CN109468267B - 一种子宫内膜干细胞的制备方法 - Google Patents

一种子宫内膜干细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干细胞培养领域，特别涉及子宫内膜干细胞的制备方法。本发明使用双酶法，通过分步消化子宫内膜组织，获得更纯、增殖活性更好的子宫内膜干细胞，为未来子宫内膜干细胞及其在相关疾病治疗的研究与临床应用的开展奠定良好基础。

Description

一种子宫内膜干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞培养领域，特别涉及子宫内膜干细胞的制备方法。
背景技术
干细胞是指在一定条件下可以无限自我更新和增殖分化的细胞，包括从胚胎发育到成人生长发育过程中各种未分化的细胞。从受精卵到胚胎发育，直至最终衰老死亡的整个生命过程中都贯穿干细胞的存在、自我更新和发育分化。干细胞研究是近年生命科学领域发展最快、最受重视的前沿生物技术，涉及生命科学和生物医药的所有领域，在细胞治疗、器官移植、基因治疗、新药筛选等方面发挥重要作用。
在一个妇女的生育期,子宫内膜历经约400多次再生、分化和剥脱的动态循环过程，每个月经周期中增殖期子宫内膜都会在体内雌激素水平不断增加的作用下在4～10d内增厚4～10mm。分娩后、子宫内膜切除后和绝经后妇女应用激素替代治疗时也会发生内膜再生。Prianishnikov于1978年提出子宫内膜干细胞的概念，并认为其可使子宫内膜功能层增生修复，并提示，子宫内膜干细胞位于基底层，并存在上皮和基质两种类型干细胞。
目前国际上子宫内膜干细胞研究尚处于早期阶段，已建立的子宫内膜干细胞分离方法和体系也较少。根据已查找到的资料，一般是运用一种或多种酶配合同时对子宫内膜组织进行一次性消化。一般从医院采集得到的子宫内膜组织包括内膜全层和部分子宫肌层组织，使用一种或多种酶配合同时对子宫内膜组织进行一次性消化所获得的细胞较杂，且细胞增殖活性较差。因此，提供一种能提供更高纯度、更好增殖活性的子宫内膜干细胞的制备方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种子宫内膜干细胞的制备方法。本发明提供了一种子宫内膜干细胞分离方法，能分离到具备更高纯度且更好细胞增殖活性的细胞，为未来子宫内膜干细胞及其在相关疾病治疗的研究与临床应用奠定良好基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种子宫内膜干细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：获得子宫内膜清洗后与胰蛋白酶混合消化，离心，弃去上层溶液；
步骤2：取步骤1获得的组织剪碎，与Ⅰ型胶原酶混合后消化；
步骤3：终止消化，静置分层，取上清液离心后弃去液体，与培养基混合后接种至培养容器中培养。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述胰蛋白酶为质量百分含量为0.2％的胰蛋白酶溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为30～40min。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述子宫内膜与所述胰蛋白酶溶液的体积比为1:(1～3)。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述离心为于2000r/min离心5min。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述清洗为取子宫内膜与生理盐水混合轻轻吹打清洗，静置至明显分层，吸弃组织下层溶液，此步骤重复至少一次。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述清洗后与所述消化之间还包括离心的步骤，所述离心为2000r/min，离心5min，弃去上层溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述Ⅰ型胶原酶为质量百分含量为0.2％的Ⅰ型胶原酶溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中剪碎后的组织块与所述Ⅰ型胶原酶溶液的体积比为1:1。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为30～40min。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2与步骤3之间还包括清洗的步骤，所述清洗为加入生理盐水轻轻吹打清洗后，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；此步骤至少重复一次。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述终止消化采用含10％FBS的DMEM培养基终止消化。具体为消化结束后，加入等体积含10％FBS的DMEM培养基终止消化，吹打均匀后，静置3min，待分层，收集上清液。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述离心为于1500r/min离心5min。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中与培养基混合后接种至培养容器中培养具体为加入含10％FBS的DMEM培养基稀释成5×105/ml的细胞悬液，并接种到培养皿中，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。培养48h后，镜下观察细胞生长情况并换液。待细胞生长融合到80％后进行传代，用P1代细胞进行流式检测、细胞克隆形成实验和细胞群体倍增时间测定。
本发明提供了一种子宫内膜干细胞的制备方法，包括如下步骤：获得子宫内膜清洗后与胰蛋白酶混合消化，离心，弃去上层溶液；取获得的组织剪碎，与Ⅰ型胶原酶混合后消化；终止消化，静置分层，取上清液离心后弃去液体，与培养基混合后接种至培养容器中培养。本发明使用双酶法，通过分步消化子宫内膜组织，获得更纯、增殖活性更好的细胞。使用本发明所获得的细胞更纯、增殖活性更好，为未来子宫内膜干细胞及其在相关疾病治疗的研究与临床应用的开展奠定良好基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1制得的P0代细胞生长融合到80％-100％后的电镜图；
图2示对比例1制得的P0代细胞生长融合到80％-100％后的电镜图；
图3示对比例2制得的P0代细胞生长融合到80％-100％后的电镜图。
具体实施方式
本发明公开了一种子宫内膜干细胞的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
无菌条件下，手术采集子宫内膜标本，加入生理盐水轻轻吹打清洗，静置至明显分层，吸弃组织下层溶液，此步骤重复一次；
组织清洗结束后，转移至50ml离心管中，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；
向组织中加入1-3倍体积的0.2％的胰蛋白酶溶液，37℃消化30-40min；
消化结束后，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液。加入生理盐水轻轻吹打清洗后，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；此步骤重复一次；
将子宫内膜组织剪碎成约为1mm3的小块，并加入等体积的0.2％的Ⅰ型胶原酶，37℃消化30-40min；
消化结束后，加入等体积含10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打均匀后，静置约3min，待分层，取上清液转移到新的离心管，1500r/min，离心5min，离心后弃去液体，加入含10％FBS的DMEM培养基稀释成5×105/ml的细胞悬液，并接种到培养皿中，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养；
培养48h后，镜下观察细胞生长情况，并换液；待细胞生长融合到80％后可进行传代、冻存等操作。
本发明使用双酶法，通过分步消化子宫内膜组织，可获得更纯、增殖活性更好的细胞。
本发明提供的子宫内膜干细胞的制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
获得子宫内膜，加入生理盐水轻轻吹打清洗，静置至明显分层，吸弃组织下层溶液，此步骤重复一次；
组织清洗结束后，转移至50ml离心管中，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；
向组织中加入1倍体积的0.2％的胰蛋白酶溶液，37℃消化30min；
消化结束后，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液。加入生理盐水轻轻吹打清洗后，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；此步骤重复一次；
将子宫内膜组织剪碎成约为1mm3的小块，并加入等体积的0.2％的Ⅰ型胶原酶，37℃消化30～40min；
消化结束后，加入等体积含10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打均匀后，静置约3min，待分层，取上清液转移到新的离心管，1500r/min，离心5min，离心后弃去液体，加入含10％FBS的DMEM培养基稀释成5×105/ml的细胞悬液，并接种到培养皿中，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养；
培养48h后，镜下观察细胞生长情况，并换液；
待细胞生长融合到80％后进行传代，用P1代细胞进行流式检测、细胞克隆形成实验和细胞群体倍增时间测定。
实施例2
获得子宫内膜，加入生理盐水轻轻吹打清洗，静置至明显分层，吸弃组织下层溶液，此步骤重复一次；
组织清洗结束后，转移至50ml离心管中，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；
向组织中加入2倍体积的0.2％的胰蛋白酶溶液，37℃消化30min；
消化结束后，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液。加入生理盐水轻轻吹打清洗后，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；此步骤重复一次；
将子宫内膜组织剪碎成约为1mm3的小块，并加入等体积的0.2％的Ⅰ型胶原酶，37℃消化30～40min；
消化结束后，加入等体积含10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打均匀后，静置约3min，待分层，取上清液转移到新的离心管，1500r/min，离心5min，离心后弃去液体，加入含10％FBS的DMEM培养基稀释成5×105/ml的细胞悬液，并接种到培养皿中，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养；
培养48h后，镜下观察细胞生长情况，并换液；
待细胞生长融合到80％后进行传代，用P1代细胞进行流式检测、细胞克隆形成实验和细胞群体倍增时间测定。
实施例3
获得子宫内膜，加入生理盐水轻轻吹打清洗，静置至明显分层，吸弃组织下层溶液，此步骤重复一次；
组织清洗结束后，转移至50ml离心管中，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；
向组织中加入3倍体积的0.2％的胰蛋白酶溶液，37℃消化30～40min；
消化结束后，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液。加入生理盐水轻轻吹打清洗后，2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；此步骤重复一次；
将子宫内膜组织剪碎成约为1mm3的小块，并加入等体积的0.2％的Ⅰ型胶原酶，37℃消化30～40min；
消化结束后，加入等体积含10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打均匀后，静置约3min，待分层，取上清液转移到新的离心管，1500r/min，离心5min，离心后弃去液体，加入含10％FBS的DMEM培养基稀释成5×105/ml的细胞悬液，并接种到培养皿中，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养；
培养48h后，镜下观察细胞生长情况，并换液；
待细胞生长融合到80％后进行传代，用P1代细胞进行流式检测、细胞克隆形成实验和细胞群体倍增时间测定。
对比例1
获得子宫内膜，加入生理盐水轻轻吹打清洗，静置至明显分层，吸弃组织下层溶液，此步骤重复一次；组织清洗结束后，转移至50ml离心管中，
2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；
将子宫内膜组织剪碎成约为1mm3的小块，并加入等体积的0.2％的Ⅰ型胶原酶，37℃消化30min；
消化结束后，加入等体积含10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打均匀后，静置约3min，待分层，取上清液转移到新的离心管，1500r/min，离心5min，离心后弃去液体，加入含10％FBS的DMEM培养基稀释成5×105/ml的细胞悬液，并接种到培养皿中，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养；
培养48h后，镜下观察细胞生长情况，并换液；
待细胞生长融合到80％后进行传代，用P1代细胞进行流式检测、细胞克隆形成实验和细胞群体倍增时间测定。
对比例2
获得子宫内膜，加入生理盐水轻轻吹打清洗，静置至明显分层，吸弃组织下层溶液，此步骤重复一次；组织清洗结束后，转移至50ml离心管中，
2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；
将子宫内膜组织剪碎成约为1mm3的小块，并加入等体积的0.2％的Ⅰ型胶原酶与0.1％的Ⅱ型胶原酶的混合液(0.2％的Ⅰ型胶原酶与0.1％的Ⅱ型胶原酶的的体积比为1:1)，37℃消化30min；
消化结束后，加入等体积含10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打均匀后，静置约3min，待分层，取上清液转移到新的离心管，1500r/min，离心5min，离心后弃去液体，加入含10％FBS的DMEM培养基稀释成5×105/ml的细胞悬液，并接种到培养皿中，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养；
培养48h后，镜下观察细胞生长情况，并换液；
待细胞生长融合到80％后进行传代，用P1代细胞进行流式检测、细胞克隆形成实验和细胞群体倍增时间测定。
对比例3
获得子宫内膜，加入生理盐水轻轻吹打清洗，静置至明显分层，吸弃组织下层溶液，此步骤重复一次；组织清洗结束后，转移至50ml离心管中，
2000r/min，离心5min，倒去上层溶液；
将子宫内膜组织剪碎成约为1mm3的小块，并加入等体积的0.2％的胰蛋白酶溶液，40℃消化20min；
消化结束后，加入等体积含10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打均匀后，静置约3min，待分层，取上清液转移到新的离心管，1200r/min，离心7min，离心后弃去液体，加入含10％FBS的DMEM培养基稀释成5×105/ml的细胞悬液，并接种到培养皿中，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养；
培养48h后，镜下观察细胞生长情况，并换液；
待细胞生长融合到80％后进行传代，用P1代细胞进行流式检测、细胞克隆形成实验和细胞群体倍增时间测定。
实验结果
细胞照片：待P0代细胞生长融合到80％-100％后进行拍照。从图1～图3可以看出，实施例1的细胞比对比例1和对比例2的细胞形态更均一，死细胞和杂细胞更少，而对比例2的细胞又比对比例1的好。
流式检测：
取P1代细胞做流式检测，检测阳性表面标记物CD73、CD90和CD105、阴性表面标记物CD34和CD45。从表1可以看出实施例1～3的细胞比对比例1～3的细胞纯度更高，干性维持也更好，具有显著差异(P＜0.05)。而对比例2的细胞又比对比例1的好。
表1
Figure BDA0001912019920000081
注：与对照组相比，*示具有显著差异(P＜0.05)，#示具有极显著差异(P＜0.01)。
细胞克隆形成实验：
取P1代细胞做细胞克隆形成实验。细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率高反映了细胞的增殖能力强。从表2可以看出实施例1～3的细胞比对比例1～3的细胞克隆形成率更高，细胞活性和增殖能力强，具有显著差异(P＜0.05)。而对比例2的细胞又比对比例1的好。
表2
Figure BDA0001912019920000091
注：与对照组相比，*示具有显著差异(P＜0.05)，#示具有极显著差异(P＜0.01)。
细胞群体倍增时间测定：
取P1代细胞做细胞群体倍增时间测定。细胞群体倍增时间指细胞群体的细胞数量倍增的间隔时间，可反映细胞的增殖活性，倍增时间短，细胞的增殖活性好。从表3可以看出实施例1～3的细胞比对比例1～3的细胞增殖活性好，具有显著差异(P＜0.05)。而对比例2的细胞又比对比例1的好。
表3
Figure BDA0001912019920000092
注：与对照组相比，*示具有显著差异(P＜0.05)，#示具有极显著差异(P＜0.01)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种子宫内膜干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得子宫内膜清洗后与胰蛋白酶混合消化，离心，弃去上层溶液；
步骤2：取步骤1获得的组织剪碎，与Ⅰ型胶原酶混合后消化；
步骤3：终止消化，静置分层，取上清液离心后弃去液体，与培养基混合后接种至培养容器中培养；
步骤1中所述胰蛋白酶为质量百分含量为0.2%的胰蛋白酶溶液；
步骤1中所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为30~40min；步骤2中所述Ⅰ型胶原酶为质量百分含量为0.2%的Ⅰ型胶原酶溶液；
步骤2中所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为30~40min；
步骤1中所述子宫内膜与所述胰蛋白酶溶液的体积比为1:（1~3）；
步骤2中剪碎后的组织块与所述Ⅰ型胶原酶溶液的体积比为1:1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述离心为于2000r/min离心5min。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述终止消化采用含10%FBS的DMEM培养基终止消化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述离心为于1500 r/min离心5min。
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