CN105647869B - 一种人肺腺癌细胞株ha1221及其建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人肺腺癌细胞株HA1221及其建立方法，所述人肺腺癌细胞株HA1221的保藏编号为CCTCC No:C201618，其是将胸腔积液加入到人外周血淋巴分离液，得到肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞，用胸腔积液加二抗培养基进行培养，双密度梯度离心得到活力高的肿瘤细胞，反复贴壁剔除内皮及上皮细胞，逐步减少胸腔积液比例进行培养，至第5代时直接用含胎牛血清的培养基培养，培养细胞注射小鼠成瘤，杀小鼠取肿瘤并消化，得到活力好的原代肿瘤细胞。由于中晚期肺癌病人的组织标本一般难以获得，成熟的高分化肿瘤细胞较难体外培养，本发明从比较容易获得又不为病人带来痛苦的胸腔积液中分离纯化高分化的肿瘤细胞并成功建系，使得建立新的肺癌研究模型更简单方便且成功率大大提高。

Description

一种人肺腺癌细胞株HA1221及其建立方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的人肺腺癌细胞株HA1221及其建立方法。
背景技术
体外建立肺癌细胞系为研究肿瘤的基础和临床研究提供了极其重要的细胞实验模型。但是随着实验的不断开展，常需要对细胞系进行不断的体外传代，于是一些生物学特征会渐渐的改变或消失，所以不断建立新的细胞系已经成为研究肺癌的发病机理和探寻新的治疗方法的重要环节。
原代细胞的培养难易程度与取材时的组织类型、分化程度、年龄等密切相关，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
现有技术大多采用手术中切除的早中期病人肿瘤组织进行原代培养，包括直接将组织进行消化培养或是将病人肿瘤组织移植至小鼠体内，待成瘤后，再取出小鼠肿瘤组织进行消化培养。
胸水细胞的主要成分为淋巴细胞、粒细胞、树突状细胞、少量脱落的上皮细胞、成纤维细胞及肿瘤细胞等，成分相对较为复杂，胸腔积液中的肿瘤细胞属于高分化的成熟细胞，比较脆弱，一般而言比较难培养。但是相对于原发肿瘤灶，胸水取材容易，如果能建立稳定的培养体系，对肺癌原代细胞的建立有很大的推广意义。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的人肺腺癌细胞株HA1221及其建立方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种人肺腺癌细胞株HA1221的建立方法，包括以下步骤：
(1)、去除中晚期肺癌病人胸腔积液中的血块，离心后得到上清液和沉淀；
(2)、将步骤(1)的沉淀用两倍体积的PBS重悬，再按1:1的体积比缓慢贴壁加入到人外周血淋巴分离液的液面上，离心；
(3)、小心吸取分离液面交界处的液体，得到肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞，无菌PBS清洗，离心弃上清；
(4)、使用含0.5～2wt％的青-链双抗的步骤(1)的上清液作为条件培养基培养步骤(3)的细胞；
(5)、待细胞长满时，用0.25～0.5wt％的胰酶消化，离心后，用PBS将沉淀重悬成细胞悬液；所述PBS与沉淀的体积比为2～3:1；
(6)、预先在干净离心管中依次缓慢贴壁加入40％的比重为1.056的percoll液和20％的比重为1.031的percoll液；
(7)、将步骤(5)的细胞悬液缓慢贴壁加入到步骤(6)的离心管中，离心；
(8)、吸取40％的percoll液面处的液体，无菌PBS清洗，离心弃上清，得到肿瘤细胞，使用步骤(4)中的条件培养基进行培养；
(9)、重复步骤(4)-(8)一次，然后进行细胞传代，传代时，步骤(4)的条件培养基的上清液的比例每次减少20％，再相应增加20％含10％胎牛血清的DMEM培养基，到第五代时条件培养基为加青-链双抗的10％胎牛血清的DMEM培养基；
(10)、将传代五次后的细胞注射小鼠成瘤，杀小鼠取肿瘤并消化，得到原代人肺腺癌细胞株HA1221。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述人外周血淋巴分离液的比重为1.077。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述离心是在4℃1000rpm/min离心10min；步骤(2)所述离心是在20℃1350rpm/min升速5，降速0，水平离心25分钟；步骤(7)所述离心是在20℃2000rpm/min，升速5，降速0，水平离心25分钟。
在其中一些实施例中，步骤(4)的青-链双抗的含量为1wt％
在其中一些实施例中，步骤(4)中置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养细胞。
在其中一些实施例中，步骤(5)中所述PBS与沉淀的体积比为2:1。
本发明还提供了上述建立方法建立的人肺腺癌细胞株HA1221。
本发明创建了一种从中晚期病人的癌性胸腔积液中分离纯化肿瘤细胞进行培养并建系的方法。分离得到活力高的肿瘤细胞后，用胸腔积液加培养基进行培养，每次传代，利用上皮和内皮细胞容易脱落，而肿瘤细胞贴壁更牢固的特点，丢弃先脱落的细胞，剩下肿瘤细胞进行培养，逐步剔除内皮和上皮细胞。本发明通过以下几个特殊的处理实现了本发明的发明目的：
1、本发明的人肺腺癌细胞株HA1221的建立方法中分离肿瘤细胞时采用了两次双密度梯度离心法，第一次双密度梯度离心法，得到含量较高的肿瘤细胞和部分成纤维细胞及内皮细胞，由于成纤维细胞通常比肿瘤细胞生长更快，导致肿瘤细胞生长抑制甚至死亡，因此本发明利用反复贴壁法剔除成纤维细胞和内皮细胞，再次采用双密度梯度离心法，分离除去凋亡和死亡细胞，得到活力高的肿瘤细胞；
2、由于成熟肿瘤细胞在体外培养条件与体内环境变化剧烈，细胞不容易 适应，容易造成生长缓慢甚至死亡，因此本发明采用了在培养初期，用自体胸腔积液加二抗为主的条件培养基，使细胞适应生长环境，视长出的细胞量适当加大含10％胎牛血清的DMEM量，逐步过渡到细胞稳定生长时不加胸腔积液上清；
3、为了得到活力高的肿瘤细胞，本发明将培养的肿瘤细胞接种至裸鼠中，通过裸鼠体内的自然筛选，那些生长能力较强的细胞群体(肿瘤细胞)继续生长存活，相对生长能力较弱的群体(包括人成纤维细胞及内皮细胞)就会慢慢丢失，再将裸鼠体内的移植瘤取出作原代细胞培养，从而得到本发明所需要的高活力的原代人肺腺癌细胞。
本发明所述的人肺腺癌细胞株HA1221已在中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏日期为2016年1月28日，保藏编号为CCTCC No:C201618。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
由于中晚期肺癌病人的组织标本一般难以获得，成熟的高分化肿瘤细胞较难体外培养，本发明从比较容易获得又不为病人带来痛苦的胸腔积液中分离纯化高分化的肿瘤细胞并成功建系，使得建立新的肺癌研究模型更简单方便且成功率大大提高。
附图说明
图1为160×光学显微镜下，细胞稀疏与密集生长的状态图；
图2分别为15000×和30000×透射电镜下的细胞内部结构图，其中2-1中，A为胞核，B为自噬体，C为核仁；2-2中，A为胞核，B为胞核，C为核仁，D为线粒体；2-3中，A腔内的微绒毛；B线粒体；C内浆网；
图3分别为500×扫描电镜下的细胞生长情况图和4000×扫描电镜下的细胞表面结构图；
图4分别为流式细胞仪检测细胞周期结果图和细胞周期各阶段DNA含量图；
图5为染色体核型分析结果；
图6为细胞生长曲线图；
图7分别为克隆形成图和克隆形成率图；
图8为HA1229细胞体外成瘤能力检测图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明的人肺腺癌细胞株HA1221的建立方法的主要流程为：
胸腔积液→人外周血淋巴分离液→得到肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞用胸腔积液加培养基进行培养→双密度梯度离心得到活力高的肿瘤细胞→反复贴壁法→剔除内皮及上皮细胞→逐步减少胸腔积液比例→直接用含胎牛血清的培养基培养→培养细胞注射小鼠成瘤→杀小鼠取肿瘤并消化→活力好的原代肿瘤细胞。
实施例1人肺腺癌细胞株HA1221的建立方法
包括以下具体步骤：
(1)、将中晚期肺癌病人的胸腔积液过100μm滤网除去血块，4℃1000rpm/min离心10min得到上清液和沉淀，将上清液吸出另外保存；
(2)、在离心管中准备人外周血淋巴分离液(LTS1077,天津灏洋，比重为1.077)，将步骤1的沉淀用两倍体积的PBS重悬，再按PBS重悬液与人外周血淋巴分离液的体积比1:1，将PBS重悬液缓慢贴壁加入人外周血淋巴分离液的液面上，水平离心机20℃1350rpm/min(升速5，降速0)水平离心25分钟；
(3)、小心吸取分离液面交界处的约1mL液体(含肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞)到新的离心管中，用无菌的1×PBS清洗三次，室温，1000rpm/min，离心5分钟，弃上清；
(4)、步骤1离心得到的胸腔积液上清液，加入胸腔积液上清液含量1wt％的青-链双抗，作为条件培养基，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱(HERAcell150i,USA)中培养步骤(3)的细胞，即(1mL液体，含肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞)；
(5)、待细胞长满时，用0.3wt％的胰酶消化，离心后，用PBS按2:1(PBS:沉淀)的体积比重悬成细胞悬液；
(6)、预先在干净离心管中缓慢贴壁加入40％的比重为1.056的percoll液和20％的比重为1.031的percoll液；
(7)、将4ml步骤(5)的细胞悬液缓慢贴壁加入到步骤(6)已加入percoll液的离心管中，水平离心机20℃2000rpm/min(升速5，降速0)水平离心25min；
(8)、吸取40％的percoll液面处的1ml液体(分离得到的活力高的肿瘤细胞)到新的离心管中，加入无菌PBS 2ml混匀1000rpm/min离心5min，重复洗涤1次，弃上清，得到肿瘤细胞，使用步骤(4)中的条件培养基进行培养；
(9)、重复步骤(4)-(8)进行一次，然后进行细胞传代，传代时，步骤(4)的条件培养基的胸腔积液上清液的比例每次减少20％，再增加20％含10％胎牛血清的DMEM培养基，到第五代时条件培养基为加青-链双抗的10％胎牛血清的 DMEM培养基；传代时，利用上皮和内皮细胞容易脱落，而肿瘤细胞贴壁更牢固的特点，丢弃先被胰酶消化脱落的细胞，剩下肿瘤细胞进行培养，逐步剔除内皮和上皮细胞；
(10)、将传代五次后肿瘤的细胞用胰酶消化，用生理盐水洗2遍后制成细胞悬液，浓度为1×107个/mL，将细胞悬液接种在免疫缺陷小鼠两侧皮下成瘤，待肿瘤形成，杀小鼠，取肿瘤组织块，进行鼠间传代。
通过10-70um尼龙细胞滤网去除细胞团以及细胞碎片，然后再用0.25％的胰蛋白酶消化约1小时，弃掉上清再次低速离心，得到了大量的肿瘤上皮样细胞。
a剪切
把已成瘤的肿瘤组织块剪碎，约1～2mm3大小的组织块。
b加液漂洗
将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2～3次(采用倾斜，自然沉降法)。
c消化
使用含1％胶原酶II的完全细胞培养基(10％FCS的DMEM)37℃消化4小时，800r/min低速离心8分钟后,弃掉上清。消化液的量应该是组织的8～10倍，消化过程中要间断的振荡摇匀，观察组织呈絮状，消化液变浑浊时即终止消化。
d漂洗
将含有10％胎牛血清的DMEM(GIBCO)培养基沿瓶壁缓缓加入，终止漂洗2-3次后，加入DMEM(GIBCO)培养基重悬。
e机械分散
采用吸管吹打，通过10-70um尼龙细胞滤网去除细胞团以及细胞碎片，然后再用0.25％的胰蛋白酶消化约1小时，弃掉上清再次低速离心，得到了大量的肿瘤上皮样细胞，用10％胎牛血清的DMEM培养基进行体外培养，得到人肺腺癌细胞株HA1221，已在中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏日期为2016年1月28日，保藏编号为CCTCC No:C201618。
体外培养的细胞的鉴定
细胞形态及光镜下观察
细胞体外培养物呈贴壁状态；不规则形，体积较大；各代细胞始终保持旺盛代谢；细胞形态稳定，即使传至第50代，细胞形态和生长速度不变。冻存后复苏良好。
在光镜下观察细胞生长情况如图1所示：体外培养的单层贴壁细胞大小不一，形态不规则，多为梭形，少量为多角形，细胞体积大。
透射电镜观察细胞内部结构
透射电镜样品制作步骤
1、取材：用于透射的细胞团块小于lmm3。
2、固定：2.5％戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时以上；用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分钟，共3次；l％锇酸固定液固定2～3小时；用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分钟，共3次；
3、脱水：50％乙醇15～20分钟；70％乙醇15～20分钟；90％乙醇15～20分钟；90％乙醇90％丙酮(1：1)15～20分钟；90％丙酮15～20分钟；以上在4℃冰箱内进行。100％丙酮室温15～20分钟，重复三次。
4、包埋：纯丙酮+包埋液(2：1)室温3～4小时；纯丙酮+包埋液(1：2)室温过夜；纯包埋液37℃2～3小时；
5、固化：37℃烘箱内过夜；45℃烘箱内12小时；60℃烘箱内24小时
6、切片：Leica EM UC 7型超薄切片机切片50～60nm；
7、双染：3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色；
8、HITACHI H-7650透射电镜观察，拍片。
结果如图2-1和2-2所示，从图2可以看出：胞核巨大、畸形，多种形状，有的核膜内陷呈锯齿状；有的见胞核内包裹一部分胞浆。核仁明显，有的细胞含有多个核仁，核仁中间有空白区。胞浆内线粒体明显增多，形状不一，体积增大,峭增多。胞浆内内浆网较多,有部分明显扩张、表面微绒毛较少。有的细胞见有新腔形成的趋势，腔内有突入的微绒毛。
扫描电镜观察细胞表面结构
扫描电镜样品制作步骤
1、取材：对数生长期细胞消化后计数，5×103个细胞(100u1)接种于盖玻片上(面积为lcm2)，加适量DMEM培养液，放于孵箱，至细胞到生长对数期停止培养。
2、清洗：用PBS冲洗两次。
3、固定：①2.5％戊二醛4℃预固定2小时；②0.1M磷酸缓冲液冲洗3次，每次各15分钟；③1％锇酸4℃后固定2小时。
4、清洗：0.1M磷酸缓冲液冲洗3次，每次各15分钟。
5、脱水及置换：各15分钟。50％乙醇→70％乙醇→90％乙醇→100％乙醇I、II、III→100％乙醇+醋酸正戊酯(2：1)→100％乙醇+醋酸正戊酯(1：2)→100％ 醋酸正戊酯I、II、III
6、临界点干燥：样品装入样品盒中入HCP-2临界点干燥仪中干燥约2小时。
7、样品粘贴：取双面胶将已干燥的样品粘贴于样品台上。
8、喷镀：样品入IB一3型离子溅射仪中喷金3分钟。
9、扫描电镜观察：日立S-3000N。
结果如图3所示，从图3可以看出：细胞大小不一，细胞外形多为扁平，少数圆形(图3-1)，表面许多长短不一的指状微绒毛均匀分布，有大量丝状伪足，还可以见到大小不一的泡状凸起以及片层状凸起的皱褶(图3-2)。扫描电镜未见有支原体等异常颗粒存在。
流式细胞仪检测细胞周期
消化对数生长期的细胞，制成细胞悬液，PBS洗三遍，离心，用预冷的70％乙醇4℃固定过夜，用PBS洗一次后用PBS重悬，加PI 4℃避光孵育半小时，用流式细胞仪(BDFACScanto L)检测。从图4中通过G1，G2/M期的比较，可见HA1221比A549细胞增殖速度更快。
染色体核型分析
细胞G显带核型分析操作步骤
1、细胞培养(16～24)h；
2、阻留中期分裂相在培养细胞中加入秋水仙酰胺，终浓度为0.05mg/ml摇匀后置37℃温箱，0.5h后加增强剂100微升(原液：蒸馏水＝1：99)；
3、再过0.5h消化细胞，吸去原培养液，用无血清1640洗两遍，然后加10％胰酶消化，待大部分细胞离壁变圆，用含10％胎牛血清1640中和胰酶，收获细胞， 将培养物吸至尖底离心管，离心，1000转/分，10min；
4、低渗：弃上清液，沿管壁缓缓加入预温37℃的0.075M KCl溶液6～8ml，吹打混匀后置37℃温箱30min；
5、预固定：加1～1.5ml固定液(甲醇：乙酸＝3：1)打匀离心2000rpm/min 10min；
6、固定：离心后去上清加固定液6～8ml室温30分钟；
7、再固定：与步骤6一样固定，时间为15分钟或可延长，固定两次
8、收集细胞待分析；
9、将细胞悬液打匀后滴片4～6张左右，平铺于洁净滤纸上，待干；
10、取2～3只容积为50ml的白瓷立式染缸，倒入pH6.5的Earle’S溶液，加盖后置水浴箱中加热至87.5℃；
11、将表面干燥的玻片标本放入预温87.5℃的Earle’S溶液中温育，片与片之间留有空隙，进行G显带；
12、标本温育60min后，每隔5～10min取出1～2片，流水下冲洗。温育时间约在60～120min之间；
13、用新鲜配制的10％Giemsa染色液染色8～10min，取出水洗，待干。
取第10代HA1221的100个中期分裂相细胞的染色体进行分析，图5可见，细胞内染色体数目分布在50-55之间，而小鼠染色体数目2n＝40,从核型分析结果图可见，该细胞为人源细胞。染色体条数增加主要是：第10号和X染色体；丢失的主要是：第1，3，5，7，8，9号。染色体结构畸变主要为1号染色体长臂3区2带增加，11号染色体长臂2区2带增加，12号染色体长臂2区4带增加，18号染色体短臂1区1带增加，19号染色体短臂1区3带增加，22号染色体长臂1区1带增加。分别计100个细胞的染色体条带分析，二倍体染色体细胞占11％，二倍体和三倍体之间(包括三倍体)的细胞占89％， 说明细胞染色体不稳定，属亚三倍体，容易发生转移。
细胞生长曲线绘制
分别取生长良好的对数生长期HA1221细胞(第20代)和A549细胞，胰蛋白酶消化细胞，轻轻吹匀，倍比稀释，以每孔100uL(1.0×104/m1)J接种至96孔板，每孔再加入DMEM培养液100uL，使细胞终浓度为l×l03/孔，每组3个复孔，培养板放入孵箱。0h后，在各组的3孔细胞中加入MTI20uL(5mg/mL)，置孵箱培养4h后取出，吸尽上清，加入DMSO 150uL，置孵箱30min后取出，混匀后吸尽孔内液体至一空白96孔板，微型振荡仪上振荡5min，选择波长为590nm，在酶标仪上测定吸光值，取均值，DMSO做空白对照。其余细胞更换培养液。分别于12、24、48、72h测定吸光值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线，图6可见HA1221生长速度明显比A549高。
克隆形成实验对其增殖能力进行检测
分别取对数期生长的HA1221和A549细胞，消化、重悬，按每孔200个细胞，接种至6孔板中，每个细胞重复3孔，再放入37℃，5％CO2细胞培养箱内培养，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时(约14天)，终止培养。用PBS小心浸洗2次，加1:3醋酸/甲醇固定15分钟。然后去固定液，加适量结晶紫染色30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，最后计算克隆形成率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。从图7中可见，A549细胞克隆形成体积虽然较大，但克隆形成率明显低于HA1221细胞。
体外成瘤能力检测
消化对数生长期的细胞数，用生理盐水洗2遍后制成细胞悬液，浓度为1×107个/mL。分别接种在3只免疫缺陷小鼠右侧臀部皮下。图8显示接种44天肿瘤分别长成21mm×19mm、17mm×18mm，20mm×18mm。致瘤率100％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种人肺腺癌细胞株HA1221，其特征在于，所述细胞株HA1221的保藏编号为CCTCCNo:C201618。
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