CN102041243A

CN102041243A - 一种快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102041243A
Application number: CN 201010569165
Authority: CN
Inventors: 杨仕明; 秦贺; 赵立东; 翟所强; 郭维维; 孙建和; 杨伟炎
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2010-11-26
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2011-05-04

Abstract

本发明提供了一种快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒及方法。该试剂盒包括洗涤液，细胞培养液A，细胞培养液B，细胞消化液，其中洗涤液为磷酸盐缓冲液；细胞培养液A为α-MEM液体培养基；细胞培养液B为胎牛血清；细胞消化液A为质量/体积百分比浓度为0.25％的胰蛋白酶液。与传统分离培养方法相比，采用此试剂盒，利用骨髓冲出细胞，培养液贴壁培养24小时后半量换液方式进行培养和纯化，得到的细胞纯度高，增殖更快，一般7天即可完成原代细胞培养。将原代细胞传代，利用培养液进行培养，一般2-3天细胞密度即可达到90％，为利用骨髓间充质干细胞进行进一步实验研究提供了丰富的来源。

Description

一种快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于组织工程领域，具体地，涉及一种快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒、该试剂盒的应用以及一种快速分离骨髓间充质干细胞的方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞等多种组织细胞，在临床上应用于组织工程、基因治疗、细胞因子替代治疗等领域。然而，骨髓间充质干细胞仅占骨髓内成核细胞总数的0.001％～0.01％，并且随着年龄的增长而减少。应用骨髓间充质干细胞进行进一步实验的前提条件是快速实现骨髓间充质干细胞的扩增分离。

目前，对骨髓间充质干细胞的分离培养、扩增还没有统一的标准。现阶段用于骨髓间充质干细胞的分离培养方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞术法和免疫磁珠法。密度梯度离心法主要根据细胞不同密度来分离细胞群落。流式细胞术法和免疫磁珠法利用骨髓间充质干细胞对一定数目抗体的反应性从而通过表达抗体的阳性选择来获得。贴壁筛选法是最早也是最简单的分离方法，但存在纯度低、培养时间长等缺点。以前的研究对贴壁筛选法进行了深入的探讨，其中包括采用不同的培养液，选择不同的换液方式等。然而现有的实验仍然存在一定的不足，例如培养液的配制过于复杂、原代培养时间仍然过长、细胞的纯度不高等。

发明内容

为了解决骨髓间充质干细胞分离的纯度、数量和时间问题，本发明提供了一种快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒。利用此试剂盒，能有效纯化哺乳动物骨髓间充质干细胞，快速获得大量骨髓间充质干细胞，以利于进行下一步的实验研究。

根据本发明的一个方面，本发明的快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒包括洗涤液，细胞培养液A，细胞培养液B和细胞消化液，其中：

所述洗涤液为磷酸盐缓冲液溶液；

所述细胞培养液A为α-MEM液体培养基；

所述细胞培养液B为胎牛血清；

所述细胞消化液为胰蛋白酶液。

根据本发明的一个方面，所述骨髓间充质干细胞源自哺乳动物。

根据本发明的一个方面，所述洗涤液、培养液A、培养液B以及细胞消化液是无菌的。

根据本发明的一个方面，所述洗涤液、培养液A、培养液B以及细胞消化液为独立包装。

根据本发明的一个方面，用于骨髓间充质干细胞的培养的细胞培养液是将细胞培养液A与细胞培养液B按照9∶1体积比配制的细胞培养混合液。

根据本发明的一个方面，所述磷酸盐缓冲液可为0.01M，所述细胞消化液可为质量/体积百分比浓度为0.25％。

本发明的另一目的在于提供了一种快速分离骨髓间充质干细胞的方法。该方法用洗涤液冲洗骨髓腔得到细胞，经原代培养，传代培养最终获得分离的骨髓间充质干细胞。

根据本发明的一个方面，所述快速分离骨髓间充质干细胞的方法可通过下述步骤实现的：将得到的细胞在细胞培养混合液中贴壁培养，培养24小时后半量更换细胞培养混合液，培养获得原代培养的骨髓间充质干细胞；利用洗涤液冲洗获得的骨髓间充质干细胞，随后用细胞消化液对其进行消化，经细胞混合液传代培养至细胞密度达到90％；以及再次利用细胞消化液对经传代培养的骨髓间充质干细胞进行消化，获得分离的骨髓间充质干细胞。

本发明的方法采用培养24小时首次半量换液方法，利用存在于原培养液中造血干细胞的旁分泌作用，既部分地清除了大量未贴壁的造血系细胞，又保证了骨髓中其他细胞分泌的细胞因子对骨髓间充质干细胞的滋养作用，从而确保了细胞培养和传代过程中的生长和纯化效果。

根据本发明的一个方面，所述快速分离骨髓间充质干细胞的方法可包括：

1、骨髓间充质干细胞的原代分离培养：

利用洗涤液将细胞从骨髓腔内冲出，收集、离心、弃去上悬液，用细胞培养混合液充分吹打成单细胞悬液，接种培养。接种24小时后，半量换液，继续培养，以后每3天更换一次细胞培养混合液。7天即可完成原代培养。

2、骨髓间充质干细胞的传代培养：

弃除原代培养的培养混合液，用洗涤液充分清洗细胞，去除悬浮在贴壁细胞表面的圆形细胞，加入细胞消化液，待细胞回缩、细胞间隙增大时，加入细胞培养混合液，充分吹打、离心、弃上清液、加入细胞培养混合液、接种、培养。

3、骨髓间充质干细胞的收获：

细胞密度达到90％，弃去原培养液，加入细胞消化液进行消化，收获培养的骨髓内的间充质干细胞。

附图说明

图1是原代骨髓间充质干细胞培养7天后的细胞观察图；

图2是原代骨髓间充质干细胞传代培养后的细胞形态观察图；和

图3是大鼠骨髓间充质干细胞反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)产物的电泳结果：M：DNA分子量标准(DL-2000Marker)；1：空白对照；2：β-actin；3：SH2；4：CD44；5：CD34；6：CD31。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但是并不以此来限制本发明。

实施例1、用于分离骨髓间充质干细胞的试剂盒的配制

1、洗涤液：取7.9g NaCl、0.2g KCl、0.24g KH₂PO₄、1.8g K₂HPO₄，以去离子水定容至1000ml，高压灭菌制得0.01M磷酸盐缓冲液，调节pH至7.2～7.4，放置在4℃冰箱内备用。

2、细胞培养液：将α-MEM液体培养基和无菌胎牛血清培养液按照9∶1的体积比混合配制细胞培养中所用细胞培养混合液。

3、细胞消化液：配制质量/体积百分比浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液。

实施例2、用于分离骨髓间充质干细胞的试剂盒的分装

试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量：洗涤液1瓶(100ml/瓶)，细胞培养液A 1瓶(90ml/瓶)，细胞培养液B 1瓶(10ml/瓶)，细胞消化液1瓶(100ml/瓶)。按上述剂量对试剂盒中各组分进行独立包装，得到快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒。

实施例3、骨髓间充质干细胞的快速分离

(一)、骨髓间充质干细胞的分离及原代培养

取4周龄清洁级SD大鼠1只，颈椎脱臼处死，无菌条件下分离大鼠股骨及胫骨，从股骨干和胫骨干两端剪断，用洗涤液反复冲洗骨髓腔，冲洗液经200目不锈钢标准筛过滤掉大的团块后充分吹打混匀获取细胞悬液。收集细胞悬液并将其转入15ml离心管中1200r/min，离心5min。弃上清液，加入细胞培养液3ml重悬，接种于25cm²的培养瓶中，置于37℃、体积分数为0.05的CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。于接种第24小时半量换液。置于倒置显微镜下观察培养细胞形态和活性情况，以后对各组每3天全量换液1次。原代培养7天即可观察到培养的贴壁细胞达到融合状态。

在细胞培养液中原代培养24小时，可见细胞分布不均匀，在培养瓶底呈分片聚集，形态不规则，并有大量圆形细胞悬浮存在。细胞首次半量换液后每3天全量换液1次，7天后观察，细胞集落多，细胞规则，呈长梭形、椭圆形，折光性强，细胞间相互融合，基本铺满瓶底(如图1所示)。

(二)、骨髓间充质干细胞的传代培养

SD大鼠骨髓间充质干细胞原代培养7天后，弃除原代培养瓶的细胞培养液，用洗涤液充分清洗细胞，去除悬浮在贴壁细胞表面的圆形细胞，加入细胞消化液，倒置显微镜下观察，待细胞回缩、细胞间隙增大时，加入细胞培养液，充分吹打培养瓶壁细胞，将细胞悬液以1200r/min速度离心5分钟，弃去上清液，加入细胞培养液，按1∶3比例接种于新的25cm²的培养瓶中，放置在37℃的二氧化碳孵箱内培养。如图2所示，倒置显微镜下观察到细胞呈梭形，生长良好，一般2-3天细胞密度即可达到90％。

实施例4、大鼠骨髓间充质干细胞进行表面分子检测和诱导分化

对利用此试剂盒获得的大鼠骨髓间充质干细胞进行表面分子检测，发现此细胞具有下列特征：RT-PCR结果显示细胞阳性表达SH2、CD44、CD31，不表达CD34(图3)；加入脂肪细胞诱导培养液，体外诱导8天后，利用脂肪细胞鉴定液对脂肪细胞进行鉴定，可诱导分化成脂肪细胞；加入成骨细胞诱导培养液，体外诱导4周后，利用成骨细胞鉴定液进行鉴定，可诱导分化成骨细胞。

Claims

1.一种分离骨髓间充质干细胞的试剂盒，包括：

洗涤液，其为磷酸盐缓冲液；

培养液A，其为α-MEM液体培养基；

培养液B，其为胎牛血清，以及

细胞消化液，其为胰蛋白酶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液、培养液A、培养液B以及细胞消化液是无菌的。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液、培养液A、培养液B以及细胞消化液是独立包装。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞源自哺乳动物。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述培养液B的技术指标如下：渗透压(240～340mOsmol/kg)、pH(7.0～7.5)、总蛋白含量(3～3.5/100ml)、血红蛋白(≤20mg/100ml)。

6.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述培养液A与培养液B以9∶1的体积比来提供。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为0.01M，所述细胞消化液为质量/体积百分比浓度0.25％的胰蛋白酶液。

8.一种分离骨髓间充质干细胞的方法，包括：

(1)利用洗涤液冲洗骨髓腔得到细胞，经细胞培养混合液培养获得原代培养的骨髓间充质干细胞；

(2)利用洗涤液冲洗步骤1)获得的骨髓间充质干细胞，随后用细胞消化液消化，经传代培养获得传代培养的骨髓间充质干细胞；和

(3)利用细胞消化液对步骤2)获得的传代培养的骨髓间充质干细胞进行消化，获得分离的骨髓间充质干细胞，

其中洗涤液为磷酸盐缓冲液；

细胞培养混合液为按照9∶1体积比来配制的培养液A与培养液B，其中培养液A为α-MEM液体培养基，培养液B为胎牛血清；以及

细胞消化液胰蛋白酶液。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤(1)中，采用24小时半量更换细胞培养混合液。

10.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤(2)中，传代培养使细胞密度达到90％。