CN108184818B - 一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂，包含如下成分：人血白蛋白、海藻糖、维生素C、右旋糖酐氯化钠注射液和注射用NaCl溶液，经过基础液的制备、成分的添加和存储步骤，完成人胎盘间充质干细胞悬液保护剂的制备；本发明能够有效的维持胎盘间充质干细胞的活性、干性和均一性，且本发明成分明确，不含异源动物血清，安全性高，并且本发明提供的保存方法能够有效维持干细胞活性，高效省时，利于规模化生产，实验表明人胎盘间充质干细胞在上述细胞保存剂中，在4‑8℃保存48 h后，细胞形态均一，存活率仍保持在90%以上，间充质干细胞特异性表面标志CD73,CD105,CD90表达率高于95%。

Description

一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂

技术领域

本发明涉及一种干细胞悬液保护溶液，具体涉及一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。它首先在骨髓中发现，随后分别在脂肪、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及在脐带、脐带血、胎盘组织中分离出来。由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。

绒毛膜来源于孕妇产后的胎盘组织，是胎盘的主要构成部位。绒毛膜层组织中富含大量的间充质干细胞和血管内皮细胞。研究发现，人胎盘绒毛膜源的间充质干细胞除表达CD105、CD73、CD90等间充质干细胞表面标记外，其还表达某些胚胎干细胞的表面标记，如SSEA-4、TRA-1-61、TRA-1-80等，且不表达HLA-DR（MHC-II类分子），表明胎盘绒毛源的MSC更原始，免疫原性更低，这为临床上各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。

如何长时间有效维持干细胞的活性成为临床细胞治疗的一大难点。生理盐水或葡萄糖注射液作为细胞的输注介质，由于其缺乏营养和缓冲能力，细胞活性的下降速度非常快，而且细胞易聚团，静脉输注存在安全隐患。血浆可以较好的维持细胞活性，但是，血浆中含有大量未知成分，异体输注存在安全隐患，同体输注则成本极高。因此发明一种成分明确，临床输注安全，有效长时间维持输注干细胞的活性和干性的保护剂就成为了临床治疗亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种能够有效维持胎盘间充质干细胞的活性、干性和均一性，且保护剂成分明确，不

含异源动物血清、安全性能高的人胎盘间充质干细胞悬液保护剂。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂，其创新点在于：包含如下成分：人血白蛋白、海藻糖、维生素C、右旋糖酐氯化钠注射液和注射用NaCl溶液，经过基础液的制备、成分的添加和存储步骤，完成人胎盘间充质干细胞悬液保护剂的制备；具体步骤如下：

（1）基础液的制备：将右旋糖酐氯化钠注射液与注射用NaCl溶液按照1:1进行稀释混匀，完成基础液的制备；

（2）成分的添加：向上述基础液中依次加入人血白蛋白、海藻糖和维生素C，所述人血白蛋白的添加量为2-10%，所述海藻糖的添加量为0.001-0.005%，所述维生素C的添加量为0.01-0.05%，充分搅拌，混匀，制备得到人胎盘间充质干细胞悬液保护剂；

（3）存储：将制备得到的人胎盘间充质干细胞悬液保护剂放置于500ml无菌培养基瓶中，放于4℃环境下进行保存。

进一步的，所述步骤（1）中的右旋糖酐氯化钠注射液的浓度为6%，所述注射用NaCl溶液的浓度为0.9%。

进一步的，所述步骤（2）中的震荡时间为30 s-1 min，震荡速度为1820 rpm。

本发明的有益效果如下：本发明能够有效的维持胎盘间充质干细胞的活性、干性和均一性，且本发明成分明确，不含异源动物血清，安全性高，并且本发明提供的保存方法能够有效维持干细胞活性，高效省时，利于规模化生产，实验表明人胎盘间充质干细胞在上述细胞保存液中，在4-8℃保存48 h后，细胞形态均一，存活率仍保持在90%以上，间充质干细胞特异性表面标志CD73,CD105,CD90阳性率高于95%。

附图说明

图1为人胎盘间充质干细胞生长形态图；

图2为P3流式细胞图；

图3-8为48h后流式细胞图；

图9为48h后细胞形态图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂，包含如下成分：人血白蛋白、海藻糖、维生素C、右旋糖酐氯化钠注射液和注射用NaCl溶液，经过基础液的制备、成分的添加和存储步骤，完成人胎盘间充质干细胞悬液保护剂的制备；具体步骤如下：

（1）基础液的制备：将右旋糖酐氯化钠注射液与注射用NaCl溶液按照1:1进行稀释混匀，完成基础液的制备，右旋糖酐氯化钠注射液的浓度为6%，所述注射用NaCl溶液的浓度为0.9%；

（2）成分的添加：向上述基础液中依次加入人血白蛋白、海藻糖和维生素C，人血白蛋白的添加量为2-10%，海藻糖的添加量为0.001-0.005%，维生素C的添加量为0.01-0.05%，充分震荡混匀，震荡时间为30 s-1 min，震荡速度为1820 rpm，制备得到人胎盘间充质干细胞悬液保护剂；

（3）存储：将制备得到的人胎盘间充质干细胞悬液保护剂放置于500 ml无菌培养基瓶中，放于4℃环境下进行保存。

实施例1

胎盘干细胞的制备

（1）人胎盘组织的采集：胎盘取自足月健康孕妇，孕妇HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体等检测项目均为阴性，胎盘自手术台取下后，浸在专用的胎盘保存液中，维持在2-8℃的环境中运输，24 h内分离；

（2）组织消毒、洗涤：将胎盘从保存液中取出，平放在无菌托盘上，脐带面向上，剪掉脐带，剥离羊膜，剪取羊膜下0-0.3 cm厚的绒毛膜组织，放入无菌培养皿内，将基蜕膜组织剥离干净，剪掉末端绒毛簇，用0.9%的生理盐水洗涤2次；

（3）酶消：将绒毛膜组织放入50 ml离心管内，10 ml/管，用顿头剪刀剪成1-3 mm³小块，加入1倍体积的混合胶原酶，混合胶原酶由1.5 mg/ml的胶原酶P和1 mg/ml的I型胶原酶组成，然后充分混匀，37℃，180 rpm震荡消化20-25 min。将消化产物加入0.5倍体积的培养液终止消化，200目筛网过滤，将细胞经2000 rpm，10 min，1800 rpm，10 min两次梯度离心后，弃上清，获得人胎盘间充质干细胞，此干细胞为种子。

（4）间充质干细胞体外培养和流式表型鉴定

干细胞原代培养：将分离的单个干细胞以1×10⁴/cm²的密度接种于T75培养瓶内，加入12 ml培养基，置于37℃、饱和湿度、CO₂体积分数为5%的培养箱内培养，每3天全量换液，并观察细胞的生长情况,如图1a-g所示，即为原代细胞生长过程图，待细胞长至80%-90%融合度,如图1g,此时可对细胞进行连续传代扩增，获得P3代干细胞，如图1h所示，即为P3细胞生长形态图。

细胞酶解：倒掉无菌培养瓶内的培养基，用0.9%的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入10 ml浓度为0.125%的胰蛋白酶，37℃消化1-3 min后，加入1 ml培养液终止消化，将脱落的细胞转移到离心管内，1500 rpm，离心6 min，将离心所得的沉淀即为干细胞；

细胞传代培养：用培养基重悬细胞，按1×10⁵ /ml密度接种于T75培养瓶进行传代培养，每瓶加入12-15 ml培养基，3天细胞即可达到80%汇合度。

干细胞流式表型鉴定

取P3代细胞，酶解后，将细胞沉淀用DPBS洗涤2次，取0.8~1×10⁶，100 ul细胞悬液放于EP管中，加入一抗15 ul（空白管不加一抗），4℃避光孵育30 min，加入400 ul DPBS，1500 rpm离心6 min，弃去上清，加入10 ul的二抗，4℃避光孵育30 min后，加入400 ulDPBS，1500 rpm离心6 min，弃去上清，加入500 ul DPBS混匀后转移到流式上机管中，上机检测，结果如图2，间充质干细胞特异性表面标志CD73,CD105,CD90阳性率分别为99.68%、99.82%、99.75%，CD34,HLA-DR表达率分别为0.26%，0.35%，表明我们分离到的是间充质干细胞。

（5）细胞悬液制备

取P3代的胎盘间充干细胞，细胞长至80-90%汇合度，细胞经酶解后，往细胞沉淀内加入50 ml生理盐水，1500 rpm，离心6 min，弃上清，重复此步骤3次，洗涤后的干细胞用于制剂的制备，最后一遍的洗液用于内毒素，无菌检测。

实施例2

一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂

取6%低分子右旋糖酐氯化钠注射液与0.9%注射用NaCl溶液1：1稀释混匀后，作为基础液，向基础液内加入人血白蛋白，海藻糖，维生素C，人血白蛋白的体积比2%，海藻糖质量百分比为0.001%，维生素C质量百分比为0.01%，充分混匀后制备成细胞保护剂，将配制成的细胞保护剂放置于500 ml无菌培养基瓶内，4℃保存。

实施例3

一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂

基础液的配置同实施例1，向基础液中加入人血白蛋白，海藻糖，维生素C，人血白蛋白的体积比5%，海藻糖质量百分比为0.02%，维生素C质量百分比为0.2%，充分混匀后制备成细胞保护剂，将配制成的细胞保护剂放置于500 ml无菌培养基瓶内，4℃保存。

实施例4

一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂：

基础液的配置同实施例1，向基础液中加入人血白蛋白，海藻糖，维生素C，人血白蛋白的体积比10%，海藻糖质量百分比为0.0005%，维生素C质量百分比为0.05%，充分混匀后制备成细胞保护剂。将配制成的细胞保护剂放置于500 ml无菌培养基瓶内，4℃保存。

对比例5-7

一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂：

基础液的配置同实施例1，分别向基础液中加入人血白蛋白，人血白蛋白的体积比为2%、5%、10%，充分混匀后制备成细胞保护剂。将配制成的细胞保护剂分别放置于500 ml无菌培养基瓶内，4℃保存。

将实施例1制备获得的P3代的人胎盘间充质干细胞重悬于实施例2-4和对比例5-7的细胞保护剂中，经100目筛网过滤后，调整细胞密度为0.5-2×10⁶个/ml，体系为50 ml，4℃保存。

由上述实施例，可以得到以下细胞及制剂质量评价，具体如下表所示：

细胞形态：A+：圆形或椭圆形，分布均匀，直径在18-22 um之间，折光性好；静置后有轻微聚团，摇晃后散开。A： 圆形或椭圆形，分布均匀，折光性好；静置聚团，摇晃后仍有小团；B：个别细胞体积变大，折光性下降，长时间静置出现少量死团。-：表示未检测到

在制备48 h后，实施例2-4制备的人胎盘干细胞悬液细胞形态均一，折光性强，细胞存活率高于90%，明显高于对照组，且细胞密度为1.5×10⁶个/ml时，效果尤为明显；细菌，真菌检测呈阴性，内毒素检测小于2EU/ml。

48h后细胞流式表型鉴定和再培养

将实施例2-4和对比例5-7中，以1.5×10⁶个/ml密度制备的细胞悬浮液，保存48h后，每个样本分别取1.5ml,做好标识，用于流式表型鉴定，如表1和图3-8，结果显示间充质干细胞特异性表面标记CD73、CD90、CD105均高于95%，而阴性指标CD34，HLA-DR低于5%，说明细胞在保护剂中保存48 h仍具有良好的干性，未发生分化；而对比例中的细胞CD73、CD90、CD105的阳性率在90-95%，而阴性指标CD34,HLA-DR为5-10%。

表1流式表型鉴定

48h后细胞再培养

将6种方法保存48h的干细胞分别以1×10⁵/孔接种于6孔板中，每孔加入3 ml培养基，置于37℃、饱和湿度、CO₂体积分数为5%的培养箱内培养，连续培养6天观察细胞形态和增殖情况。结果显示，在本发明保存液保存48 h后的细胞仍然具有很好的贴壁和增殖能力，细胞形态呈梭形，分布均匀，如图9a-c，连续培养6天细胞量分别达到了18×10⁵，20×10⁵，19.5×10⁵，与正常生长组细胞增殖（21×10⁵）情况差别不大，而对比例细胞贴壁后细胞大部分呈梭形，部分扁平,如图9d-f，增殖能力变慢，连续培养6天，细胞数量分别达到了12.5×10⁵，14.5×10⁵，14×10⁵，细胞增殖明显低于正常生长组。

本发明能够有效的维持胎盘间充质干细胞的活性、干性和均一性，且本发明成分明确，不含异源动物血清，安全性高，并且本发明提供的保存方法能够有效维持干细胞活性，高效省时，利于规模化生产，实验表明人胎盘间充质干细胞在上述细胞保存液中，在4-8℃保存48 h后，细胞形态均一，存活率仍保持在90%以上，间充质干细胞特异性表面标志CD73,CD105,CD90阳性率仍高于95%。

上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。

Claims (3)

1.一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂，其特征在于：包含如下成分：人血白蛋白、海藻糖、维生素C、右旋糖酐氯化钠注射液和注射用NaCl溶液，经过基础液的制备、成分的添加和存储步骤，完成人胎盘间充质干细胞悬液保护剂的制备；具体步骤如下：

（1）基础液的制备：将右旋糖酐氯化钠注射液与注射用NaCl溶液按照1:1进行稀释混匀，完成基础液的制备；

（2）成分的添加：向上述基础液中依次人血白蛋白、海藻糖和维生素C，所述人血白蛋白的添加量为2-10%，所述海藻糖的添加量为0.001-0.005%，所述维生素C的添加量为0.01-0.05%，放于微型振荡器（VORTEX GENIE）充分震荡，混匀，制备得到人胎盘间充质干细胞悬液保护剂；

（3）存储：将制备得到的人胎盘间充质干细胞悬液保护剂放置于500 ml无菌培养基瓶中，放于4℃环境下进行保存。

2.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂，其特征在于：所述步骤（1）中的右旋糖酐氯化钠注射液的浓度为6%，所述注射用NaCl溶液的浓度为0.9%。

3.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂，其特征在于：所述步骤（2）中的震荡时间为30 s-1 min，震荡速度为1820 rpm。

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