CN108823154A - 一种脂肪干细胞的无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂肪干细胞的无血清培养基及其制备方法。本发明所述脂肪干细胞的无血清培养基由低糖DMEM基础培养基和添加成份组成。采用该无血清培养基体外培养时，减少了添加血清带来的相关风险，消除血清潜在的免疫原性以及病毒微生物污染，脂肪干细胞大量快速增长，生长稳定，纯度高，且该无血清培养基的制备方法简单，保留了培养基中各组分的有效活性。

Description

一种脂肪干细胞的无血清培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种脂肪干细胞的无血清培养基及其制备方法。
背景技术
多年以来，人们为提高组织器官移植技术做出了巨大的努力和尝试，但仍然面临一个主要的难题：即组织和器官的短缺。目前临床上修复组织或器官的常用方法大致有三种，即：应用人工替代品植入、自体组织移植、异体组织移植。但是人工合成材料易产生异物排斥反应，而自体移植又可能引起供区的继发畸形。临床上最常采用的自体脂肪组织移植也面临着移植物再吸收、纤维组织替代的问题。自体脂肪移植通常面临移植物体积减少的现象，究其原因，游离移植后数以万计或十万计的脂肪细胞团块无法从受区获得足够的营养供应，因此导致移植后的脂肪细胞大量坏死。即使剩余得以存活的脂肪细胞也丧失继续增殖的能力，极易退化，移植后数月内逐渐被成纤维细胞所代替，逐渐失去了脂肪细胞的特性。因此，脂肪移植成功的关键是：如何能有效地保证游离移植物的血供、保持其旺盛的增殖状态以及维持其细胞特性。
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。人体脂肪中含有大量干细胞，是最容易获得的干细胞来源之一。脂肪干细胞在脂肪组织的生长发育中扮演者至关重要的角色，脂肪干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它取材容易，少量组织即可获取大量干细胞，具有适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植。
发明内容
根据本发明的一个方面，本发明所要解决的技术问题是提供一种脂肪干细胞的无血清培养基，采用该无血清培养基体外培养时，脂肪干细胞大量快速增长，且生长稳定，纯度高，且该无血清培养基的制备方法简单，保留了培养基中各组分的有效活性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种脂肪干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM基础培养基和添加成份组成。
作为本发明优选的技术方案之一，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白5～10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白0.1～5mg/mL；
维生素C 35～80ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5～5mmol/mL；
细胞生长因子1～20ng/mL；
重组LIF 1～20ng/mL；
氨基葡萄糖5～15μM；
2-巯基乙醇25～120μM；
青链霉素双抗溶液2～15μM。
在上述添加成分中：
玻璃粘连蛋白由478个氨基酸配列组成，是存在于血清和细胞外基质的糖蛋白。它与纤连蛋白、层连蛋白统称为细胞粘附蛋白。玻璃粘连蛋白除具有细胞粘附作用和伸展作用，还是与补体系统、凝血系统相关的多功能蛋白质。
维生素C是大部分生物的必需营养，是一种抗氧化剂，保护细胞组织免于自由基的威胁。
L-谷氨酰胺在细胞培养时起到很重要的作用，脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢，而缺少谷氨酰胺则会导致细胞生长不良而死亡。
2-巯基乙醇是一种有机化合物，其化学式为HOCH2CH2SH，它兼具乙二醇(HOCH2CH2OH)和乙二硫醇(HSCH2CH2SH)的官能团，通常用于二硫键的还原，保护二硫键，从而使蛋白质不被氧化掉而失活。
青链霉素双抗溶液用于抑制细菌增长，为干细胞提供无菌的生长环境。
优选地，所述表皮生长因子包括bFGF和/或EGF。
其中，表皮细胞生长因子EGF是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。
作为本发明特别优选的技术方案之一，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白5～10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白0.1～5mg/mL；
维生素C 35～80ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5～5mmol/mL；
表皮细胞生长因子1～20ng/mL；
重组LIF 1～20ng/mL；
氨基葡萄糖5～15μM；
2-巯基乙醇25～120μM；
青链霉素双抗溶液2～15μM；
蛋白水解物100～250mg/L。
所述蛋白水解物通过以下制备工艺得到：称取蛋白粉置于反应器中，加入去离子水，配置得到质量分数10～20％的蛋白粉溶液，调节蛋白粉溶液的pH至7～8；按照蛋白粉重量的1～3％加入蛋白酶，混合均匀，调节至蛋白酶的最适pH，置于超高压生物反应器中，在压力100～150MPa、温度40～50℃的条件下酶解4～24小时；将酶解反应液在沸水浴中放置10～15分钟，随后立即冷却至20～30℃，离心分离，收集上清液；将上清液过滤，收集滤液，得到蛋白水解液；将蛋白水解液真空冷冻干燥，得到所述蛋白水解物。
蛋白水解物是细胞生长所需氨基酸的主要来源。根据氨基酸序列的不同，其在生物体内或者体外具有免疫、抑制细菌和病毒、抗癌、抗氧化和清除自由基、改善元素吸收等作用。蛋白水解物中活性成分通过酶水解的方法进行水和并得到多种具有生理活性复合肽片段，为细胞提供营养物质，从而促进细胞增殖。
所述蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶中的一种或多种。优选地，所述蛋白酶为胰酶。
在发明人研究的过程中，采用以下方法制备蛋白水解物：称取蛋白粉置于反应器中，加入去离子水，配置得到质量分数15％的蛋白粉溶液，然后使用质量分数1％的氢氧化钠水溶液调节至蛋白酶的最适pH；按照蛋白粉重量的1％加入蛋白酶，混合均匀，使用质量分数1％的盐酸调节pH至7.5，置于超高压生物反应器中，在压力100MPa、温度45℃的条件下酶解12小时；将酶解反应液在沸水浴中放置10分钟，随后立即冷却至22℃，以4000转/分钟离心30分钟，收集上清液；将上清液采用200目滤布过滤，收集滤液，得到蛋白水解液；将蛋白水解液真空冷冻干燥，得到所述蛋白水解物。分别使用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶作为蛋白酶，其最适合pH分别为8.0、7.0、7.0、8.0、2.0、7.5。然后对蛋白水解物中游离氨基酸的含量进行测定：取蛋白水解物100mg溶解至100mL纯化水中，用5％的三氯乙酸溶液将原液浓度稀释2倍后，以8000转/分钟离心15分钟，采用全自动氨基酸分析仪检测上清液中的游离氨基酸含量。结果发现，碱性蛋白酶水解得到蛋白水解物中游离氨基酸的含量为21.4％，木瓜蛋白酶水解得到蛋白水解物中游离氨基酸的含量为12.1％，中性蛋白酶水解得到蛋白水解物中游离氨基酸的含量为5.8％，胰蛋白酶水解得到蛋白水解物中游离氨基酸的含量为8.9％，胃蛋白酶水解得到蛋白水解物中游离氨基酸的含量为5.4％，胰酶水解得到蛋白水解物中游离氨基酸的含量为43.0％。
作为本发明特别优选的技术方案之二，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白5～10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白0.1～5mg/mL；
维生素C 35～80ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5～5mmol/mL；
表皮细胞生长因子1～20ng/mL；
重组LIF 1～20ng/mL；
氨基葡萄糖5～15μM；
2-巯基乙醇25～120μM；
青链霉素双抗溶液2～15μM；
蛋白水解物100～250mg/L；
反式脂肪酸20～40μM。
作为本发明特别优选的技术方案之三，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白5～10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白0.1～5mg/mL；
维生素C 35～80ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5～5mmol/mL；
表皮细胞生长因子1～20ng/mL；
重组LIF 1～20ng/mL；
氨基葡萄糖5～15μM；
2-巯基乙醇25～120μM；
青链霉素双抗溶液2～15μM；
蛋白水解物100～250mg/L；
反式脂肪酸20～40μM；
虫草素1～20ng/mL。
优选地，所述反式脂肪酸为反油酸和反异油酸中的一种或两者的混合物。更优选地，所述反式脂肪酸由反油酸和反异油酸按照摩尔比1:1组成。
本发明的脂肪干细胞的无血清培养基的有益效果在于：青链霉素双抗溶液抑制了培养基内的细菌增长，为脂肪干细胞提供无菌的生长环境；维生素C和2-巯基乙醇构建了一个良好的脂肪干细胞分裂环境，防止脂肪干细胞在生长的过程中干细胞的组分被氧化而失掉活性；表皮细胞生长因子促进了的脂肪干细胞分裂生长，胎球蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺及葡萄糖为脂肪干细胞的生长提供足够的能量，使新生的细胞具有活性；采用本发明的无血清培养基体外培养脂肪干细胞，脂肪干细胞可快速增长，且生长稳定，纯度高。
根据本发明的另一方面，本发明所要解决的技术问题是提供一种脂肪干细胞的无血清培养基的制备方法：在无菌环境下，取低糖DMEM基础培养基，加入血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白、玻璃粘连蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺、表皮细胞生长因子、重组LIF、氨基葡萄糖、2-巯基乙醇以及青链霉素双抗溶液(蛋白水解物、反式脂肪酸、虫草素，有则添加，无则不添加)，吹打混匀，过滤除菌，即获得脂肪干细胞的无血清培养基。
采用该无血清培养基体外培养时，减少了添加血清带来的相关风险，消除血清潜在的免疫原性以及病毒微生物污染，脂肪干细胞大量快速增长，生长稳定，纯度高，且该无血清培养基的制备方法简单，保留了培养基中各组分的有效活性。
附图说明
附图为不同脂肪干细胞培养基培养的脂肪干细胞的形态图。
图1为本发明实施例1无血清的脂肪间干细胞培养基培养的脂肪干细胞的形态图；图1左为培养3天的脂肪干细胞形态图，图1右为添加了溴化丙锭的显色细胞形态图。
图2为对比含血清干细胞培养基培养的脂肪干细胞的形态图。图2左为培养3天的脂肪干细胞形态图，图2右为添加了溴化丙锭的显色细胞形态图。
具体实施方式
实施例中原料介绍如下：
低糖DMEM基础培养基，购于上海慧颖生物科技有限公司，货号：31600034，成分为：含有1000mg/L D-葡萄糖，584mg/L L-谷氨酸，110mg/L丙酮酸钠。
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白，购于上海源培生物科技有限公司提供，货号：S450。
玻璃粘连蛋白，购于广州波柏贸易有限公司，货号：220-02401，由20-398氨基酸片段构成。保存温度-80℃。
维生素C，CAS号：50-81-7。
L-谷氨酰胺，CAS号：56-85-9。
表皮细胞生长因子EGF，购于赛叶生物科技有限公司。
重组LIF(也称为白血病抑制因子)，购于上海研卉生物科技有限公司，货号：300-05。
氨基葡萄糖，购于郑州亿之源化工产品有限公司，型号467857954794。
2-巯基乙醇，CAS号：60-24-2。
青链霉素双抗溶液，购于友康恒业生物科技(北京)有限公司，型号RS0008，其中青霉素的含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL。
蛋白粉，具体采用牛乳酪蛋白粉，购于江苏鑫和源生物科技有限公司。
胰酶，购于远成赛创科技有限公司，CAS号：8049-47-6，食品级，酶活力4000U/g。
反油酸，CAS：112-79-8。
反异油酸，CAS：693-72-1。
虫草素，CAS：73-03-0。
RPMI1640培养基，购于GIBCO公司。
胎牛血清，购于美国Hyclone公司。
成脂诱导分化培养基，购于赛业生物科技有限公司，货号为：HUXMD-90031。
成骨诱导分化培养基，购于深圳伟通生物科技有限公司，货号为：CP1204。
其他工作液的配制方法如下：
D-Hans平衡液：称取NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O 0.06g，KCl 0.4g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g、酚红0.02g，加蒸馏水定容至1L，充分溶解后用NaHCO3调节pH至7.2，采用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌，高压灭菌，4℃保存。
磷酸盐缓冲液(PBS溶液)：称取NaCL 8g，Na2HPO4·10H2O 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g，加蒸馏水定容至1L，高压灭菌。
浓度0.1％的Ⅰ型胶原酶：称取100mg的Ⅰ型胶原酶，溶解于100mL的D-Hans平衡液中，室温搅拌溶解1小时，采用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌，高压灭菌。
0.25％胰酶-EDTA：称取0.125g的胰蛋白酶，0.22g的EDTA-2Na，溶解于50mL的磷酸盐溶液中，室温搅拌溶解1小时，采用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
油红O染液的配置：油红O粉0.5g，异丙醇100mL，将油红O和异丙醇倒入烧杯内，于37℃水浴中加热溶解，待充分溶解，冷却后过滤，配成0.5％的油红O储备液，用小口塞密封保存备用。使用时配置油红O储备液3mL，加入蒸馏水2mL，混合后静置10分钟，即可染色，染色时间20～30分钟。
5mg/mL的MTT溶液：称取250mgMIT溶入50mL磷酸盐缓冲液中，充分搅拌溶解30分钟，采用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
碱式磷酸酶试剂盒，北京首医临床医学科技中心生产，规格型号：R1：4*60mL。
钙分析试剂盒，购于艾美捷生物科技有限公司，货号：K380-250。
TB缓冲液：20mM Tris，pH7.5，150mM NaCl。
裂解缓冲液：向TB缓冲液中添加0.1％的T riton X-100。
在本发明未作具体说明的情况下，调节pH使用的溶液是质量分数为1～5％的盐酸或者质量分数1～5％的氢氧化钠水溶液。
在本发明未作具体说明的情况下，真空冷冻干燥的具体工艺条件是：预冻温度-85～-80℃，预冻时间1～3小时，冷冻温度-72～-70℃，绝对压强10～100Pa，干燥时间24～48小时。实施例中具体采用的冷冻干燥条件是：预冻温度-85℃，预冻时间3小时，冷冻温度-70℃，绝对压强100Pa，干燥时间48小时。
实施例1
一种脂肪干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白2mg/mL；
维生素C 60ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5mmol/mL；
表皮细胞生长因子EGF10ng/mL；
重组LIF 10ng/mL；
氨基葡萄糖15μM；
2-巯基乙醇70μM；
青链霉素双抗溶液5μM。
脂肪干细胞的无血清培养基的制备方法：在无菌超净工作台中，取低糖DMEM基础培养基，加入血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白、玻璃粘连蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺、表皮细胞生长因子EGF、重组LIF、氨基葡萄糖、2-巯基乙醇以及青链霉素双抗溶液，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌，即获得脂肪干细胞的无血清培养基。
脂肪干细胞的分离和传代培养步骤如下：
①在患者签署知情同意书后，从其腹部皮下组织通过抽脂术获得人脂肪组织；将吸脂来源的脂肪组织移入细胞操作间的超净工作台上，用D-Hans平衡液冲洗，去除脂肪组织中残留的血液、血管及组织碎片，剔除肉眼可见的细小血管及筋膜，得到脂肪组织；
②把脂肪组织用眼科剪成0.5mm×0.5mm的碎块，放入离心管中，记录原始体积；加入等体积的浓度0.1％的Ⅰ型胶原酶，放入温度37℃的气浴振荡器中消化30分钟，消化过程中不断震荡离心管，并每隔10分钟吹打一次消化液；
③将消化液静置5分钟，待其分层后，用吸管吸取上层的脂肪细胞悬液，将脂肪细胞悬液以1000转/分钟离心2分钟，收集底部的脂肪细胞；将脂肪组织用磷酸盐缓冲液冲洗三遍，称重后继续消化，消化的方法同②，直至脂肪组织成稀糊状时停止消化；消化完成后，弃掉上层未消化的脂肪组织，将下层的细胞悬液以1500转/分钟离心10分钟，收集位于离心管底部的脂肪干细胞团；
④将脂肪干细胞团重悬，密度调整到1×105mL-1，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中；加入实施例1中的脂肪干细胞的无血清培养基，以后每48小时更换培养液一次，使脂肪干细胞群获得足够养分充分生长，传代五代，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化获得培养后的脂肪干细胞。
对照试验
对照试验同实施例1，区别在于：以完全干细胞培养基(采用RPMI1640培养基，含10％(V/V的)胎牛血清)培养脂肪干细胞，并与实施例1中无血清脂肪干细胞培养基培养的脂肪干细胞进行对照，结果如下：
细胞形态鉴定
用溴化丙锭染细胞核，方法如下：细胞贴壁1小时后，用质量百分比为4％的多聚甲醛固定15分钟，用磷酸缓冲液洗两遍；然后使用10μg/mL的溴化丙锭在22℃染核15分钟，用磷酸缓冲液洗三遍。结果发现，脂肪干细胞核质比很大，则细胞核在细胞中所占的比例很大，生长良好。
从说明书附图中可以看出，图1相较于图2，本发明所述脂肪干细胞的无血清培养基培养的脂肪干细胞，在培养初期保持良好的贴壁特性，呈现梭形的成纤维状细胞形态；在培养后期，细胞密度较高时，细胞排列呈现较为一致的漩涡状。
细胞生长速度测定
在培养1天、3天、5天、8天、11天、14天后，采用全自动细胞计数仪进行细胞计数。具体结果见表1。
表1细胞数量数据表单位：亿
第1天 第3天 第5天 第8天 第11天 第14天
实施例1 0.50 0.42 1.78 6.20 18.20 38.40
对照试验 0.60 0.46 1.60 5.47 15.60 31.34
从上述数据可以看出，使用本发明所述脂肪干细胞的无血清培养基培养脂肪干细胞，相较于对照试验培养的脂肪干细胞，在培养中后期，细胞数量明显增多。这说明本发明所述脂肪干细胞的无血清培养基，可以显著提高脂肪干细胞的生长速度，有效改善脂肪干细胞的生长状态。
实施例2
一种脂肪干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白2mg/mL；
维生素C 60ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5mmol/mL；
表皮细胞生长因子EGF10ng/mL；
重组LIF 10ng/mL；
氨基葡萄糖15μM；
2-巯基乙醇70μM；
青链霉素双抗溶液5μM；
蛋白水解物100mg/L。
所述蛋白水解物通过以下制备工艺得到：称取蛋白粉置于反应器中，加入去离子水，配置得到质量分数15％的蛋白粉溶液，然后使用质量分数1％的氢氧化钠水溶液调节蛋白粉溶液的pH至8；按照蛋白粉重量的1％加入胰酶，混合均匀，使用质量分数1％的盐酸调节pH至7.5，置于超高压生物反应器中，在压力100MPa、温度45℃的条件下酶解12小时；将酶解反应液在沸水浴中放置10分钟，随后立即冷却至22℃，以4000转/分钟离心30分钟，收集上清液；将上清液采用200目滤布过滤，收集滤液，得到蛋白水解液；将蛋白水解液真空冷冻干燥，得到所述蛋白水解物。
脂肪干细胞的无血清培养基的制备方法：在无菌超净工作台中，取低糖DMEM基础培养基，加入血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白、玻璃粘连蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺、表皮细胞生长因子EGF、重组LIF、氨基葡萄糖、2-巯基乙醇以及青链霉素双抗溶液、蛋白水解物，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌，即获得脂肪干细胞的无血清培养基。
实施例3
一种脂肪干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白2mg/mL；
维生素C 60ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5mmol/mL；
表皮细胞生长因子EGF10ng/mL；
重组LIF 10ng/mL；
氨基葡萄糖15μM；
2-巯基乙醇70μM；
青链霉素双抗溶液5μM；
蛋白水解物100mg/L；
反油酸30μM。
所述蛋白水解物通过以下制备工艺得到：称取蛋白粉置于反应器中，加入去离子水，配置得到质量分数15％的蛋白粉溶液，然后使用质量分数1％的氢氧化钠水溶液调节蛋白粉溶液的pH至8；按照蛋白粉重量的1％加入胰酶，混合均匀，使用质量分数1％的盐酸调节pH至7.5，置于超高压生物反应器中，在压力100MPa、温度45℃的条件下酶解12小时；将酶解反应液在沸水浴中放置10分钟，随后立即冷却至22℃，以4000转/分钟离心30分钟，收集上清液；将上清液采用200目滤布过滤，收集滤液，得到蛋白水解液；将蛋白水解液真空冷冻干燥，得到所述蛋白水解物。
脂肪干细胞的无血清培养基的制备方法：在无菌超净工作台中，取低糖DMEM基础培养基，加入血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白、玻璃粘连蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺、表皮细胞生长因子EGF、重组LIF、氨基葡萄糖、2-巯基乙醇以及青链霉素双抗溶液、蛋白水解物、反油酸，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌，即获得脂肪干细胞的无血清培养基。
实施例4
一种脂肪干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白2mg/mL；
维生素C 60ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5mmol/mL；
表皮细胞生长因子EGF10ng/mL；
重组LIF 10ng/mL；
氨基葡萄糖15μM；
2-巯基乙醇70μM；
青链霉素双抗溶液5μM；
蛋白水解物100mg/L；
反油酸30μM；
虫草素10ng/mL。
所述蛋白水解物通过以下制备工艺得到：称取蛋白粉置于反应器中，加入去离子水，配置得到质量分数15％的蛋白粉溶液，然后使用质量分数1％的氢氧化钠水溶液调节蛋白粉溶液的pH至8；按照蛋白粉重量的1％加入胰酶，混合均匀，使用质量分数1％的盐酸调节pH至7.5，置于超高压生物反应器中，在压力100MPa、温度45℃的条件下酶解12小时；将酶解反应液在沸水浴中放置10分钟，随后立即冷却至22℃，以4000转/分钟离心30分钟，收集上清液；将上清液采用200目滤布过滤，收集滤液，得到蛋白水解液；将蛋白水解液真空冷冻干燥，得到所述蛋白水解物。
脂肪干细胞的无血清培养基的制备方法：在无菌超净工作台中，取低糖DMEM基础培养基，加入血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白、玻璃粘连蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺、表皮细胞生长因子EGF、重组LIF、氨基葡萄糖、2-巯基乙醇以及青链霉素双抗溶液、蛋白水解物、反油酸、虫草素，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌，即获得脂肪干细胞的无血清培养基。
实施例5
一种脂肪干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白2mg/mL；
维生素C 60ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5mmol/mL；
表皮细胞生长因子EGF10ng/mL；
重组LIF 10ng/mL；
氨基葡萄糖15μM；
2-巯基乙醇70μM；
青链霉素双抗溶液5μM；
蛋白水解物100mg/L；
反异油酸30μM；
虫草素10ng/mL。
所述蛋白水解物通过以下制备工艺得到：称取蛋白粉置于反应器中，加入去离子水，配置得到质量分数15％的蛋白粉溶液，然后使用质量分数1％的氢氧化钠水溶液调节蛋白粉溶液的pH至8；按照蛋白粉重量的1％加入胰酶，混合均匀，使用质量分数1％的盐酸调节pH至7.5，置于超高压生物反应器中，在压力100MPa、温度45℃的条件下酶解12小时；将酶解反应液在沸水浴中放置10分钟，随后立即冷却至22℃，以4000转/分钟离心30分钟，收集上清液；将上清液采用200目滤布过滤，收集滤液，得到蛋白水解液；将蛋白水解液真空冷冻干燥，得到所述蛋白水解物。
脂肪干细胞的无血清培养基的制备方法：在无菌超净工作台中，取低糖DMEM基础培养基，加入血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白、玻璃粘连蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺、表皮细胞生长因子EGF、重组LIF、氨基葡萄糖、2-巯基乙醇以及青链霉素双抗溶液、蛋白水解物、反异油酸、虫草素，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌，即获得脂肪干细胞的无血清培养基。
实施例6
一种脂肪干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白2mg/mL；
维生素C 60ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5mmol/mL；
表皮细胞生长因子EGF10ng/mL；
重组LIF 10ng/mL；
氨基葡萄糖15μM；
2-巯基乙醇70μM；
青链霉素双抗溶液5μM；
蛋白水解物100mg/L；
反油酸15μM；
反异油酸15μM；
虫草素10ng/mL。
所述蛋白水解物通过以下制备工艺得到：称取蛋白粉置于反应器中，加入去离子水，配置得到质量分数15％的蛋白粉溶液，然后使用质量分数1％的氢氧化钠水溶液调节蛋白粉溶液的pH至8；按照蛋白粉重量的1％加入胰酶，混合均匀，使用质量分数1％的盐酸调节pH至7.5，置于超高压生物反应器中，在压力100MPa、温度45℃的条件下酶解12小时；将酶解反应液在沸水浴中放置10分钟，随后立即冷却至22℃，以4000转/分钟离心30分钟，收集上清液；将上清液采用200目滤布过滤，收集滤液，得到蛋白水解液；将蛋白水解液真空冷冻干燥，得到所述蛋白水解物。
脂肪干细胞的无血清培养基的制备方法：在无菌超净工作台中，取低糖DMEM基础培养基，加入血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白、玻璃粘连蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺、表皮细胞生长因子EGF、重组LIF、氨基葡萄糖、2-巯基乙醇以及青链霉素双抗溶液、蛋白水解物、反油酸、反异油酸、虫草素，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌，即获得脂肪干细胞的无血清培养基。
脂肪干细胞培养方法同实施例1，仅将脂肪干细胞的无血清培养基进行相应替换。在培养1天、3天、5天、8天、11天、14天后，采用全自动细胞计数仪进行细胞计数。具体测试结果见表2。
表2细胞数量数据表单位：亿
第1天 第3天 第5天 第8天 第11天 第14天
实施例1 0.50 0.42 1.78 6.20 18.20 38.40
实施例2 0.53 0.41 1.89 6.91 20.67 42.59
实施例3 0.51 0.43 1.95 7.05 21.11 43.87
实施例4 0.55 0.40 2.07 7.35 21.57 45.31
实施例5 0.53 0.44 1.99 7.27 21.49 45.07
实施例6 0.50 0.42 2.13 7.44 21.84 46.82
实施例7脂肪干细胞在培养基中培养的成脂分化潜能
参考实施例1中脂肪干细胞的分离和传代培养步骤，仅将脂肪干细胞的无血清培养基进行替换，取传至5代的细胞，以50000个/cm2的密度接种于96孔板中，并添加相应的脂肪干细胞的无血清培养基进行培养；待细胞融合度达到90％时，弃去无血清培养基，使用磷酸盐缓冲液清洗每孔，加入成脂诱导分化培养基，每3天换液一次。
上述相应的脂肪干细胞的无血清培养基，指的是实施例2～6的脂肪干细胞的无血清培养基。
脂肪干细胞在培养基中培养的成脂分化潜能使用脂滴的出现时间和细胞增殖率这两个指标表示：
1、使用油红O染色法进行成脂测定，记录脂滴的出现时间。
2、使用MIT比色法检测体外培养的人脂肪源干细胞，诱导分化为脂肪细胞的细胞增殖率。具体步骤如下：分别在成脂诱导分化培养基培养12小时、24小时、48小时各取出一块96孔板，每孔滴加5mg/L的MTT溶液40μL，孵育4小时后弃孔内溶液；随后加入二甲基亚砜150μL，避光振荡5分钟，在酶联免疫检测仪上测各孔490mm的光吸收值(OD)。连续测量三次，并记录各组的吸光度值，取其平均值作为最终测试结果。
具体测试结果见表3。
表3脂肪干细胞在培养基中培养的成脂分化潜能测试结果表
从表3可以看出，实验组各组之间在油红O染色时人脂肪源干细胞诱导分化新形成脂肪细胞的脂滴出现时间，以及新形成脂肪细胞的增殖速率，差异具有统计学意义(P＜0.05)。其中，实施例3～6中，在脂肪干细胞的无血清培养基中添加反式脂肪酸，脂肪干细胞的脂滴出现时间明显变短，说明反式脂肪酸的加入可以明显促进脂肪干细胞的成脂诱导分化潜能。尤其是实施例6，采用反油酸和反异油酸组合的反式脂肪酸，得到的脂肪干细胞的无血清培养基具有极佳的成脂诱导分化潜能。
实施例8脂肪干细胞在培养基中培养的成骨诱导分化潜能
参考实施例1中脂肪干细胞的分离和传代培养步骤，仅将脂肪干细胞的无血清培养基进行替换，取传至5代的细胞，以50000个/cm2的密度接种于96孔板中，并添加相应的脂肪干细胞的无血清培养基进行培养；待细胞融合度达到90％时，弃去无血清培养基，使用磷酸盐缓冲液清洗每孔，加入成骨诱导分化培养基，每3天换液一次。培养4周后，用茜素红进行成骨鉴定。
上述相应的脂肪干细胞的无血清培养基，指的是实施例2～6的脂肪干细胞的无血清培养基。
脂肪干细胞在培养基中培养的成骨分化潜能使用碱式磷酸酶活性和钙含量这两个指标表示：
1、碱式磷酸酶活性按照碱式磷酸酶试剂盒说明书进行检测：培养第7天时，将脂肪干细胞使用TB缓冲液冲洗两遍，然后使用100μL裂解缓冲液进行细胞裂解；细胞裂解液在4℃以12000转/分钟离心20分钟，取上清液；将45μL上清液与100μL p-NPP磷酸对硝基苯酯底物在37℃孵化1分钟。依据说明检测其405nm时的吸光值，而后计算出碱式磷酸酶活性。
2、钙含量按照钙分析试剂盒说明书进行测定：培养第14天后，向脂肪干细胞中加入1M醋酸并放置于4℃旋涡混合器过夜以提取矿化基质中的钙；在96孔板中，将15μL细胞提取物与150μL钙分析试剂常温下孵化30秒，测量其650nm的吸光度并重复3次，而后计算出钙含量。
将实施例2的碱式磷酸酶活性和钙含量分别定义为100，将实施例3～6的碱式磷酸酶活性和钙含量除以实施例2的数据的比值，作为最终的测试结果。
具体测试结果见表4。
表4脂肪干细胞在培养基中培养的成骨分化潜能测试结果表
从表4可以看出，实验组各组之间的碱式磷酸酶活性和钙含量，差异具有统计学意义(P＜0.05)。虫草素是从稀有珍贵的传统中药冬虫夏草中分离出来的有效成分。实施例4～6在脂肪干细胞的无血清培养基中添加虫草素，脂肪干细胞的碱式磷酸酶活性以及钙含量明显提高，这说明虫草素能够增强脂肪干细胞的成骨分化能力。
综上所述，本发明所述脂肪干细胞的无血清培养基，不仅具有极佳的成脂诱导分化潜能，还具有极佳的成骨诱导分化潜能。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为了清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种脂肪干细胞的无血清培养基，其特征在于，由低糖DMEM基础培养基和添加成份组成。
2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白5～10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白0.1～5mg/mL；
维生素C 35～80ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5～5mmol/mL；
表皮细胞生长因子1～20ng/mL；
重组LIF 1～20ng/mL；
氨基葡萄糖5～15μM；
2-巯基乙醇25～120μM；
青链霉素双抗溶液2～15μM。
3.根据权利要求2所述的脂肪干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述表皮生长因子包括bFGF和/或EGF。
4.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白5～10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白0.1～5mg/mL；
维生素C 35～80ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5～5mmol/mL；
表皮细胞生长因子1～20ng/mL；
重组LIF 1～20ng/mL；
氨基葡萄糖5～15μM；
2-巯基乙醇25～120μM；
青链霉素双抗溶液2～15μM；
蛋白水解物100～250mg/L。
5.根据权利要求4所述的脂肪干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述蛋白水解物通过以下制备工艺得到：称取蛋白粉置于反应器中，加入去离子水，配置得到质量分数10～20％的蛋白粉溶液，调节蛋白粉溶液的pH至7～8；按照蛋白粉重量的1～3％加入蛋白酶，混合均匀，调节至蛋白酶的最适pH，置于超高压生物反应器中，在压力100～150MPa、温度40～50℃的条件下酶解4～24小时；将酶解反应液在沸水浴中放置10～15分钟，随后立即冷却至20～30℃，离心分离，收集上清液；将上清液过滤，收集滤液，得到蛋白水解液；将蛋白水解液真空冷冻干燥，得到所述蛋白水解物。
6.根据权利要求5所述的脂肪干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白5～10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白0.1～5mg/mL；
维生素C 35～80ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5～5mmol/mL；
表皮细胞生长因子1～20ng/mL；
重组LIF 1～20ng/mL；
氨基葡萄糖5～15μM；
2-巯基乙醇25～120μM；
青链霉素双抗溶液2～15μM；
蛋白水解物100～250mg/L；
反式脂肪酸20～40μM。
8.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述添加成份及其在低糖DMEM基础培养基中的含量如下：
血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白5～10％(v/v)；
玻璃粘连蛋白0.1～5mg/mL；
维生素C 35～80ng/mL；
L-谷氨酰胺1.5～5mmol/mL；
表皮细胞生长因子1～20ng/mL；
重组LIF 1～20ng/mL；
氨基葡萄糖5～15μM；
2-巯基乙醇25～120μM；
青链霉素双抗溶液2～15μM；
蛋白水解物100～250mg/L；
反式脂肪酸20～40μM；
虫草素1～20ng/mL。
9.根据权利要求7或8所述的脂肪干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述反式脂肪酸为反油酸和反异油酸中的一种或两者的混合物。
10.根据权利要求2所述的脂肪干细胞的无血清培养基的制备方法，其特征在于，在无菌环境下，取低糖DMEM基础培养基，加入血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白、玻璃粘连蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺、表皮细胞生长因子、重组LIF、氨基葡萄糖、2-巯基乙醇以及青链霉素双抗等溶液，吹打混匀，过滤除菌，即获得脂肪干细胞的无血清培养基。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110974944A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 广州赛加生物科技有限公司 间充质干细胞复合活性因子冻干粉及其制备方法和应用
CN111034711A (zh) * 2019-12-19 2020-04-21 海南一龄医疗产业发展有限公司 高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法
CN111518764A (zh) * 2020-06-04 2020-08-11 广州同康生物科技有限公司 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106086136A (zh) * 2016-07-01 2016-11-09 西北民族大学 一种水解乳蛋白及其制备方法和应用
CN106635979A (zh) * 2017-01-16 2017-05-10 广东万海细胞生物科技有限公司 脂肪间充质干细胞的无血清培养基
CN106754675A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 广东科玮生物技术股份有限公司 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法和用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106086136A (zh) * 2016-07-01 2016-11-09 西北民族大学 一种水解乳蛋白及其制备方法和应用
CN106754675A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 广东科玮生物技术股份有限公司 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法和用途
CN106635979A (zh) * 2017-01-16 2017-05-10 广东万海细胞生物科技有限公司 脂肪间充质干细胞的无血清培养基

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SOTIROPOULOU等: "Cell Culture Medium Composition and Translational Adult Bone Marrow-Derived Stem Cell Research", 《STEM CELLS》 *
刘建福等: "《细胞工程》", 30 June 2014, 华中科技大学出版社 *
刘斌: "《细胞培养（第3版）》", 31 January 2018, 世界图书出版西安有限公司 *
张靖伟: "反油酸和反异油酸对脂肪干细胞成脂分化的影响及机制研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *
杨建平: "虫草素对人脂肪干细胞成骨分化作用的实验研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
郑荣等: "蛋白水解物在细胞培养中的应用研究", 《西北民族大学学报（自然科学版）》 *
郭立达等: "《动物细胞分离培养》", 31 August 2015, 重庆大学出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111034711A (zh) * 2019-12-19 2020-04-21 海南一龄医疗产业发展有限公司 高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法
CN110974944A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 广州赛加生物科技有限公司 间充质干细胞复合活性因子冻干粉及其制备方法和应用
CN111518764A (zh) * 2020-06-04 2020-08-11 广州同康生物科技有限公司 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法
CN111518764B (zh) * 2020-06-04 2021-10-12 惟力维斯(上海)医学科技有限公司 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法

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