CN111321107A - 人主动脉瓣膜间质细胞的分离及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人主动脉瓣膜间质细胞的分离和培养方法，该方法有效结合磁力转子机械分离方法和胶原酶消化方法分离组织，采用200目细胞筛过滤消化液，过滤好的消化液1000rpm离心5min，收集获得细胞沉淀并重悬浮，接种至培养瓶，置于37℃、5％CO₂环境中培养，其操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的人主动脉瓣间质细胞分离培养的方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

Description

人主动脉瓣膜间质细胞的分离及培养方法

技术领域

本发明属于人细胞分离及培养技术领域，涉及人主动脉瓣膜间质细胞的分离及培养方法。

背景技术

近年来，随着生活水平和医疗水平的提升，人口预期寿命逐渐延长，钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)患病率也日益增高，严重影响了人们健康。人的主动脉瓣膜间质细胞作为人的主动脉瓣膜的主要构成细胞，是体外研究钙化性主动脉瓣疾病的最佳的细胞。

由于主动脉瓣膜间质细胞再生能力较弱的特性，目前研究者主要采用原代细胞分离方法分离离体的人主动脉瓣来获得人主动瓣膜间质细胞，并通过原代培养获得稳定的有限细胞系。

目前国内外瓣膜间质细胞的分离多采用胶原酶消化序贯分离法，但耗时较长，效率低。

发明内容

根据上述问题，本发明提供了人主动脉瓣膜间质细胞的分离和培养方法，该方法结合磁力转子机械分离方法和胶原酶消化方法，其操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的人主动脉瓣间质细胞分离培养的方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

其技术方案如下：

本发明的目的之一是提供人主动脉瓣膜间质细胞的分离及培养方法，该方法采用磁力转子机械分离方法和/或胶原酶消化方法分离主动脉瓣膜间质细胞。

在其中一个实施例中，所述磁力转子机械分离方法，通过恒温磁力搅拌器实现，搅拌器上烧杯内水温恒定在37℃，搅拌器的转子转速为50-60次/分钟，第一次搅拌时长为30min，以后每次搅拌时长为1小时。

在其中一个实施例中，所述胶原酶消化方法，初次使用的胶原酶终浓度为2.5mg/mL，以后每次使用的胶原酶终浓度为0.8mg/mL。

在其中一个实施例中，采用磁力转子机械分离方法和/或胶原酶消化方法分离人主动脉瓣膜间质细胞，弃去第一次细胞沉淀，收集以后每次获得的细胞沉淀。

在其中一个实施例中，具体步骤包括：

(1)打开恒温磁力搅拌器，在搅拌器上准备37℃烧杯恒温水；

(2)于超净台内，在血清瓶里使用M199混合培养基，配制5mL胶原酶I终浓度为2.5mg/mL的消化液；

(3)选取新鲜刚离体人主动脉瓣膜标本，剪去周围的肌肉、软组织，超净台内用4℃预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)的PBS(PH为7.4)反复轻柔吹洗3遍；

(4)在4℃预冷的PBS中将组织剪成3mm×3mm×3mm的碎块，将碎块转移至步骤(2)的血清瓶中；

(5)将血清瓶用固定器固定，浸入(1)中37℃烧杯水中，调整烧杯水面稍高于血清瓶液面，打开血清瓶中恒温磁力搅拌器的磁力转子，调整转速为50-60转每分钟；

(6)搅拌30min后于超净台内吸净消化液，过滤消化液，过滤好的消化液1000rpm离心5min，其后吸取上清移回血清瓶，弃去第一次细胞沉淀(多为上皮细胞)；

(7)往步骤(6)中血清瓶加入10mL的M199混合培养基，调整血清瓶内胶原酶I，使其终浓度为0.8mg/mL，重复步骤(5)；

(8)搅拌1小时后，取出步骤(7)中血清瓶，于超净台内吸净消化液，过滤消化液，过滤好的消化液1000rpm离心5min，吸取上清移回血清瓶；

(9)往(8)中离心后的沉淀加入M199混合培养基重悬，计数细胞。

在其中一个实施例中，优选地，所述步骤(6)和步骤(8)的消化液使用200目细胞筛进行过滤，细胞筛上肉眼可见的组织碎片，用镊子夹回血清瓶。

在其中一个实施例中，优选地，重复步骤(5)、步骤(8)和步骤(9)2-3次，直至组织完全消化。

在其中一个实施例中，将上述所得的重悬细胞接种至培养瓶中，置于37℃、5％CO₂环境中培养。

在其中一个实施例中，所述M199混合培养基含有：10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素。

本发明的有益效果：

1、本发明建立了一种简单、高效的分离培养人主动脉瓣膜间质细胞的方法，所得的原代细胞，经细胞形态学观察与鉴定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达90％以上，细胞纯度达90％以上。

2、本发明联合磁力转子机械分离方法和胶原酶消化方法，降低了的胶原酶I的浓度，大大节省了时间投入和经济成本，获得的细胞数量多，细胞损伤性小。

3、本方法简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，研究主动脉瓣膜细胞的特性，为后续的实验提供可靠的细胞资源，并且为开展不同类型主动脉瓣膜间质细胞功能及结构研究提供了可靠的保障。

附图说明

图1普通倒置显微镜下人主动脉瓣间质细胞(40X)

图2激光共聚焦显微镜下α-SMA染色人主动脉瓣间质细胞(100X)

图3本发明实施例中的流程示意图

具体实施方式

下面对本发明的实施例进行详细说明。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

本实验所用的实验仪器耗材与试剂如下：

外科手术器械一套，倒置显微镜(Olympus，日本)，荧光显微镜(Leica，美国)，低温离心机(北利，北京)，低温冰箱(美的)，移液枪(Eppendorf，美国)，电子分析天平(美国)，超净工作台(AirTech，日本)，CO₂细胞培养箱(ThermoFisher，美国)，C型10mm聚四氟磁力搅拌子(梅颖浦，中国上海)，恒温磁力搅拌器(梅颖浦，上海)，MilliporeMillex-GP(0.2μm)针头过滤器(默克，美国和加拿大)，10mL注射器(康佳，中国云南)，500mL烧杯(蜀牛，中国)，15mL离心管和75cm²细胞培养瓶等细胞培养耗材(康宁，美国)。

试剂：胶原酶I(Gibco，美国)，M199基础培养基(Gibco,美国)，100X双抗(含青霉素、链霉素)(Gibco，美国)，胎牛血清(Gibco，美国)，0.25％胰蛋白酶(Gibco，美国)，PBS(Gibco，美国)。

本发明提供的技术方案包括如下步骤：

1.准备组织处理器械盒(内含眼科剪1把、平镊2把，60mm玻璃皿2个，25mL血清瓶1个(内含C型10mm聚四氟磁力搅拌子1枚)、200目细胞筛1个)于高温蒸汽锅灭菌30min，再置于72℃烘箱1小时；

2.将组织处理器械盒、15mL无菌离心管、10mL注射器、MilliporeMillex-GP(0.2μm)针头过滤器放入超净台，打开紫外灯照射30min；

3.打开恒温磁力搅拌器的加热器，将温度调至37℃，在搅拌器上面放置1个500mL烧杯，杯内含2/3体积的清水，30min后注意观察烧杯内温度计读数是否稳定在37℃；

4.超净台内称量胶原酶I12.5mg，加入M199混合培养基(M199培养基含10％胎牛血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素))5mL中，充分吹打均匀，配制成胶原酶I浓度为2.5mg/mL(w/v)的消化液；

5.打开组织器械盒，取出25mL血清瓶，将MilliporeMillex-GP(0.2μm)针头过滤器置于瓶口，用10mL注射器吸取5mL消化液，将5mL消化液经MilliporeMillex-GP(0.2μm)针头过滤器缓慢注入25mL血清瓶中；

6.选取新鲜刚离体人主动脉瓣膜标本，剪去周围的肌肉、软组织，用PBS(PH为7.4)浸泡于50ml离心管后置于有冰袋的保温盒30min内运回实验室；

7.超净台内取出60mm玻璃皿，往其中一个皿中加入4℃预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)的PBS液(PH为7.4)，将人主动脉瓣膜放入皿中，用枪头吸取PBS液反复轻柔吹洗，弃去PBS，如此反复吹洗3遍；

8.用镊子将清洗好的人主动脉瓣膜转移至另一个60mm玻璃皿中，在预冷的PBS(PH为7.4)中用眼科剪将组织剪成3mm×3mm×3mm的碎块，将碎块转移至25mL血清瓶中，盖紧瓶盖，封好封口膜；

9.将25mL血清瓶用固定器固定，浸入500mL烧杯里，调整烧杯液面稍高于瓶内液面，打开恒温磁力搅拌器的磁力转子，调整转速为50转每分钟；

10.搅拌30min后取下25mL血清瓶，于超净台内吸取消化液，将消化液经200目细胞筛过滤至15mL离心管中，细胞筛上肉眼可见的的组织碎片用镊子夹回25mL血清瓶，过滤好的消化液1000rpm离心5min，其后吸取上清转移回25mL血清瓶，弃去细胞沉淀(多为上皮细胞)；

11.往(10)中25mL血清瓶加入10mL的M199混合培养基，此时25mL血清瓶内胶原酶I浓度为0.8mg/mL(w/v)，重复步骤(9)；

12.搅拌1小时后取下25mL血清瓶，于超净台内吸取消化液，将消化液经200目细胞筛过滤至15mL离心管中，细胞筛上肉眼可见的的组织碎片用镊子夹回25mL血清瓶，过滤好的消化液1000rpm离心5min，其后吸取上清转移回25mL血清瓶；

13.往(12)中沉淀加入M199混合培养基重悬，全自动细胞计数仪计数细胞；

14.接种细胞至75cm²培养瓶中，置于37℃、5％CO₂环境中培养；

15.其后重复步骤(9)、(12)、(13)、(14)约2-3次，直至组织完全消化；

16.细胞传代培养：人主动脉瓣膜间质细胞长至80％～90％时弃去培养基，用PBS(PH为7.4)洗涤2～3次，用0.025％的胰蛋白酶1-2mL消化1-2min，倒置显微镜下观察，当细胞脱壁并回缩呈圆形，且折光度降低时，加入胰蛋白酶2倍体积的M199混合培养基终止消化，将细胞悬液转移至15mL离心管，1000rpm离心5min，弃上清，加入4mL的M199混合培养基使细胞沉淀重悬，按1:2接种至75cm²培养瓶，记为P1；

17.细胞形态观察：48小时后贴壁达50％，镜下观察细胞呈梭形，铺石状贴壁生3天后开始迅速增殖，6-7天后细胞可长至80％以上，细胞均质透明，胞体清亮，折光性好；

18.人主动脉瓣膜细胞免疫学鉴定：选取P1细胞时进行表型鉴定，以4％多聚甲醛固定后，PBS缓冲液漂洗3遍,0.2％Triton-X100处理15min，1％BSA封闭过夜，一抗(兔抗人α-SMA抗体，鼠抗人Vimentin抗体，Sigma公司，美国)1：100稀释4℃孵育过夜，PBS缓冲液漂洗后加人l：100稀释的二抗(荧光染料AlexaFlour488标记的羊抗兔和AlexaFlour568标记的羊抗鼠IgG抗体，Sigma公司，美国)，室温下避光孵育2小时，PBS缓冲液漂洗，1：1000Drap5复染细胞核15min，激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照。

高倍下计数400个细胞，人主动脉瓣膜间质细胞纯度为90％以上。

本发明所得到的人主动脉瓣膜间质细胞数量多，P1代细胞成活率达90％以上，细胞纯度达90％以上。

本发明分离所得人主动脉瓣膜间质可大量增殖，并且可以原代培养5-7代，为后续的实验提供可靠的细胞资源。

以上所述，仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此实施例。任何在本发明的精神和原则之内做出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.人主动脉瓣膜间质细胞的分离及培养方法，其特征在于，采用磁力转子机械分离方法和/或胶原酶消化方法分离主动脉瓣膜间质细胞。

2.根据权利要求1所述的间质细胞分离及培养方法，其特征在于，所述磁力转子机械分离方法通过恒温磁力搅拌器实现，搅拌器上烧杯内水温恒定在37℃，搅拌器的转子转速为50-60次/分钟，第一次搅拌时长为30min，以后每次搅拌时长为1小时。

3.根据权利要求1或2所述的间质细胞分离及培养方法，其特征在于，所述胶原酶消化方法，初次使用的胶原酶终浓度为2.5mg/mL，以后每次使用的胶原酶终浓度为0.8mg/mL。

4.根据权利要求3所述间质细胞分离及培养方法，其特征在于，采用磁力转子机械分离方法和/或胶原酶消化方法分离人主动脉瓣膜间质细胞，弃去第一次沉淀，收集以后每次获得的细胞沉淀。

5.根据权利要求4所述的间质细胞分离及培养方法，其特征在于，具体步骤包括：

(1)打开恒温磁力搅拌器，在搅拌器上准备37℃烧杯恒温水；

(2)于超净台内，在血清瓶里使用M199混合培养基，配制5mL胶原酶I终浓度为2.5mg/mL的消化液；

(3)选取新鲜刚离体人主动脉瓣膜标本，剪去周围的肌肉、软组织，超净台内用4℃预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)的PBS(PH为7.4)反复轻柔吹洗3遍；

(4)在4℃预冷的PBS中将组织剪成3mm×3mm×3mm的碎块，将碎块转移至步骤(2)的血清瓶中；

(5)将血清瓶用固定器固定，浸入(1)中37℃烧杯水中，调整烧杯水面稍高于血清瓶液面，打开血清瓶中恒温磁力搅拌器的磁力转子，调整转速为50-60转每分钟；

(6)搅拌30min后于超净台内吸净消化液，过滤消化液，过滤好的消化液1000rpm离心5min，其后吸取上清移回血清瓶，弃去第一次细胞沉淀；

(7)往步骤(6)中血清瓶加入10mL的M199混合培养基，调整血清瓶内胶原酶I，使其终浓度为0.8mg/mL，重复步骤(5)；

(8)搅拌1小时后，取出步骤(7)中血清瓶，于超净台内吸净消化液，过滤消化液，过滤好的消化液1000rpm离心5min，吸取上清移回血清瓶；

(9)往(8)中离心后的沉淀加入M199混合培养基重悬，计数细胞。

6.根据权利要求5所述的间质细胞分离及培养方法，其特征在于，步骤(6)和步骤(8)的消化液使用200目细胞筛进行过滤，细胞筛上肉眼可见的组织碎片，用镊子夹回血清瓶。

7.根据权利要求6所述的间质细胞分离及培养方法，其特征在于，重复步骤(5)、步骤(8)和步骤(9)2-3次，直至组织完全消化。

8.根据权利要求5至7任一所述的间质细胞分离及培养方法，其特征在于，将权利要求5至7任一所得的重悬细胞接种至培养瓶中，置于37℃、5％CO₂环境中培养。

9.根据权利要求5至7任一所述间质细胞分离及培养方法，其特征在于，所述M199混合培养基含有：10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素。

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