CN111040992A - 一种子宫内膜干细胞的分离培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了干细胞培养相关技术领域的一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括干细胞原料获取、原代培养、P1代细胞培养、Pn代细胞培养等步骤，还可以包括冷冻保藏步骤；通过本发明的技术方案分离培养的子宫内膜干细胞迁移能力强；具有多向分化潜能；在体外能够快速扩增；能够从P1持续培养，尽量延长干细胞传代代数，克服传代代数少，需要从子宫内膜取材的限制。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞培养相关技术领域，特别涉及一种子宫内膜干细胞的分离培养方法。
背景技术
干细胞是一种具有自我复制与自我更新能力，并且能够多向分化的细胞。正是由于干细胞的这些特性，近年来已成为疾病治疗和组织工程领域理想的材料。
由于人类子宫内膜功能层在月经周期内受内激素的作用发生周期性的增生和脱落，研究表明，子宫内膜之所以具有如此强大的再生能力，与其中包含的干细胞密不可分。越来越多的研究也将精力投入这一领域。从体外分离培养子宫内膜干细胞，然后移植于机体内，为干细胞培养提供了一种切实可行的途径。
但是，由于子宫内膜干细胞的复杂性与稀少性，严重制约了子宫内膜干细胞的研究，并且制得的干细胞的纯度低、数量少，无法摆脱对子宫内膜原材料直接来源的限制。因而，研发一种能够从P1持续培养，尽量延长干细胞传代代数的子宫内膜干细胞的分离培养方法，是现有技术迫切需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的制得的干细胞的纯度低、数量少，无法摆脱对子宫内膜原材料直接来源的限制的技术问题，本发明提供一种子宫内膜干细胞的分离培养方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
S1)干细胞原料处理：向经血原料中加入所述经血原料体积1～2倍的PBS充分混匀，然后缓慢加入到等体积的分离液中，在2000-2500r/min下离心获得中间层，然后经过50～200目细胞滤网过滤，将得到的滤液在1000～1200r/min下离心弃上清，得细胞沉淀；
S2)原代培养：向S1)制得的所述细胞沉淀中加入生理盐水中进行重悬，得到第一单细胞悬液，将所述第一单细胞悬液按照4～5×104个/mL的浓度接种于第一原代培养基中，在37±1℃条件下体积分数为5±0.2％CO2的饱和湿度的培养箱中培养6～12h，将未贴壁细胞移入第二原代培养基后继续培养，待所述第一原代培养基或所述第二原代培养基中的细胞融合至85～90％时分别收获细胞，将得到的细胞均标记为P0代细胞；其中，4～5×104个/mL指的是4×104个/mL至5×104个/mL，具体实施例中有详细数据，其他涉及细胞计数的与此相同，不再赘述；
S3)P1代细胞培养：将S2)制得的所述P0代细胞加入生理盐水中进行重悬，得到第二单细胞悬液，然后将所述第二单细胞悬液按照4～5×104个/mL的浓度加入到传代培养基中，在37±1℃条件下，在体积分数为5±0.2％CO2的饱和湿度的培养箱中培养至细胞融合度达到85～90％，弃除未贴壁细胞收获细胞，将得到的细胞标记为P1代细胞；
S4)Pn代细胞培养：取P1代细胞接种至所述传代培养基中，并每天向所述传代培养基中加入所述传代培养基重量3～5％的增活剂，待所述P1代细胞生长达到90～95％融合时收集细胞，按照本步操作继续培养至P5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞。
进一步的，S2)中所述第一培原代养基为包括体积浓度为8～12％的FBS、2～5％的甘露醇、2～5％的SOD，以及8～16ng/mLEGF和8～16ng/mLPDGF-BB的DMEM/F12培养液。
进一步的，S2)中所述第二培原代养基为含有3～6ng/mLLIF、10～20ng/mLbFGF、10～20mg/mLTGF-α和70～90ng/mL辅酶Q10的DMEM/F12培养液。
进一步的，所述收获细胞的具体操作为用质量浓度为3～5％的胰蛋白酶消化至通过显微镜观察细胞变圆，大部分细胞脱落，然后加入所述消化终止液，离心、洗涤后再次离心，弃上清获得细胞。
进一步的，S3)中所述传代培养基向培养基为含有8～15ng/mLLIF、10～20ng/mLbFGF、10～30mg/mLTGF-β1和70～90ng/mL辅酶Q10的DMEM/F12培养液。
进一步的，所述增活剂包括按重量份计的以下组分：10～20份D-半乳糖、2～3份NGF、5～10份维生素C、5～10份HEPES、5～8份罂粟碱和8～15份氯化钠。
进一步的，在上述任一项所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，S4)之后还包括S5)冻存：用2～5℃的冻存液重悬S4)制得的所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞，使细胞的密度为1～2×107个/mL，放入冻存盒中降温后置于-196℃液氮中保存。
本发明具有如下优点：
1.通过本发明的方法制备的子宫内膜干细胞，迁移能力强；具有多向分化潜能；在体外能够快速扩增；
2.能够从P1持续培养，尽量延长干细胞传代代数，克服传代代数少，需要从子宫内膜取材的限制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的制备流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
如图1本发明的制备流程示意图所示，本法的子宫内膜干细胞的分离培养方法的具体实施例如下：
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
实施例1
S1)干细胞原料处理：向经血原料中加入所述经血原料体积1倍的PBS充分混匀，然后缓慢加入到等体积的分离液中，在2000r/min下离心获得中间层，然后经过50目细胞滤网过滤，将得到的滤液在1000r/min下离心弃上清，得细胞沉淀；
S2)原代培养：向S1)制得的细胞沉淀中加入生理盐水中进行重悬，得到第一单细胞悬液，将第一单细胞悬液按照4×104个/mL的浓度接种于第一原代培养基中，在36℃条件下体积分数为4.8％CO2的饱和湿度的培养箱中培养6h，将未贴壁细胞移入第二原代培养基后继续培养，待第一原代培养基或第二原代培养基中的细胞融合至85％时分别收获细胞，将得到的细胞均标记为P0代细胞；
其中，第一培原代养基为包括体积浓度为8％的FBS、2％的甘露醇、2％的SOD，以及8ng/mLEGF和8ng/mLPDGF-BB的DMEM/F12培养液；第二培原代养基为含有3ng/mLLIF、10ng/mLbFGF、10mg/mLTGF-α和70ng/mL辅酶Q10的DMEM/F12培养液；收获细胞的具体操作为用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化至通过显微镜观察细胞变圆，大部分细胞脱落，然后加入消化终止液，离心、洗涤后再次离心，弃上清获得细胞；以下步骤中的收获细胞与本步中的操作相同，不再赘述；
S3)P1代细胞培养：将S2)制得的P0代细胞加入生理盐水中进行重悬，得到第二单细胞悬液，然后将第二单细胞悬液按照4×104个/mL的浓度加入到传代培养基中，在36℃条件下，在体积分数为4.8％CO2的饱和湿度的培养箱中培养至细胞融合度达到85％，弃除未贴壁细胞收获细胞，将得到的细胞标记为P1代细胞；
其中，传代培养基向培养基为含有8ng/mLLIF、10ng/mLbFGF、10mg/mLTGF-β1和70ng/mL辅酶Q10的DMEM/F12培养液；
S4)Pn代细胞培养：取P1代细胞接种至传代培养基中，并每天向传代培养基中加入传代培养基重量3％的增活剂，待P1代细胞生长达到90％融合时收集细胞，重复本步操作一直培养到P5代，即得子宫内膜干细胞的传代培养细胞；
其中，增活剂包括按重量份计的以下组分：10份D-半乳糖、2份NGF、5份维生素C、5份HEPES、5份罂粟碱和8份氯化钠；
S5)冻存：用2℃的冻存液重悬S4)制得的子宫内膜干细胞的传代培养细胞，使细胞的密度为1×107个/mL，放入冻存盒中降温后置于-196℃液氮中保存。
实施例2
S1)干细胞原料处理：向经血原料中加入所述经血原料体积1.5倍的PBS充分混匀，然后缓慢加入到等体积的分离液中，在2500r/min下离心获得中间层，然后经过100目细胞滤网过滤，将得到的滤液在1100r/min下离心弃上清，得细胞沉淀；
S2)原代培养：向S1)制得的细胞沉淀中加入生理盐水中进行重悬，得到第一单细胞悬液，将第一单细胞悬液按照4.5×104个/mL的浓度接种于第一原代培养基中，在37℃条件下体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中培养9h，将未贴壁细胞移入第二原代培养基后继续培养，待第一原代培养基或第二原代培养基中的细胞融合至88％时分别收获细胞，将得到的细胞均标记为P0代细胞；
其中，第一培原代养基为包括体积浓度为10％的FBS、3％的甘露醇、4％的SOD，以及12ng/mLEGF和12ng/mLPDGF-BB的DMEM/F12培养液；第二培原代养基为含有5ng/mLLIF、15ng/mLbFGF、15mg/mLTGF-α和80ng/mL辅酶Q10的DMEM/F12培养液；收获细胞的具体操作为用质量浓度为4％的胰蛋白酶消化至通过显微镜观察细胞变圆，大部分细胞脱落，然后加入消化终止液，离心、洗涤后再次离心，弃上清获得细胞；以下步骤中的收获细胞与本步中的操作相同，不再赘述；
S3)P1代细胞培养：将S2)制得的P0代细胞加入生理盐水中进行重悬，得到第二单细胞悬液，然后将第二单细胞悬液按照4.5×104个/mL的浓度加入到传代培养基中，在37℃条件下，在体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中培养至细胞融合度达到88％，弃除未贴壁细胞收获细胞，将得到的细胞标记为P1代细胞；
其中，传代培养基向培养基为含有12ng/mLLIF、15ng/mLbFGF、20mg/mLTGF-β1和80ng/mL辅酶Q10的DMEM/F12培养液；
S4)Pn代细胞培养：取P1代细胞接种至传代培养基中，并每天向传代培养基中加入传代培养基重量4％的增活剂，待P1代细胞生长达到93％融合时收集细胞，重复本步操作一直培养到P10代，即得子宫内膜干细胞的传代培养细胞；
其中，增活剂包括按重量份计的以下组分：15份D-半乳糖、2.5份NGF、8份维生素C、8份HEPES、7份罂粟碱和12份氯化钠；
S5)冻存：用3℃的冻存液重悬S4)制得的子宫内膜干细胞的传代培养细胞，使细胞的密度为1.5×107个/mL，放入冻存盒中降温后置于-196℃液氮中保存。
实施例3
S1)干细胞原料处理：向经血原料中加入所述经血原料体积2倍的PBS充分混匀，然后缓慢加入到等体积的分离液中，在2500r/min下离心获得中间层，然后经过200目细胞滤网过滤，将得到的滤液在1200r/min下离心弃上清，得细胞沉淀；
S2)原代培养：向S1)制得的细胞沉淀中加入生理盐水中进行重悬，得到第一单细胞悬液，将第一单细胞悬液按照5×104个/mL的浓度接种于第一原代培养基中，在38℃条件下体积分数为5.2％CO2的饱和湿度的培养箱中培养12h，将未贴壁细胞移入第二原代培养基后继续培养，待第一原代培养基或第二原代培养基中的细胞融合至90％时分别收获细胞，将得到的细胞均标记为P0代细胞；
其中，第一培原代养基为包括体积浓度为12％的FBS、5％的甘露醇、5％的SOD，以及16ng/mLEGF和16ng/mLPDGF-BB的DMEM/F12培养液；第二培原代养基为含有6ng/mLLIF、20ng/mLbFGF、20mg/mLTGF-α和90ng/mL辅酶Q10的DMEM/F12培养液；收获细胞的具体操作为用质量浓度为5％的胰蛋白酶消化至通过显微镜观察细胞变圆，大部分细胞脱落，然后加入消化终止液，离心、洗涤后再次离心，弃上清获得细胞；以下步骤中的收获细胞与本步中的操作相同，不再赘述；
S3)P1代细胞培养：将S2)制得的P0代细胞加入生理盐水中进行重悬，得到第二单细胞悬液，然后将第二单细胞悬液按照5×104个/mL的浓度加入到传代培养基中，在38℃条件下，在体积分数为5.2％CO2的饱和湿度的培养箱中培养至细胞融合度达到90％，弃除未贴壁细胞收获细胞，将得到的细胞标记为P1代细胞；
其中，传代培养基向培养基为含有15ng/mLLIF、20ng/mLbFGF、30mg/mLTGF-β1和90ng/mL辅酶Q10的DMEM/F12培养液；
S4)Pn代细胞培养：取P1代细胞接种至传代培养基中，并每天向传代培养基中加入传代培养基重量5％的增活剂，待P1代细胞生长达到95％融合时收集细胞，重复本步操作一直培养到P15代，即得子宫内膜干细胞的传代培养细胞；
其中，增活剂包括按重量份计的以下组分：20份D-半乳糖、3份NGF、10份维生素C、10份HEPES、8份罂粟碱和15份氯化钠；
S5)冻存：用5℃的冻存液重悬S4)制得的子宫内膜干细胞的传代培养细胞，使细胞的密度为2×107个/mL，放入冻存盒中降温后置于-196℃液氮中保存。
取实施例3制备的子宫内膜干细胞，采用RT-PCR法检测Oct-4的表达，CD90+，CD44+，CD73+，CD105+；24h迁移率达到74.48～86.52％；具有向肌肉细胞、脂肪细胞等多向分化潜能；能在体外能够快速扩增，24h BrdU阳性细胞率86.03～90.31％。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，在没有做出创造性劳动前提下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1)干细胞原料获取：向经血原料中加入所述经血原料体积1～2倍的PBS充分混匀，然后缓慢加入到等体积的分离液中，在2000-2500r/min下离心获得中间层，然后经过50～200目细胞滤网过滤，将得到的滤液在1000～1200r/min下离心弃上清，得细胞沉淀；
S2)原代培养：向S1)制得的所述细胞沉淀中加入生理盐水中进行重悬，得到第一单细胞悬液，将所述第一单细胞悬液按照4～5×104个/mL的浓度接种于第一原代培养基中，在37±1℃条件下体积分数为5±0.2％CO2的饱和湿度的培养箱中培养6～12h，将未贴壁细胞移入第二原代培养基后继续培养，待所述第一原代培养基或所述第二原代培养基中的细胞融合至85～90％时分别收获细胞，将得到的细胞均标记为P0代细胞；
S3)P1代细胞培养：将S2)制得的所述P0代细胞加入生理盐水中进行重悬，得到第二单细胞悬液，然后将所述第二单细胞悬液按照4～5×104个/mL的浓度加入到传代培养基中，在37±1℃条件下，在体积分数为5±0.2％CO2的饱和湿度的培养箱中培养至细胞融合度达到85～90％，弃除未贴壁细胞收获细胞，将得到的细胞标记为P1代细胞；
S4)Pn代细胞培养：取P1代细胞接种至所述传代培养基中，并每天向所述传代培养基中加入所述传代培养基重量3～5％的增活剂，待所述P1代细胞生长达到90～95％融合时收集细胞，按照本步操作继续培养至P5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞。
2.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于：S2)中所述第一培原代养基为包括体积浓度为8～12％的FBS、2～5％的甘露醇、2～5％的SOD，以及8～16ng/mLEGF和8～16ng/mLPDGF-BB的DMEM/F12培养液。
3.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于：S2)中所述第二培原代养基为含有3～6ng/mLLIF、10～20ng/mLbFGF、10～20mg/mLTGF-α和70～90ng/mL辅酶Q10的DMEM/F12培养液。
4.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述收获细胞的具体操作为用质量浓度为3～5％的胰蛋白酶消化至通过显微镜观察细胞变圆，大部分细胞脱落，然后加入所述消化终止液，离心、洗涤后再次离心，弃上清获得细胞。
5.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于：S3)中所述传代培养基向培养基为含有8～15ng/mLLIF、10～20ng/mLbFGF、10～30mg/mLTGF-β1和70～90ng/mL辅酶Q10的DMEM/F12培养液。
6.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述增活剂包括按重量份计的以下组分：10～20份D-半乳糖、2～3份NGF、5～10份维生素C、5～10份HEPES、5～8份罂粟碱和8～15份氯化钠。
7.根据权利要求1～6任一项所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于：S4)之后还包括S5)冻存：用2～5℃的冻存液重悬S4)制得的所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞，使细胞的密度为1～2×107个/mL，放入冻存盒中降温后置于-196℃液氮中保存。
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