CN108728411B - 一种脂肪干细胞的分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种脂肪干细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括：静置含有组织液的脂肪组织，分层后留取上层脂肪组织，采用PBS溶液洗涤脂肪组织；采用含有I型胶原酶、III型胶原酶的溶液对洗涤后的脂肪组织进行消化；消化结束后，加入FBS摇匀，离心，弃上清液，得到脂肪干细胞；将脂肪干细胞接种至含有FBS的高糖DMEM培养基进行细胞培养；培养40～50h后，更换含有EGF、bFGF、FBS的DMEM培养基继续培养。本发明采用I型胶原酶和III型胶原酶对脂肪组织进行消化，在维持细胞活力的同时，可充分消化脂肪组织，使脂肪干细胞游离出来，得到的脂肪干细胞数量多，且活力强。

Description

一种脂肪干细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种脂肪干细胞的分离培养方法。
背景技术
脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。传统的脂肪移植手段由于存在免疫排斥、炎症反应等缺陷难以得到让人满意的疗效。据统计，自体脂肪组织移植到缺损部位后，通常其中40％～60％会被吸收。通过患者自身的脂肪组织内的干细胞，来构建具有完整生物学结构和功能工程脂肪组织无疑将是解决这一难题的最佳方案。如何实现从干细胞到脂肪细胞的分化，是构建工程脂肪组织不可回避的问题。早在2001年，Zuk等人发现脂肪干细胞以来，就已经证明脂肪干细胞具有向脂肪、软骨、成骨、成肌等多向分化潜能。
研究发现脂肪干细胞可恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。近年来的研究证实，干细胞广泛存在于体内各组织，脂肪干细胞以其来源广泛、获取简单、适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，一直以来是整形修复科、组织工程和再生医学等相关学科的研究重点。
目前，常用的脂肪干细胞的分离培养方法为：将吸脂来源的脂肪组织用D-Hanks冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，把脂肪组织放入离心管中，记录原始体积。向组织中加入等体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，放入37℃气浴振荡器中消化30min。当消化完成后，弃掉上层未消化的脂肪组织，将下层的细胞悬液以1500r/min(375g)，离心10min后弃上清，得到离心管底部的脂肪干细胞团，将其重悬，密度调整到1×105mL-1，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中。当干细胞长满培养瓶后按一传二进行传代。但该法得到的脂肪干细胞总数量少，细胞活率低。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种脂肪干细胞的分离培养方法。该方法得到的脂肪干细胞数量多，且活力强。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脂肪干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
静置含有组织液的脂肪组织，分层后留取上层脂肪组织，采用PBS溶液洗涤脂肪组织；
采用含有I型胶原酶、III型胶原酶的溶液对洗涤后的脂肪组织进行消化；消化结束后，加入FBS摇匀，离心，弃上清液，得到脂肪干细胞；
将脂肪干细胞接种至含有FBS的高糖DMEM培养基进行细胞培养；培养40～50h后，更换含有EGF、bFGF、FBS的DMEM培养基继续培养。
作为优选，I型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～0.1％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.01％～0.05％。
优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.07％～0.09％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.01％～0.03％。
更优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.08％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.02％。
作为优选，I型胶原酶与III型胶原酶的质量比为9:1～7:3。
更优选地，I型胶原酶与III型胶原酶的质量比为4:1。
作为优选，含有I型胶原酶、III型胶原酶的溶液与洗涤后的脂肪组织的体积比为(1～2)：1。
优选地，含有I型胶原酶、III型胶原酶的溶液与洗涤后的脂肪组织的体积比为1：1。
作为优选，消化的温度为36～38℃，消化的转速为180～220r/min，消化的时间为45～55min。
优选地，消化的温度为37℃，消化的转速为200r/min，消化的时间为50min。
作为优选，离心的转速为1400～1600rpm/min，离心的时间为4～6min。
优选地，离心的转速为1500rpm/min，离心的时间为5min。
作为优选，接种的浓度为3×104～8×104个/cm2。
优选地，接种的浓度为5×104个/cm2。
作为优选，细胞培养的条件为：5％CO2、37℃、饱和湿度95％。
在本发明提供的具体实施例中，细胞培养的时间为48h。
作为优选，含有EGF、bFGF、FBS的DMEM培养基为含有8～12ng/mL EGF、8～12ng/mLbFGF、8％～12％FBS的DMEM培养基。
优选地，含有EGF、bFGF、FBS的DMEM培养基为含有10ng/mL EGF、10ng/mL bFGF、10％FBS的DMEM培养基。
本发明提供了一种脂肪干细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括如下步骤：静置含有组织液的脂肪组织，分层后留取上层脂肪组织，采用PBS溶液洗涤脂肪组织；采用含有I型胶原酶、III型胶原酶的溶液对洗涤后的脂肪组织进行消化；消化结束后，加入FBS摇匀，离心，弃上清液，得到脂肪干细胞；将脂肪干细胞接种至含有FBS的高糖DMEM培养基进行细胞培养；培养40～50h后，更换含有EGF、bFGF、FBS的DMEM培养基继续培养。本发明具有的技术效果为：
本发明采用I型胶原酶和III型胶原酶对脂肪组织进行消化，在维持细胞活力的同时，可充分消化脂肪组织，使脂肪干细胞游离出来，得到的脂肪干细胞数量多，且活力强。
具体实施方式
本发明公开了一种脂肪干细胞的分离培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
PBS：磷酸缓冲盐溶液；
FBS：胎牛血清；
EGF：表皮细胞生长因子；
bFGF：碱性成纤维细胞生长因子。
本发明提供的脂肪干细胞的分离培养方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本实施例脂肪干细胞的分离培养方法如下：
1、静置含有组织液的脂肪组织，待脂肪组织与液体自然分层后10mL移液管吸弃下方液体；用50mL注射器吸取等体积的PBS加入到脂肪组织中，盖上瓶盖后反复摇晃脂肪组织，静置5min；用25mL移液管吸弃脂肪组织下方溶液(重复一次)。
2、一次性移液管将脂肪组织均移至50mL离心管中；加入等体积I型胶原酶和III型胶原酶混合液(质量百分数浓度分别为0.08％、0.02％)，封口后上下颠倒瓶子摇晃，充分混匀。转移至37℃恒温气浴摇床中，200R消化50min。
3、每管加入1mL FBS，盖上瓶盖后封口摇匀，1500rpm/min，离心5min；离心后弃上清液。
4、按照脂肪体积：10％FBS的DMEM＝1:1的比例，用含有10％FBS的DMEM重悬ADSCs沉淀，吹打均匀后形成细胞悬液；将悬液接种至含有10％FBS的高糖DMEM培养基中。
5、把接种后的ADSCs转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养。
6、培养48h后，吸弃皿内培养基，加入10mL/皿PBS清洗(重复2次)。添加10％FBS的DMEM、10ng/mL EGF、10ng/mL bFGF，转移细胞培养箱中继续培养。
实施例2
本实施例脂肪干细胞的分离培养方法如下：
1、静置含有组织液的脂肪组织，待脂肪组织与液体自然分层后10mL移液管吸弃下方液体；用50mL注射器吸取等体积的PBS加入到脂肪组织中，盖上瓶盖后反复摇晃脂肪组织，静置5min；用25mL移液管吸弃脂肪组织下方溶液(重复一次)。
2、一次性移液管将脂肪组织均移至50mL离心管中；加入等体积I型胶原酶和III型胶原酶混合液(质量百分数浓度分别为0.09％、0.01％)，封口后上下颠倒瓶子摇晃，充分混匀。转移至37℃恒温气浴摇床中，100R消化30min。
3、每管加入1mL FBS，盖上瓶盖后封口摇匀，1000rpm/min，离心3min；离心后弃上清液。
4、按照脂肪体积：10％FBS的DMEM＝1:1的比例，用含有10％FBS的DMEM重悬ADSCs沉淀，吹打均匀后形成细胞悬液；将悬液接种至含有10％FBS的高糖DMEM培养基中。
5、把接种后的ADSCs转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养。
6、培养24h后，吸弃皿内培养基，加入10mL/皿PBS清洗(重复2次)。添加10％FBS的DMEM、10ng/mL EGF、10ng/mL bFGF，转移细胞培养箱中继续培养。
实施例3
本实施例脂肪干细胞的分离培养方法如下：
1、静置含有组织液的脂肪组织，待脂肪组织与液体自然分层后10mL移液管吸弃下方液体；用50mL注射器吸取等体积的PBS加入到脂肪组织中，盖上瓶盖后反复摇晃脂肪组织，静置5min；用25mL移液管吸弃脂肪组织下方溶液(重复一次)。
2、一次性移液管将脂肪组织均移至50mL离心管中；加入等体积I型胶原酶和III型胶原酶混合液(质量百分数浓度分别为0.07％、0.03％)，封口后上下颠倒瓶子摇晃，充分混匀。转移至37℃恒温气浴摇床中，250R消化60min。
3、每管加入1mL FBS，盖上瓶盖后封口摇匀，1500rpm/min，离心10min；离心后弃上清液。
4、按照脂肪体积：10％FBS的DMEM＝1:1的比例，用含有10％FBS的DMEM重悬ADSCs沉淀，吹打均匀后形成细胞悬液；将悬液接种至含有10％FBS的高糖DMEM培养基中。
5、把接种后的ADSCs转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养。
6、培养72h后，吸弃皿内培养基，加入10mL/皿PBS清洗(重复2次)。添加10％FBS的DMEM、10ng/mL EGF、10ng/mL bFGF，转移细胞培养箱中继续培养。
对比例1
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.1％的Ⅰ型胶原酶替代实施例1中I型胶原酶和III型胶原酶的混合液。
对比例2
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.08％Ⅰ型胶原酶+0.02％IV型胶原酶替代实施例1中I型胶原酶和III型胶原酶的混合液。
对比例3
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.1％的Ⅰ型胶原酶+0.02％胰蛋白酶替代实施例1中I型胶原酶和III型胶原酶的混合液。
对比例4
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.1％的胰蛋白酶替代实施例1中I型胶原酶和III型胶原酶的混合液。
对比例5
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.1％的Ⅰ型胶原酶+0.001％DNA酶替代实施例1中I型胶原酶和III型胶原酶的混合液。
对比例6
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.03％K脂酶+0.08％I型胶原酶+0.05％IV型胶原酶替代实施例1中I型胶原酶和III型胶原酶的混合液。
对比例7
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.04％I型胶原酶+0.04％IV型胶原酶+0.02％accutase替代实施例1中I型胶原酶和III型胶原酶的混合液。
对比例8
除消化酶的浓度配比外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.1％III型胶原酶。
对比例9
除消化酶的浓度配比外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.05％I型胶原酶+0.05％III型胶原酶。
试验例1细胞活率检测
消化等重的脂肪组织10mL，接种1天后进行台盼蓝染色，检测实施例1-3和对比例1-9的活细胞数量、总细胞数量，每组试验重复3次，取平均值，计算细胞活率，计算公式为：
细胞活率＝(活细胞数量/总细胞数量)×100％。
结果如下表所示：
表1细胞活率检测结果
Figure BDA0001708600940000071
Figure BDA0001708600940000081
根据实施例和对比例各组所提取出来细胞数量及活力来看，实施例1-3的活细胞数量及细胞活率显著高于对比例1-9。虽然对比例1、对比例7、对比例9的细胞活率也较高，但其活细胞数量及总细胞数量均较低。
试验例2脂肪干细胞形态对比
将实施例1分离得到的脂肪干细胞原代细胞培养至第3天，在显微镜下放大至100倍时观察细胞形态。
从显微视图中可见，脂肪干细胞为梭型形态，鲜少见到分枝状细胞，符合脂肪干细胞的形态特征。
试验例3脂肪干细胞成脂诱导实验
将实施例1获得的脂肪干细胞进行成脂诱导实验。试验结果显示，混合酶所获取的脂肪干细胞，在成脂分化诱导实验中，呈现良好的分化能力。在成脂诱导实验中，经油红染色后，可见干细胞分化形成的脂肪细胞含有明显的脂滴，说明该酶解方案所获取的脂肪干细胞仍维持着良好的干性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
静置含有组织液的脂肪组织，分层后留取上层脂肪组织，采用PBS溶液洗涤脂肪组织；
采用含有I型胶原酶、III型胶原酶的溶液对洗涤后的脂肪组织进行消化；消化结束后，加入FBS摇匀，离心，弃上清液，得到脂肪干细胞；
将脂肪干细胞接种至含有FBS的高糖DMEM培养基进行细胞培养；培养40～50h后，更换含有EGF、bFGF、FBS的DMEM培养基继续培养；
所述I型胶原酶的质量百分浓度为0.08％，所述III型胶原酶的质量百分浓度为0.02％；
所述含有I型胶原酶、III型胶原酶的溶液与洗涤后的脂肪组织的体积比为1：1。
2.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述消化的温度为36～38℃，消化的转速为180～220r/min，消化的时间为45～55min。
3.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述离心的转速为1400～1600rpm，离心的时间为4～6min。
4.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述接种的浓度为3×104～8×104个/cm2。
5.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养的条件为：5％CO2、37℃、饱和湿度95％。
6.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述含有EGF、bFGF、FBS的DMEM培养基为含有8～12ng/mL EGF、8～12ng/mL bFGF、8％～12％FBS的DMEM培养基。
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GR01 Patent grant
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