EP1868659A1 - Verfahren zur herstellung eines gewebetransplantatkonstruktes zur rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen organs - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines gewebetransplantatkonstruktes zur rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen organs

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EP1868659A1
EP1868659A1 EP06722790A EP06722790A EP1868659A1 EP 1868659 A1 EP1868659 A1 EP 1868659A1 EP 06722790 A EP06722790 A EP 06722790A EP 06722790 A EP06722790 A EP 06722790A EP 1868659 A1 EP1868659 A1 EP 1868659A1
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EP
European Patent Office
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cells
membrane
tissue cells
bladder
tissue
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06722790A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gouya Ram-Liebig
Ursula Ravens
Manfred Wirth
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Urotiss GmbH
Original Assignee
Technische Universitaet Dresden
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/22—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of hollow organs, e.g. bladder, esophagus, urether, uterus

Definitions

  • the invention relates to a method for the production of a tissue transplant construct for the reconstruction of a human or animal organ, to a tissue graft construct of this kind and to the use of such a tissue transplant construct. More particularly, the invention relates to a tissue graft construct for reconstructing the bladder.
  • the urinary bladder consists of the mucosal layer and the muscular system.
  • Mucosa cells are urothelial cells that cover the inside of the urinary bladder in multiple layers and protect it against urine.
  • the musculature called the Detrusor, consists of smooth muscle cells and interstitial cells in between, which are fibroblasts or fibroblastic cells. These cells contain a subpopulation of c-Kit positive cells.
  • the muscle cells are for contraction, d. H. the bladder emptying responsible.
  • the interstitial cells are responsible for the transmission of the electrical impulses, which originate from muscle cells, and thus for the function of the muscle cells as a unit.
  • Reconstruction of the bladder may be necessary due to congenital or acquired diseases such as meningomyelocele, bladder and congestive dystrophy, trauma, malignancy, neuropathic dysfunction, detrusor instability. Reconstruction of the bladder is clinically
  • tissue graft constructs for the reconstruction of a human urinary bladder which comprise a biological, membrane-containing membrane to which one or more layers of organ-specific urothelial cells are applied.
  • the outer layer of the urothelial cells is a layer of terminally differentiated tissue cells [4].
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a method for producing a tissue transplant construct is to be specified which, with regard to its physiological contractile functionality, resembles more strongly than hitherto healthy natural tissue.
  • a method of making a tissue graft construct for reconstructing a human or animal organ comprising the steps
  • the organ-specific tissue cells are isolated before application to the membrane and cultured two-dimensionally. After the multiplication of the two-dimensionally cultured tissue cells, the tissue cells thus obtained are applied to the membrane and further cultured there under biochemical stimulation and with mechanical stimulation. Biochemical stimulation and mechanical stimulation are preferably performed simultaneously. The mechanical stimulation can take place continuously or at intervals.
  • the invention is based on the surprising discovery that the mechanical stimulation of the tissue cells cultured on the membrane leads to transplant constructs whose membrane is densely interspersed with tissue cells, the tissue cells having their natural phenotype.
  • the tissue cells are preferably muscle tissue cells.
  • organ-specific tissue cells should be understood to mean that tissue cells of the same or a similar organ to be reconstructed are applied to the membrane. If, for example, a bladder is to be reconstructed, then organ-specific tissue cells are to be understood as meaning urothelial cells and / or muscle tissue cells.
  • Organs are functional units of the body.
  • a preferred example is the bladder.
  • membrane and “matrix” are used interchangeably herein unless otherwise specified.
  • the membrane should contain the components of the extracellular matrix (ECM), in particular its growth factors.
  • ECM extracellular matrix
  • the membrane is a biological membrane, more preferably a biological membrane, which is degraded in the body to non-toxic substances and replaced by an endogenous tissue structure.
  • a collagen-containing membrane is to be understood here as a membrane based mainly on collagen.
  • Reconstruction is the replacement of damaged or diseased areas of a human or animal organ, especially a bladder.
  • the tissue cells are preferably muscle tissue cells, more preferably bladder muscle tissue cells.
  • the muscle tissue cells are particularly preferably smooth muscle cells and interstitial cells (i.e., fibroblasts or fibroblastic cells containing a subpopulation of c-kit positive cells) of the muscle layer of the bladder in their natural relationship.
  • Bladder muscle tissue cells are also referred to below as detrusor tissue cells or detrusor cells.
  • Biochemical stimulation is understood to mean urothelial induction and serum induction.
  • a preferred example of biochemical stimulation is the mitogenic stimulation of the urothelium and the serum.
  • the muscle tissue cells after being applied to the membrane, are cultured under mitogenic stimulation.
  • the muscle tissue cells applied to the membrane are two-dimensionally cultured muscle tissue cells from passages 2 through 7, more preferably 3 through 6, most preferably passage 3.
  • Urothelial induction can be achieved by using a medium that has been conditioned by urothelium.
  • the medium may be a medium conditioned with proliferating urothelium or a medium conditioned with terminally differentiated urothelium.
  • proliferating urothelium or “proliferative urothelium” is meant urothelial cells that have proliferated on an acellular membrane in a culture medium with a constant FCS addition (for example, 5%). The urothelial cells were then incubated in DMEM and the medium harvested. This medium is referred to as a proliferating urothelium conditioned medium. This medium can then be supplemented with FCS.
  • terminal differentiated urothelium urothelial cells that have proliferated on an acellular membrane in a culture medium with a decreasing FCS addition (for example, from 5% to 1%) under fibroblastic induction. The urothelial cells were then incubated in DMEM and the medium harvested. This medium is considered to be terminal
  • the urothelium may originate from the mucosal layer of the urinary bladder, preferably the bladder, from whose muscle layer the muscle tissue cells have been taken. Fibroblasts used to induce terminally differentiated urothelial cells can be obtained from the submucosal layer of the same urinary bladder.
  • the culture of the muscle tissue cells in step (c) should be in a urothelium conditioned medium which further contains fetal bovine serum (FCS) or autologous serum.
  • FCS fetal bovine serum
  • the medium contains 5% FCS or autologous serum.
  • the concentration of FCS or autologous serum is gradually reduced to 0% during culture of the muscle tissue cells on the membrane.
  • Two-dimensional cultivation is understood to mean culturing in a plane, for example on the bottom of a culture vessel.
  • Three-dimensional cultivation is understood as culturing in a three-dimensional space, for example in such a way that the tissue cells cover the membrane surface and also pass through the membrane.
  • the mechanical stimulation in step (c) of the method according to the invention can be carried out by stretching the membrane to which the tissue cells are applied.
  • the membrane can be stretched statically and / or cyclically.
  • this can be mechanical stimulation
  • the membrane When mechanical stimulation is performed by stretching the membrane, the membrane is preferably stretched along its longitudinal axis.
  • the muscle tissue cells and the urothelium are from a urinary bladder, most preferably from the same urinary bladder.
  • the invention is particularly suitable for the production of a tissue graft construct for the reconstruction of the urinary bladder.
  • a method of making a tissue transplant construct for reconstruction of the bladder is particularly suitable for the production of a tissue graft construct for the reconstruction of the urinary bladder.
  • the muscle tissue cells include smooth muscle cells and interstitial cells, preferably in their natural proportion.
  • the muscle tissue cells of the bladder after being applied to the membrane, are cultured under mitogenic stimulation. More preferably, the muscle tissue cells of the urinary bladder applied to the membrane are two-dimensionally cultured muscle tissue cells of passage 2 to 7, more preferably 3 to 6, most preferably passage 3. It should be noted that with increasing two-dimensional passenger count the cells reduce their multiplication potential.
  • the culture of the bladder muscle tissue cells in step (c *) should be performed in a medium that is a urothelium conditioned medium, preferably a proliferating urothelium conditioned medium.
  • a concentration of serum FCS or autologous serum
  • FCS fetal calf serum
  • the muscle tissue cells used to construct a transplant construct for reconstruction of the bladder are smooth muscle cells and interstitial cells, preferably in their natural ratio as found in the muscle layer of a natural healthy bladder. From the muscle layer of a bladder, the smooth muscle cells and interstitial cells can be obtained by the muscle layer of urothelium, lamina intestinal and serosa
  • M 05 1 534 5 .doc is released.
  • the treated muscle layer is then minced and treated with collagenase.
  • the individual cells can then be recovered by centrifugation, cultured two-dimensionally and passaged at confluency.
  • tissue transplant constructs which have biocompatible membranes penetrated by tissue cells with a native phenotype. Due to the high degree of penetration, the membranes have a three-dimensional network of tissue cells, ie. in the case of bladder muscle tissue cells, a three-dimensional network of smooth muscle cells and interstitial cells.
  • the presence of the interstitial cells promotes smooth muscle cell intercellular communication and is therefore of importance for the physiological functionality, in particular the contractility, of the graft construct after its implantation.
  • the method according to the invention comprises the isolation of muscle tissue cells from a bladder biopsy; the two-dimensional proliferation of muscle tissue cells in the culture flask; applying the passage 3 proliferated muscle tissue cells (P3 cells) to the surface of a biocompatible membrane; and the activation of the P3 cells under
  • the membrane surface is preferably up to 40 cm 2 in size.
  • tissue transplant construct for the reconstruction of a human or animal organ is also provided, which
  • the tissue graft construct according to the invention is thus a contractible tissue graft construct.
  • the organ-specific tissue cells are muscle tissue cells of a bladder.
  • the muscle tissue cells of the bladder are smooth muscle cells and interstitial cells, preferably in their natural ratio.
  • tissue graft constructs according to the invention can be used for the reconstruction of a human or animal organ, preferably for the reconstruction of a human or animal bladder.
  • the beneficial results are based on the following findings: After applying the tissue cells to the membrane, the dynamic process of cell migration to the membrane was the response to the migration signals provided by the matrix of the membrane. Obviously, there are receptive proteins on the cell surface that communicate these migration signals into the interior of the cell.
  • the tissue cells should have their corresponding phenotype for the function of the graft when implanted in the host. For this reason, already at passage 3, the tissue cells were sown on three-dimensional biomaterials to enable them to at least partially maintain their differentiated phenotype by proliferating early enough in three dimensions through interaction with the supporting extracellular matrix. As a result, the physiological environment affected cell behavior [9, 10, H]. Indeed, when tissue cells were cultured two-dimensionally under conventional conditions for seven passages before being applied to the membrane, only less than 5% of the tissue cells stained positive with desmin and SMA antibodies, while about 20% of the P3 cells desmin and SMA expressed when cultured under the same conditions.
  • tissue cells were cultured that were cultured with media conditioned by urothelium (that is, urinary bladder epithelial cells).
  • urothelium that is, urinary bladder epithelial cells
  • proliferative and terminally differentiated urothelium were used for this purpose.
  • proliferative urothelium had a stronger proliferative effect on the cell cultures, while only a smaller effect was achieved by terminally differentiated urothelium.
  • the urothelium-conditioned medium increased with proliferative urothelial cells and gradually reduced concentration and later
  • the detrusor is known to have a large network of fibroblasts.
  • approximately 20% of the isolated detrusor cell population was interstitial cells that were positive for vimentin but negative for desmin and SMA, confirming results [8] that suggest it from immunoreactivity and ultrastructural analyzes, that these cells are fibroblasts.
  • the c-kit immunoreactivity was additionally demonstrated in a subpopulation of interstitial cells.
  • the interstitial cells showed only weak immunoreactivity against biochemical and mechanical stimuli, which induced the differentiation of the SMC. Since it is believed that the propagation of activating impulses in the bladder is mediated by interstitial cells, the presence of these cells in our model system may improve the features of graft functionality after implantation.
  • FIG. 1 shows photographs for the characterization of bladder tetrorrystal cells on an acellular tissue membrane (FIG.
  • IA staining with BCECF, 40X magnification
  • IB staining of cellular DNA with DAPI, 100 fold
  • FIG. 2 shows immunohistochemical staining of passage tetrusor cell cultures of passage 3 on acellular membranes using antibody for alpha smooth muscle actin (Fig. 2A: cultivation without urothelial induction and mechanical stimulation; Fig. 2B: cultivation under urothelial induction with reduction of serum concentration; 2C: Cultivation under urothelial induction and mechanical stimulation (10% of the membrane surface) with serum reduction, day 32, FIGS. 2D to 2F: penetrating SMC in the membrane on culture day 21 below
  • Fig. 3 Hematatoxylin and eosin staining with blast detrusor cells cultured under urothelial induction and without mechanical stimulation on day 18 on the membrane
  • Fig. 3A Cultivation of bladder tetrusor cells under induction with terminally differentiated urothelial medium
  • Fig. 3B Cultivation of bladder tetrusor cells under induction with proliferating urothelium-conditioned medium
  • Fig. 5 Hematatoxylin and eosin stains of the bladder detrusor cells cultured under urothelial induction and mechanical stimulation (10% of the membrane surface) on the membrane (Fig. 5A: cell layers on the membrane Fig. 5B: penetration of the cells within the membrane in Fig different directions; Fig. 5C: fully penetrated membrane on day 32); and
  • FIG. 6 shows immunohistochemical SMA staining of the bladder trastorus cells on the membrane, which were cultured under urothelial induction and mechanical stimulation (10% of the membrane surface). Compared to SMC, the fibroblastic cells did not stain with alpha-smooth muscle actin antibody and did not show the corresponding brown color.
  • Acellular tissue membranes (also referred to herein as acellular membranes) were prepared from porcine bladder, aorta, small intestine and skin samples. They were obtained in Triton X 1% (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany) for 24 to 48 h in the presence of 0.1% sodium azide with stirring in a water bath at 37 0 C acellular. Extraction of all cellular elements was confirmed histologically. In addition, lyophilized small intestinal submucosa (SIS) was provided by Cook Biotech (Mönchengladbach, Germany).
  • the apoptosis index was determined with 4'-6-diamino-2-phenylindole (DAPI), the vitality of the cells with 2 ', 7' bis-carboxyethyl-5 and 6-carboxyfluorescein (BCECF) and propidium iodide (PI) (both MoBiTec , Göttingen, Germany).
  • DAPI 4'-6-diamino-2-phenylindole
  • BCECF bis-carboxyethyl-5 and 6-carboxyfluorescein
  • PI propidium iodide
  • Urothelium-conditioned media To produce urothelium-conditioned media, urothelial cells (obtained from the mucosal layer of samples from the same urinary bladder were cultured on the surface of acellular membranes.) As in [4], urothelial cells were maintained in two distinct groups, either in a proliferative phenotype in the presence of 5% FCS or terminally differentiated by reducing the FCS concentration to 1% with fibroblastic induction (from the lamina intestinal of the same urinary bladder). Urothelial cells were then incubated in DMEM for 24 h and the conditioned media were harvested Scaffolds were each fed with medium conditioned with proliferating or terminally differentiated urothelium at the FCS levels discussed below.
  • FCS-conditioned media FCS became urothelium-conditioned media, i. H. either with proliferative
  • FCS was reduced in three steps: 5% from day 1 to 14, 1% to day 28 and then serum-free for 4 days.
  • cells were cultured with media containing the same serum concentrations but lacking urothelial conditioning. The culture media were changed every three days, except in serum-free conditions, where they were changed on a daily basis to ensure the availability of sufficient nutrients to the cells.
  • the mechanical stretching can be carried out by means of a bioreactor. Details of the bioreactor are described in DE 101 51 822.
  • the detrusor cells freshly isolated from the porcine or human urinary bladder had a spindle-shaped morphology, with approximately 80% of the cells staining positive with antibodies to desmin and SMA, and about 20% were vimentin-positive cells showing no desmin and SMA expression , 15 to 20% of these cells stained positive with c-kit antibody.
  • the fraction of desmin and SMA positive cells decreased with the increasing number of passages under 2D conditions and was less than 60% at passage 7, with a variability between different animals and patients was detected.
  • Fig. 1 shows images for characterizing the tissue cells on the membrane.
  • Figure IA shows, at 40X magnification, an assay for determining the viability of tissue cells on the membrane.
  • the dye used was BCECF (green color).
  • the fluorescent dye BCECF is specific for living cells and showed a high cell vitality of the tissue
  • Fig. IB shows in 10X magnification staining of the cellular DNA with DAPI. Recognizable are several dividing cell nuclei on the membrane 14 days after application of the tissue cells.
  • FIGS. 2A to 2F show recordings of immunohistochemical analyzes of membrane-cell composites using SMA antibodies, each in 20-fold magnification. Passage 3 tissue cells were transferred to the membrane.
  • Fig. 2A shows cultured tissue cells at rest, i. H. Tissue cells without urothelial induction and without mechanical
  • Stimulation were cultured. These tissue cells showed about 20% positive staining with SMA antibody after 32 days
  • Fig. 2B shows that about 60% of the tissue cells have a differentiated (mature) phenotype on the membrane surface.
  • FIG. 2C to 2F show cells cultured on the membrane surface under urothelial induction and mechanical stimulation. More than 80% of the cells show positive responses with SMA antibody on day 32 after serum removal (Figure 2C). In serum-depleted medium (1% FCS), on day 21, urothelial and mechanical stimulation led tissue cells to the interior of the membrane, with the tissue cells retaining their differentiated phenotype ( Figures 2D-2F).
  • Figures 3A and 3B show images of H & E staining of cultured membrane-cell composites on day 18 after application of the P3 tissue cells to the membrane at 20x magnification.
  • the tissue cells formed 1 to 2 layers and then penetrated the membrane ( Figure 3A).
  • the medium conditioned with proliferating urothelium induces a higher proliferation of PS tissue cells and penetration of the membrane ( Figure 3B).
  • the percentage of desmin and SMA positive cells in the second group was about 60% at day 32 ( Figure 4B) compared to 40% in the first group (ie cells , which were cultured with terminally differentiated urothelial medium), when the serum was depleted in the three steps.
  • the additional mechanical stretching not only induced cell penetration and migration in different directions in the presence of serum (day 1 to 28, Figures 4, 5) but also increased the level of desmin and SMA-positive cells (Figs. 2C to 2F).
  • Figures 4A and 4B show images of H & E staining of the P3 cells on the acellular membrane at 20x magnification.
  • the spatial cell movement in the interior of the three-dimensional structure of the acellular membrane is visible under urothelial induction and mechanical stimulation on day 18 after application of the cells to the membrane (FIGS. 4A, 4B).
  • the cells abolish cell-cell adhesion during migration.
  • the degradation of the extracellular matrix by the migrating cells could be detected.
  • the elongated shape of the migrating cells under extension is the spatial cell movement in the interior of the three-dimensional structure of the acellular membrane at 20x magnification.
  • Figures 5A to 5C show further images of H & E staining of the membrane-cell composites in 20X magnification. Visible is the penetration of the membrane through the P3 tissue cells under urothelial induction and mechanical stimulation (10% of the membrane surface). The highly mobile cells moved on the entire surface of the membrane and formed many layers thereon (Figure 5A). They strongly penetrated the interior of the membrane in different directions and initially maintained cell-cell adhesion ( Figure 5A), degrading the extracellular matrix components and overcoming their spatial barrier
  • FIG. 6 shows a picture of an SMA staining of a membrane-cell composite. Evident are the cells that have penetrated into the membrane. The interstitial cells did not stain positively with SMA antibody under urothelial induction and mechanical stimulation. In comparison, the smooth muscle cells showed a positive reaction with the antibody (brown color) under the same conditions. The interstitial cells are indicated by arrows.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs. Das Verfahren umfaßt die Schritte: a) Isolieren und zweidimensionales Kultivieren von organspezifischen Gewebezellen; b) Aufbringen der organ-spezifischen Gewebezellen auf eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran; und c) Kultivieren der organ-spezifischen Gewebezellen auf der Membran unter biochemischer und mechanischer Stimulierung der organ-spezifischen Gewebezellen.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs, ein derartiges Gewebe- transplantatkonstrukt sowie eine Verwendung eines derartigen Gewebetransplantatkonstruktes. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Gewebetransplantatkonstrukt zur Rekonstruktion der Harnblase.
Die Harnblase besteht aus der Mukosaschicht und der Muskula- tur. Mukosazellen sind Urothelzellen, die mehrschichtig die Innenseite der Harnblase bedecken und sie gegen Urin schützen. Die Muskulatur, die als Detrüsor bezeichnet wird, besteht aus glatten Muskelzellen und dazwischen befindlichen interstitiellen Zellen, bei denen es sich um Fibroblasten oder fibroblastische Zellen handelt. Diese Zellen beinhalten eine Subpopulation von c-Kit positiven Zellen. Die Muskelzellen sind für die Kontraktion, d. h. die Harnblasenentleerung verantwortlich. Die interstitiellen Zellen sind für die Weiterleitung der elektrischen Impulse, die aus Muskelzellen stammen, und damit für die Funktion der Muskelzellen als Einheit verantwortlich.
Die Rekonstruktion der Harnblase kann aufgrund angeborener oder erworbener Erkrankungen wie beispielsweise Meningomye- lozele, Blasen- und Kloakaldystrophy, Traumata, Malignome, neuropathische Dysfunktionen, Detrusorinstabilität notwendig sein. Die Rekonstruktion der Harnblase erfolgt klinisch un-
M 05 1 534 5 . doc ter Anwendung von Darmabschnitten. Dies ist mit multiplen Komplikationen wie zum Beispiel Infektion, Inkontinenz, maligner Entartung, Diarrhöe, Elektrolytstörung, Malabsorption und erhöhter Morbidität verbunden. Es ist vorgeschlagen wor- den, die Rekonstruktion, d. h. den Ersatz beschädigter oder erkrankter Bereiche einer Harnblase, mittels Gewebetrans- plantatkonstrukten, die als eine Matrix für das nachwachsende ursprüngliche Gewebe dienen sollen, durchzuführen. In diesem Zusammenhang ist die Kultivierung von patienteneige- nen Harnblasenzellen auf der Membran und somit die In-vitro- Erzeugung von lebensfähigem Blasengewebe mehrfach vorgeschlagen worden [1, 2, 3]. Diese weist aber eine Vielzahl von Problemen auf.
Ferner sind Gewebetransplantatkonstrukte zur Rekonstruktion einer humanen Harnblase bekannt, die eine biologische, kol- lagenhaltige Membran umfassen, auf die eine oder mehrere Schichten organ-spezifischer Urothelzellen aufgebracht sind. Die äußere Schicht der Urothelzellen ist eine Schicht termi- nal differenzierter Gewebezellen [4] .
Zur Rekonstruktion einer Harnblase auch im Hinblick auf deren physiologische Funktion sind jedoch nicht nur Urothelzellen als Sperrschicht gegen Urin erforderlich, sondern auch Glattmuskelzellen um deren Kontraktion zu ermöglichen. Es ist jedoch bisher nicht gelungen, Harnblasengewebe mit besäten Membranen zu rekonstruieren, deren Kontraktilität der des nativen Gewebes entspricht, da eine vollständige Generierung der Muskelzellen nach der Implantation nicht er- reicht wurde. Ein Grund dafür ist vermutlich, daß adulte Glattmuskelzellen in vitro ihren differenzierteren Phänotyp verlieren [5, 6] . Es ist außerdem unbekannt, ob Glattmuskel-
M 05 1 534 5 .doc zellen überhaupt vollständig nach der Implantation redifferenzieren können [6]. Anderseits kann die interzelluläre Kommunikation zwischen Glattmuskelzellen durch den Mangel an interstitiellen Zellen in dem Gewebetransplantatkonstrukt beeinträchtigt werden, was zu einer Entleerungsdysfunktion nach der Konstruktimplantation führen kann [7, 8] .
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes angegeben werden, daß hinsichtlich seiner physiologischen kontraktilen Funktionalität stärker als bisher gesundem natürlichen Gewebe gleicht.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 20, 26 und 27 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 19, 21 bis 25.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs vorgesehen, umfassend die Schritte
(a) Isolieren und zweidimensionales Kultivieren von organspezifischen Gewebezellen;
(b) Aufbringen der organ-spezifischen Gewebezellen auf eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran; und
M 05 1 534 5 .doc (c) Kultivieren der organ-spezifischen Gewebezellen auf der Membran unter biochemischer und mechanischer Stimulierung der organ-spezifischen Gewebezellen.
Erfindungsgemäß werden die organ-spezifischen Gewebezellen vor dem Aufbringen auf die Membran isoliert und zweidimensional kultiviert. Nach der Vermehrung der zweidimensional kultivierten Gewebezellen werden die so erhaltenen Gewebezellen auf die Membran aufgebracht und dort unter biochemischer Sti- mulierung und unter mechanischer Stimulierung weiter kultiviert. Die biochemische Stimulierung und die mechanische Stimulierung werden vorzugsweise gleichzeitig durchgeführt. Die mechanische Stimulierung kann dabei kontinuierlich oder in Intervallen erfolgen.
Die Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis , daß die mechanische Stimulierung der auf der Membran kultivierten Gewebezellen zu Transplantatkonstrukten führt, deren Membran dicht von Gewebezellen durchsetzt ist, wobei die Gewebezellen ihren natürlichen Phänotyp aufweisen. Die Gewebezellen sind vorzugsweise Muskelgewebezellen.
Der Begriff "organ-spezifische Gewebezellen" soll hierbei so verstanden werden, daß Gewebezellen desselben oder eines gleichen Organs, das rekonstruiert werden soll, auf die Membran aufgebracht werden. Soll beispielsweise eine Harnblase rekonstruiert werden, so sind hier unter organ-spezifischen Gewebezellen Urothelzellen und/oder Muskelgewebezellen zu verstehen.
Organe sind funktionelle Einheiten des Körpers. Bevorzugtes Beispiel ist die Harnblase.
M 05 1 534 5 .doc Die Begriffe "Membran" und "Matrix" werden hier, soweit nicht anders angegeben, synonym verwendet. Die Membran sollte die Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) , insbesondere deren Wachstumsfaktoren, enthalten. Vorzugsweise ist die Membran eine biologische Membran, besonders bevorzugt eine biologische Membran, die im Körper zu nicht-toxischen Stoffen abgebaut und durch eine körpereigene Gewebestruktur ersetzt wird.
Unter einer kollagenhaltigen Membran soll hier eine Membran hauptsächlich auf Kollagenbasis verstanden werden.
Unter Rekonstruktion wird der Ersatz von beschädigten oder kranken Bereichen eines menschlichen oder tierischen Organs, insbesondere einer Harnblase verstanden.
Die Gewebezellen sind vorzugsweise Muskelgewebezellen, stärker bevorzugt Muskelgewebezellen der Harnblase. Die Muskel- gewebezellen sind besonders bevorzugt Glattmuskelzellen und interstitielle Zellen (d.h. Fibroblasten oder fibroblastische Zellen, die eine Subpopulation von c-Kit positiven Zellen beinhalten) der Muskelschicht der Harnblase in deren natürlichem Verhältnis. Muskelgewebezellen der Harnblase werden im folgenden auch als Detrusorgewebezellen oder Detrusorzellen bezeichnet .
Unter biochemischer Stimulation werden hier die urotheliale Induktion und die Seruminduktion verstanden. Ein bevorzugtes Beispiel der biochemischen Stimulation ist die mitogene Stimulation des Urotheliums und des Serums.
M 05 1 534 5 . doc In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Muskelgewebezellen, nachdem sie auf die Membran aufgebracht werden, unter mitogener Stimulation kultiviert. Vorzugsweise sind die Mus- kelgewebezellen, die auf die Membran aufgebracht werden, zweidimensional kultivierte Muskelgewebezellen der Passagen 2 bis 7, stärker bevorzugt 3 bis 6, am stärksten bevorzugt der Passage 3.
Das Kultivieren der Muskelgewebezellen in Schritt (c) sollte unter urothelialer Induktion und adaptierter Serumkonzentration erfolgen. Die urotheliale Induktion kann durch Verwendung eines Mediums erfolgen, das mittels Urothel konditioniert wurde. Dabei kann das Medium ein mit proliferierendem Urothel konditioniertes Medium oder ein mit terminal differenziertem Urothel konditioniertes Medium sein.
Unter "proliferierendem Urothel" oder "proliferativem Urothel" werden Urothelzellen verstanden, die auf einer azel- lulären Membran in einem Kulturmedium mit einem konstanten FKS-Zusatz (beispielsweise 5 %) proliferiert wurden. Die Urothelzellen wurden dann in DMEM inkubiert und das Medium geerntet. Dieses Medium wird als mit proliferierendem Urothel konditioniertes Medium bezeichnet. Dieses Medium kann an- schließend mit FKS supplementiert werden.
Unter "terminal differenziertem Urothel" werden Urothelzellen verstanden, die auf einer azellulären Membran in einem Kulturmedium mit einem abnehmenden FKS-Zusatz (beispielsweise von 5 % auf 1 %) unter fibroblastischer Induktion proliferiert wurden. Die Urothelzellen wurden dann in DMEM inkubiert und das Medium geerntet. Dieses Medium wird als mit terminal
M 05 1 534 5 .doc differenziertem Urothel konditioniertes Medium bezeichnet. Dieses Medium kann anschließend mit FKS supplementiert werden.
Das Urothel kann aus der Mukosaschicht der Harnblase stammen, vorzugsweise der Harnblase, aus deren Muskelschicht die Muskelgewebezellen entnommen wurden. Fibroblasten, die zur Induktion der terminal differenzierten Urothelzellen verwendet werden, können aus der Submukosaschicht derselben Harnblase gewonnen werden.
Das Kultivieren der Muskelgewebezellen in Schritt (c) sollte in einem mittels Urothel konditionierten Medium erfolgen, das ferner fötales Rinderserum (FKS) oder autologes Serum ent- hält. Vorzugsweise enthält das Medium 5 % FKS oder autologes Serum. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration an FKS oder autologem Serum während der Kultivierung der Muskelgewebezellen auf der Membran schrittweise auf 0 % verringert .
Unter zweidimensionaler Kultivierung wird die Kultivierung in einer Ebene, beispielsweise auf dem Boden eines Kulturgefäßes verstanden. Unter dreidimensionaler Kultivierung wird die Kultivierung in einem dreidimensionalen Raum verstanden, bei- spielsweise derart, daß die Gewebezellen die Membranoberfläche bedecken und die Membran darüber hinaus durchsetzen.
Das mechanische Stimulieren in Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durchgeführt werden, indem die Membran, auf die die Gewebezellen aufgebracht sind, gestreckt wird. Die Membran kann statisch und/oder zyklisch gestreckt werden. Demnach kann das mechanische Stimulieren
M 05 1 534 5 .doc (cl) das Strecken der Membran für einen vorgegebenen Zeitraum;
(c2) die Relaxation der Membran für einen vorgegebenen Zeitraum; und
(c3) das n-fache Wiederholen der Schritte (cl) und (c2), wobei n eine Ganzzahl größer oder gleich 1 ist, umfassen.
Wird die mechanische Stimulation ausgeführt, indem die Membran gestreckt wird, so wird die Membran vorzugsweise entlang ihrer Längsachse gestreckt.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Muskelgewebezellen und das Urothel von einer Harnblase, besonders bevorzugt von derselben Harnblase.
Die Erfindung ist insbesondere zur Herstellung eines Gewebe- transplantatkonstruktes zur Rekonstruktion der Harnblase geeignet. Ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplan- tatkonstruktes zur Rekonstruktion der Harnblase umfaßt
(a*) Isolieren und zweidimensionales Kultivieren von Muskel- gewebezellen der Harnblase;
(b*) Aufbringen der Muskelewebezellen auf eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran; und
(c*) Kultivieren der Muskelgewebezellen auf der Membran unter urothelialer Induktion und adaptierter Serumkonzentration sowie unter mechanischer Stimulierung der Muskelgewebezellen.
M 05 1 534 5 .doc Die Muskelgewebezellen umfassen Glattmuskelzellen und interstitielle Zellen vorzugsweise in deren natürlichen Verhältnis .
Vorzugsweise werden die Muskelgewebezellen der Harnblase, nachdem sie auf die Membran aufgebracht werden, unter mitogener Stimulation kultiviert. Besonders bevorzugt sind die Muskelgewebezellen der Harnblase, die auf die Membran aufge- bracht werden, zweidimensional kultivierte Muskelgewebezellen der Passagen 2 bis 7, stärker bevorzugt 3 bis 6, am stärksten bevorzugt der Passage 3. Dabei ist zu berücksichtigen, daß sich mit zunehmender zweidimensionaler Passagierungszahl der Zellen deren Vermehrungspotential verringert.
Das Kultivieren der Muskelgewebezellen der Harnblase in Schritt (c*) sollte in einem Medium durchgeführt werden, daß ein mit Urothel konditioniertes Medium, vorzugsweise ein mit proliferierendem Urothel konditioniertes Medium ist. Vorzugs- weise wird die Konzentration an Serum (FKS oder autologes Serum) während des Kultivierens schrittweise verringert, beispielsweise in drei Schritten, zum Beispiel von 5 % auf 1 % auf 0 %
Die Muskelgewebezellen, die zur Herstellung eines Transplan- tatkonstruktes zur Rekonstruktion der Harnblase eingesetzt werden, sind Glattmuskelzellen und interstitielle Zellen, vorzugsweise in deren natürlichen Verhältnis, wie es in der Muskelschicht einer natürlichen gesunden Harnblase gefunden wird. Aus der Muskelschicht einer Harnblase können die Glattmuskelzellen und interstitiellen Zellen gewonnen werden, indem die Muskelschicht von Urothel, Lamina propria und Serosa
M 05 1 534 5 .doc befreit wird. Die so behandelte Muskelschicht wird dann zerkleinert und mit Kollagenase behandelt. Die einzelnen Zellen können dann durch Zentrifugieren gewonnen, zweidimensional kultiviert und bei Konfluenz passagiert werden.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können erstmals Ge- webetransplantatkonstrukte erhalten werden, die biokompatible Membranen aufweisen, die von Gewebezellen mit nativen Phänotyp durchsetzt sind. Aufgrund des hohen Durchsetzungsgrades weisen die Membranen ein dreidimensionales Netzwerk von Gewebezellen auf, d h. im Fall von Muskelgewebezellen der Harnblase ein dreidimensionales Netzwerk von Glattmuskelzellen und interstitielle Zellen. Die Anwesenheit der interstitiellen Zellen fördert die interzelluläre Kommunikation der Glattmuskelzellen und ist daher von Bedeutung für die physiologische Funktionalität, insbesondere die Kontraktitlität , des Transplantatkonstruktes nach dessen Implantierung.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsge- mäße Verfahren die Isolierung von Muskelgewebezellen aus einer Harnblasenbiopsie; die zweidimensionale Proliferation der Muskelgewebezellen in der Kulturflasche; das Aufbringen der proliferierten Muskelgewebezellen der Passage 3 (P3-Zellen) auf die Oberfläche einer biokompatiblen Membran; und das KuI- tivieren der P3-Zellen unter
(i) urothelialer Induktion unter Verwendung eines mit proliferierendem Urothel konditionierten Mediums und
(ii) Seruminduktion und
(iii) mechanischer Stimulierung.
M 05 1 534 5 . doc Wird die urothelialer Induktion 32 Tage durchgeführt, so umfaßt die Seruminduktion die Verringerung der Serumkonzentration von 5 % (Tage 1 bis 14) auf 1 % (Tage 15 bis 28) und dann weiter auf 0 % (Tage 29 bis 32) . Die mechanische Stimulierung wird über den gesamten Zeitraum der urothelialen Induktion (32 Tage) aufrechterhalten, wobei die Membran vorzugsweise zyklisch gedehnt und relaxiert wird.
Die Membranoberfläche ist vorzugsweise bis zu 40 cm2 groß.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ferner ein Gewebetransplantat- konstrukt zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs vorgesehen, das
(a) eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran; und
(b) organ-spezifische Gewebezellen, die auf der Membran unter biochemischer und mechanischer Stimulierung kultiviert worden sind, umfaßt.
Das erfindungsgemäße Gewebetransplantatkonstrukt ist somit ein kontraktionsfähiges Gewebetransplantatkonstrukt.
Ein solches Gewebetransplantatkonstrukt kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden. Vorzugsweise sind die organ-spezfischen Gewebezellen Muskelgewebezellen einer Harnblase. Die Muskelgewebezellen der Harnblase sind Glattmuskelzellen und interstitielle Zellen, vorzugsweise in deren natürlichem Verhältnis.
M 05 1 534 5 .doc Die erfindungsgeπiäßen Gewebetransplantatkonstrukte können zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs, vorzugsweise zur Rekonstruktion einer menschlichen oder tierischen Harnblase verwendet werden.
Die vorteilhaften Ergebnisse basieren auf folgenden Erkenntnissen: Nach dem Aufbringen der Gewebezellen auf die Membran war der dynamische Prozeß der Zellmigration zu der Membran die Antwort auf die Migrationssignale, die durch die Matrix der Membran bereitgestellt werden. Offensichtlich gibt es rezeptive Proteine auf der Zelloberfläche, die diese Migrationssignale in das Innere der Zelle kommunizieren.
Unter den mitogenen Wirkungen von FKS waren Zellen der Passa- ge 3 (sogenannte P3-Zellen) fähig, Membranoberflächen von bis zu 40 cm2 innerhalb weniger Tage konfluent zu bedecken, während die Bedeckung der Membran durch P7-Zellen aus ähnlicher Biopsiegröße, d. h. Zellen nach siebenmaligem Passagieren in der Kulturflasche unter konventionellen Bedingungen) nicht vollständig war. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß in zweidimensionalen Kulturen unter konventionellen Bedingungen in der Kulturflasche die Zellen zunehmend ihre proliferative Fähigkeit mit erhöhender Anzahl an Passagen verlieren.
Eine Hauptfunktion von SMC ist die Kontraktion. Durch die De- differenzierung verlieren unter konventionellen Bedingungen zweidimensional kultivierte Harnblasen-SMCs ihre Kontraktili- tätsantwort auf verschiedene In-vivo-Agonisten [5] . Anderer- seits ist die potentielle Fähigkeit der in vitro dedifferenzierten Zellen zu redifferenzieren nicht bekannt [6] . Bedenkt man, daß das zelluläre Tissue-Engineering mit Harnblasen-
M 05 1 534 5 .doc SMCs für klinische Anwendungen bestimmt ist, so sollten die Gewebezellen ihren entsprechenden Phänotyp für die Funktion des Transplantats, wenn es in den Wirt implantiert wird, aufweisen. Aus diesem Grund wurden schon bei Passage 3 die Gewe- bezellen auf dreidimensionale Biomaterialien gesät, um es ihnen zu ermöglichen, mindestens teilweise ihren differenzierten Phänotypen aufrechtzuerhalten, indem sie früh genug sich in drei Dimensionen durch Interaktion mit der tragenden extrazellulären Matrix proliferieren. Folglich beeinflußte die physiologische Umgebung das Zellverhalten [9, 10, H]. Wenn tatsächlich Gewebezellen zweidimensional unter konventionellen Bedingungen für sieben Passagen kultiviert wurden, bevor sie auf die Membran aufgebracht wurden, färbten sich nur weniger als 5 % der Gewebezellen mit Desmin- und SMA- Antikörpern positiv, während etwa 20 % der P3-Zellen Desmin und SMA exprimierten, wenn sie unter denselben Bedingungen kultiviert wurde.
Bei der Harnblasenregeneration ist bekannt, daß Epithel- Stroma-Interaktionen die SMC-Proliferation und -Differenzierung regulieren [12, 13] . Um herauszufinden, wie Detrusor- zellen auf Epithelreize auf azellulären Membranen reagieren, wurden Gewebezellen charakterisiert, die mit Medien kultiviert wurden, welche durch Urothel (d. h. Epithelzellen der Harnblase) konditioniert worden waren. Für diesen Zweck wurde proliferatives einerseits und terminal differenziertes Urothel anderseits verwendet. Tatsächlich hatte proliferatives Urothel eine stärkere proliferative Wirkung auf die Zellkulturen, während nur eine geringere Wirkung durch terminal differenziertes Urothel erreicht wurde. Jedenfalls erhöhte das Urothel-konditionierte Medium mit proliferativen Urothel- zellen und schrittweise verringerter Konzentration und später
M 05 1 534 5 .doc der Abwesenheit von Serum [14] die Desmin- und SMA-Protein- expression, auch wenn dies die Desmin- und SMA- Proteinexpression nicht vollständig induzieren konnte (60 %) .
Es ist bekannt, daß mechanische Spannung die SMC in unterschiedlichen Weisen, d. h. Proliferation, Differenzierung, Bildung von extrazellulärer Matrix und Wachstumsfaktoren, induzieren [15-19] . Interessanterweise sind einige dieser Wirkungen charakteristisch für einen stärker differenzierten Phänotyp, während andere auf einen synthetischeren proliferierenden, d. h. weniger differenzierten Zustand hinweisen. Mit der vorliegenden Erfindung wurde durch mechanische Stimulierung ein stärker bewachsenes Gewebe mit erhöhter Expression von Desmin und SMA erreicht. Außerdem zeigten die Gewebe- zellen ein unterschiedliches Beweglichkeitsmuster als unter Bedingungen ohne mechanische Stimulierung. In dem letzteren Fall bewegten sich stärker persistente Zellen meistens in zwei Richtungen über die Membranoberfläche. Unter mechanischer Streckung und Relaxation drangen weniger persistente Zellen in mehreren Richtungen in das Innere der Membran durch Überwindung des Matrixwiderstandes ein, indem deren dreidimensionale Struktur abgebaut wurde. Die Verwendung der mechanischen Stimulierung in Urothel-konditionierten Kulturen ermöglichte es den SMCs, ihren differenzierten Phänotypen zu zeigen, wenn die mitogene Wirkung von FKS verringert und anschließend beseitigt wurde. In diesem Fall waren etwa 80 % der Gewebezellen für Desmin und SMA positiv. Desmin und SMA sind Marker für den differenzieren Phänotyp von SMC.
Die unlöslichen Signale der dreidimensionalen extrazellulären Matrix, die mit den löslichen Faktoren des Urothel-konditionierten Mediums interagieren, und mechanischen Kräfte in der
M 05 1 534 5 .doc schrittweise angepaßten Serumkonzentration förderten die Migration, Teilung und Differenzierung von SMC. Die Induktion der SMC-Differenzierung als Antwort auf das Urothel- konditionierte Medium ist charakteristisch für einen endoge- nen Regulationsmechanismus. Außerdem zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung, daß SMC die mechanische Spannung registriert, die außerdem die Zelldifferenzierung induziert. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Wirkungen der mechanischen Umgebung auf andere Wege als Wachstumsfaktor/Rezeptorbindung hinweisen. Auf Basis dieser Erkenntnisse ist es möglich, wirksame zelluläre Strategien für eine proliferativere oder differenziertere Aktivität von Gewebezellen zu entwickeln, um die Gewebeentwicklung zu verbessern.
Der Detrusor ist dafür bekannt, ein großflächiges Netzwerk an Fibroblasten aufzuweisen. In den nachfolgend beschriebenen Beispielen waren etwa 20 % der isolierten Detrusorzellpopula- tion interstitielle Zellen, die für Vimentin positiv, aber für Desmin und SMA negativ färben, was Ergebnisse [8] bestä- tigt, die aufgrund von Immunoreaktivitäts- und Ultrastrukturanalysen darauf schließen lassen, daß diese Zellen Fibroblasten sind. Die c-kit-Immunoreaktivität wurde zusätzlich in einer Subpopulation der interstitiellen Zellen bewiesen. Die interstitiellen Zellen zeigten dabei nur schwache Immunoreak- tivität gegen biochemische und mechanische Reize, die die Differenzierung des SMC induzierten. Da angenommen wird, daß die Ausbreitung von aktivierenden Impulsen in der Blase durch interstitielle Zellen vermittelt wird, kann die Gegenwart von diesen Zellen in unserem Modellsystem die Merkmale der Funk- tionalität des Transplantats nach der Einpflanzung verbessern.
M 05 1 534 5 .doc Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen
Fig. 1 Aufnahmen zur Charakterisierung von Blasendetrusor- zellen auf einer azellulären Gewebemembran (Fig.
IA: Färbung mit BCECF, 40fache Vergrößerung; Fig.
IB: Färbung der zellulären DNA mit DAPI, lOOfache
Vergrößerung) ;
Fig. 2 immunohistochemische Färbungen von Blasendetrusor- zellkulturen der Passage 3 auf azelluären Membranen unter Verwendung von Antikörper für alpha- Glattmuskelaktin (Fig. 2A: Kultivierung ohne urotheliale Induktion und mechanische Stimulation; Fig. 2B: Kultivierung unter urothelialer Induktion bei Verringerung der Serumkonzentration; Fig. 2C: Kultivierung unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation (10 % der Membranoberfläche) bei Serumverringerung, Tag 32, Fig. 2D bis 2F: pen- trierende SMC in der Membran am Kulturtag 21 unter
Beibehalt ihres differenzierten Phänotyps (positive Reaktion mit alpha-Glattmuskel-Aktin-Antikörper) ;
Fig. 3 Hematatoxylin- und Eosin-Anfärbungen mit unter urothelialer Induktion und ohne mechanische Stimulation kultivierten Blasendetrusorzellen am Tag 18 auf der Membran (Fig. 3A: Kultivierung der Blasendetrusorzellen unter Induktion mit terminal differenziertem Urothelmedium; Fig. 3B: Kultivierung der Blasendetrusorzellen unter Induktion mit proliferierendem Urothel-konditioniertem Medium) ;
M 05 1 534 5 .doc Fig. 4 Hematatoxylin- und Eosin-Anfärbungen der unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation
(10 % der Membranoberfläche) kultivierten Blasen- detrusorzellen am Tag 18 auf der Membran (Fig. 4A und 4B zeigen die Bewegung der Zellen innerhalb der
Membran) ;
Fig. 5 Hematatoxylin- und Eosin-Anfärbungen der unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation (10 % der Membranoberfläche) kultivierten Blasen- detrusorzellen auf der Membran (Fig. 5A: Zellschichten auf der Membran; Fig. 5B: Penetration der Zellen innerhalb der Membran in verschiedenen Richtungen; Fig. 5C: vollständig durchdrungene Membran am Tag 32) ; und
Fig. 6 immunhistochemische SMA-Anfärbungen der Blasende- trusorzellen auf der Membran, die unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation (10 % der Membranoberflache) kultiviert wurden. Im Vergleich zu SMC färbten sich die fibroblastischen Zellen nicht mit alpha-Glattmuskel-Aktin-Antikörper und zeigen damit nicht die entsprechende braune Farbe .
Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Harnblasen-Gewebetransplantat- konstrukten.
M 05 1 534 5 .doc Soweit nicht gesondert angegeben, haben die verwendeten Abkürzungen folgende Bedeutung:
BCECF 2' , 7' -Bis- (2-carboxyethyl) -5/6-carboxyfluorescein DAPI 4 '-β-Diamidino-2-phenylindol
DMEM Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium,
ECM extrazelluläre Matrix,
FKS fötales Rinderserum
PI Propidiumiodid SIS small intestinal submukosa
SMA alpha-Glattmuskel-Aktin (alpha smooth muscle actin)
SMC Glattmuskelzellen
Materialien und Methoden
Herstellung azellulärer Gewebemembranen: Azelluläre Gewebemembranen (hierin auch als azelluläre Membranen bezeichnet) wurden aus porzinen Harnblasen-, Aorta-, Dünndarm- und Hautproben hergestellt. Sie wurden in Triton X 1 % (Sigma- Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) 24 bis 48 h in Gegenwart von 0,1 % Natriumazid unter Rühren in ein Wasserbad bei 37 0C azellulär gewonnen. Die Extraktion aller zellulären Elemente wurde histologisch bestätigt. Zusätzlich wurde lyophilisiertes Dünndarmsubmukosa (SIS) von Cook Biotech (Mönchenglad- bach, Deutschland) bereitgestellt.
Zellisolation, Kultur und Charakterisierung: Die Muskelschicht von porzinen (n = 8) und humanen (n = 4) Harnblasenproben (0,5 x 0,5 cm) wurde von dem Harnwegsepithel, Lamina propria und Serosa disseziert, zerkleinert und mit Kollagenase B 0,5 % 2 h behandelt (Worthingto Biochemical, Lakewood, NJ, USA) . Einzelne Zellen wurden durch Zentrifugation gesam-
M 05 1 534 5 .doc melt, und die Pellets wurden in Kulturflaschen, enthaltend DMEM (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) , supplementiert mit 5 % FCS, überführt. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz kultiviert. P3- und P7-Zellen wurden auf den Oberflächen von azellulären Membranen (bis zu 40 cm2) kultiviert. Die kultivierten Zellen wurden histologisch und immunohistochemisch unter Verwendung der Hematoxylin- und Eosin-Färbung (H & E) , SMA-, Vimentin- und Desmin-Antikörper (alle Dako, Glastrup, Dänemark) sowie c-Kit-Antikörpern (Sigma-Aldrich; Deutsch- land) analysiert. Der Apoptoseindex wurde mit 4' -6-Diamino- 2-phenylindol (DAPI) bestimmt, die Vitalität der Zellen mit 2' , 7' -Bis-carboxyethyl-5 und 6-Carboxyfluorescein (BCECF) und Propidiumiodid (PI) (beide MoBiTec, Göttingen, Deutschland) .
Urothel-konditionierte Medien. Um Urothel-konditionierte Medien herzustellen, wurden Urothelzellen (erhalten aus der Mu- kosaschicht von Proben derselben Harnblase auf der Oberfläche von azellulären Membranen kultiviert. Wie in [4], wurden Urothelzellen in zwei unterschiedlichen Gruppen gehalten, entweder in einem proliferativen Phänotyp in Gegenwart von 5 % FKS oder terminal differenziert durch die Verringerung der FKS-Konzentration auf 1 % unter fibroblastischer Induktion (aus der Lamina propria derselben Harnbalsen) . Urothelzellen wurden dann in DMEM 24 h inkubiert, und die konditionier- ten Medien wurden geerntet. Detrusorzellen, die auf Gerüsten kultiviert wurden, wurden jeweils mit Medium, konditioniert mit proliferierenden oder mit terminal differenzierten Urothel, bei den nachstehend erläuterten FKS-Konzentrationen, gespeist .
FCS-konditionierte Medien. FKS wurde zu Urothel- konditionierten Medien, d. h. entweder mit proliferativen
M 05 1 534 5 .doc oder mit terminal differenzierten Urothel konditionierten Medium, bei einer konstanten Konzentration von 5 % von Tag 1 bis Tag 32 supplementiert . Alternativ wurde FKS in drei Schritten verringert: 5 % von Tag 1 bis 14, 1 % bis Tag 28 und anschließend serumfreier Zustand für 4 Tage. In den Kontrollgruppen wurden die Zellen mit Medien, die dieselben Serumkonzentrationen enthalten, aber denen die Urothelkonditio- nierung fehlte, kultiviert. Die Kulturmedien wurden alle drei Tage gewechselt, außer in serumfreien Zuständen, wo sie täg- lieh gewechselt wurden, um die Verfügbarkeit von ausreichenden Nährstoffen für die Zellen zu gewährleisten.
Mechanische Stimulation. Ein spezieller Bioreaktor wurde verwendet, um die Wirkungen der mechanischen Stimulation auf die Membran-Zell-Komposite nachzuweisen. Mit Zellen besähte Membranen wurden einer Streckung um 5, 10 bzw. 20 % der Oberfläche unterzogen, was eine passive Dehnung der Zellen erzeugte. Die Vorrichtung bestand aus einem motorgetriebenen System, das die gleichzeitige Ausübung einer mechanischen Streckung bei vier rechteckig geformten Membranen ermöglichte (Fig. 1) . Die Membran-Zell-Komposite, d. h. die Membran, auf die die Gewebezellen aufgebracht worden sind, wurden parallel und in sterilen Kammern plaziert. Die Medien wurden separat durch eine Rollenpumpe in die unterschiedlichen Kammern mit 1 ml/h injiziert und an der gegenüberliegenden Seite in einer sterilen Flasche aufgefangen. Die Kulturen wurden mit 95 % Luft und 5 % CO2 bei 37 °C versorgt. Die Membranen wurden einheitlich in horizontale Richtung gestreckt und an jeder Seite zwischen zwei Platten befestigt. Die Wirkungen der mechani- sehen Streckung wurden unter kontinuierlicher Dehnung sowie unter zyklischer Dehnung und Relaxation untersucht (20 s Deh-
M 05 1 534 5 .doc nung und 10 s Relaxation oder 10 s Dehnung und 10 s Relaxation) .
Die mechanische Streckung kann mittels eines Bioreaktors durchgeführt werden. Einzelheiten des Bioreaktors werden in DE 101 51 822 beschrieben.
Ergebnisse
Die frisch aus der porzinen oder humanen Harnblase isolierten Detrusorzellen wiesen eine spindelförmige Morphologie auf, wobei etwa 80 % der Zellen positiv mit Antikörpern gegenüber Desmin und SMA färbten, und etwa 20 % waren Vimentin-positive Zellen, die keine Desmin- und SMA-Expression zeigten. 15 bis 20 % dieser Zellen färbten sich positiv mit c-Kit Antikörper Die Fraktion von Desmin- und SMA-positiven Zellen verringerte sich mit der erhöhenden Anzahl von Passagen unter 2D- Bedingungen und betrug weniger als 60 % bei Passage 7, wobei eine Variabilität zwischen unterschiedlichen Tieren und Patienten festgestellt wurde.
Es konnten keine großen Unterschiede zwischen Zellkulturen auf den Matrizes aus unterschiedlichen Quellen nachgewiesen werden. Fluoreszenzmikroskopische Analysen (Fig. 1) zeigten, daß die Zellen auf dem Gerüst bis zu 32 Tage hafteten und Ie- bensfähig blieben (> 80 %) . DAPI-Färbung von kultivierten Zellen auf den Membranen zeigte Zellkerne mit einer Apoptose- rate von weniger als 20 %.
Fig. 1 zeigt Aufnahmen zur Charakterisierung der Gewebezellen auf der Membran. Fig. IA zeigt in 40facher Vergrößerung einen Assay zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Gewebezellen auf der Membran. Als Farbstoff wurde BCECF (grüne Farbe) verwendet. Der Fluoreszenzfarbstoff BCECF ist spezifisch für lebende Zellen und zeigte eine hohe Zellvitalität der Gewebe-
M 05 1 534 5 .doc zellen 32 Tage nach dem Aufbringen der Gewebezellen auf die Membran. Fig. IB zeigt in 10Ofacher Vergrößerung Anfärbungen der zellulären DNA mit DAPI. Erkennbar sind mehrere sich teilende Zellkerne auf der Membran 14 Tage nach dem Aufbringen der Gewebezellen.
Histologische Analysen zeigten, daß P3-Zellen gleichmäßig auf der Oberfläche der Membran fünf Tage nach dem Aufbringen verteilt waren, während P7-Zellen, die aus ähnlich großen Biop- sien erhalten wurden, nur teilweises und weniger gleichmäßig verteiltes Wachstum zeigen. Am Tag 32 waren die Zellpopulationen auf den Membranen beinahe lOmal höher mit P3- Zellen als mit P7-Zellen. Jedoch sank der Prozentsatz von Zellen, die für Desmin und SMA positiv färben, im wesentlichen auf etwa 20 % in Kulturen mit P3-Zellen und auf 5 % in Kulturen mit P7-Zellen, wenn die Zellen auf der Oberfläche von größeren Membranen (> 10 cm2) kultiviert wurden.
Die Entfernung des Serums führte zwar zur Unterdrückung der Zeilproliferation und -migration, induzierte aber nicht die Differenzierung von SMC auf den Membranen wirksam (20 bis 30 % Exprimierung von Desmin und SMA in P3-Zellen, 5 bis 10 % in P7-Zellen an Tag 32) .
Die Figuren 2A bis 2F zeigen Aufnahmen immunohistochemischer Analysen von Membran-Zell-Kompositen unter Verwendung von SMA-Antikörpern jeweils in 20facher Vergrößerung. Auf die Membran wurden Gewebezellen der Passage 3 transferiert. Fig. 2A zeigt kultivierte Gewebezellen im Ruhezustand, d. h. Gewe- bezellen, die ohne urotheliale Induktion und ohne mechanische
Stimulation kultiviert wurden. Diese Gewebezellen zeigten nach 32 Tagen etwa 20 % positive Färbung mit SMA-Antikörper
(braune Farbe) . Fig. 2B zeigt, daß etwa 60 % der Gewebezellen einen differenzierten (reifen) Phänotyp auf der Membranober-
M 05 1 534 5 .doc fläche an Tag 32 nach der Serumentfernung aufwiesen, wenn die Gewebezellen unter in mit proliferativem Urothel konditioniertem Medium kultiviert wurden. Die Figuren 2C bis 2F zeigen Zellen, die auf der Membranoberfläche unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation kultiviert worden waren. Mehr als 80 % der Zellen zeigen positive Reaktionen mit SMA-antikörper an Tag 32 nach der Serumentfernung (Fig. 2C) . Im Serum-abgereicherten Medium (1 % FCS) waren am Tag 21 unter urothelialer und mechanischer Stimulation Gewebezellen in das Innere der Membran gelangt, wobei die Gewebezellen ihren differenzierten Phänotyp beibehalten haben (Fig. 2D bis Fig. 2F) .
Die Zellproliferation und -migration wurde durch ein Medium induziert, das mit proliferierendem Urothel konditioniert worden war. Tatsächlich bildeten bereits am Tag 18 die PS- Zellen, die in diesem Medium kultiviert wurden, 3 bis 5 Schichten auf der Oberfläche der Membran, während Kulturen, die mit Medium gespeist wurden, das mit terminal differen- ziertem Urothel konditioniert wurden war, nur 1 bis 2 Schichten von Zellen bildeten (Fig. 3) .
Die Figuren 3A und 3B zeigen Aufnahmen von H & E-Anfärbung von kultivierten Membran-Zell-Kompositen am Tag 18 nach dem Aufbringen der P3-Gewebezellen auf die Membran in 20facher Vergrößerung. In dem Kultursystem, konditioniert mit terminal differenziertem Urothel ohne mechanische Stimulierung, bildeten die Gewebezellen 1 bis 2 Schichten und drangen dann in die Membran ein (Fig. 3A) . Im Vergleich zu diesem System in- duziert das Medium, das mit proliferierendem Urothel konditioniert worden war, eine höhere Proliferation der PS- Gewebezellen und Penetration der Membran (Fig. 3B) . Tatsächlich konnten 3 bis 5 Zellschichten auf der Oberfläche der
M 05 1 534 5 .doc Membran identifiziert werden, die ebenso mit stärker pene- trierten Zellen durchsetzt ist (Fig.3B).
Der Prozentsatz von Desmin- und SMA-positiven Zellen betrug in der zweiten Gruppe (d. h. Zellen, die mit proliferativem urothelialen Medium kultiviert wurden) etwa 60 % an Tag 32 (Fig. 4B) im Vergleich zu 40 % in der ersten Gruppe (d. h. Zellen, die mit terminal differenziertem urothelialen Medium kultiviert wurden) , wenn das Serum in den drei Schritten ab- gereichert wurde. Unter den zweiten Bedingungen (mit proliferierendem Urothel konditioniertes Medium) induzierte die zusätzliche mechanische Streckung nicht nur die Zellpenetration und -migration in unterschiedliche Richtungen in Gegenwart von Serum (Tag 1 bis 28; Fig. 4, 5), sondern erhöhte ebenso den Anteil von Desmin- und SMA-positiven Zellen (Fig. 2C bis 2F) . In diesem Kultursystem färbten sich über 80 % der PS- Zellen positiv für Desmin und SMA an Tag 32, wenn das Serum in den drei Schritten reduziert wird (Fig. 2C) (10 % Strek- kung der Membranoberfläche) . Die übrigen 20 % der Zellpopula- tion (interstitielle Zellen) färbten sich positiv für mit Vi- mentin-Antikörper, während sie sich für SMA negativ färbten und nur schwache Empfindlichkeit für die mechanischen Verformungen und biochemischen Stimuli zeigten (Fig. 6) . Eine Sub- population (15-20 %) dieser Zellen färbte sich positiv mit C- Kit-Antikörper. Somit ist die Anwesenheit von C-Kit-positiven
Zellen in den Konstrukten bestätigt. Der Anteil an Desmin- und SMA-positiven Zellen unter den gleichen Bedingungen
(urothelialer Induktion und dreischrittiger FKS-Reduktion) war bei der mechanischen Dehnung der Konstrukten um 5 % bzw. 20 % der Membranoberfläche 66 % bzw. 69 %.
M 05 1 534 5 .doc In Kulturen mit konstanter Serumkonzentration (5 % FKS, Tag 1 bis 32) migrierten die P3-Zellen in die unter Spannung stehende Membran, wenn sie mit Urothel-konditioniertem Medium ernährt wurden, zeigten aber nur teilweise Desmin- und SMA- Expression (40 % Desmin- und SMA-positive Zellen in mit proliferierendem Urothel konditioniertem Medium und 30 % Desmin- und SMA-positive Zellen in, mit terminal differenziertem Urothel konditioniertem Medium) .
Die Figuren 4A und 4B zeigen Aufnahmen von H & E-Anfärbungen der P3-Zellen auf der azellulären Membran in 20facher Vergrößerung. Sichtbar ist die räumliche Zellbewegung im Inneren der dreidimensionalen Struktur der azellulären Membran unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation an Tag 18 nach dem Aufbringen der Zellen auf die Membran (Fig. 4A, Fig. 4B) . Die Zellen lösen die Zell-Zell-Adhäsion während der Migration ab. Der Abbau der extrazellulären Matrix durch die wandernden Zellen konnte nachgewiesen werden. Beachtenswert ist insbesondere die längliche Form der wandernden Zellen un- ter Streckung.
Die Figuren 5A bis 5C zeigen weitere Aufnahmen von H & E- Anfärbungen der Membran-Zell-Komposite in 20facher Vergrößerung. Sichtbar ist die Penetration der Membran durch die P3- Gewebezellen unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation (10 % der Membranoberfläche) . Die stark beweglichen Zellen bewegten sich auf der gesamten Oberfläche der Membran und bildeten darauf viele Schichten (Fig. 5A) . Sie drangen stark in das Innere der Membran in unterschiedliche Richtungen ein und hielten zunächst die Zell-Zell-Adhäsion aufrecht (Fig. 5A) , wobei die extrazellulären Matrixkomponenten abgebaut werden, und überwanden deren räumliche Barriere
M 05 1 534 5 .doc (Fig. 5A bis 5C) . Die Membran war am Tag 32 vollständig von Gewebezellen nach der Serumentfernung durchsetzt (Fig. 5C) .
Fig. 6 zeigt eine Aufnahme einer SMA-Anfärbung eines Membran- Zell-Komposits. Zu erkennen sind die in die Membran eingedrungenen Zellen. Die interstitiellen Zellen färbten mit SMA- Antikörper unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation nicht positiv. Im Vergleich dazu zeigten die Glattmuskelzellen eine positive Reaktion mit dem Antikörper (brau- ne Farbe) unter denselben Bedingungen. Die interstitiellen Zellen sind durch Pfeile gekennzeichnet.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkon- struktes zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs, umfassend die Schritte
(a) Isolieren und zweidimensionales Kultivieren von or- gan-spezifischen Gewebezellen;
(b) Aufbringen der organ-spezifischen Gewebezellen auf eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran; und
(c) Kultivieren der organ-spezifischen Gewebezellen auf der Membran unter biochemischer und mechanischer Stimulierung der organ-spezifischen Gewebezellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebezellen Muskelgewebezellen sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen Muskelgewebezellen der Harnblase sind.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen, nachdem sie auf die Membran aufgebracht werden, unter mitogener Stimulation kultiviert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen, die auf die Membran aufgebracht
M 05 1 534 5 .doc werden, unter mitogener Stimulation kultivierte Muskelgewebezellen der Passagen 2 bis 7 sind.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen kultivierte Muskelgewebezellen der Passagen 3 bis 6 sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Kultivieren der Muskelgewebezel- len in Schritt (c) unter urothelialer Induktion erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur urothelialen Induktion ein mit proliferierendem Urothel konditioniertes Medium verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur urothelialen Induktion ein mit terminal differenziertem Urothel konditioniertes Medium verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Urothel aus der Mukosaschicht der Harnblase stammt.
11. Verfahren nach einem Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Kultivieren der Muskelgewebezellen in Schritt (c) in einem mittels Urothel konditionierten Medium erfolgt, das ferner fötales Rinderserum (FKS) oder autologes Serum enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium 5 % FKS oder autologes Serum enthält.
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13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an FKS oder autologem Serum während der Kultivierung der Muskelgewebezellen auf der Membran schrittweise auf 0 % verringert wird.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das mechanische Stimulieren in Schritt (c) das Strecken der Membran, auf die die Gewebezellen aufgebracht sind, umfaßt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das mechanische Stimulieren
(cl) das Strecken der Membran für einen vorgegebenen Zeitraum;
(c2) die Relaxation der Membran für einen vorgegebenen Zeitraum; und
(c3) das n-fache Wiederholen der Schritte (cl) und (c2), wobei n eine Ganzzahl größer oder gleich 1 ist.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran entlang ihrer Längsachse gestreckt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen und das Urothel von einer Harnblase stammen.
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18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen und das Urothel von derselben Harnblase stammen.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen Glattmuskelzellen und interstitielle Zellen sind.
20. Gewebetransplantatkonstrukt zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs, umfassend
(a) eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran; und
(b) organ-spezifische Gewebezellen, die auf der Membran unter biochemischer und mechanischer Stimulierung kultiviert sowie biochemisch und mechanisch stimuliert worden sind, umfaßt.
21. Gewebetransplantatkonstrukt nach Anspruch 20, umfassend c-Kit-positive Zellen.
22. Gewebetransplantatkonstrukt nach Anspruch 20 oder 21, erhalten durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
23. Gewebetransplantatkonstrukt nach einem der Ansprüche 20 oder Anspruch 22 zur Rekonstruktion einer menschlichen oder tierischen Harnblase, dadurch gekennzeichnet, daß die organ-spezfischen Gewebezellen Muskelgewebezellen einer Harnblase sind.
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24. Gewebetransplantatkonstrukt nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen der Harnblase Glattmuskelzellen und interstitielle Zellen sind.
25. Gewebetransplantatkonstrukt nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, erhalten durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 19.
26. Verwendung eines Gewebetransplantatkonstruktes nach ei- nem der Ansprüche 20 bis 22 zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs.
27. Verwendung eines Gewebetransplantatkonstruktes nach einem der Ansprüche 23 bis 25 zur Rekonstruktion einer menschlichen oder tierischen Harnblase.
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