biopsie werden Chondrozyten enzymatisch herausgelöst, isoliert und in vitro expandiert. Nach ca. zwei Wochen und erfolgreicher Zellexpansion wird das Gelenk erneut eröffnet und von Debris gereinigt. Anschließend wird ein patienteneigener Periostlappen (Knochenhaut) über den Defekt genäht, wodurch eine Kammer geschaffen wird, die mit der Chondrozyten-Suspension gefüllt wird.
  • Die ACT hat auf der anderen Seite einige Nachteile, denen inzwischen insbesondere durch die Implantation von auf Biomaterialien aufgebrachten Zellen/Chondrozyten begegnet wurde.
  • So ist im Stand der Technik bspw. ein bioresorbierbarer, biphasischer Kollagen-Träger bekannt (NOVOCART® 3D, TETEC AG, Reutlingen, Deutschland), der – mit autologen Chondrozyten besiedelt – in Knorpel-Knochen- oder reine Knorpeldefekte implantiert wird. Während die Zellen die biologische Wiederherstellung des defekten Knorpels vermitteln, erleichtert der biphasische Träger die intraoperative Handhabung und sorgt in-vivo für mechanischen Schutz der implantierten Zellen und des neu entstehenden Knorpelgewebes. Darüber hinaus gewährleistet der Träger auch, dass die zu implantierenden Chondrozyten an der Stelle des Defekts verbleiben, was bei der konventionellen ACT, also einer ACT mit Periostlappenabdeckung, sehr oft ein größeres Problem darstellt.
  • Gleichwohl stellt die Auswahl, Identifizierung und Kultivierung der Chondrozyten, sowohl bei der konventionellen ACT als auch bei einem Einsatz von trägerunterstützter ACT, oder generell von Chondrozytenimplantationen, eine große Herausforderung dar; dies liegt darin begründet, dass Chondrozyten hinsichtlich ihrer Geeignetheit, als autologe Zellen für die Implantation zur Knorpelregeneration eingesetzt zu werden, stark variieren können, und zwar nicht nur Chondrozyten eines Spenders im Verhältnis zu Chondrozyten eines anderen Spenders, bspw. eines gesunden Spenders im Vergleich eines erkrankten Spenders, sonder auch Chondrozyten innerhalb eines Spenders. Ferner können sich Chondrozyten während der ex vivo Kultur in ihren Eigenschaften derart verändern, dass sie für eine Implantation nicht mehr so geeignet sind, wie direkt nach der Isolierung aus dem Spender angenommen.
  • Daher wäre es wünschenswert, ein Verfahren zu entwickeln, anhand dessen Chondrozyten auf ihre Geeignetheit für eine voraussichtlich erfolgreiche Chondrozytentransplantation hin überprüft werden können, bspw. Kriterien zu besitzen, die darauf schließen lassen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein solches Verfahren bzw. Kriterien bereitzustellen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe durch die Verwendung von Markern bzw. Markergenen gelöst, die für die Bestimmung von zumindest einem der folgenden geeignet sind, nämlich Identität, Reinheit und Potenz, und die ausgewählt sind aus zumindest einem der folgenden FLT-1 (Rezeptor des ”vascular endothelial growth factor), BSP-2 (”bone sialoprotein 2”), Kollagen Typ I, Kollagen Typ II, Aggrekan, Interleukin IL-1beta und MMP-3 (Matrixmetalloproteinase 3), wobei die Expression des zumindest einen Markers bestimmt wird.
  • Ferner wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Identität, Reinheit und/oder Potenz von Chondrozyten in vitro, wobei in einer biologischen Probe enthaltend Chondrozyten zumindest einer der folgenden Marker bestimmt wird: FLT-1, BSP-2, Kollagen Typ I, Kollagen Typ II, Aggrekan, IL-1beta und MMP-3.
  • Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe wird dadurch vollkommen gelöst.
  • Mit der Bereitstellung der Marker und deren Verwendung ist es erstmals möglich, gezielt Chondrozyten auszuwählen und zu identifizieren, die hinsichtlich ihrer Identität, Reinheit und Potenz optimal für eine aussichtsreiche Chondrozytentransplantation sind, also eine Chondrozytenpopulation darstellen, die einerseits hinreichend identifiziert und rein ist, und die andererseits in ihrer Fähigkeit noch aktiv ist, schrittweise den transienten proliferativen Zustand in Richtung metabolischen Zustand umzukehren.
  • Mit ”Bestimmen” ist vorliegend jedes gen- und/oder biotechnologische Verfahren gemeint, anhand dessen der oder die Marker bzw. deren Expression in einer biologischen Probe, insbesondere einer Chondrozyten enthaltenden Probe identifiziert werden können.
  • Ferner ist vorliegend mit ”biologischer Probe” jede Probe gemeint, die einem Menschen zuvor entnommen wurde, und von der angenommen wird, dass sie Chondrozyten enthält. Vorzugsweise ist die Probe eine Gelenkprobe bzw. eine Knorpelprobe, sowie noch bevorzugter eine Knorpel- bzw. Gelenkprobe aus einer Stelle eines Körpers, in die ein Implantat zur Behandlung eines Knorpelschadens eingesetzt werden soll, wobei die in der biologischen Probe enthaltenen Chondrozyten direkt nach der Entnahme der Probe ex vivo untersucht und/oder aber nach einer in vitro Kultivierung untersucht werden.
  • Die vorliegenden Marker bieten die Möglichkeit, Chondrozyten nicht nur hinsichtlich ihrer anatomischen Identität auszuwählen, sondern gerade auch hinsichtlich ihres genetischen Musters zu bestätigen. Dabei spielt insbesondere auch die Reinheit der so zu identifizierenden Chondrozyten eine große Rolle, da dadurch sicher gestellt wird, dass nur Chondrozyten gereinigt und letztendlich verwendet werden, und nicht auch bspw. osteogene oder endotheliale Zellen, die gemeinsam noch die Fähigkeit besitzen, ektopen Knochen entstehen zu lassen.
  • Ferner wird durch die bereitgestellte neue Verwendung sichergestellt, dass auch nur Chondrozyten eingesetzt werden, die noch bzw. wieder in der Lage sein werden, extrazelluläre Matrix zu produzieren, eine Schlüsseleigenschaft von Chondrozyten, die für eine erfolgreiche Chondrozytentransplantation notwendig ist.
  • Dementsprechend wird unter ”Potenz” die Fähigkeit von Chondrozyten verstanden, die Produktion der extrazellulären Matrix wieder aufzunehmen, wenn die Zellen in die zu behandelnde Stelle des Defekts implantiert werden.
  • Die mit der vorliegenden Erfindung erstmals für diesen Zweck bereitgestellten Marker stellen daher ein ausgezeichnetes Werkzeug dar, mit dem eine gute und ausreichende Überprüfung der einzusetzenden Chondrozyten gewährleistet wird.
  • Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn die Expression des Markers über den mRNA-Level, den Protein-Level und/oder über einen Funktionstest bestimmt wird.
  • Die Bestimmung des Levels der mRNA und/oder der Proteine, die von den Genen kodiert werden, liegt im allgemeinen Können und Wissen eines Fachmanns. Zu den üblichen Verfahren zählen bspw. Northern Blot, Western Blot, ELISA, und (quantitative) Reverse-Transkriptase PCR (Polymerase Kettenreaktion) Techniken, sämtlich die zum Standard-Können eines Fachmanns in dem betreffenden Gebiet zählen.
  • Insbesondere ist dabei bevorzugt, wenn die Expression des Markers über einen erhöhten mRNA-Level, einen erhöhten Protein-Level und/oder Enzymaktivitäts-Level bestimmt wird. Dabei kann der erhöhte mRNA-Level entweder in Relation über die Zeit bezüglich einer Chondrozytenpopulation bestimmt werden, oder aber im Verhältnis zu anderen Zellpopulationen.
  • Ferner ist dabei bevorzugt, wenn der Marker zumindest einer der folgenden ist, FLT-1, BSP-2, Kollagen Typ I oder II ist, und dass dessen Expression über einen erhöhten mRNA-Level bestimmt wird.
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass über einen erhöhten Level der mRNA von FLT-1, BSP-2, Aggrekan, Kollagen Typ I und/oder Kollagen Typ II Chondrozyten hinsichtlich ihrer Identität (Kollagen Typ II und Aggrekan), Reinheit (BSP-2 und FLT-1) oder Potenz (Kollagen Typ I und II, Aggrekan) eindeutig bestimmt werden können. So kann bspw. über die Quantifizierung der Kollagen Typ II mRNA und der Aggrekan mRNA eine positive Aussage über die Identität der Chondrozyten gemacht werden. Ferner kann über die Quantifizierung der BSP-2 mRNA und der FLT-1 mRNA eine positive Aussage über die Reinheit der Chondrozyten bzw. negative über verunreinigende Zelltypen getroffen werden, da diese beiden Marker typisch für subchondrale Gewebe sind.
  • Dabei bedeutet vorliegend ”negativer Marker”, dass dann, wenn bei einem der Gene eine erhöhte Expression festgestellt wird, die Chondrozyten bspw. nicht rein sind (wie bspw. für den Marker BSP-2 und FLT-1); hingegen bedeutet ”positiver Marker”, dass ein erhöhte Expression dieser Marker die Identität der Chondrozyten bestätigt.
  • Ferner ist in einer anderen Ausführungsform bevorzugt, wenn der Marker MMP3 oder Aggrekan, insbesondere das 846-Epitop, ist, und die Expression des Markers über einen erhöhten Protein-Level bestimmt wird. Hierbei wird sich zu Nutze gemacht, dass eine Veränderung in der Freisetzung des 846-Epitops von Aggrekan ein Hinweis auf eine beginnende Re-Differenzierung ist, so dass ein erhöhter Level diese Epitops auf eine funktionierende Potenz hinweist. Gleiches gilt für MMP-3, da die Freisetzung von MMP-3 ein positiver Marker für die Knorpelregeneration ist.
  • Durch die Bestimmung dieser Marker können vorteilhaft Chondrozyten hinsichtlich deren Potenz, eine extrazelluläre Matrix zu bilden, isoliert werden.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist bevorzugt, wenn die mRNA von Interleukin-1beta (IL-1beta) bestimmt wird, wobei ein erhöhter IL-1beta-mRNA-Level als Negativ-Marker verwendet wird.
  • Wie bereits weiter oben erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung der Identität, Reinheit und/oder Potenz von Chondrozyten in vitro, wobei in einer biologischen Probe enthaltend Chondrozyten zumindest einer der folgenden Marker bestimmt wird: FLT-1, BSP-2, Kollagen Typ I, Kollagen Typ II, Aggrekan, IL-1beta und MMP-3. Insbesondere ist dabei ein Verfahren bevorzugt, das die folgenden Schritte aufweist: a) Isolieren und ggf. Kultivieren von Chondrozyten aus einer biologischen Probe, und b) Bestimmen der Genexpression von zumindest einem der folgenden Marker in den Chondrozyten: FLT-1, BSP-2, Kollagen Typ I, Kollagen Typ II, Aggrekan, IL-1beta und MMP-3.
  • Insbesondere ist bei dem Verfahren bevorzugt, wenn zur Bestimmung der Identität von Chondrozyten eine erhöhte Gen-Expression von Kollagen Typ II und/oder Aggrekan bestimmt wird, und/oder wenn zur Bestimmung der Reinheit von Chondrozyten eine erhöhte Gen-Expression von FLT-1 und/oder BSP-2 bestimmt wird, und/oder wenn zur Bestimmung der Potenz von Chondrozyten eine erhöhte Genexpression von Kollagen Typ I, Kollagen Typ II, Aggrekan, IL-1beta und/oder MMP3 bestimmt wird.
  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden in den Chondrozyten, die in einer biologischen Probe vorliegen, die betreffenden Marker in ihrer Genexpression bestimmt, und zwar dahingehend, ob sie im Vergleich zu Kontrollen und/oder über die Zeit eine erhöhte Genexpression für diese Marker besitzen.
  • Dabei ist wie bereits bei der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt, wenn die erhöhte Genexpression über einen erhöhten mRNA-Level, einen erhöhten Proteinlevel und/oder Enzymaktivitätslevel bestimmt wird.
  • Insbesondere ist dabei bevorzugt, wenn ein erhöhter mRNA-Level von Kollagen Typ I, Kollagen Typ II, und/oder Aggrekan mit der Identität, Reinheit oder Potenz von Chondrozyten korreliert wird, und insbesondere, wenn ein erhöhter mRNA-Level von BSP-2 und/oder FLT-1 mit der Reinheit von Chondrozyten umgekehrt korreliert wird, bzw. wenn ein erhöhter mRNA-Level von Kollagen Typ I, Kollagen Typ II mit der intakten Potenz von Chondrozyten korreliert wird.
  • In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens ist bevorzugt, wenn ein erhöhter Protein-Level von Aggrekan, insbesondere über den Nachweis des 846-Epitops, und/oder MMP3 mit der intakten Potenz von Chondrozyten korreliert wird.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird, analog zu der erfindungsgemäßen Verwendung, ein erhöhter mRNA-Level von IL-1beta mit einer erniedrigten Potenz von Chondrozyten korreliert wird.
  • Insgesamt ist bevorzugt, wenn die Marker alleine oder in einer Kombination miteinander eingesetzt werden. Hierbei können die Marker also jeweils entweder alleine in ihrer Genexpression bestimmt werden, oder aber zwei oder mehrere oder alle, und das Ergebnis der Bestimmung der Genexpression der Marker entsprechend mit der Identität, Reinheit und Potenz von Chondrozyten korreliert werden. Ferner können diese Ergebnisse auch noch mit dem mRNA-Verhältnis zwischen Kollagen Typ I und Kollagen Typ II korreliert werden, um die Sicherheit der korrekten Bestimmung der Chondrozyten zu gewährleisten.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Marker selber, und zwar zur Verwendung der Bestimmung der Identität, Reinheit und/oder Potenz con Chondrozyten in einer biologischen Probe, wobei der Marker ausgewählt ist aus zumindest einem der folgenden: FLT-1, BSP-2, Kollagen Typ I, Kollagen Typ II, Aggrekan, IL-1beta und MMP-3.
  • Es versteht sich, dass die vorliegend genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in Alleinstellung oder in anderen Kombinationen denkbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
  • Die Erfindung wird nachstehend anhand den Figuren und den Beispielen näher erläutert. Es zeigen:
  • 1: eine Analyse der relativen Genexpression der veschiedenen Markergene
  • 2: Tabelle 1: eine Übersicht der Markergene und deren Einsatz als Marker bei der Untersuchung der Identität, Reinheit und Potenz von autologen Chondrozyten
  • Beispiel: Charakterisierung der autologen Chondrozyten Implantation in einer dreidimensionalen Matrix (bspw. NOVOCART® 3D) sowie Identifizierung von Markergenen
  • Während der Herstellung von dreidimensionalen Matrices, die mit Zellen für die autologe Chondrozyten Implantation beladen werden, ist es essentiell, die „richtigen” Zellen, d. h. Chondrozyten zu identifizieren, die für die Besiedelung eingesetzt werden sollen. Zu den Charkateristika dieser Zellen gehören – neben der Lebensfähigkeit, der Zellmorphologie und der Proliferations-Aktivität – insbesondere Identität, Reinheit und Potenz. Um diese Eigenschaften standardisiert untersuchen und mit Sicherheit bestimmen zu können, wurden Markergene identifiziert, anhand derer diese Untersuchungen durchgeführt werden können.
  • Neben der Identifizierung der Markergene wurden ferner Beeinträchtigungen bzw. Nebeneffekte der Implantate an den Patienten untersucht, sowie Erhebungen vor und nach der Implantation durchgeführt.
  • Ein Zweck der Untersuchungen war demnach auch eine rückschauende Betrachtung von frühzeitigen Ergebnissen, Nebeneffekten oder Veränderungen, und zwar insbesondere hinsichtlich Schmerz, Funktion und Anschwellen in einer größeren Patientengruppe. Darüber hinaus wurden weitere Analysen durchgeführt, um die Auswirkungen der einzelnen Patienten, der Herstellung und der Produktfreisetzungscharakteristika auf die Sicherheit und die Patientenergebnisse zu untersuchen.
  • Bei den zu untersuchenden Patienten, die hinsichtlich des Erfordernisses einer Behandlung mit NOVOCART® 3D (TETEC, Reutlingen, s. o.) arthroskopisch untersucht wurden, wurden zwei bis drei Knorpel-/Knochen-Zylinder aus der interkondylären Kerbe des betroffenen Gelenks entnommen). Nach Entfernung des Knochens, sowie von mineralisiertem Knorpel wurden die Chondrozyten aus dem verbleibenden Knorpelmaterial mechanisch und enzymatisch isoliert, sowie als Primärkultur in vitro unter „Good Manufacturing Practice” (GMP) expandiert.
  • Die NOVOCART® 3D Implantation wurde routinemäßig 21 Tage nach der Arthroskopie und der Zellexpansion durchgeführt. NOVOCART® 3D wurde mit einer durchschnittlichen Zelldichte von 1.36 × 106 Zellen pro cm2 Defekt verabreicht, wobei die Zellen auf den Träger aufgetragen wurden, nachdem diese aus der Monolayer-Kultur mittels Trypsinierung geerntet worden waren. Für jedes einzelne Chondrozytenkultur-Batch wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mittels Trypan Blau Ausschluss untersucht, sowie RT-PCR-Analysen durchgeführt, wobei sechs unterschiedliche Markergene eingesetzt wurden, um die Identität, Reinheit und Potenz der expandierten Chondrozyten zu untersuchen.
  • Diese Markergene wurden basierend auf vorherigen in vitro and in vivo Versuchen unter Verwendung humaner Gelenkchondrozyten ausgewählt, um deren Fähigkeit zur Knorpelbildung zu untersuchen, sowie um die jeweilige Gelenkumgebung für den Knorpelersatz einzuschätzen.
  • Sowohl die jeweiligen Chirurgen der Patienten als auch die Patienten selber füllten entsprechende Datenblätter aus, wobei die Patienten neben grundlegenden demographischen Eckdaten auch Angaben zur Selbsteinschätzung des Operationsergebnisses machten, wie bspw. hinsichtlich des Grades der Schmerzen, der Funktionsfähigkeit.
  • Die Einstufung der Operationsergebnisse sowie die Beeinträchtigungen wurden gesammelt und statistisch erfasst. Die Erhebung erfolgte in allen klinischen Zentren Deutschlands, in denen 433 Patienten, denen NOVOCART® 3D implantiert wurde, behandelt wurden. Insgesamt wurden Daten für 422 Patienten erfasst, davon waren 140 weiblich und 282 männlich. Das Durchschnittsalter betrug 33,4 Jahre.
  • Statistiken, einschließlich von Mittelwerten, Standard-Abweichungen, Konfidenz-Intervallen, wurden dazu eingesetzt, die Zusammenfassungen der Beeinträchtigungen, der Effizienz der Operationen sowie die Patienten-Charakteristiken darzustellen. Chi-Quadrat Tests und Regressionsmodelle wurden konstruiert, um Assoziationen zwischen Herstellungs- oder Freisetzungscharakteristiken und den fünf Operationsergebnis-Einstufungen der Patientenbefragungen zu untersuchen: Implantat bezogene Beeinträchtigungen (definiert als die zusammenfassende Sammlung aus Implantatversagen, Delamination, Hypertrophie, Arthrofibrose, Adhäsion, Chondromalazie, Gelenkinfektion und das Vorliegen von osteochchondralen Dissektaten (abgelöste Knorpel-Knochen-Fragmente)), erneute Operation (aus egal welchem Grund), und Veränderungen mit Bezug auf die Basislinie von Schmerz, Funktion, und Anschwellgrad des betroffenen Gelenks.
  • Zur Untersuchung der Zell- und biomolekularen Charakteristiken wurde die Lebensfähigkeit von Chondrozyten bei der Entnahme untersucht (% lebende Zellen); sowie die mRNA Expressionlevels von sechs unterschiedlichen Markergenen in den Chondrozyten, nämlich FLT-1, BSP-2, Kollagen-Typ I/Kollagen-Typ II, Aggrekan, Interleukin-1beta sowie MMP-3, untersucht, und zwar hinsichtlich der Identität, Reinheit und Potenz von Chondrozyten.
  • Hierzu wurde jeweils die mRNA der einzelnen Marker mittels qRT-PCR (quantitative Reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion). Hierbei wurde die Expression der Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) zur Normalisierung der ermittelten Werte eingesetzt. Nach ex vivo Expansion der Chondrozyten wurde die mRNA aus den Zellen isoliert und hinsichtlich der jeweiligen Marker untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass eine erhöhte Expression von Kollagen Typ II in Verbindung mit einer erhöhten Expression von Aggrekan ein ausgezeichneter Marker bzw. eine ausgezeichnete Markerkombination für den Beleg einer geeigneten Chondrozyten-Linie ist. Ferner konnten die Marker FLT-1 und BSP-2 als negative Marker identifiziert werden, d. h., dass eine erhöhte Expression dieser beiden Gene auf unreine Chondrozyten-Populationen hinweist. Der Grenzwert für einen Hinweis auf eine unreine Population lag bei weniger als 50 mRNA Kopien pro 1000 Zellen (< 0,001/GAPDH). Hinsichtlich der zu untersuchenden Potenz der Chondrozyten konnten die Markergene Kollagen Typ I/Kollagen Typ II bzw. deren Verhältnis als geeignete Marker/Markerkombination identifiziert werden, wobei zur Bestimmung des Kollagen Typ/Kollagen Typ II Verhältnisses an Tag 19 nach der ex-vivo Expansion die Zellen geerntet und die Markergene wie oben erläutert, mittels qRT-PCR untersucht und ins Verhältnis zueinander gesetzt. Ferner kann zur Bestimmung der Potenz die Expression von IL-1beta bestimmt werden, wobei ein erhöhter IL-1beta-Wert ein negativer Marker darstellt, und diese Tatsache bspw. auch in Verbindung mit dem Wert für das Kollagen Typ/Kollagen Typ II Verhältnis zur Bestimmung der Potenz verwendet werden kann.
  • Als weitere Marker, die für die Potenz eingesetzt werden können, wurden Aggrekan (846 Epitop) und MMP-3 identifiziert. Beide Proteine wurden mittels ELISA nachgewiesen, und zwar an den Tagen 4, 19 und 20. Die quantitative Proteinexpression des 846 Epitops und von MMP-3, bzw. deren erhöhte Level, sind wichtige Indikatoren für eine funktionelle Potenz von Chondrozyten.
  • 1 zeigt die Analyse der Genexpression bei der Ernte der Chondrozyten aus expandierten Monolayerkulturen. Die Daten wurden aus PCR-Versuchen gemäß Standardprotokollen wie oben beschrieben gewonnen, bevor die Zellen auf das biphasische Trägermaterial ausgesät wurden.
  • In einigen Fällen wurden Vergleichsbiopsien von Patienten entnommen, die eine konventionelle ACI erhalten haben oder dem NOVOCART® 3D Verfahren unterzogen wurden. Diese Biopsien wurden in physiologischer Saline gesammelt, kurz in gepuffertem 4% Paraformaldehyd fixiert und in einen Gefrierschnitt-Träger (TissueTek) eingebettet, und bei –20°C bis zur Anfertigung der Schnitte aufbewahrt. Es wurden jeweils 10 Schnitte angefertigt, und jeweils mit Hämatoxylin-Eosin (HE), oder Safranin O-Fast Green (SafO) gefärbt, oder mit primären monoklonalen Antikörpern immungefärbt gegen Kollagen Typ I und II, Aggrekan (anti-Typ I Kollagen; 1 mg/ml (monoklonal Maus; Spezies-Spezifität: human; MP-Biomedical * 63170 I-8H5); anti-Typ II Kollagen; 1 mg/ml (monoklonal Maus; Spezies-Spezifität: breit; Entwicklungsstudien Thomas F. Linsenmeyer * II-II6B3); anti-Aggrekan; 0,75 mg/ml (monoklonal Maus; Spezies-Spezifität: human/bovine; Acris * SM1353)). Die Detektion wurde mit fluoreszierenden sekundären Antikörpern durchgeführt (Cy3 konjugierter AffiniPure Ziege, Anti-Maus IgG+M; 0,75 mg/ml; (Jackson, Dianova; #115-165-044)).
  • Vor dem Eingriff untersuchten die jeweiligen Chirurgen den Patienten und stuften die Untersuchungen hinsichtlich Gelenkschmerz, Funktion und Anschwellen auf einer 10-Punkt-Skala ein, wobei höhere Werte ein besseres Operationsergebnis anzeigten. Patienten, bei denen die Befragung prä- und postoperativ ausgewertet wurde, konnten signifikante Verbesserungen über der Basislinie (p < 0.0001, Wilcoxon Signed-Rank Test) feststellen.
  • Hinsichtlich des Auftretens von Beeinträchtigungen konnte Folgendes festgestellt werden: Ein Implantatversagen trat bei 3,1% der Gesamtpatientenpopulation auf. Insgesamt waren die berichteten Raten für implantatbezogene Komplikationen für die gesamte Patientenpopulation sehr niedrig. Delamination, Arthrofibrose and Hypertrophie wurden jeweils bei 1,7%, 2,4% and 0,7% beobachtet.
  • Insgesamt 36 Patienten (8,5%) benötigten eine erneute Operation und/oder Revision. Die häufigsten Beeinträchtigungen bei Patienten, die eine erneute Operation benötigten, waren Implantatversagen (13), Delamination (6), Arthrofibrose (7), Synovitis (7), Adhäsion (5), und Schmerz (6).
  • Die Größe aller behandelten Defekte korrelierte nicht mit den Beeinträchtigungen. Allerdings war die Veränderung der Basislinie bei der Funktion signifikant mit dem Alter der Patienten assoziiert, was bedeutet, dass die jüngeren Patienten im Durchschnitt stärkere Verbesserungen zeigten, p = 0.004, (Daten nicht gezeigt).
  • Ferner waren implantatbezogene Beeinträchtigungen und erneute Operationen weitestgehend unabhängig von der Lage des primären Defekts, mit Ausnahme von Patelladefekten.
  • Bei der Beurteilung der Assoziation zwischen der Klassifizierung des Knorpeldefekts und dem Auftreten von implantatbezogenen Beeinträchtigungen wurde festgestellt, dass ein Patient dann eher Beeinträchtigungen verzeichnete, wenn der Knorpeldefekt als degenerativ (p = 0,005) eingeschätzt wurde. Bei Patienten mit einem durch Osteochondrosis dissecans verursachten Knorpeldefekt wurden solche Beeinträchtigungen weniger verzeichnet (p = 0,04).
  • Währen der retro- und prospektiven klinischen Evaluationen mit NOVOCART® 3D wurden die eingelagerten cDNAs der Patienten analysiert, um gleichzeitig die Genexpressionslevel der Marker Kollagen Typ I (Col1), Kollagen Typ II (Col2), Aggrekan (Agg), Interleukin-1beta (IL-1b), Knochen-Sialoprotein-2 (BSP-2) und der endotheliale VEGF Rezeptor FLT-1 zu bestimmen. Diese Datensets wurden dann mit den klinischen Operationsergebnissen kombiniert und Assoziationen zwischen den Herstellungsprozessen und Implantatfreigabecharakteristiken sowie klinischen Ergebnissen untersucht.
  • Der zusätzliche Einsatz des Redifferenzierungsprotokolls für ausgesäte Chondrozyten im biphasischen Träger oder eine temporäre Kryokonservierung der Zellen war nicht mit einem höheren Auftreten von implantatbezogenen Beeinträchtigungen oder mit signifikanten Unterschieden in anderen Operationsergebnissen verbunden. Die gleichen Ergebnisse wurden für die verabreichten Zellzahlen beobachtet.
  • Währen der retro- und prospektiven klinischen Evaluationen mit NOVOCART® 3D wurden die eingelagerten cDNAs der Patienten analysiert, um gleichzeitig die Genexpressionslevel der Marker Kollagen Typ I (Col1), Kollagen Typ II (Col2), Aggrekan (Agg), Interleukin-1beta (IL-1b), Bone Sialo Protein-2 (BSP-2; Knochensialoprotein) und der endotheliale VEGF Rezeptor FLT-1 zu bestimmen. Diese Datensets wurden dann mit den klinischen Operationsergebnissen kombiniert und Assoziationen zwischen den Herstellungsprozessen und Implantatfreigabecharakteristiken sowie klinischen Ergebnissen untersucht.
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in 2 (Tabelle 1) gezeigt:
    Der Tabelle in 2 ist eine signifikante Assoziation zwischen implantatbezogenen Beeinträchtigungen und den Expressionslevel der erfindungsgemäßen Markergene zu entnehmen. So war ein erhöhter Expressionslevel für einen der ausgesuchten Marker für die molekulare Verunreinigung der Chondrozyten (FLT-1) mit implantatbezogenen Beeinträchtigungen assoziiert (p = 0.02). Grenzwerte wurden hinsichtlich eines erhöhten Expressionslevels eines Markers (Kollagen Typ I) für negative Potenz gefunden, sowie ein verminderter Expressionslevel eines positiven Potenzmarkers (Kollagen Typ II) (siehe auch 2 = Tabelle 1), was zeigt, dass auch diese Potenz-Marker geeignet sind, um die jeweils einzusetzenden Chondrozyten, die mit dem biphasischen Träger oder überhaupt bei der ACI eingesetzt werden, auf deren Potenz, Reinheit und Identität zu überprüfen. Im Gegensatz dazu, konnte eine Assoziation zwischen dem Verschwinden des Schmerzes und einer erhöhten Co-Expression des Identitätsmarkers und des positiven Potenz-Markers (Kollagen Typ II) für Chondrozyten festgestellt werden.
  • Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die identifizierten Marker für Identität, Reinheit und Potenz dazu eignen, den chondrogenen Phänotyp der expandierten Zellen zu bestätigen. Anhand der Marker konnte gezeigt werden, dass das für die Herstellung von NOVOCART® 3D Trägern verwendete Verfahren sicher ist und dass die verabreichte Zellzahl innerhalb des Fensters für eine therapeutische Effizienz ist. Die Marker wurden wie folgt eingesetzt:
    Kollagen Typ I und Interleukin-1beta: Negative Potenzmarker; Kollagen Typ II: positiver Potenzmarker; FLT-1, BSP-2: negative Reinheitsmarker; Aggrekan: positiver Identitätsmarker.
  • Darüber hinaus wurden Grenzwerttendenzen für implantatbezogene Nebeneffekte identifiziert, was sowohl auf eine erhöhte Expression des negativen Potenzmarkers (Kollagen Typ I) und eine erhöhte Expression des positiven Potenzmarkers zurückzuführen war. Der positive Potenzmarker ist mit dem chondrogenen Differenzierungsgrad der expandierten Chondrozyten assoziiert, wohingegen der negative Potenzmarker mit lokaler Gelenkentzündung assoziiert ist, sowie mit Apoptose (kontrollierter Zelltod) und einem eher katabolen Stoffwechsel der Chondrozyten. Andererseits gingen erhöhte Koexpressionsniveaus der Identitäts- und positiven Potenzmarker mit einem Nachlassen bzw. Verschwinden des Schmerzes nach Implantation des NOVOCART® 3D einher.
  • Insgesamt legen diese Daten nahe, dass sowohl die Qualität der implantierten Chondrozyten als auch die molekulare Umgebung des jeweiligen Gelenks das klinische Ergebnis beeinflussen kann. Mit den neuen Markern können daher neben der tatsächlichen Qualität der Zellen und des Implantats auch Teile des klinischen Erfolges vorhergesagt werden.

Claims (12)

  1. Verwendung eines Markers zur in vitro Bestimmung der pharmazeutischen Identität, Reinheit oder Potenz von Chondrozyten, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ausgewählt ist aus zumindest einem der folgenden: FLT-1, BSP-2, Kollagen Typ I, und IL-1beta, wobei die Expression des Markers bestimmt wird.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des Markers über den mRNA-Level, den Protein-Level und/oder über einen Funktions-Level bestimmt wird.
  3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Vorhersage der Reinheit von Chondrozyten zumindest einer der Marker FLT-1 oder BSP-2 eingesetzt wird, und dass eine erhöhte Genexpression dieser Gene als negativer Marker für die Reinheit der Chondrozyten benutzt wird.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Vorhersage der Potenz von Chondrozyten zumindest einer der Marker Kollagen Typ I/Kollagen Typ II Verhältnis und II-1beta bestimmt wird.
  5. Verfahren zur Bestimmung der Identität, Reinheit und/oder Potenz von Chondrozyten in vitro, mit den folgenden Schritten: a) Isolieren und ggf. Kultivieren von Chondrozyten aus einer biologischen Probe, und b) Bestimmen der Genexpression von zumindest einem der folgenden Marker in den Chondrozyten: FLT-1, BSP-2, Kollagen Typ I, und IL-1beta.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Reinheit von Chondrozyten die Genexpression von FLT-1 und/oder BSP-2 bestimmt wird, und dass eine erhöhte Genexpression dieser Gene als negativer Marker für die Reinheit der Chondrozyten benutzt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Potenz von Chondrozyten die Genexpression von Kollagen Typ I/Kollagen Typ II Verhältnis, und/oder IL-1beta bestimmt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein erhöhter mRNA-Level von Kollagen Typ I, BSP-2, und/oder FLT-1 mit der Identität, Reinheit oder Potenz von Chondrozyten korreliert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein erhöhter mRNA-Level von BSP-2 und/oder FLT-1 mit der Reinheit von Chondrozyten umgekehrt korreliert wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein erhöhter mRNA-Level an Kollagen Typ I/Kollagen Typ II Verhältnis mit der intakten Potenz von Chondrozyten korreliert wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein erhöhter mRNA-Level von IL-1beta mit einer erniedrigten Potenz von Chondrozyten korreliert wird.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker jeweils alleine oder in einer Kombination miteinander und/oder in Kombination mit einem der folgenden eingesetzt werden: Kollagen Typ II, Aggrekan, und MMP-3.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014201528A1 (de) 2013-03-27 2014-10-02 Tetec Tissue Engineering Technologies Ag In vitro-Verfahren zur prognostischen Beurteilung der Erfolgsaussichten einer Implantation und/oder Transplantation
DE102016213684A1 (de) * 2016-07-26 2018-02-01 Tetec Tissue Engineering Technologies Ag Marker und Verfahren zur Beurteilung der Zusammensetzung oder Reinheit einer Zellkultur sowie zur in vitro Bestimmung der Identität einer Knorpelzelle oder einer Synovialzelle

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102006027991A1 (de) * 2006-06-14 2007-12-27 Stiftung Orthopädische Universitätsklinik Verfahren zur Qualitätskontrolle von in einem Kulturmedium kultivierten Zellen nebst SERPINA1 und MMP-3 als Qualitätsmarker für die chondrogene Potenz von Chondrozyten

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5686116A (en) * 1990-01-12 1997-11-11 New York Society For The Relief Of The Ruptured And Crippled, Maintaining The Hospital For Special Surgery Methods of enhancing repair, healing and augmentation of bone implants
GB0001448D0 (en) * 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
IL162132A0 (en) * 2001-12-07 2005-11-20 Geron Corp Chondrocyte precursors derived from human embryonic stem cells
JP3762975B2 (ja) * 2003-03-18 2006-04-05 学校法人慶應義塾 単球由来多能性細胞ｍｏｍｃ
US8287853B2 (en) * 2005-02-11 2012-10-16 Agency For Science, Technology And Research Methods of culturing mesenchymal stem cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102006027991A1 (de) * 2006-06-14 2007-12-27 Stiftung Orthopädische Universitätsklinik Verfahren zur Qualitätskontrolle von in einem Kulturmedium kultivierten Zellen nebst SERPINA1 und MMP-3 als Qualitätsmarker für die chondrogene Potenz von Chondrozyten

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOFFMANN, B.E. u.a.: Development and characterization of a human articular cartilagederived chondrocyte cell line that retains chondrocyte phenotype. J. Cell. Physiol. (März 2010) 222 (3) 695-702 (elektronisch veräffentlicht 17.12.2009) *

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